giải trình tự thế hệ mới trong tìm và đánh giá các đột biến của hệ gen ung thƣ u nguyên bào thần kinh

HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT TOÀN VĂN ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐỘT BIẾN CỦA HỆ GEN UNG THƯ U NGUYÊN BÀO THẦN KINH Mã

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐỘT BIẾN CỦA HỆ GEN UNG THƯ U

NGUYÊN BÀO THẦN KINH

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: TS BÙI CHÍ BẢO

Tp Hồ Chí Minh, 11/2017

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TOÀN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC ĐỘT BIẾN CỦA HỆ GEN UNG THƯ U

NGUYÊN BÀO THẦN KINH

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên)

Tp Hồ Chí Minh, 11/2017

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu:

STT Họ và tên Chuyên ngành Cơ quan công tác

Đơn vị phối hợp chính:

-Nơi thực hiện đề tài: Đại học Y Dƣợc TP.HCM

-Nơi cung cấp bệnh phẩm:

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3

A MỞ ĐẦU 3

1.TỔNG QUAN ĐỀ TÀI 3

2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

KẾT LUẬN 29

TÀI LIỆU THAM KHẢO 30

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Thông tin hóa chất dùng cho giải trình tự thế hệ mới 17

Bảng 2 Các chỉ số kiểm soát chất lượng kết quả giải trình thế hệ mới 18

Bảng 3 Các thông số để định lượng và đánh giá chất lượng DNA 20

Bảng 4 Chất lượng DNA đầu vào 23

Bảng 5 Thống kê sơ bộ xuất ra thông tin tổng quan về dữ liệu 25

DANH MỤC BẢNG HÌNH Hình 1 Sự phát triển của các phân nhóm chính của UNBTK 4

Hình 2 Mối tương quan giữa gen và giai đoạn bệnh UNBTK 4

Hình 3 Rudolf Virchow - người đầu tiên mô tả một khối u trong bụng một đứa trẻ như một "u thần kinh đệm" 5

Hình 4 U nguyên bào thần kinh có thể được tìm thấy trong các tuyến thượng thận và các mô thần kinh paraspinal từ cổ xuống xương chậu 6

Hình 5 Phân giai đoạn bệnh u nguyên bào thần kinh 9

Hình 6 Hệ thống máy sử dụng cho phương pháp giải trình tự thế hệ mới 14

Hình 7 Tổng quan quá trình chuẩn bị mẫu và tiến hành thực hiện giải trình tự thế hệ mới 16

Hình 8 Quy trình phân tích kết quả NGS 16

Hình 9 Kiểm tra độ phân mảnh của gDNA trên gel agarose 1%, 100V trong 30 phút 21

Hình 10 Điện di kiểm tra DNA phân mảnh 21

Hình 11 Kết quả kiểm tra chất lượng DNA 22

Hình 12 Đánh giá thư viện các mẫu NB chuẩn bị giải trình tự 23

Hình 13 Biểu đồ đo kết quả phân cắt gDNA 24

Hình 14 Quy trình kiểm tra thư viện 24

Hình 15 Đánh giá chất lượng dữ liệu giải trình tự 27

2

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ Giải nghĩa

SNS Sympathetic nervous system Hệ thần kinh giao cảm

INSS International Neuroblastoma Staging

System

Hệ thống định giai đoạn u nguyên

bào thần kinh quốc tế

NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

A MỞ ĐẦU

1 TỔNG QUAN ĐỀ TÀI

U nguyên bào thần kinh – Neuroblastoma (NB) là một khối u rắn phổ biến nhất ở trẻ em Gần một nửa số trường hợp u nguyên bào thần kinh xảy ra ở trẻ em dưới năm tuổi Nó là một khối u thần kinh nội tiết, phát sinh từ đỉnh thần kinh của hệ thần kinh giao cảm (SNS) Nó thường bắt nguồn từ một trong các tuyến thượng thận, cũng có thể phát triển trong các mô thần kinh ở cổ, ngực, bụng hoặc khung xương chậu

U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là một loại ung thư có nguồn gốc từ các tế bào thuộc mào thần kinh Đây là loại u đặc, nằm ở ngoại vi não, thường xuất phát từ tuyến thượng thận hay

