quy trình sản xuất mẫu huyết thanh, ứng dụng trong chƣơng trình ngoại kiểm hóa sinh

Kết quả của nghiên cứu không chỉ nâng cao chất lượng kết quả của phòng xét nghiệm hóa sinh mà còn giúp cho các phòng xét nghiệm trong nước có thể tiến hành thực hiện chương trình ngoại k

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH, ỨNG DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM

HÓA SINH

Mã số: 211/2017/HĐ-NCKH

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Vũ Quang Huy

Tp Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2018

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH, ỨNG DỤNG TRONG CHƯƠNG TRÌNH NGOẠI KIỂM

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Vũ Quang Huy. (1,2)

Cs Nguyễn Thị Quỳnh Nga (3) , Lê Ngọc Minh Trân, Trần Thái (1) , Phạm Hồng Thụy, Lâm Quốc Cường (1) , Bùi Quang Sang (1) , Lê Hoàng Anh (1) , Nguyễn Văn Hoàng Sơn (1) , Trần

Hà Tiểu Linh (1)

(1) Trung tâm Kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm y học - Đại Học Y Dược TP HCM (2) Bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều dưỡng Kỹ thuật Y học- Đại Học Y Dược TP HCM (3) Bộ môn Huyết học, Khoa Xét nghiệm – Đại học Kỹ thuật Y-Dược Đà Nẵng

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 VAI TRÕ CỦA XÉT NGHIỆM HÓA SINH TRONG LÂM SÀNG 4 1.2 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM 14

1.3 NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG (EQA – External Quality Assessment) 19

1.4 MẪU NGOẠI KIỂM 21

1.5 KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ 25

1.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH 28

1.7 TÌNH HÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 29

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31

2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 31

2.3 CỠ MẪU 31

2.4 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU 32

2.5 PHƯƠNG PHÁP THU THẬP SỐ LIỆU 32

2.6 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT 33

2.7 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.8 KIỂM SOÁT SAI LỆCH 43

2.9 Y ĐỨC VÀ TÍNH ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 47

3.1 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG MẪU SẢN XUẤT 47

3.2 ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA 2 YẾU TỐ NHIỆT ĐỘ, THỜI GIAN LÊN QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN MẪU NGOẠI KIỂM 54

3.3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH NGOẠI KIỂM HÓA SINH 64

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 67

4.1 QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM HÓA SINH 67

4.2 SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT MẪU HUYẾT THANH BẰNG ĐÔNG KHÔ VÀ ĐÔNG LẠNH 69

4.3 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA MẪU THEO THỜI GIAN VÀ NHIỆT ĐỘ 70

KẾT LUẬN 76

KIẾN NGHỊ 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PHỤ LỤC A I PHỤ LỤC B III PHỤ LỤC C IV PHỤ LỤC D VI PHỤ LỤC E VIII

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ tiếng Việt

BV : Bệnh viện ĐHYD : Đại Học Y Dược ĐNM : Định nhóm máu ĐTĐ : Đái tháo đường

ML : Millilit NĐBĐ : Nồng độ ban đầu TCQG : Tiêu chuẩn quốc gia TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

TP HCM : Thành phố Hồ Chí Minh

Từ tiếng Anh

ALT : Alanine Transaminase AMP : AdenosineMonophosphate AST : Aspartate Transaminase

AU : Acid Uric BUN : Blood Urea nitrogen CDC : Centers for Disease Control and Prevention, USA CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

Cho : Cholesterol

CM : Chylomicron

Cre : Creatinin CRM : Certified Reference Material

CV : Coefficient of Variation DNA :Deoxynucleic acid

EQA : External Quality Assessment GOD : Glucose Oxidase

GOT : Glutamat Oxaloacetac Transaminase GLU : Glucose

GLDH : Glutamate Dehydrogenase GGT : Gamma Glutamyl Transaminase

GH : Growth Hormone GMP : Guanosine Monophosphate GPO : Glycerol 3 Phosphate Oxidase GPT : Glutamat Pyruvat Transaminase HBsAg :Hepatitis B surface antigen HCV : Hepatitis C virus

HIV :Human immunodeficiency virus HDL : High density lipoprotein

IDL : Intermediate density lipoprotein IEC : International Electrotechnical Commission IFCC : International Fedaration of clinical Chemistry

IQC : Internal Quality Control ISO : International Organization for Standardization LDL : Low density lipoprotein

PAP : Peroxidase Antiperoxidase

PT : Proficiency testing

QA : Quality Assurance

QC : Quality Control

QM : Quality Management QMS : Quality Management System RNA : Ribonucleic acid

RM : Reference Material

SD : Standard Deviation SSG : Sum of Squares between - Groups SST : Total Sum of Squares

SSW : Sum of Squares Within-groups

TG : Triglycerid Tri :Triglycerid Ure : Ure

VLDL : Very low density lipoprotein WHO :World Health Organization

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cơ chế điều hòa nồng độ Glucose máu 5

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa BUN trong cơ thể 7

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa Creatinin trong cơ thể 9

Hình 1.4 Sơ đồ vận chuyển Cholesterol trong cơ thể 11

Hình 1.5 Quá trình hình thành Acid Uric 12

Hình 1.6 Các yếu tố của hệ thống quản lý chất lượng 19

Hình 1.7 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm [3] 19

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp tiến hành 386

Hình 2.2 Quá trình đông khô mẫu huyết thanh 38

Hình 2.3 Mẫu huyết thanh trộn và kết quả sàng lọc anti-HIV 40

Hình 2.4 Biểu đồ nội kiểm tra Levey Jennings 45

Hình 3.1 Nồng độ glucose 54

Hình 3.2 Nồng độ ure 55

Hình 3.3 Nồng độ creatinin 55

Hình 3.4 Nồng độ triglycerid 56

Hình 3.5 Nồng độ cholesterol 56

Hình 3.6 Nồng độ acid uric 57

Hình 3.7 Hoạt động enzym GOT 57

Hình 3.8 Hoạt động enzym GPT 58

Hình 3.9 Hoạt động enzym GGT 58

Hình 3.10 Nồng độ glucose theo thời gian 59

Hình 3.11 Nồng độ ure theo thời gian 59

Hình 3.12 Nồng độ creatinin theo thời gian 60

Hình 3.13 Nồng độ triglycerid theo thời gian 60

Hình 3.14 Nồng độ cholesterol theo thời gian 61

Hình 3.15 Nồng độ acid uric theo thời gian 61

Hình 3.16 Hoạt độ enzym GOT theo thời gian 62

Hình 3.17 Hoạt độ enzym GPT theo thời gian 62

Hình 3.18 Hoạt độ enzym GGT theo thời gian 63

Hình 3.19 Hình ảnh mẫu ngoại kiểm sản xuất 66

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Mối quan hệ giữa nhiệt độ và áp suất hơi 27

Bảng 2.1 Máy móc và thiết bị sử dụng 33

Bảng 2.2 Dụng cụ và vật tư tiêu hao 34

Bảng 2.3 Hóa chất và thuốc thử 35

Bảng 2.4 Bảng điều chỉnh nồng độ mẫu ngoại kiểm 32

Bảng 2.5 Phương pháp định lượng các chỉ số Hóa sinh 39

Bảng 3.1 Đánh giá độ đồng nhất của mẫu sản xuất bằng phương pháp đông lạnh 48

Bảng 3.2 Đánh giá độ đồng nhất của mẫu sản xuất bằng phương pháp đông khô 49

Bảng 3.3 So sánh phương pháp đông khô và đông lạnh 49

Bảng 3.4 Độ ổn định của mẫu đông khô bảo quản ở nhiệt độ - 200 C sau 5 tháng 50

Bảng 3.5 Độ ổn định của mẫu đông khô bảo quản ở nhiệt độ 2- 80 C sau 5 tháng 51

Bảng 3.6 Độ ổn định của mẫu đông lạnh bảo quản ở nhiệt độ -200 C sau 5 tháng 51

Bảng 3.7 Độ ổn định của mẫu đông lạnh bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80 C sau 5 tháng 52

