sử dụng công cụ tin sinh học giải trình tự thế hệ mới trong tìm các đột biến của ca bệnh seckel

HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT TOÀN VĂN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN-SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN CỦA CA BỆNH SECKEL Mã số:

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN-SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN CỦA CA

BỆNH SECKEL

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: TS HUỲNH KIM HIỆU

Tp Hồ Chí Minh, 11/2017

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

SỬ DỤNG CÔNG CỤ TIN-SINH HỌC GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM CÁC ĐỘT BIẾN CỦA CA

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu:

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3

A MỞ ĐẦU 3

1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 3

2 ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

1 Bảng thống kê sơ bộ về đoạn đọc thô 26

2 Kết quả đột biến 26

3 Bàn luận 29

KẾT LUẬN 30

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Tổng quan các gen liên quan đến các nhóm bệnh thuộc hội chứng lùn tương đối 1,2

(Theo Geister KA và cs (2015) và Khetarpal P và cs (2016)) 10

Bảng 2 Các thông số để định lượng và đánh giá chất lượng DNA 15

Bảng 3 Thông số kỹ thuật kiểm tra chất lượng DNA phân mảnh 17

Bảng 4 Chu trình nhiệt Gắn index và khuếch đại thư viện 18

Bảng 5 Thống kê cho hai đoạn đọc thô, forward (trái) và reverse (phải) 26

Bảng 6 Tổng hợp đột biến hai gen liên quan tới SCKS 27

Bảng 7 Tổng hợp đột biến trên các gen liên quan tới MOPD I-III 28

Bảng 8 Tổng hợp các đột biến các gen liên quan tới MGS 29

DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình 1 Sơ đồ thể hiện sự di truyền bệnh 7

Hình 2 Sơ đồ quy trình tiến hành các bước trong đề tài 11

Hình 3 Quy trình xử lý và tách chiết gDNA 12

Hình 4 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA 14

Hình 5 Kiểm tra độ phân mảnh của gDNA trên gel agarose 1%, 100V trong 30 phút Mẫu gDNA bị đứt gãy trên giếng 2, 3, 4,5 và 7 gDNA ở giếng 6, 8, 9, 10, 11 đạt chất lượng để tiến hành chạy NGS 15

Hình 6 Sơ đ tổng quát các ư c gi i t n t ng NGS 16

Hình 7 Điện di kiểm tra DNA phân mảnh 17

Hình 8 Minh họa quá trình gắn adapter, index và khuếch đại thư viện 19

Hình 9 Biểu đồ đo kết quả phân cắt gDNA 19

Hình 10 Quy trình kiểm tra thư viện 20

Hình 11 Chuẩn bị thư viện DNA 21

Hình 12 Dùng mồi đặc hiệu với adapter để khuếch đại các mảnh DNA trên giá bám thành từng clone 22

Figure 13 Bắt cặp trình tự đọc thô (Alignment) 24

Hình 14 Tổng quan đột biến non-synonymous không tác động tới intron trên các gen liên quan 27

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MOPD Microcephalic Osteodysplactic

Primordial Dwarfsims

Hội chứng lùn tương đối

Microcephalic Osteodysplactic

NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

A MỞ ĐẦU

1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

Hội chứng Seckel – Seckel Syndrome (SCKS) là một bệnh rối loạn di truyền hiếm thuộc nhóm bệnh lùn tương đối – Primordial Dwarfism Hội chứng seckel còn được gọi là "bệnh lùn đầu chim" (một thuật ngữ mô tả đã được coi là bắt chước) Trong đầu nhỏ, thật không may, có một bộ não rất nhỏ Điều này thường có nghĩa là chậm phát triển và, sau đó, chậm phát triển tâm thần Khoảng một nửa số trẻ em Seckel có chỉ số IQ dưới 50 Hầu hết trẻ em mắc hội chứng Seckel đều “thân thiện và dễ chịu” nhưng “thường siêu cường (hiếu động) và dễ bị phân tâm”(1)