ở hạch thần kinh giao cảm vùng cổ, ngực, bụng và cột sống Bệnh lý thường xảy ra ở trẻ sơ sinh

và trẻ em dưới 15 tuổi Đây là loại u ác tính đặc ngoại vi não phổ biến hàng thứ hai và là dạng u đặc phổ biến nhất ở trẻ nhỏ(2)

Trong trường hợp u nguyên bào thần kinh, các tế bào phát triển từ các tế bào thần kinh trong thời kỳ phôi thai hoặc bào thai Các tế bào non liên tục phân chia và phát triển bất thường, tạo ra khối u Một số khối u chuyển thành lành tính và được coi là u hạch thần kinh

U nguyên bào thần kinh là một trong các khối u ác tính, biểu hiện không đồng nhất và được phân thành 3 loại nguy cơ: thấp, trung bình và cao Bệnh có nguy cơ thấp thường gặp ở trẻ

sơ sinh và có kết quả tốt bằng cách phẫu thuật, trong khi bệnh có nguy cơ cao thì khó để điều trị thành công ngay cả với phương pháp điều trị đa phương thức chuyên sâu nhất

So với hệ gen ung thư người lớn, các biến đổi di truyền đặc trưng của UNBTK khá ít và khu trú cho những gen có vai trò quan trọng trong quyết định yếu tố tiên lượng và điều trị như:

khuếch đại gen MYCN, khuếch đại hay đột biến hoạt hoá chức năng sin ung của ALK, đột biến gây kéo dài đoạn telomere gây ra bởi ATRX (10)

Bên cạnh đó, hiện tại ghi nhận nhiều công trình cho thấy có thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể 1p, 3p, 11q và 17q(7,14)

4 Hình 1 Sự phát triển của các phân nhóm chính của UNBTK

Hình 2 Mối tương quan giữa gen và giai đoạn bệnh UNBTK

Mặt khác, các đột biến làm thay đổi yếu tố thuộc ngoại di truyền cũng được báo cáo như: methyl hóa DNA bởi CASP8, RASSF1A, các trình tự phiên mã không giải mã protein như miRNA (let7a, miR-9, miR-17-92a) và đột biến trong phức hợp tái cấu trúc nhiễm sắc chất SWI/SNF và tiểu đơn vị của nó như BRG1, ARID1A và BRN đóng vai trò quan trọng trong việc trưởng thành của tế bào mào thần kinh(3,11)

Các thông tin về hệ gen của UNBTK kể trên đã chứng minh có vai trò quan trọng trong tiên lượng, điều trị và hướng điều trị đích cho ung thư này(13)

Vào năm 1864, bác sĩ người Đức - Rudolf Virchow là người đầu tiên mô tả một khối u trong bụng một đứa trẻ như một "u thần kinh đệm" Các đặc tính của những khối u của hệ thần kinh giao cảm và tủy thượng thận sau đó đã được ghi nhận vào năm 1891 bởi nhà nghiên cứu bệnh người Đức - Felix Marchand Vào năm 1901, William Pepper đã mô tả đặc tính của giai đoạn 4S ở trẻ sơ sinh (ở gan, không có di căn xương) Năm 1910, James Homer Wright hiểu rõ được các khối u có nguồn gốc từ các tế bào thần kinh nguyên thủy và đặt tên nó là u nguyên bào thần kinh Ông cũng lưu ý các khối tròn của các tế bào trong các mẫu tủy xương mà bây giờ được gọi là "pseudorosettes Homer Wright"(1)

Hình 3 Rudolf Virchow - người đầu tiên mô tả một khối u trong bụng

một đứa trẻ như một "u thần kinh đệm"

6

Các triệu chứng đầu tiên của u nguyên bào thần kinh thường mơ hồ, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán Ví dụ như mệt mỏi, chán ăn và đau nhức trong các khớp xương Những triệu chứng khác phụ thuộc vào vị trí u nguyên bào thần kinh bắt đầu phát triển(4,5):

 Nếu như khối u trong vùng bụng, bụng có thể bị sưng phồng lên và bệnh nhân có thể có biểu hiện táo bón hoặc khó đi tiểu Đôi khi huyết áp cao