Bảng 3.8 Độ ổn định mẫu đông khô và đông lạnh bảo quản ở - 200 C sau 5 tháng 53

Bảng 3.9 Độ ổn định của mẫu đông khô bảo quản ở 2 – 80 C sau 3 tháng 53

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, việc chẩn đoán và điều trị bệnh đã dễ dàng hơn rất nhiều nhờ sử dụng máy móc hiện đại vào xét nghiệm cận lâm sàng Việc sử dụng máy móc thay thế con người sẽ giúp cho công tác khám chữa bệnh nhanh chóng, có thể cho ra hàng loạt kết quả trong một thời gian ngắn [58], nhưng trong quá trình máy phân tích tự động có thể xảy ra lỗi và dẫn đến sai kết quả Dù sai số đó chỉ chiếm 1% nhưng cũng dẫn đến sai lầm trong chẩn đoán và điều trị [20] Vì vậy, đảm bảo chất lượng kết quả là vấn đề đáng quan tâm nhất tại mỗi phòng xét nghiệm

Để có được kết quả đảm bảo độ tin cậy thì mỗi phòng xét nghiệm cần tiến hành nội kiểm tra và đặc biệt là ngoại kiểm tra chất lượng theo khuyến cáo của CLSI, CDC kết hợp với WHO Ngoài ra theo như hướng dẫn Thông tư số 01/2013/TT-BYT của Bộ Y tế thì cần có hệ thống quản lý chất lượng để đảm bảo chất lượng [1] nhằm tiến tới lộ trình liên thông kết quả xét nghiệm trên phạm vi toàn quốc theo quyết định số 316/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính Phủ

về phê duyệt Đề án tăng cường năng lực hệ thống quản lý chất lượng xét nghiệm y học giai đoạn 2016 – 2025 [11]

Tuy nhiên, để có thể kiểm tra chất lượng xét nghiệm cần có một mẫu chuẩn đạt tiêu chuẩn Các mẫu chuẩn thường dùng hiện nay đa số được nhập khẩu từ thị trường nước ngoài với giá thành rất cao Các cơ sở trong nước chưa sản xuất được sinh phẩm dùng để kiểm tra chất lượng các chỉ số xét nghiệm đặc biệt là các chỉ số hóa sinh Vì vậy, các phòng xét nghiệm trên cả nước vẫn chưa thể thực hiện đồng nhất và có quy mô chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm các chỉ số hóa sinh, đặc biệt là các phòng xét nghiệm nhỏ và các phòng xét nghiệm tuyến huyện… [36]

Trong tình hình hiện tại như vậy, việc sản xuất một mẫu kiểm chuẩn đảm bảo tính đồng nhất và ổn định theo thời gian để có thể tiến hành ngoại kiểm

tra chất lượng phòng xét nghiệm là điều cần thiết Các mẫu kiểm chuẩn thường được sản xuất với rất nhiều phương pháp, trong đó có phương pháp đông khô, đông lạnh [32], [34], [36], [40], [41] Do đó, tiến hành hai phương pháp để sản xuất mẫu kiểm chuẩn nhằm so sánh và lựa chọn được mẫu kiểm chuẩn tối ưu nhất, giúp ích cho việc nâng cao chất lượng kết quả xét nghiệm trên cả nước Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Quy trình sản xuất mẫu huyết thanh, ứng dụng trong chương trình ngoại kiểm hóa sinh” nhằm sản xuất ra được mẫu kiểm chuẩn đảm bảo tính đồng nhất, ổn định và ít bị tác động bởi điều kiện môi trường trong quá trình bảo quản mẫu Kết quả của nghiên cứu không chỉ nâng cao chất lượng kết quả của phòng xét nghiệm hóa sinh mà còn giúp cho các phòng xét nghiệm trong nước có thể tiến hành thực hiện chương trình ngoại kiểm tra chất lượng với giá cả hợp lý mà vẫn đảm bảo tính tin cậy trong quá trình thực hiện xét nghiệm

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh dùng

để ngoại kiểm hóa sinh ở quy mô phòng thí nghiệm đảm bảo tính ổn định và đồng nhất trong quá trình sản xuất hay không?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu quy trình thử nghiệm sản xuất mẫu huyết thanh để ứng dụng trong chương trình ngoại kiểm Hóa sinh ở quy mô phòng thí nghiệm

Mục tiêu cụ thể

1 Nghiên cứu quy trình thử nghiệm sản xuất mẫu huyết thanh để ứng dụng trong chương trình ngoại kiểm Hóa sinh ở quy mô phòng thí nghiệm

2 So sánh sự ổn định và đồng nhất của mẫu huyết thanh được sản xuất theo hai phương pháp đông khô và đông lạnh

3 Khảo sát độ ổn định của mẫu huyết thanh theo thời gian và nhiệt độ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VAI TRÕ CỦA XÉT NGHIỆM HÓA SINH TRONG LÂM SÀNG

Cơ thể chúng ta gồm các mô, các cơ quan và các dịch thể Qua quá trình tiêu hóa thức ăn nhờ hệ thống tiêu hóa của cơ thể đã phân giải thức ăn thành các chất dinh dưỡng hay các dưỡng chất (glucose, acid amin…) Dưỡng chất

sẽ được hấp thu vào máu, rồi được đến các mô, tại đây chúng được dùng để tổng hợp các đại phân tử hay thoái hóa thành các sản phẩm trung gian và cuối cùng Các sản phẩm này được đưa vào máu tới các mô để sử dụng hay các cơ quan bài tiết để thải ra ngoài (qua nước tiểu, thức ăn hay mồ hôi, phân…) Ngoài những quá trình chuyển hóa chung, mỗi mô có các đặc điểm chuyển hóa riêng và có sự tham gia của các enzym và isoenzym đặc trưng để tạo ra các sản phẩm chuyển hóa riêng Việc đo lường những enzym và các sản phẩm chuyển hóa đặc trưng của cơ thể có ý nghĩa nhất định trong việc xác định tình trạng bệnh lý của các mô tương ứng [5]

Cùng với các xét nghiệm chẩn đoán khác, xét nghiệm hóa sinh thường quy góp phần quan trọng trong việc chẩn đoán, đánh giá chức năng, tiên lượng bệnh và theo dõi kết quả điều trị Ngoài ra xét nghiệm hóa sinh còn có thể tầm soát bệnh và nguy cơ bị bệnh Do đó, các xét nghiệm hóa sinh được chỉ định thường quy trong quá trình khám và chữa bệnh Một trong số xét nghiệm hóa sinh thường được chỉ định để chẩn đoán, theo dõi và điều trị bệnh

đó là: Glucose, Ure, Creatinin, GOT, GPT, GGT, Triglycerid, Acid Uric, Cholesterol…

1.1.1 Xét nghiệm định lượng Glucose máu

Glucose là nguồn năng lượng chủ yếu và trực tiếp của cơ thể, được dự trữ ở gan dưới dạng glycogen Glucose tham gia vào cấu trúc tế bào (RNA và DNA) và một chất đặc biệt khác (Mucopolysaccharid, heparin, acid

hyaluronic, chondroitin…) Bình thường nồng độ glucose máu tương đối hằng định Khi cơ thể đói, sự giảm nồng độ glucose có thể tránh được nhờ phân hủy glycogen, khi glucose máu tăng thì glucose sẽ sinh tổng hợp thành glycogen Việc điều hòa nồng độ glucose máu chịu tác động của 2 hệ thống hormone đối lập nhau:

- Insulin có tác dụng làm hạ glucose máu

- Glucagon, adrenalin, cortisol và GH có tác dụng làm tăng nồng độ glucose máu (hình 1.1)

Hình 1.1 Cơ chế điều hòa nồng độ glucose máu

Đánh giá nồng độ glucose máu cho phép phát hiện các rối loạn chuyển hóa glucose Nguyên nhân thường gặp ở rối loạn trong chuyển hóa glucose đó

là đái tháo đường Xác định nồng độ glucose huyết tương lúc đói và làm

nghiệm pháp gây tăng glucose máu đường uống là một biện pháp sàng lọc bệnh ĐTĐ cực kì có giá trị Ngoài ra đánh giá nồng độ glucose máu lúc đói

và sau khi ăn 2 giờ, xét nghiệm tìm glucose trong nước tiểu, diễn biến của nồng độ glucose máu mao mạch hay định lượng hemoglobin A1C và C peptid cũng cung cấp thông tin hữu ích cho chúng ta để chẩn đoán và điều trị ĐTĐ [2], [5], [13], [14]

Giá trị bình thường của Glucose [2]:

- Huyết tương: 60 - 110 mg/dl hay 3,36 – 6,16 mmol/L

- Máu toàn phần: 60 – 105 mg/dL hay 3,36 – 5,58 mmol/L

- Trẻ sơ sinh: 20 – 80 mg/dL hay 1,12 – 4,48 mmol/L

Sự thay đổi giá trị của glucose máu không những giúp chẩn đoán và kiểm soát bệnh đái tháo đường mà còn để chẩn đoán tình trạng hạ đường huyết Bên cạnh đó xét nghiệm định lượng nồng độ glucose máu còn giúp chẩn đoán và theo dõi các rối loạn chuyển hóa cacbohydrat khác bao gồm ĐTĐ thai kỳ, hạ đường huyết ở trẻ sơ sinh, hạ đường huyết vô căn và ung thư biểu mô tế bào tụy đảo [2], [5], [13], [14]

1.1.2 Xét nghiệm định lượng Ure máu

Ure là sản phẩm thoái hóa chính của các protein và acid amin trong cơ thể và là sản phẩm quan trọng nhất của chuyển hoá nitơ Ure được tạo thành ở gan và đây là cơ quan duy nhất tổng hợp ure từ NH3 Ure nitrogen (BUN) là phần nitrogen của ure trong máu Ure có nguồn gốc xuất xứ chủ yếu từ quá trình thoái hóa các protein (hình 1.2) Các protein có thể có nguồn gốc từ thức ăn (1) hay nội sinh (2):

Protein ngoại sinh Protease

Nồng độ ure máu phụ thuộc vào chức năng thận, chế độ ăn, quá trình dị hóa protein nội sinh và tình trạng thăng bằng điện giải trong cơ thể Tất cả rối loạn chức năng gan đều sẽ làm quá trình chuyển hóa NH3 thành ure bị suy giảm nhiều hay ít Ure được đào thải qua hai con đường tiêu hóa nhờ enzym urease của ruột và đường thận Ure được lọc qua cầu thận và tái hấp thu thụ động qua ống thận Tất cả các rối loạn chức năng thận đều dẫn tới tăng nồng

độ ure huyết thanh và khi nồng độ ure tăng tới > 33mmol/L (>200 mg/dL) thì

có thể thấy biểu hiện lâm sàng ở tim, phổi, tiêu hóa và hệ thần kinh… [2], [5], [13], [14]

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển hóa BUN trong cơ thể

Giá trị bình thường [2]:

- Huyết thanh: Ure: 13 – 40 mg/dL hay 2,1 – 6,6 mmol/L

BUN: 5 - 17 mg/dL

- Tỷ lệ nồng độ ure huyết thanh/ creatinin huyết thanh: 10 – 40

Xét nghiệm định lượng ure cho phép đánh giá mức độ tăng đơn độc nồng độ ure không kèm tăng creatinin giúp hướng tới chẩn đoán dị hóa protein hay tăng song song với creatinin gợi ý tình trạng suy thận Đây là xét nghiệm giúp quyết định dùng loại thuốc gì không gây độc cho thận Xét nghiệm này còn giúp ích trong việc đánh giá mức độ nặng nhẹ của suy thận [2], [5], [13], [14]

1.1.3 Xét nghiệm định lượng Creatinin máu

Creatinin là một chất chuyển hóa nitơ, là sản phẩm của sự thoái hóa creatinin cơ và được đào thải duy nhất qua thận Phản ứng giữa arginin và glycin xảy ra ở mô thận, tạo ra ornithin và acid guanidon-acetic (glycocyamin) Sau đó glycocyamin được đưa vào máu rồi chuyển đến gan,

và được chuyển hóa thành creatinin (hình 1.3) Creatinin vào mạch máu và được tế bào cơ hấp thụ Tại đây creatinin được chuyển hóa thành creatinin phosphat, chất này được chuyển hóa thành creatinin Sự tạo thành creatinin phụ thuộc vào khối lượng cơ (đàn ông nhiều hơn phụ nữ) Creatinin ổn định trong máu, không phụ thuộc vào chế độ ăn và những thay đổi sinh lý khác mà chỉ phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận Creatinin được lọc qua cầu thận

và không được tái hấp thụ tại ống thận Vì vậy nồng độ creatinin máu có tác dụng đánh giá chức năng lọc của cầu thận và theo dõi diễn tiến của chức năng thận [2], [5], [13], [14]

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa creatinin trong cơ thể

Giá trị bình thường [2]:

- Creatinin huyết thanh: Nam: 0,7 – 1,3 mg/dL hay 62 – 115 µmol/L Nữ: 0,5 – 1,0 mg/dL hay 44 – 88 µmol/L

Trẻ em: 0,3 – 1,0 mg/dL hay 26 – 88 µmol/L

Creatinin máu có thể tăng trong các trường hợp suy thận do nguyên nhân trước thận (suy tim mất bù, hẹp động mạch thận, xuất huyết… ) hay nguyên nhân tại thận do tổn thương ống thận (sỏi thận, đa u tủy xương, viêm thận –

bể thận cấp hay mạn tính…) hoặc do tổn thương cầu thận (tăng huyết áp, đái tháo đường, viêm cầu thận…) và nguyên nhân sau thận (sỏi thận, khối u bàng quang…)

Creatinin máu giảm thường do hòa loãng máu, suy dinh dưỡng nặng, một số bệnh gây teo mô cơ hoặc do có thai [2], [5], [13], [14]

1.1.4 Xét nghiệm định lượng Triglycerid

Triglycerid (TG) là ester của glycerol và 3 acid béo cấu tạo thành TG là một dạng mỡ và là nguồn cung cấp năng lượng chính cho cơ thể TG có hai nguồn gốc ngoại sinh (thức ăn) và nội sinh (do gan tổng hợp) TG ngoại sinh được vận chuyển bởi chylomicron và TG nội sinh được vận chuyển trong máu nhờ VLDL

Xét nghiệm TG thường được chỉ định để đánh giá tình trạng cân bằng giữa lượng lipid đưa vào và chuyển hóa lipid trong cơ thể Tăng nồng độ TG máu thường làm tăng nguy cơ xơ vữa động mạch và bệnh tim mạch

Giá trị bình thường [2]:

- Bình thường: < 1,7 mmol/L hay < 150 mg/dL

- Giới hạn bình thường cao: 1,7 – 2,24 mmol/L hay 150 – 199 mg/dL

- Giới hạn cao: 2,25 – 5,63 mmol/L hay 200 – 499 mg/dL

- Rất cao: ≥ 5,64 mmol/L hay ≥ 500 mg/dL

TG tăng nguyên phát trong bệnh tăng lipid huyết gia đình và thứ phát trong ĐTĐ, xơ gan do rượu, viêm tụy, viêm gan, tắc mật, hội chứng thận hư

và xơ vữa động mạch [2], [5], [13], [14]

1.1.5 Xét nghiệm định lượng Cholesterol

Cholesterol huyết tương có 2 nguồn gốc ngoại sinh (thức ăn) và nội sinh (do cơ thể tổng hợp) Cholesterol được tích hợp chủ yếu trong các lipoprotein loại LDL, HDL, VLDL và một số ít dưỡng chấp (chylomicron)

Cholesterol là steroid chính trong cơ thể người Cholesterol được các lipoprotein LDL và HDL vận chuyển trong máu để tham gia vào hai quá trình chuyên biệt Cholesterol tích hợp vào LDL được vận chuyển trong máu từ gan đến mô ngoại biên với nguy cơ tạo nên xơ vữa động mạch Cholesterol tích hợp vào HDL sẽ được vận chuyển từ các mô ngoại biên đến gan để thực hiện quá trình dị hóa cholesterol Khoảng 25 – 40% cholesterol huyết tương ở dạng

tự do, 60 -70% dưới dạng ester hóa Trong xét nghiệm hai dạng này thường được đo chung gọi là cholesterol toàn phần (hình 1.4)

Cholesterol là một chất cần thiết cho hoạt động chức năng màng tế bào

và như một tiền chất của acid mật, progesterone, vitamin D, estrogen, glucocorticoid và các corticosteroid điều hòa chuyển hóa khoáng chất Xét

nghiệm định lượng cholesterol để nghiên cứu các tình trạng rối loạn lipoprotein máu và giúp đánh giá nguy cơ hình thành màng xơ vữa động mạch Ngoài ra xét nghiệm định lượng cholesterol còn dùng để nghiên cứu chức năng gan và hỗ trợ cho chẩn đoán các tình trạng rối loạn chức năng tuyến giáp [2], [5], [13], [14]

Giá trị bình thường [2]:

- Cholesterol toàn phần:

+ < 10 tuổi: 100 – 180 mg/dL hay 2,6 – 4,7 mmol/L

+ 10 – 20 tuổi: 120 – 180 mg/dL hay 3,1 – 4,7 mmol/L

+ > 20 tuổi: 120 – 200 mg/dL hay 3,1 – 5,2 mmol/L

Hình 1.4 Sơ đồ vận chuyển cholesterol trong cơ thể

1.1.6 Xét nghiệm định lượng Acid uric

Acid uric là sản phẩm thoái hóa của các base purin, một thành phần của acid nucleic Acid nucleic khi bị thủy phân thì cho ra các đơn vị cấu tạo AMP, GMP… Các chất này tiếp tục thoái hóa cho acid uric (hình 1.5)

Xét nghiệm định lượng acid uric là một thông số để đánh giá chức năng thận và xơ vữa động mạch Đặc biệt acid uric dùng để chẩn đoán các bệnh lý gây biến đổi nồng độ acid uric, để theo dõi điều trị bệnh Gout và điều trị hóa chất chống ung thư nhằm hạn chế tình trạng lắng đọng cấp urat tại thận với nguy cơ gây suy thận cấp [2], [5], [13], [14]

Giá trị bình thường Acid uric trong máu [2], [5]:

- Nam: 3,6 – 8,5 mg/dL hay 214 – 506 µmol/L

- Nữ: 2,3 – 6,6 mg/dL hay 137 – 393 µmol/L

Hình 1.5 Quá trình hình thành acid uric

1.1.7 Xét nghiệm định lượng GOT (Glutamat Oxaloacetat Transaminase)

Đây là một aminotransferase, còn có tên gọi khác là AST (Aspartate Aminotransferase) có tác dụng xúc tác sự chuyển hóa các acid amin thành acid α-cetonic và ngược lại bằng cách vận chuyển nhóm amin GOT khu trú rộng rãi trong cơ thể, được tìm thấy ở tim, gan, thận và cơ xương GOT được tìm thấy ở bào tương và cả ty thể

Aspartate + α-ceto glutarat AST/GOT Glutamat + Oxalo acetat [13] Hoạt độ enzym GOT trong huyết thanh thường tăng do các yếu tố: hủy

tế bào, tổn thương hoặc rối loạn trong tế bào và tăng sinh tổng hợp enzym thường gặp trong các bệnh lý về gan đặc biệt tăng cao trong viêm gan do rượu, xơ gan và u gan [13] Ngay khi xảy ra tình trạng tổn thương hoặc chết

tế bào chứa enzym GOT thì chất này sẽ được giải phóng vào tuần hoàn Vì vậy enzym GOT còn dùng để chẩn đoán viêm gan cấp Hoạt độ enzym GOT trong máu cũng tăng cao trong nhồi máu cơ tim, tăng từ giờ thứ 6 – 12 giờ sau cơn đau thắt ngực, đạt đỉnh điểm khoảng 36 – 42 giờ [5] Thời gian bán hủy trong máu là 17 giờ

cơ quan khác [2], [5], [13], [14]

1.1.8 Xét nghiệm định lượng GPT (Glutamat Pyruvat Transaminase)

Đây là một aminotransferase, còn có tên gọi khác là ALT (Alanin Aminotransferase) có tác dụng xúc tác sự chuyển hóa các acid amin thành acid α-cetonic và ngược lại bằng cách vận chuyển nhóm amin GPT khu trú rộng rãi trong cơ thể, được tìm thấy ở gan, thận và nhiều ở tim, cơ xương GPT được tìm thấy ở bào tương

Alanin + α-ceto glutarat ALT/GPT

Glutamat + Pyruvat [13]

Trong hầu hết các bệnh gan, hoạt độ GPT luôn tăng cao hơn so với GOT ngoại trừ viêm gan do rượu, xơ gan và u gan Hoạt độ của enzym này tăng khi có sự hoại tử của tế bào gan, có thể tăng cao gấp 100 lần so với giá trị bình thường GPT là enzym đặc hiệu hơn để chẩn đoán bệnh về gan Ngoài ra GPT tăng còn có giá trị để chẩn đoán các bệnh về tim, thận, cơ xương như nhồi máu cơ tim, suy tim mất bù, suy giáp hay viêm tụy… [2], [5]

Giá trị bình thường [2]:

- Nam: < 22 UI/L

- Nữ: < 17 UI/L

1.1.9 Xét nghiệm định lượng GGT (Gamma Glutamyl Transferase)

GGT là enzym giữ vai trò xúc tác sự vận chuyển nhóm δ-glutamyl từ peptid và hợp chất chứa nó đến chất nhận GGT được tìm thấy ở ống lượn gần của thận, gan, tụy và ruột GGT có mặt ở bào tương và màng tế bào GGT

là chất chỉ điểm nhạy đối với các bệnh lý về gan mật [15]

tăng trong các trường hợp viêm gan do rượu và người nghiện rượu [14]

1.2 CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ĐẾN CHẤT LƯỢNG XÉT NGHIỆM

1.2.1 Một số khái niệm liên quan đến chất lượng xét nghiệm

- Chất lượng (Quality) là tập hợp các đặc tính vốn có của sản phẩm đáp ứng các yêu cầu của khách hàng [4], [8], [9]

- Quản lý chất lượng (Quality Management – QM) là một loạt các hoạt động có phối hợp để định hướng và kiểm soát một tổ chức về chất lượng bao gồm: chính sách chất lượng, mục tiêu chất lượng, hoạch định chất lượng, kiểm soát chất lượng, đảm bảo chất lượng và cải tiến chất lượng [4], [9], [10], [15]

- Hệ thống quản lý chất lượng (Quality Management System – QMS) là các hoạt động phối hợp để chỉ đạo và kiểm soát một tổ chức về phương diện chất lượng Hệ thống quản lý chất lượng bao gồm 12 yếu tố thiết yếu, mỗi yếu

tố là một mắt xích quan trọng của hệ thống [9], [15], [25], [27], [28], [29], (hình 1.6)

2

12 yếu tố thiết yếu của hệ thống chất lượng

Cải tiến liên tục

Tài liệu và

hồ sơ

Mua hàng – kiểm kê

Bị

Quản lý thông tin Quản lý qui

trình

QL sự kiện không mong muốn.