Đây là một hội chứng khuyết tật bẩm sinh có tầm vóc ngắn nghiêm trọng, trọng lượng sơ sinh thấp, đầu rất nhỏ (microcephaly), trán trán, mắt to, tai thấp, nhô ra nổi bật của mũi và cằm nhỏ Khuyết tật của xương ở cánh tay và chân, trật khớp của khuỷu tay và hông, và không có khả năng làm thẳng đầu gối là tất cả phổ biến như là (ở trẻ em trai) thất bại của tinh hoàn để đi vào bìu (cryptorchidism) Tình trạng thiếu sản xuất của tất cả các loại tế bào máu (pancytopenia) xảy

ra ở một số bệnh nhân, cũng như sự bất ổn định của nhiễm sắc thể Bệnh này là di truyền Nó được thừa hưởng một cách lặn tự động(2,3)

Hội chứng seckel được đặc trưng bởi sự tăng trưởng chậm bất thường trong quá trình phát triển của thai nhi (chậm phát triển trong tử cung), dẫn đến trọng lượng sơ sinh thấp Tăng trưởng chậm bất thường (chậm phát triển và chậm trễ xương) tiếp tục sau sinh (sau khi sinh) và thường dẫn đến tầm vóc ngắn (lùn) với sự phát triển tỷ lệ thuận tay và chân (trái ngược với tầm vóc ngắn với cánh tay và chân nhỏ bất thường, tức là ngắn -người lùn được trả tiền) Trung bình đến chậm phát triển tâm thần nghiêm trọng cũng có thể có mặt lúc sinh (bẩm sinh) nhưng có thể không trở nên rõ ràng cho đến khi một đứa trẻ bị ảnh hưởng lớn hơn(8,9)

Ngoài ra, trẻ sơ sinh có hội chứng Seckel có những bất thường đặc biệt của vùng đầu và mặt (craniofacial) Trong hầu hết các trường hợp, trẻ sơ sinh bị ảnh hưởng có thể có triệu chứng nhỏ, một điều kiện chỉ ra rằng chu vi vòng đầu nhỏ hơn so với dự kiến cho tuổi và giới tính của trẻ sơ sinh; một trán sâu; một hàm nhỏ bất thường (micrognathia) được lõm xa hơn bình thường (retrognathia); và / hoặc mũi cong "hình tam giác" Do những bất thường như vậy phần giữa của khuôn mặt có thể xuất hiện bất thường nổi bật Ngoài ra, trong một số trường hợp, một số khớp

xơ nhất định giữa xương sọ (sọ sọ) có thể đóng sớm (craniosynostosis) Kết quả là, đầu có thể xuất hiện kéo dài hoặc rút ngắn bất thường, tùy thuộc vào phần nào của hộp sọ bị ảnh hưởng(4,5)

Ở một số trẻ sơ sinh có hội chứng Seckel, các bất thường khác của sọ có thể xuất hiện bao gồm mắt lớn bất thường với nếp gấp mí mắt xiên xuống (các vết nứt trên da); đôi mắt chéo (lác); tai thấp, dị dạng (loạn sản) với thùy tai vắng mặt; và / hoặc một mái vòm cong của miệng (vòm miệng) có thể không được hình thành hoàn toàn (hở hàm ếch) Ngoài ra, trong một số trường hợp, một bên của khuôn mặt có thể xuất hiện lớn hơn mặt kia (mặt không đối xứng) Một số trẻ

sơ sinh và trẻ em bị ảnh hưởng có thể có bất thường về răng miệng bao gồm phát triển kém (hypoplasia) của men răng và / hoặc đông đúc và / hoặc định vị không đúng của răng(11,12)