 Nếu như khối u ảnh hưởng đến vùng ngực, có thể bị khó thở hoặc khó nuốt

 Nếu khối u xuất hiện ở cổ thì có thể nhìn thấy được như là một cục u, cũng ảnh hưởng đến việc thở và nuốt

 Đôi khi thấy chân mình yếu và đi không vững nếu như khối u đè ép lên tủy sống

 Nếu khối u trong xương quanh mắt, có thể gây bầm tím và sưng

 Nếu khối u xâm nhập tủy xương có thể gây xanh xao do thiếu máu

U nguyên bào thần kinh thường lan truyền đến các bộ phận khác của cơ thể trước khi có triệu chứng rõ ràng và khoảng 50 – 60% trường hợp di căn Các vị trí phổ biến nhất của u nguyên bào thần kinh là trên các tuyến thượng thận Điều này xảy ra ở 40% các khối u khu trú và 60% lan rộng U nguyên bào thần kinh có thể phát triển ở bất cứ đâu trong hệ thống thần kinh giao cảm từ cổ xuống xương chậu Tần suất tại các vị trí khác nhau bao gồm: cổ (1%), ngực (19%), vùng bụng (30% phi tuyến thượng thận) hoặc xung quanh xương chậu (1%)(6)

Tương tự các bệnh ung thư khác, nguyên nhân của u nguyên bào thần kinh không được biết rõ Bệnh này không lây nhiễm và không truyền bệnh sang người khác Phần lớn là các trường hợp đơn lẻ Khoảng 1-2% các trường hợp di truyền trong gia đình và có liên quan đến đột biến gen U nguyên bào thần kinh di truyền trong gia đình thường gặp ở đột biến gen PHOX2A hoặc KIF1B và hiếm gặp ở gen anaplastic lymphoma kinase (ALK) Sự khuếch đại bất thường của gen tiền ung thư MYCN thường gặp trong u nguyên bào thần kinh Mức độ vào khoảng: từ 3 đến 10 lần hoặc từ 100 đến 300 lần Sự hiện diện với mức độ cao này có liên quan chặt chẽ với các giai đoạn của bệnh (13)

U nguyên bào thần kinh cũng có liên quan đến hội chứng mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 Mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 được tìm thấy ở khoảng 35% số ca u nguyên bào thần kinh Các mất đoạn trên nhiễm sắc thể số 1 được tìm thấy nhiều hơn ở các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh giai đoạn sau, và mất đoạn dị hợp tử 1p rất hay kèm với sự khuyếch đại MYCN Ý nghĩa tiên lượng độc lập của mất đoạn dị hợp tử 1p vẫn còn đang được tranh luận, nhưng các bằng chứng hiện nay chỉ ra rằng mất đoạn dị hợp tử ở vị trí 1p36 dự báo cho sự tiến triển của bệnh, chứ không phải là tỷ lệ sống sót tổng cộng của các bệnh nhân u nguyên bào thần kinh

Có một sự liên kết chặt chẽ giữa khuyếch đại MYCN và mất đoạn 1p Đa số các ca có khuyếch đại MYCN thì có mất đoạn 1p, trong khi không phải tất cả các ca mất đoạn 1p đều có khuyếch đại MYCN Điều này gợi ra giả thuyết là mất đoạn 1p có thể xảy ra trước sự khuyếch đại MYCN, có thể vì khi mất đoạn 1p xảy ra, một gen nào đó điều hòa hoạt động sao chép gen MYCN bị mất đi, và kết quả là dẫn đến sự khuếch đại(7)

Một loạt các xét nghiệm có thể tiến hành để chuẩn đoán u nguyên bào thần kinh Các xét nghiệm như chụp X quang, chụp cắt lớp vi tính hoặc chụp cộng hưởng từ (MRI), các xét nghiệm tủy xương và xét nghiệm máu được tiến hành để tìm ra vị trí chính xác của u nguyên bào thần kinh trong cơ thể và để biết liệu khối u có di căn chưa Việc này được tiến hành để xác định giai đoạn bệnh