Đánh giá

Lấy khách hàng làm trung tâm

Cơ sở vật chất và an toàn

Tổ chức

Hình 1.6 Các thành tố của hệ thống quản lý chất lượng

- Đảm bảo chất lượng xét nghiệm hay còn gọi là QA (Quality Assurance) là toàn bộ các hoạt động có kế hoạch, có hệ thống đảm bảo cho

các yêu cầu cung cấp chất lượng đảm bảo đủ độ tin cậy QA là một vấn đề khá rộng liên quan đến sự ảnh hưởng chất lượng của một sản phẩm hay dịch

vụ Đảm bảo chất lượng xét nghiệm liên quan đến nhiều yếu tố của phòng xét nghiệm như: chính sách, kế hoạch tổ chức, các quy trình thao tác chuẩn, nhân

sự, cơ sở hạ tầng, trang thiết bị, quản lý hồ sơ… [9], [10], [15], [20]

- Kiểm tra chất lượng (QC - Quality Control) là một quá trình thiết lập các yêu cầu về kỹ thuật, về quy trình tiến hành… đảm bảo việc tiến hành kỹ thuật xét nghiệm tuân thủ theo đúng tiêu chuẩn đã được đề ra Trong kiểm tra chất lượng xét nghiệm thì nội kiểm tra và ngoại kiểm tra chất lượng là hai công cụ quan trọng nhất [9], [10], [15]

- Nội kiểm tra chất lượng IQC (Internal Quality Control) là một quy trình kiểm tra chất lượng trong nội bộ được chính các nhân viên xét nghiệm thực hiện để theo dõi và giám sát liên tục mọi khía cạnh trong quá trình xét nghiệm, giúp kiểm tra độ tin cậy của xét nghiệm và báo kết quả cho bác sĩ lâm sàng sử dụng IQC là một công cụ đặc biệt để phát hiện và giám sát lỗi ngẫu nhiên hoặc hệ thống bằng cách sử dụng các biểu đồ và các quy tắc kiểm soát chất lượng [16], [27], [28], [29]

- Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm EQA (External Quality Assessment) là một công cụ cơ bản để đánh giá và cải tiến chất lượng phòng xét nghiệm bao gồm việc đánh giá thông qua một cơ quan bên ngoài hay thông qua so sánh liên phòng các phòng xét nghiệm [16], [27], [28], [29]

- So sánh liên phòng là việc tổ chức, thực hiện và đánh giá các thử nghiệm trên cùng một mẫu thử nghiệm hoặc mẫu thử nghiệm tương tự được thực hiện bởi hai hay nhiều phòng thí nghiệm theo các điều kiện xác định

trước [16], [27], [28], [29]

1.2.2 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm

Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm được chia thành 3 giai đoạn: trước, trong và sau xét nghiệm Việc quản lý quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm giúp kiểm soát chất lượng của phòng xét nghiệm, phát hiện điểm không phù hợp và phân tích nguyên nhân gốc rễ, tìm cách khắc phục lỗi và cải tiến liên tục chất lượng [4], [16], (hình 1.7) Mỗi giai đoạn đều có khả năng ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm

1.2.2.1 Giai đoạn trước xét nghiệm

Đây là giai đoạn thường xảy ra lỗi nhất trong quy trình xét nghiệm, chiếm đến 41% [20] Giai đoạn này bao gồm các giai đoạn chuẩn bị cho quá trình xét nghiệm từ khâu thông tin bệnh nhân, điền phiếu biểu mẫu yêu cầu, các giai đoạn thu thập và xử lý mẫu, vận chuyển và tiếp nhận mẫu cho đến khâu quản lý mẫu trước xét nghiệm, chuẩn bị và bảo quản bệnh phẩm Tất cả các quá trình trên đều có thể sai sót gây ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả xét nghiệm (Ví dụ như điền sai tên bệnh nhân dẫn đến trả kết quả sai người, thu thập mẫu không đúng thể tích, lấy mẫu không đúng cách, vận chuyển và bảo quản không đúng có thể làm thay đổi nồng độ các chất trong máu gây ra sai lệch kết quả xét nghiệm cho bệnh nhân…) Vì vậy, việc xây dựng hệ thống quản lý quy trình sẽ kiểm soát được các sai sót trong quá trình nhập thông tin bệnh nhân hay xây dựng được quy trình lấy mẫu, vận chuyển

và bảo quản mẫu bệnh phẩm giúp giảm thiểu sai số trong kết quả xét nghiệm

1.2.2.2 Giai đoạn trong xét nghiệm

Đây là giai đoạn quan trọng nhất và cần lưu ý nhất, mặc dù gây ra lỗi chỉ chiếm 4% quá trình xét nghiệm [20] Trong giai đoạn này sai sót thường xảy

ra do kỹ thuật phân tích và xử lý kết quả, phương pháp đo của máy móc thiết

bị hay do trình độ tay nghề, chuyên môn của nhân viên xét nghiệm Những sai

sót trong quá trình này thường gặp ở các đơn vị không thực hiện kiểm soát chất lượng, không có quy trình chuẩn và không tuân thủ các quy trình kiểm tra, bảo trì, bảo dưỡng và hiệu chuẩn máy móc hàng năm Để đảm bảo chất lượng kết quả xét nghiệm thì phòng xét nghiệm cần xây dựng các quy trình chuẩn và hướng dẫn tất cả các nhân viên thực hiện xét nghiệm tuân thủ theo quy trình Quy trình này phải chuẩn thức, được xác nhận và cập nhật thường xuyên Bên cạnh đó, việc thực hiện nội kiểm tra chất lượng và tham gia ngoại kiểm tra chất lượng, định kỳ hiệu chuẩn trang thiết bị giúp nâng cao tính chính xác, độ tin cậy của kết quả xét nghiệm

1.2.2.3 Giai đoạn sau xét nghiệm

Giai đoạn này thường gây ra sai sót chiếm 55% trong quá trình xét nghiệm [20] Sau khi hoàn thành xét nghiệm, việc đánh giá, ghi nhận kết quả, lưu và trả kết quả, bảo quản hồ sơ và bảo quản mẫu bệnh phẩm là việc rất quan trọng Việc bảo quản hồ sơ và trả kết quả cần nhanh chóng, chính xác, tránh sai sót và nhầm lẫn gây ảnh hưởng đến chất lượng phòng xét nghiệm Tất cả kết quả đều được lưu giữ vào hồ sơ và được kiểm soát chặt chẽ, thuận tiện cho việc tìm kiếm hoặc tra cứu khi có yêu cầu

Hình 1.7 Quy trình hoạt động của phòng xét nghiệm [3]