Ngoài ra, một số trẻ bị hội chứng Seckel có thể có những bất thường xương khác nhau bao gồm trật khớp đầu xương cẳng tay ở bên ngón tay cái (chuyển vị trí xuyên tâm), trật khớp khuỷu tay, trật khớp và / hoặc dị tật (loạn sản) của hông và / hoặc không có khả năng mở rộng đầu gối hoàn toàn Trong một số trường hợp, trẻ bị ảnh hưởng có thể phát triển bất thường về mặt trước

và / hoặc bên cạnh của cột sống (kyphoscoliosis) Bất thường xương bổ sung có thể bao gồm cố định vĩnh viễn ngón tay thứ năm ở vị trí cong (lâm sàng), dị dạng của bàn chân ở tư thế xoắn (chân), và / hoặc vắng mặt của một cặp sườn (ví dụ, triển lãm 11 chứ không phải 12 cặp xương sườn) Trong một số trường hợp, nam giới với hội chứng Seckel có thể biểu hiện sự thất bại của tinh hoàn để xuống bình thường vào bìu (cryptorchidism) và / hoặc phụ nữ bị ảnh hưởng có thể

có một âm vật mở rộng bất thường (clitoromegaly) Ngoài ra, trẻ em bị ảnh hưởng có thể có tóc quá nhiều cơ thể (rậm lông), và / hoặc một nếp nhăn sâu duy nhất trên lòng bàn tay (nhăn nhăn)(6)

Trong một số trường hợp, những người mắc hội chứng Seckel cũng có thể có các rối loạn máu (huyết học) liên quan bao gồm thiếu tất cả các yếu tố tủy xương bao gồm hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu (pancytopenia) Một mức thấp của các tế bào máu đỏ lưu hành được gọi là thiếu máu

Hội chứng Seckel là một chứng rối loạn cực kỳ hiếm có được thừa hưởng như một đặc điểm lặn tự phát Ba biến thể của hội chứng Seckel liên quan đến sự gián đoạn hoặc thay đổi (đột biến) của gen trên ba nhiễm sắc thể khác nhau(9,17) Các vị trí bản đồ gen là: Hội chứng Seckel 1, trên nhiễm sắc thể số 3 (3q22-q24); Hội chứng Seckel 2, trên nhiễm sắc thể 18 (18p11.31-q11) và hội chứng Seckel 3, trên nhiễm sắc thể 14 (14q21-q22)

Nhiễm sắc thể, có mặt trong nhân tế bào của con người, mang thông tin di truyền cho từng cá thể Các tế bào cơ thể người thường có 46 nhiễm sắc thể Cặp nhiễm sắc thể của con người được đánh số từ 1 đến 22 và nhiễm sắc thể giới tính được chỉ định X và Y Nam giới có một nhiễm sắc thể X và một Y và nữ giới có hai nhiễm sắc thể X Mỗi nhiễm sắc thể có một cánh tay ngắn được chỉ định là “p” và một cánh tay dài được chỉ định “q” Nhiễm sắc thể được chia nhỏ hơn thành nhiều dải được đánh số Ví dụ, “nhiễm sắc thể 3q22-q24” đề cập đến một vùng giữa dải 22 và dải

24 trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể 3 Theo cách tương tự, “nhiễm sắc thể 18p11.31-q11.2” đề cập đến một vùng rộng hơn giữa dải 11p31 trên cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể 18 và dải 11.2 trên cánh tay nhiễm sắc thể 18 Một lần nữa, nhiễm sắc thể 14q21-q22 đề cập đến một vùng hẹp hơn trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể 14 giữa các dải 21 và 22 Các dải số xác định vị trí của hàng ngàn gen hiện diện trên mỗi nhiễm sắc thể Gen cụ thể liên quan đến hội chứng Seckel 1 được gọi là gen ataxia-telangiectasia và protein liên quan đến Rad3 (ATR) Các gen liên quan đến hội chứng Seckel loại 2 và 3 chưa được biết rõ(17)

Các bệnh di truyền được xác định bởi sự kết hợp của các gen cho một đặc điểm riêng biệt trên các nhiễm sắc thể nhận được từ người cha và người mẹ Rối loạn di truyền lặn xảy ra khi một cá nhân thừa hưởng cùng một gen bất thường cho cùng một đặc điểm từ mỗi bố mẹ Nếu một cá nhân nhận được một gen bình thường và một gen cho căn bệnh này, người đó sẽ là người mang mầm bệnh, nhưng thường sẽ không có triệu chứng Nguy cơ cho hai người mẹ mang mầm bệnh đi qua cả gen khiếm khuyết và do đó, có một đứa trẻ bị ảnh hưởng là 25% với mỗi lần mang thai Nguy cơ có con là người mang mầm bệnh như cha mẹ là 50% với mỗi lần mang thai