Trong khoảng 90% các trường hợp u nguyên bào thần kinh có nồng độ catecholamine hoặc chất chuyển hóa của chúng được tìm thấy trong nước tiểu hoặc máu Các chất chuyển hóa của catecholamine bao gồm dopamine, acid vanillyl mandelic (VMA) và acid homovanillic (HVA)

8

Xét nghiệm nước tiểu đặc biệt sẽ được làm Gần như tất cả (9 trong 10) trẻ em với u nguyên bào thần kinh sẽ có những chất được gọi là acid vanillyl mandelic (VMA) hoặc là acid homovanillic (HVA) trong nước tiểu Nồng độ VMA và HVA trong nước tiểu có thể giúp chuẩn đoán bệnh Bệnh nhân sẽ được kiểm tra nồng độ VMA và HVA trong suốt quá trình điều trị Nồng độ của các chất này giảm xuống khi đang tiến hành điều trị Vì những chất hóa học này được sản xuất ra bởi các tế bào ung thư và chúng có thể được sử dụng để đo mức độ hoạt động của khối u

Việc sàng lọc mIBG (meta-iodo-benzyl guanidine) cũng có thể được tiến hành mIBG là một chất bị các tế bào u nguyên bào thần kinh bắt giữ Chất này được dùng bằng đường tiêm Việc gắn một lượng nhỏ chất phóng xạ iodine với mIBG làm cho khối u có thể nhìn thấy được bằng một máy quét chất phong xạ mIBG còn có thể được sử dụng như một biện pháp điều trị

Một mẫu nhỏ các tế bào thường được lấy ra từ khối u trong khi mổ có sự gây mê toàn thân Điều này được gọi là sinh thiết Sau đó, các tế bào này được xét nghiệm dưới kính hiển vi

Các xét nghiệm khác được gọi chung là sinh học của khối u cũng được tiến hành trên các

tế bào này trong phòng thí nghiệm

“Giai đoạn” của một bệnh ung thư là một thuật ngữ được sử dụng để mô tả kích thước của khối u và liệu nó đã lan tràn ra ngoài vị trí ban đầu hay chưa Việc biết được giai đoạn của bệnh giúp các bác sĩ quyết định được cách điều trị tốt nhất cho bệnh nhân

Một hệ thống định giai đoạn thường được sử dụng cho u nguyên bào thần kinh được mô

tả dưới đây Hệ thống định giai đoạn u nguyên bào thần kinh quốc tế (International Neuroblastoma Staging System – INSS) được thành lập vào năm 1986 và được sửa đổi vào năm

1988, xác định giai đoạn theo mặt giải phẫu học:

Hình 5 Phân giai đoạn bệnh u nguyên bào thần kinh

 Giai đoạn 1: Bệnh được giới hạn trong một vùng của cơ thể (khu trú) và không có dấu hiệu của lan tràn bệnh Khối u này có thể được lấy ra toàn bộ bằng phẫu thuật hoặc có thể

có một lượng rất nhỏ của khối u còn lại

 Giai đoạn 2A: Bệnh còn khu trú và vẫn chưa bắt đầu lan tràn, nhưng khối u không thể được lấy ra hoàn toàn bằng phẫu thuật

 Giai đoạn 2B: Bệnh còn khu trú và đã bắt đầu lan tràn vào các hạch bạch huyết gần đó

 Giai đoạn 3: Bệnh đã lan tràn vào các cơ quan và các cấu trúc xung quanh, nhưng vẫn chưa lan tràn đến những vùng xa của cơ thể

 Giai đoạn 4: Bệnh đã lan tràn đến các hạch bạch huyết xa, xương, tủy xương, gan, da hoặc các cơ quan khác

 Giai đoạn 4S: Bệnh còn khu trú (như là trong giai đoạn 1, 2A, hoặc 2B) và đã bắt đầu lan tràn đến gan, da hoặc đến một phạm vi nhất định của tủy xương Giai đoạn này được tìm thấy ở trẻ em dưới 1 tuổi

có thể sẽ được thực hiện

Ở những trẻ em có những khối u còn khu trú, thường là có khả năng được chữa khỏi Tuy nhiên, tùy thuộc vào những kết quả sinh thiết, nếu khối u được xếp loại như là “nguy cơ cao” thì việc điều trị thêm sẽ cần thiết Nếu khối u ban đầu quá to, khó lấy ra được an toàn, việc điều trị hóa chất sẽ được thực hiện để làm cho khối u co nhỏ lại trước khi phẫu thuật