1.3 NGOẠI KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG (EQA – External Quality Assessment)

Ngoại kiểm tra là một công cụ quan trọng để giám sát chất lượng trong quá trình xét nghiệm EQA giúp đánh giá và giám sát liên tục việc tiến hành xét nghiệm của các phòng xét nghiệm tham gia Xác định những yếu tố nguy

cơ có thể ảnh hưởng đến chất lượng xét nghiệm nhằm đưa ra những giải pháp phòng ngừa EQA giúp so sánh kết quả phân tích giữa các phòng xét nghiệm tham gia và các nhóm phương pháp EQA giúp chứng minh độ tin cậy, độ xác thực của kết quả xét nghiệm đối với lâm sàng Bên cạnh đó EQA còn giúp thẩm định độ không đảm bảo đo của kết quả xét nghiệm [4], [28], [29] Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng thường được tổ chức bởi một đơn vị được giao chức trách ngoại kiểm tra chất lượng, tổ chức này sẽ sản xuất, phân phối mẫu xét nghiệm cho các phòng xét nghiệm thành viên cùng tham gia vào hoạt động ngoại kiểm tra, sau đó thu thập kết quả và tiến hành so sánh, đánh giá kết quả của các thành viên tham gia Kết quả của phòng xét nghiệm nào bị

sai hoặc nằm ở ngưỡng nguy cơ sẽ được đơn vị tổ chức thông báo, tham gia tìm hiểu đánh giá sự không phù hợp, phân tích nguyên nhân gốc rễ để khắc phục và cải tiến lỗi nhằm nâng cao chất lượng [15], [36], [41]

1.3.1 Các phương thức ngoại kiểm tra

Có 3 phương thức được sử dụng trong ngoại kiểm tra chất lượng: Thử nghiệm thành thạo (Proficiency testing – PT), kiểm tra lại/ phân tích lại (Rechecking/Retesting) và đánh giá tại chỗ (On – site evaluation)

Thử nghiệm thành thạo là đơn vị triển khai ngoại kiểm sẽ phân phối mẫu ngoại kiểm cho các phòng xét nghiệm tham gia Các phòng xét nghiệm phân tích mẫu ngoại kiểm và gửi kết quả về đơn vị triển khai để phân tích thống kê, đánh giá kết quả thực hiện Sau đó phòng xét nghiệm nhận bản phân tích kết quả ngoại kiểm tra từ đơn vị triển khai để xem xét và khắc phục sai số

Kiểm tra lại, phân tích lại là phòng xét nghiệm lựa chọn mẫu ngẫu nhiên gửi đến phòng xét nghiệm tham chiếu hoặc đơn vị kiểm chuẩn để phân tích và đánh giá lại các kết quả phân tích mà phòng xét nghiệm đã thực hiện

Đánh giá tại chỗ là đoàn đánh giá được thành lập bởi các cơ quan có thẩm quyền (Bộ Y tế, Sở Y tế…) hoặc tổ chức được công nhận của quốc gia (Văn phòng công nhận chất lượng, Trung tâm kiểm chuẩn Xét nghiệm…) sẽ đến đánh giá phòng xét nghiệm định kỳ hoặc đột xuất Việc đánh giá này căn

cứ vào bảng kiểm, những tiêu chí đã được duyệt Bảng kiểm sẽ khác nhau tùy

thuộc vào từng lĩnh vực xét nghiệm [4], [36], [41]

1.3.2 Tầm quan trọng của việc thực hiện ngoại kiểm tra

Ngoại kiểm tra chất lượng là một công cụ quan trọng giúp giám sát chất lượng xét nghiệm, đánh giá được độ tin cậy về kết quả của phòng xét nghiệm tại thời điểm cụ thể Ngoại kiểm tra giúp phòng xét nghiệm biết được năng lực thực hiện kết quả xét nghiệm có đạt chuẩn và đảm bảo độ chính xác và

xác thực hay không để có thể đưa ra phương án khắc phục xử lý nếu có và tiếp tục nâng cao cải thiện chất lượng chuyên môn cũng như chất lượng hóa chất, phương tiện, trang thiết bị…

Ngoại kiểm tra cung cấp bằng chứng khách quan về năng lực phòng xét nghiệm là cơ sở khoa học để công nhận đạt chuẩn quốc tế của phòng xét nghiệm Chương trình ngoại kiểm tra giúp phòng xét nghiệm, bác sĩ lâm sàng, nhà quản lý… tin tưởng vào kết quả xét nghiệm, giúp bệnh nhân giảm được thời gian và chi phí khám chữa bệnh Ngoại kiểm tra chất lượng giúp đơn vị kiểm chuẩn nắm được thực trạng, tình hình thực hiện xét nghiệm của các phòng xét nghiệm để đưa ra những chính sách, tham vấn hỗ trợ phương án cải thiện nâng cao chất lượng xét nghiệm Để đảm bảo tốt nhất cho chất lượng xét nghiệm thì lãnh đạo phòng xét nghiệm cần xây dựng cơ cấu, thiết lập tổ chức, lập kế hoạch và theo dõi cải tiến quy trình tại phòng xét nghiệm và kết hợp với đơn vị triển khai ngoại kiểm để nâng cao chất lượng chuyên môn cũng như chất lượng thực hành tại phòng xét nghiệm

Ngoại kiểm tra giúp duy trì và nâng cao chất lượng phân tích của các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm Ngoại kiểm tra là một chương trình giúp nâng cao thỏa thuận liên phòng và tiêu chuẩn chất lượng

1.4 MẪU NGOẠI KIỂM

Mẫu ngoại kiểm là mẫu được sử dụng trong các chương trình ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm, thường là mẫu mù với giá trị ấn định được xác định dựa vào sự đồng thuận của các phòng xét nghiệm tham gia

Có 2 loại mẫu là mẫu chuẩn RM (Reference Material) và mẫu chuẩn được chứng nhận CRM (Certified Reference Material) [7], [8], [44], [45] Mẫu chuẩn là vật liệu đủ độ đồng nhất và ổn định về một hoặc nhiều tính chất

quy định, được thiết lập phù hợp với việc sử dụng đã định trong một quá trình

đo [7], [8], [44], [45]

Mẫu chuẩn được chứng nhận là mẫu chuẩn được đặc trưng với một giấy chứng nhận cung cấp giá trị của tính chất quy định, độ không đảm bảo kèm theo và công bố về liên kết chuẩn đo lường [7], [8], [44], [45]

Theo định nghĩa của Cơ quan đo lường hợp pháp quốc tế (OIML): Mẫu chuẩn là một vật liệu hay một chất mà một hay nhiều tính chất của chúng đủ đồng nhất và được tạo nên để chuẩn hóa một dụng cụ, đánh giá một phương pháp đo hoặc để xác định giá trị đối với các vật liệu [10], [44], [45]

1.4.1 Các vật liệu mẫu kiểm chuẩn dùng trong xét nghiệm hóa sinh

Có 3 loại vật liệu có thể được sản xuất làm vật liệu ngoại kiểm dùng trong xét nghiệm hóa sinh bao gồm: huyết thanh tươi, huyết thanh thêm chất

ổn định và huyết thanh đông khô

1.4.1.1 Vật liệu kiểm chuẩn huyết thanh tươi (Frozen QC material)

Huyết thanh tươi là huyết thanh đươc thu thập và xử lý bằng huyết thanh trộn từ nhiều mẫu bệnh nhân hoặc huyết tương được tách ra túi máu hết hạn của ngân hàng máu Huyết thanh chưa thay đổi là huyết thanh đông tự nhiên hay huyết tương được tách ngay từ túi máu toàn phần và lưu trữ tại – 700