Cơ hội cho trẻ nhận các gen bình thường từ cả cha lẫn mẹ và có tính di truyền bình thường đối với đặc điểm đó là 25% Nguy cơ là như nhau đối với nam và nữ (16)

Tất cả các cá nhân đều mang một vài gen bất thường Cha mẹ là họ hàng thân thiết (đồng tính) có cơ hội cao hơn cha mẹ không liên quan để mang cả hai gen bất thường, làm tăng nguy

cơ mắc các chứng rối loạn di truyền lặn Hội chứng Seckel là một chứng rối loạn di truyền cực

kỳ hiếm gặp có ảnh hưởng đến nam và nữ với số lượng bằng nhau Tỷ lệ chính xác của rối loạn này không được biết đến Hơn 100 trường hợp đã được báo cáo trong các tài liệu y khoa kể từ khi mô tả ban đầu của nó vào năm 1960

Các triệu chứng của các rối loạn sau đây có thể tương tự như các triệu chứng của hội chứng Seckel So sánh có thể hữu ích cho chẩn đoán phân biệt: Hội chứng seckel là một trong sáu

chứng rối loạn trong lớp học của người lùn được gọi là “chủ nghĩa lùn nguyên thủy” Những rối loạn này có đặc điểm tương tự bao gồm dị tật xương (loạn sản), thiếu hụt tăng trưởng trước khi sinh (chậm phát triển trong tử cung) và trong giai đoạn trứng nước và thời thơ ấu, cuối cùng dẫn đến mức độ khác nhau của tầm vóc ngắn Nhóm rối loạn này hiện nay bao gồm năm rối loạn: Hội chứng Seckel, hội chứng tai-patella-ngắn (Meier-Gorlin); Hội chứng Russell-Silver; Majewski osteodysplastic chim đầu lùn loại I / III; và loại cá lùn dạng nhũ tương đầu dòng Majewski loại II

Loại bệnh lùn đen loại II, hay còn gọi là MOPD II hay rối loạn di truyền nguyên thủy loại II,

là một rối loạn di truyền cực kỳ hiếm gặp, có trọng lượng ngắn, trọng lượng sơ sinh thấp, đầu nhỏ bất thường (cực nhỏ) và / hoặc bất thường xương Các phát hiện vật lý khác có thể bao gồm mắt to, mũi nhô ra của mũi, hàm sau, và / hoặc mặt hẹp Thiếu hụt tăng trưởng nặng trước khi sinh (thiếu hụt trong tử cung) thường xảy ra Sự chậm phát triển tâm thần có thể xuất hiện trong một số trường hợp Một loạt các triệu chứng khác cũng có thể xảy ra Các triệu chứng cụ thể và mức độ nghiêm trọng khác nhau tùy từng trường hợp Majewski osteodysplastic dwarfism chim đầu đen loại II được cho là được thừa kế như một đặc điểm lặn tự phát(15,18)

Với sự ra đời của siêu âm siêu âm kỹ thuật, hội chứng Seckel có thể được chẩn đoán trước khi sinh (trước khi sinh) Trong siêu âm bào thai, sóng âm phản xạ được sử dụng để tạo ra hình ảnh của thai nhi đang phát triển Sau khi sinh, hội chứng Seckel có thể bị nghi ngờ dựa trên đánh giá lâm sàng toàn diện, lịch sử bệnh nhân chi tiết và một loạt các xét nghiệm chuyên biệt Mặc

dù có các triệu chứng bất thường về xương sọ, xương, và / hoặc các bất thường khác liên quan đến hội chứng Seckel khi sinh (bẩm sinh), chẩn đoán hội chứng Seckel có thể không được xác nhận ví dụ, khi tầm vóc ngắn và / hoặc chậm phát triển tâm thần trở nên rõ ràng) Tầm vóc ngắn liên quan đến hội chứng Seckel liên quan đến sự tăng trưởng tỷ lệ của cánh tay và chân, cho phép chẩn đoán phân biệt từ hội chứng có tầm vóc ngắn và cánh tay và chân nhỏ bất thường (lùn ngắn hạn)