Nếu như khối u đã lan tràn vào lúc chuẩn đoán, hoặc là có dấu hiệu nguy cơ cao dựa trên kết quả sinh học của khối u thì việc điều trị hóa chất mạnh là cần thiết Điều trị hóa chất là sử dụng các thuốc chống ung thư (gây độc tế bào) để tiêu diệt các tế bào ung thư Việc điều trị này thường được áp dụng qua đường tiêm và đường truyền vào tĩnh mạch

Nếu u nguyên bào thần kinh đã lan tràn đến một vài vùng của cơ thể, hoặc là bệnh có nguy cơ cao thì hóa trị liều cao với sự cứu thoát tế bào mầm sẽ được sử dụng (sau các tiến trình hóa trị ban đầu)

Những liều hóa trị cao “làm sạch” tủy xương của cơ thể (nơi mà các tế bào máu được sản sinh) Để đề phòng những vấn đề do việc điều trị này gây ra, các tế bào mầm (các tế bào máu ở thời kỳ phát triển sớm nhất) của bệnh nhi được thu thập lại trước khi việc điều trị hóa chất được tiến hành Ngay sau đó, chúng được làm lạnh và bảo quản Sau khi điều trị hóa chất, các tế bào mầm được truyền trở lại cho bệnh nhi (qua đường truyền nhỏ giọt) Các tế bào mầm tạo thành các tế bào máu thuần thục trong khoảng 14 - 21 ngày

Kháng thể đơn dòng có thể tiêu diệt các tế bào ung thư, khi đó cũng có thể gây một số tổn hại đến các tế bào bình thường Một phương pháp điều trị bằng kháng thể đơn mới gọi là anti – GD2 hiện đang được thử nghiệm đối với u nguyên bào thần kinh nguy cơ cao Trẻ em ở Anh với

u nguyên bào thần kinh nguy cơ cao đang được đang được điều trị với anti – GD2 như là một phần của thử nghiệm lâm sàng Có một thử nghiệm lâm sàng được tiến hành tại Mỹ vào năm

2009, đây có thể là một liệu pháp đầy hứa hẹn khi đưa ra cùng với các phương pháp điều trị khác cho u nguyên bào thần kinh

Nếu u nguyên bào thần kinh đã lan tràn đến một vài phần của cơ thể hoặc là có độ nguy

cơ cao, phương pháp xạ trị bên ngoài có thể được áp dụng Phương pháp này sử dụng các tia năng lượng cao để tiêu diệt các tế bào ung thư, trong khi có gây ra một chút tổn hại có thể có với các tế bào bình thường Xạ trị ngoài được truyền từ một chiếc máy bên ngoài cơ thể

Xạ trị trong đôi khi có thể sử dụng chất mIBG phóng xạ mIBG phóng xạ cũng giống như chất được sử dụng trong nghiên cứu để chuẩn đoán u nguyên bào thần kinh, nhưng sử dụng những liều phóng xạ cao hơn để giết chết các tế bào ung thư

U nguyên bào thần kinh là một loại ung thư bất thường bởi vì trẻ em nhỏ tuổi (dưới 12 tháng tuổi) có thể có những khối u có “nguy cơ thấp” Bệnh giai đoạn 4S có thể tự nó trở nên tốt hơn Đối với những trẻ em rất nhỏ tuổi này, việc điều trị tối thiểu hoặc thậm chí không cần điều trị có thể được đặt ra Bệnh nhi sẽ chỉ cần được theo dõi một cách cẩn thận trong vài năm sau đó Khối u sẽ thường tự biến mất hoàn toàn hoặc là có thể phát triển thành một khối u không phải ung thư (lành tính) được gọi là u hạch thần kinh Các u hạch thần kinh thường là không có hại và