C đến - 200C Ưu điểm của huyết thanh tươi là có lượng chất nền tối thiểu và không cần các giai đoạn hoàn nguyên [36], [39], [59]

1.4.1.2 Vật liệu kiểm chuẩn huyết thanh thêm chất ổn định (Stabilized liquid control material)

Chuẩn bị vật liệu kiểm chuẩn huyết thanh thêm chất ổn định bằng cách thêm hóa chất hoặc khử trùng Vật liệu kiểm soát được ổn định bằng chất hóa học có giá cả rẻ, dễ sử dụng và phù hợp trong chương trình nội kiểm tra và

ngoại kiểm tra chất lượng Huyết thanh duy trì độ ổn định tối thiểu 24 ngày ở nhiệt độ 2 – 80C và duy trì được 55 tuần nếu bảo quản ở nhiệt độ - 20 đến

- 150C Vật liệu kiểm chuẩn được ổn định bằng cách khử trùng, thực hiện bằng cách lọc huyết thanh qua bộ lọc thích hợp Huyết thanh sẽ được ổn định

từ 2 – 3 tuần ở nhiệt độ 20 – 250C Huyết thanh được chuẩn bị theo cách này

sẽ có giá thị trường cao hơn [37], [48], [49], [50], [59]

1.4.1.3 Vật liệu kiểm chuẩn đông khô (Lyophilized QC material)

Vật liệu kiểm chuẩn đông khô là huyết thanh được đông khô, thường sử dụng rộng rãi trong quá trình thực hiện nội và đặc biệt là ngoại kiểm tra chất lượng ở các phòng xét nghiệm lâm sàng Huyết thanh đông khô duy trì độ ổn định nhiều năm nếu bảo quản ở - 200

C Kỹ thuật này đòi hỏi có sự hoàn nguyên chính xác và cẩn thận Đây là loại vật liệu hữu ích nhất dùng để làm mẫu ngoại kiểm và là lựa chọn hàng đầu đối với các nhà sản xuất mẫu ngoại kiểm [37], [48], [49], [50], [59]

1.4.2 Các yêu cầu kỹ thuật sản xuất mẫu ngoại kiểm theo ISO 17043

Dựa theo tiêu chuẩn ISO 17043 về chuẩn bị mẫu thử thành thạo, tiến hành sản xuất mẫu ngoại kiểm với các yêu cầu kỹ thuật và tiêu chí để đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm [9], [46] Các yêu cầu về mẫu thử thành thạo

đó là:

- Các mẫu thử thành thạo cần đồng nhất về mặt chất nền, đại lượng đo,

nồng độ với loại mẫu hoặc vật liệu gặp trong thử nghiệm hay hiệu chuẩn thông thường

- Đánh giá tính đồng nhất và độ ổn định theo các thiết kế thống kê thích

hợp Lựa chọn ngẫu nhiên theo thống kê số lượng đại diện các mẫu thử thành thạo từ toàn bộ lô vật liệu thử để đánh giá tính đồng nhất của vật liệu

- Mẫu thử thành thạo phải được chứng tỏ là đủ ổn định để đảm bảo rằng

sẽ không có thay đổi đáng kể nào trong suốt quá trình tiến hành thử nghiệm thành thạo, bao gồm cả điều kiện bảo quản và vận chuyển

Việc đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm luôn cần thiết để thiết lập rằng

độ đồng nhất và ổn định là phù hợp với mục đích

Việc sản xuất mẫu chuẩn là một quá trình công phu và phức tạp, đòi hỏi phải tuân thủ nghiêm ngặt các quy trình và quy định của ISO Guide 31 [44], ISO Guide 34 [43], ISO Guide 35 [45]

1.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm

Tùy vào các yêu cầu của mẫu sẽ có các phương pháp đánh giá chất

lượng mẫu khác nhau Đối với chương trình sản xuất mẫu ngoại kiểm hóa sinh thì hai tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu đó là tính đồng nhất và tính ổn định Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN ISO/IEC 17043:2011 [9] và theo hướng dẫn TCVN 7366 [8] và TCVN 9596 [10], đơn vị sản xuất cần kiểm tra đánh giá độ đồng nhất thông qua việc lấy ngẫu nhiên 10% số lượng mẫu sản xuất trước mỗi lô mẫu chuẩn gửi đến các đơn vị tham gia Bên cạnh đó việc đánh giá độ ổn định cũng là tiêu chí quan trọng cho các bộ mẫu chuẩn Đánh giá tính đồng nhất và tính ổn định theo TCVN 9596 [10] đã đính kèm theo phụ lục F

1.4.3.1 Đánh giá tính đồng nhất

Mỗi chương trình ngoại kiểm khi triển khai việc gửi mẫu cùng lúc đến các phòng xét nghiệm thành viên và thu thập lại kết quả, sau đó so sánh kết quả nên yêu cầu mẫu chuẩn phải đảm bảo tính đồng nhất [9], [42]

Việc đánh giá tính đồng nhất là tiêu chí cần thiết khi tiến hành sản xuất mẫu ngoại kiểm Nhà sản xuất mẫu chuẩn cần tiến hành đánh giá tính đồng nhất của mẫu chuẩn bằng cách phân tích ngẫu nhiên, có hệ thống hoặc phân

lớp ngẫu nhiên một số đại diện của mẫu chuẩn Việc thử nghiệm, hiệu chuẩn dụng cụ, máy móc trang thiết bị, đo lường, lấy mẫu hoặc các hoạt động khác được thực hiện để đánh giá tính đồng nhất phải phù hợp với TCVN ISO/ IEC

17043 [9] Các thủ tục đo được lựa chọn để đo độ lặp lại của mẫu chuẩn Số lượng mẫu cần lấy thêm phụ thuộc chủ yếu vào việc nghiên cứu tính đồng nhất giữa các đơn vị bao gói Số lượng tối thiểu các đơn vị bao gói được lựa chọn ngẫu nhiên là 10 đến 30, nhưng thường không ít hơn 10 Các nghiên cứu

về tính đồng nhất phải được thiết kế và thực hiện theo TCVN 8245 [7], ISO

13528 [42], ISO 17043 [46]

1.4.3.2 Đánh giá tính ổn định

Để đánh giá tính ổn định của mẫu chuẩn thì việc thử nghiệm, hiệu chuẩn,

đo lường, lấy mẫu đều được tiến hành theo TCVN ISO/IEC 17025 và việc đánh giá dữ liệu đo theo TCVN 8245 [8] và TCVN 9596 [10] Độ ổn định phải được đánh giá ngay cả trong điều kiện vận chuyển mẫu từ đơn vị sản xuất đến các phòng thí nghiệm tham gia ngoại kiểm Phải định kỳ đánh giá tính ổn định của mẫu chuẩn sau khi mô tả đặc trưng để xác nhận rằng tất cả các giá trị được duy trì từ khi sản xuất đến khi hết hạn sử dụng

Do vậy để sản xuất được một mẫu ngoại kiểm chuẩn là một quá trình phức tạp và đòi hỏi sự nghiêm ngặt, khắt khe trong từng khâu và phải tuân thủ theo các quy trình, quy định của ISO 31 [44], ISO 35 [45] về sản xuất mẫu

ngoại kiểm

1.5 KỸ THUẬT ĐÔNG KHÔ

1.5.1 Nguyên tắc đông khô

Đông khô là kỹ thuật được áp dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như

y học, nông nghiệp và bảo quản thực phẩm… dùng để bảo quản và lưu giữ mẫu Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang

ở trạng thái lạnh sâu Ở đây mẫu bệnh phẩm sẽ được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được đóng kín để cho môi trường chứa mẫu

là chân không

Nguyên lý của quá trình đông khô là nguyên liệu được đông lạnh đột ngột tại điểm chuyển pha, khiến nước từ thể lỏng sang thể rắn, tiếp tục xử lý chân không thăng hoa thành thể hơi Sau đó ngưng tụ thành nước rồi thải ra ngoài Theo nguyên lý này, sản phẩm được làm đông khô vẫn giữ nguyên hình thái, khi hoàn nguyên bằng nước cất hoặc dung dịch thích hợp thì sản phẩm sẽ trở lại trạng thái ban đầu

Quá trình đông khô trải qua 03 giai đoạn:

Giai đoạn làm lạnh: trong giai đoạn này mẫu bệnh phẩm được làm lạnh

từ nhiệt độ môi trường khoảng 200C giảm xuống nhiệt độ âm 400C đến âm

100C Đồng thời, trong giai đoạn này bình thăng hoa được hút chân không nên

áp suất hơi nước trong bình giảm làm so với trong lòng vật liệu dẫn tới hiện tượng thoát ẩm trong lòng vật liệu Kết thúc giai đoạn này khoảng 10% – 15% nước thoát ra khỏi bệnh phẩm

Giai đoạn thăng hoa: trong giai đoạn này nhờ dòng nhiệt chủ yếu là các bức xạ từ các tấm bức xạ, nước trong vật liệu sấy bắt đầu thăng hoa Độ ẩm của vật liệu sấy giảm rất nhanh, giai đoạn này có tốc độ và nhiệt độ sấy không đổi Cuối giai đoạn này, nhiệt độ vật liệu sấy mới dần tăng từ âm 100C đến âm

400C lên đến 00

C Đến đây quá trình thăng hoa kết thúc

Giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại: trong giai đoạn này áp suất trong bình thăng hoa vẫn duy trì bé hơn áp suất bên ngoài nhờ bơm chân không và mẫu vẫn tiếp tục được gia nhiệt, nước vẫn tiếp tục từ thể rắn sang thể hơi và đi vào

bình thăng hoa, giai đoạn bốc hơi ẩm còn lại chính là quá trình sấy chân không bình thường, kết thúc quá trình đông khô mẫu [12], [54]

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và áp suất hơi đến quá trình đông khô

Yếu tố quan trọng trong hệ thống sấy thăng hoa là năng lượng Năng lượng được cung cấp dưới dạng nhiệt để thăng hoa một gam nước từ thể đông lạnh sang thể khí gấp 10 lần năng lượng cần để đóng băng một gam nước Vì vậy, khi tất cả các điều kiện khác đã phù hợp, nhiệt lượng phải được cung cấp đầy đủ cho sản phẩm để thúc đẩy quá trình loại bỏ hơi nước ra khỏi sản phẩm lạnh đông Cần kiểm soát nhiệt lượng một cách cẩn thận tránh sự thoát nhiều nhiệt hơn so với quá trình làm lạnh bay hơi trong hệ thống có thể làm tăng nhiệt sản phẩm đến mức vượt quá nhiệt độ phá vỡ cấu trúc hoặc nhiệt độ eutecti của sản phẩm Có nhiều cách cung cấp nhiệt đó là cấp nhiệt trực tiếp qua kệ dẫn nhiệt khi sấy khay hay sử dụng nhiệt môi trường bức xạ nhiệt khi sấy với giá chia mẫu [12], [54]

Bảng 1.1 Mối quan hệ giữa áp suất hơi và nhiệt độ

1.5.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp đông khô so với các phương pháp khác

Phương pháp đông khô là một phương pháp hiện nay được ứng dụng khá rộng rãi trong việc bảo quản sinh phẩm trong lĩnh vực y học Phương pháp đông khô thường được sử dụng để sản xuất thuốc hay vắc xin và các hóa chất sinh phẩm dùng trong các trường hợp nội kiểm tra và ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Ưu điểm của phương pháp đông khô đó là dễ dàng trong việc xử lý chất lỏng và vô trùng, tăng độ ổn định ở dạng bột khô,loại bỏ nước mà không làm quá nóng sản phẩm, vì thế ít bị ảnh hưởng đến các thành phần trong sản phẩm Ngoài ra phương pháp đông khô còn dễ hòa tan và hoàn nguyên lại giống sản phẩm ban đầu khi bù lại lượng nước đã mất và vận chuyển dễ dàng không sợ làm đổ dung dịch ra ngoài như các phương pháp khác

Nhược điểm của phương pháp đông khô đó là tốn thời gian xử lý mẫu và chi phí đông khô, máy móc đông khô đắt tiền Ngoài ra việc đông khô mẫu

bắt buộc hoàn nguyên phải cẩn thận, tỉ mỉ và chính xác

1.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH

Đông lạnh là kỹ thuật được áp dụng rộng rãi để bảo quản và lưu giữ mẫu lâu dài trong nhiều lĩnh vực khác nhau như y học, nông nghiệp và bảo quản thực phẩm… Đông lạnh là quá trình bảo quản mẫu bệnh phẩm ở trạng thái nhiệt độ âm sâu từ - 800C đến – 100

C Ở đây mẫu bệnh phẩm sẽ được làm lạnh nhanh và bất hoạt các hoạt động của các enzym, protein, lipid… làm cho các tế bào ngừng hoạt động ở trạng thái đóng băng Trong quá trình này, nước được chuyển đổi trực tiếp từ trạng thái lỏng sang trạng thái tinh thể sau khi tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng

Ưu điểm của phương pháp này là đảm bảo về chất nền tối thiểu của mẫu, không cần hoàn nguyên mẫu Dễ thực hiện và bảo quản mẫu trong thời gian dài

Nhược điểm của phương pháp này đó chính là giá thành cao, đòi hỏi phải có trang thiết bị là tủ đông sâu Ngoài ra, các mẫu được bảo quản bằng phương pháp đông lạnh thường có khó khăn trong vấn đề vận chuyển mẫu đến các vùng sâu vùng xa

1.7 TÌNH HÌNH NGOẠI KIỂM HÓA SINH TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.7.1 Tình hình ngoại kiểm hóa sinh trên thế giới

Các chương trình ngoại kiểm đã bắt đầu từ nhiều thập kỉ trước ở trên thế giới Chúng là công cụ cơ bản để đánh giá chất lượng của phòng xét nghiệm Chương trình ngoại kiểm tra chất lượng được triển khai rộng rãi trên các lĩnh vực: Sinh hóa, huyết học, vi sinh, ký sinh trùng… Đến cả lĩnh vực khó triển khai ngoại kiểm như giải phẫu bệnh cũng đã bắt đầu triển khai vào năm 2017 Chương trình ngoại kiểm hóa sinh là một trong các lĩnh vực bắt đầu triển khai khá sớm vào năm 1969 tại Anh [23] với 650 phòng xét nghiệm tham gia và triển khai 20 – 35 chỉ tiêu Năm 1988 [19], các nước Trung đông đã tiến hành ngoại kiểm tra chất lượng hóa sinh được 7 năm, mẫu ngoại kiểm được phân phối từ nước Anh và có 88 đơn vị tham gia ngoại kiểm Và đến nay thì chương trình ngoại kiểm hóa sinh đã phổ biến khắp các nước trên thế giới và triển khai rộng rãi các chỉ số hóa sinh Các mẫu ngoại kiểm hóa sinh ban đầu chỉ đánh giá chất lượng của 20 – 24 chỉ số hóa sinh [19] đến nay đã lên đến

100 chỉ số Một số đơn vị triển khai ngoại kiểm hóa sinh trên thế giới được biết đến như là Randox (Anh), CLIA (Mỹ), RCPA (Öc) và CMPT (Canada)…