Bệnh lùn tương đối, ngoài SCKS, còn bao gồm Microcephalic Osteodysplactic Primordial Dwarfsims loại I-III (MOPD I-III) và hội chứng Meier-Gorlin (MGS)(1,2) Những đặc điểm lâm sàng điển hình của SCKS là dị tật đầu nhỏ (thường thể tích não giảm còn 1/3 thể tích thông thường) và dị tật nội tạng (biến đổi cấu trúc răng, hàm thụt và mũi nhô), mức độ nghiêm trọng của bệnh đối với bệnh nhân thay đổi rất nhiều với các bệnh nhân(2) Một số gen được phân loại

theo chức năng có liên hệ tới bệnh là: gen liên quan đến phản ứng với sự hư hỏng DNA – ATR, RBBP8; gen liên quan tới trung tử - CPAP (CENPJ), CEP152.(1,2)

Hình 1 Sơ đồ thể hiện sự di truyền bệnh

Giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole genome sequencing - WGS) và giải trình tự hệ gen biểu hiện (Whole exome sequencing - WES) là 2 xu hướng chính ứng dụng công nghệ NGS vào giải trình tự ADN WGS/WES cho phép tìm kiếm và xác định các biến dị di truyền SNP, InDel, CNV, SV có trong cá thể, quần thể đối với những loài đã có hệ gen tham chiếu Việc phát hiện các biến dị di truyền giúp phát hiện các biến dị gây ra bệnh di truyền đã biết, từ đó tiến hành sàng lọc ung thư/bệnh di truyền sớm hoặc theo dõi đáp ứng điều trị; cung cấp các biến dị cho nghiên cứu GWAS, chú giải ; đánh giá đa dạng quần thể bằng cách xác định tần số allen

Những ưu điểm vượt trội về công suất và giá thành đã khiến WGS trở thành phương pháp thích hợp nhất cho nhiều mục đích nghiên cứu WGS ngày càng được sử dụng nhiều hơn cho các nghiên cứu giải mã như khoa học pháp y, di truyền nông nghiệp và các chẩn đoán lâm sàng (chẩn đoán bệnh di truyền là một ví dụ)

Một trong những ứng dụng lâm sàng quan trọng khác là giải trình tự các chủng gây bệnh và các bệnh truyền nhiễm quan tâm Đối với nhiều ứng dụng, việc giải trình tự toàn bộ hệ gen là không thực tế và không cần thiết Do đó, giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là phương án tiếp cận hợp lý đối với những vùng gen quan tâm, ví dụ Exon chỉ chiếm 2% trong hệ gen người nhưng biến đổi trong đó lại gây nên 85% các căn bệnh đã biết Vì lý do này, WES đã được sử dụng cho nghiên cứu lâm sàng trong những năm gần đây, cho ra nhiều công cụ chẩn đoán hứa hẹn sẽ làm thay đổi đáng kể dịch vụ y tế và chăm sóc sức khỏe(3) Một hướng tiếp cận cao hơn mới phát triển trong thời gian gần đây là giải trình tự các gen quan tâm đã được khuếch đại bằng PCR Phương pháp này phù hợp với các kiểm tra bệnh, tập trung vào một lượng giới hạn các bệnh có liên quan đến các biến thể hoặc ứng dụng trong giải trình tự gen 16S của rARN từ các loài khác nhau Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong hệ thống học và phát sinh chủng loại, cụ thể là giữa các mẫu đa dạng về di truyền Giải trình tự thế hệ mới đã trở thành một công cụ thiết yếu trong phân tích di truyền và hệ gene

NGS ngày càng quan trọng đối với các nhà khoa học thực nghiệm, để đạt được các kỹ năng tin sinh học để đánh giá và phân tích khối lượng dữ liệu khổng lồ sau giải trình tự Vì thế nó đặt

ra một thách thức trong việc lưu trữ và phân tích dữ liệu, do đó đòi hỏi máy tính phải có cấu hình thật mạnh và các thuật toán phân tích hiệu quả Điều này gây khó khăn cho các nhà sinh học không chỉ trong phân tích các dữ liệu quan trọng với kết quả NGS mà còn ở khía cạnh hợp tác và khả năng lặp lại(1)