sẽ không gây ra bất cứ vấn đề gì hoặc không cần đến bất cứ loại điều trị nào

Hầu hết trẻ em dưới 12 tháng tuổi có u nguyên bào thần kinh được chữa khỏi

Giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole genome sequencing - WGS) và giải trình tự hệ gen biểu hiện (Whole exome sequencing - WES) là 2 xu hướng chính ứng dụng công nghệ NGS vào giải trình tự ADN WGS/WES cho phép tìm kiếm và xác định các biến dị di truyền SNP, InDel, CNV, SV có trong cá thể, quần thể đối với những loài đã có hệ gen tham chiếu Việc phát hiện các biến dị di truyền giúp phát hiện các biến dị gây ra bệnh di truyền đã biết, từ đó tiến hành sàng lọc ung thư/bệnh di truyền sớm hoặc theo dõi đáp ứng điều trị; cung cấp các biến dị cho nghiên cứu GWAS, chú giải ; đánh giá đa dạng quần thể bằng cách xác định tần số allen Những ưu điểm vượt trội về công suất và giá thành đã khiến WGS trở thành phương pháp thích hợp nhất cho nhiều mục đích nghiên cứu WGS ngày càng được sử dụng nhiều hơn cho các nghiên cứu giải mã như khoa học pháp y, di truyền nông nghiệp và các chẩn đoán lâm sàng (chẩn đoán bệnh di truyền là một ví dụ)

Một trong những ứng dụng lâm sàng quan trọng khác là giải trình tự các chủng gây bệnh và các bệnh truyền nhiễm quan tâm Đối với nhiều ứng dụng, việc giải trình tự toàn bộ hệ gen là không thực tế và không cần thiết Do đó, giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là phương án tiếp cận hợp lý đối với những vùng gen quan tâm, ví dụ Exon chỉ chiếm 2% trong hệ gen người nhưng biến đổi trong đó lại gây nên 85% các căn bệnh đã biết Vì lý do này, WES đã được sử dụng cho nghiên cứu lâm sàng trong những năm gần đây, cho ra nhiều công cụ chẩn đoán hứa

12

hẹn sẽ làm thay đổi đáng kể dịch vụ y tế và chăm sóc sức khỏe Một hướng tiếp cận cao hơn mới phát triển trong thời gian gần đây là giải trình tự các gen quan tâm đã được khuếch đại bằng PCR Phương pháp này phù hợp với các kiểm tra bệnh, tập trung vào một lượng giới hạn các bệnh có liên quan đến các biến thể hoặc ứng dụng trong giải trình tự gen 16S của rARN từ các loài khác nhau Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong hệ thống học và phát sinh chủng loại, cụ thể là giữa các mẫu đa dạng về di truyền Giải trình tự thế hệ mới đã trở thành một công cụ thiết yếu trong phân tích di truyền và hệ gene

Để xác định toàn bộ các biến đổi hệ gen trong UNBTK, phương thức tiếp cận giải trình

tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing -NGS) là cần thiết NGS đã trở thành một công cụ thiết yếu trong phân tích di truyền và hệ gene Không giống như kỹ thuật PCR hay giải trình tự Sanger, NGS có thể phát hiện hầu hết các biến đổi di truyền của hệ gen ung thư đồng thời chỉ 1 phản ứng NGS ngày càng quan trọng đối với lâm sàng và đã đang phát triển rộng trong những năm gần đây nhằm tìm kiếm gen mục tiêu và chỉ thị phân tử cho chẩn đoán tiên lượng bệnh Các nghiên cứu trên ung thư bằng NGS đã cho những bước tiến trong việc đưa ra bảng của nhóm gen ứng cử viên thường xuyên đột biến và hướng điều trị đích cho những nhóm gen này(12)

Để thực thi các kết quả NGS, các nhà khoa học thực nghiệm phải sử dụng các kỹ năng tin sinh học phân tích khối lượng dữ liệu khổng lồ của hệ gen, để tìm ra những gen ứng cử viên đích cho hướng điều trị mới Vì thế nó đặt ra một thách thức trong việc thao tác chương trình lưu trữ

và phân tích dữ liệu, và cần hệ thống máy và nhóm làm việc chuyên các thuật toán phân tích hiệu quả(1) Trong phạm vi nghiên cứu của nhóm, chúng tôi đã có các ngân hàng mẫu UNBTK thu nhận được từ 2012 – 2016 Từ ngân hàng mô ung thư, chúng tôi chọn ra những mẫu để thử nghiệm chạy NGS để chuẩn hoá kĩ thuật từ khâu định lượng mẫu đến khâu phân tích sai số, phân tích ban đầu bằng tin sinh học(12)