Một trong những bước đầu tiên của quy trình phân tích dữ liệu kết quả NGS đó là việc chuẩn

bị và kiểm tra chất lượng dữ liệu Những bước này thường được thực hiện như sau: (i) bắt cặp trình tự đầu ra, (ii) tính toán; (iii) xem thống kê tóm tắt về điểm chất lượng và phân bố các nucleotide (iv) loại bỏ trình tự được đọc không tốt nếu cầu thiết (v) lọc các trình tự dựa vào điểm chất lượng và nhiều thao tác khác

Khác hẳn các công cụ phân tích dữ liệu NGS hiện nay, Galaxy là một dự án mã nguồn mở, dựa trên nền tảng web để người dùng không có kiến thức lập trình cũng có thể tiếp cận và tiến hành tính toán cũng như phân tích y sinh học(1,5)

Galaxy giúp cho quá trình phân tích sinh học dễ dàng hơn cho người sử dụng bằng cách tương tác với các công cụ và quy trình có sẵn các thông

số với giao diện chỉ cần nhấn di chuyển chuột (point-and-click) Mỗi bước thực hiện và tính toán cũng như chỉnh sửa của người dung đều được hệ thống ghi chép một cách tự động để bất cứ người sử dụng nào khác đều có thể lặp lại và hiểu một cách tường minh, người dùng cũng có thể chia sẻ và công bố quy trình riêng của mình với nhiều người khác thông qua giao thức web một cách đầy đủ

Các công cụ của Galaxy đều là miễn phí, truy cập tại http://usegalaxy.org Ngoài ra, cũng có sẵn phiên bản để cài đặt trên máy tính cá nhân tại http://getgalaxy.org (chỉ tối ưu khi máy tính cài đặt hệ điều hành Ubuntu hoặc MAC) hoặc sử dụng với giao diện đám mây thì truy cập vào http://usegalaxy.org/cloudlaunch Khi các công cụ có sẵn trên hệ thống không có sẵn với yêu cầu của người dùng, có thể tìm kiếm và cài đặt từ cửa hàng ứng dụng của Galaxy với tên gọi là ToolShed, có sẵn tại http://usegalaxy.org/toolshed(13,14)

Giải trình tự thế hệ mới - Next Generation Sequencing (NGS) là một công nghệ mới áp dụng việc giải trình tự song song trên nhiều đoạn DNA cùng một lúc; công nghệ này ưu việt hơn so với giải trình tự Sanger về mặt công suất cũng như hiệu quả kinh tế(3,4). Cụ thể, việc sử dụng giải trình tự Sanger cho các gene nhiều exon hoặc nhiều gen là cực kỳ tốn kém so với NGS Tuy nhiên, đối với NGS, kết quả giải trình tự là một ngân hàng dữ liệu khổng lồ, vì vậy, cần phải có kiến thức về tin sinh học cùng với máy tính có khả năng xử lý dữ liệu mạnh để có thể phân tích kết quả giải trình tự

Nhóm chúng tôi đã tiếp cận được với một bệnh nhân được chẩn đoán mắc SCKS, tuy nhiên, với kiểu hình và các đặc điểm lâm sàng phức tạp để xác định và phân loại, chúng tôi quyết định

sử dụng NGS trên mẫu bệnh trên, cụ thể hơn, chúng tôi sử dụng giải trình tự toàn bộ exome để tập trung vào những gen liên quan với SCKS Thêm vào đó, chúng tôi còn mở rộng ra đánh giá tất cả các gen có liên quan tới các hội chứng khác của nhóm bệnh lùn tương đối theo bảng 1(1,2)

Bảng 1 Tổng quan các gen liên quan đến các nhóm bệnh thuộc hội chứng lùn tương đối (1,2)

(Theo Geister KA và cs (2015) và Khetarpal P và cs (2016))

RNU4ATAC, U4ATAC PCNT ORC1, ORC4, ORC6,

CDT1, CDC6

ATR, RBBP8, CENPJ,

CEP152 NIN, XRCC4, CENPE

2 ĐỐI TƯƠNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tương nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên một ca bệnh được chẩn đoán là Seckel tại Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

a Tách chiết gDNA từ máu

Mẫu gDNA từ máu ngoại vi được tách chiết bởi bộ Illustra-blood genomic Prep Mini Spin Kit (GE Healthcare) gDNA sau khi thu nhận được bảo quản ở -20oC

b Phương pháp nghiên cứu

Hình 2 Sơ đồ quy trình tiến hành các bước trong đề tài

2.3 Tách chiết gDNA từ máu

a Chuẩn bị

- Buffer: AL; AW1 (bổ sung 25 ml Ethanol 96%); AW2 (bổ sung 30 ml Ethanol 96%); Qiagen Protease (bổ sung 1.2 ml Protease solvent) (phù hợp tách DNA từ mẫu máu, dịch cơ thể) Đối với Proteinase K thích hợp cho tách mẫu mô

- Ống epp 1.5ml, pipette 10, 100, 1000 uL

- Máy li tâm thường, votex, block nhiệt (56oC)

Hình 3 Quy trình xử lý và tách chiết gDNA

b Quy trình tách chiết gDNA

- Bổ sung 20 uL Protease (hoặc proteinase K) vào mỗi ống epp 1.5 mL

- Bổ sung 200 uL mẫu (máu tổng số, huyết thanh, dịch chiết, buffy coat…) vào ống ở bước (1)

- Bổ sung 200 uL Buffer AL Vortex 15s

- Ủ 56oC/10 min

- Spin down

- Bổ sung 200 uL EtOH 100% vào mẫu Invert 15s Spin down

- Lên cột Ly tâm 8000 rpm/phút trong 1 phút

- Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi kit)

- Bs 500 uL Buffer AW1 Ly tâm 8000 rpm/phút trong 1 phút Loại dịch chảy qua cột, thay ống thu (được cấp bởi kit)

- Bs 500 uL Buffer AW2 Ly tâm 14000 rpm/ phút trong 3 phút

- Thay ống thu = epp 1.5 mL Ly tâm khan tốc độ tối đa trong 1 phút

- Thay epp 1.5 mL mới Bs 100 uL Buffer AE Ủ ở RT trong 5 phút Ly tâm 8000 rpm/phút trong 2 phút

2.4 Định lượng và đánh giá chất lượng DNA đầu vào

a Mục đích

- Kiểm tra chất lượng gDNA sau tách chiết: nồng độ, độ tinh sạch

- Đảm bảo chính xác lượng DNA đầu vào của phản ứng giải trình tự

- Đảm bảo độ phân cắt của các đoạn DNA và chất lượng thư viện

b Máy đo quang phổ

Sử dụng máy đo quang phổ Nanodrop 1000 của hãng Thermo Fisher Tỉ lệ hấp thụ ở các bước sóng 230 nm (A230), 260 nm (A260), 280 nm (A280) sẽ được sử dụng kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ gDNA sau tách chiết

Một số bước quan trọng trong nghiên cứu NGS là phải kiểm tra bệnh học và có số liệu chính xác nguồn mẫu Định lượng DNA phải được đánh giá dựa trên 2 hình thức: quang phổ và chạy điện di trên gel 1% agarose Quang phổ ở bước sóng 260/230 trong khoảng 1,5 – 2,2 để đánh giá độ tạp nhiễm hoá chất trong lúc tách chiết (phần lớn là ethanol) Quang phổ bước sóng 1,6 – 2,2 để đánh giá độ tạp nhiễm protein trong mẫu (Bảng 2) Hình ảnh DNA chạy điện di trên gel để đánh giá mức độ toàn vẹn cấu trúc DNA, mức độ đứt gãy của sản phẩm hệ gen Mức tối

ưu là 50% băng DNA > 1.000bp

Nồng độ dsDNA được tính theo công thức C = 50 (ng/µL) x A260 x 50 với pathlength 1

cm Mẫu gDNA có A260/A230 ≥ A260/A280 ≥ 1.8 được cho là “sạch”