Giải trình tự thế hệ mới đã trở thành một công cụ thiết yếu trong phân tích di truyền và hệ gene NGS ngày càng quan trọng đối với các nhà khoa học thực nghiệm, để đạt được các kỹ năng tin sinh học để đánh giá và phân tích khối lượng dữ liệu khổng lồ sau giải trình tự Vì thế nó đặt

ra một thách thức trong việc lưu trữ và phân tích dữ liệu, do đó đòi hỏi máy tính phải có cấu hình thật mạnh và các thuật toán phân tích hiệu quả Điều này gây khó khăn cho các nhà sinh học không chỉ trong phân tích các dữ liệu quan trọng với kết quả NGS mà còn ở khía cạnh hợp tác và khả năng lặp lại(1) Một trong những bước đầu tiên của quy trình phân tích dữ liệu kết quả NGS

đó là việc chuẩn bị và kiểm tra chất lượng dữ liệu

Những bước này thường được thực hiện như sau: (i) bắt cặp trình tự đầu ra, (ii) tính toán; (iii) xem thống kê tóm tắt về điểm chất lượng và phân bố các nucleotide (iv) loại bỏ trình tự được đọc không tốt nếu cầu thiết (v) lọc các trình tự dựa vào điểm chất lượng và nhiều thao tác khác Khác hẳn các công cụ phân tích dữ liệu NGS hiện nay, Galaxy là một dự án mã nguồn mở, dựa trên nền tảng web để người dùng không có kiến thức lập trình cũng có thể tiếp cận và tiến hành tính toán cũng như phân tích y sinh học(1,5)

.Galaxy giúp cho quá trình phân tích sinh học dễ dàng hơn cho người sử dụng bằng cách tương tác với các công cụ và quy trình có sẵn các thông

số với giao diện chỉ cần nhấn di chuyển chuột (point-and-click) Mỗi bước thực hiện và tính toán cũng như chỉnh sửa của người dung đều được hệ thống ghi chép một cách tự động để bất cứ người sử dụng nào khác đều có thể lặp lại và hiểu một cách tường minh, người dùng cũng có thể chia sẻ và công bố quy trình riêng của mình với nhiều người khác thông qua giao thức web một cách đầy đủ Các công cụ của Galaxy đều là miễn phí, truy cập tại http://usegalaxy.org Ngoài ra, cũng có sẵn phiên bản để cài đặt trên máy tính cá nhân tại http://getgalaxy.org (chỉ tối ưu khi máy tính cài đặt hệ điều hành Ubuntu hoặc MAC) hoặc sử dụng với giao diện đám mây thì truy cập vào http://usegalaxy.org/cloudlaunch Khi các công cụ có sẵn trên hệ thống không có sẵn với yêu cầu của người dùng, có thể tìm kiếm và cài đặt từ cửa hàng ứng dụng của Galaxy với tên gọi

là ToolShed, có sẵn tại http://usegalaxy.org/toolshed(5,12)

2 ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Yêu cầu về máy tính và phân tích dữ liệu NGS

Chỉ cần máy tính người dùng có một trình duyệt web hiện đại (hỗ trợ JavaScript và HTML5) là đủ để sử dụng và tương tác với Galaxy Hiện nay, hầu hết các trình duyệt web đều được hỗ trợ, chẳng hạn như Firefox, Chrome, Safari , nhưng phải chắc rằng plug-in của JavaScript đã được bật lên Truy cập Internet và đăng ký tài khoản người dùng để sử dụng máy chủ Galaxy (http://usegalaxy.org) hoặc cài đặt Galaxy hay sử dụng Galaxy cloud nếu cần thiết

Dữ liệu NGS cần phân tích ở định dạng FASTQ