đánh giá tác động kháng candida albicans của bài thuốc dị hoàng thang gia giảm trên in vitro

HỒ CHÍ MINH ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS CỦA BÀI THUỐC DỊ HOÀNG THANG GIA GIẢM TRÊN IN VITRO Chủ nhiệm đề tài ThS.. HỒ CHÍ MINH ĐỀ TÀI

1

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS CỦA BÀI THUỐC DỊ HOÀNG THANG GIA GIẢM TRÊN IN VITRO

Chủ nhiệm đề tài

ThS DS LÊ THỊ LAN PHƯƠNG ThS PHAN THỊ MỸ LINH

Cơ quan chủ quản

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

TP HỒ CHÍ MINH THÁNG 03 NĂM 2018

ii

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS CỦA BÀI THUỐC DỊ HOÀNG THANG GIA GIẢM TRÊN IN VITRO

Chủ nhiệm đề tài

ThS DS LÊ THỊ LAN PHƯƠNG ThS PHAN THỊ MỸ LINH

TP HỒ CHÍ MINH THÁNG 03 NĂM 2018

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ vii

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh nhiễm nấm Candida 3

1.1.1 Sơ lược về nấm Candida 3

1.1.2 Bệnh nhiễm nấm Candida âm đạo 3

1.1.3 Điều trị 4

1.2 Chứng đới hạ theo y học cổ truyền 4

1.3 Bài thuốc Dị hoàng thang 5

1.3.1 Cơ sở lý luận của bài thuốc 5

1.3.2 Các dược liệu trong bài thuốc 5

1.3.3 Các công trình nghiên cứu liên quan 7

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.1 Vật liệu 8

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 8

2.1.2 Hóa chất 8

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 9

2.2 Phương pháp nghiên cứu 9

2.2.1 Chiết xuất cao bài thuốc Dị hoàng thang 9

2.2.3 Khảo sát một số tiêu chuẩn của cao chiết Dị hoàng thang 11

2.2.4 Đánh giá tác động kháng C albicans in vitro 11

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 14

CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ 15

3.1 Đánh giá phương pháp thử nghiệm kháng C albicans in vitro bằng khoanh giấy khuếch tán 15

iv

3.3 Chiết xuất cao bài thuốc Dị hoàng thang 17

3.5 Khảo sát một số tiêu chuẩn của cao chiết Dị hoàng thang 18

3.5.1 Hình thức cảm quan 18

3.5.2 Độ ẩm 18

3.5.3 Độ tro toàn phần 18

3.6 Khảo sát tác động kháng Candida albicans in vitro 19

3.6.1 Khảo sát hoạt tính kháng C albicans 19

3.6.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu sự phát triển C albicans (MIC) 22

3.6.3 Bàn luận 23

CHƯƠNG 4- KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 24

4.1 Kết luận 24

4.2 Kiến nghị 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

PHỤ LỤC 27

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C albicans Candida albicans

DĐVN Dược điển Việt Nam

DHT Dị hoàng thang

DHT (6) Bài thuốc Dị hoàng thang chứa 6g Hoàng bá

DHT (8) Bài thuốc Dị hoàng thang chứa 8g Hoàng bá

DHT (10) Bài thuốc Dị hoàng thang chứa 10g Hoàng bá

DHT (12) Bài thuốc Dị hoàng thang chứa 12g Hoàng bá

Flu Fluconazole

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3 1 Đường kính vòng kháng C albicans của Fluconazole 15

Bảng 3 2 Đường kính vòng kháng C albicans của của các vị thuốc thành phần bài thuốc Dị hoàng thang 16

Bảng 3 3 Hiệu suất chiết cao các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm 17

Bảng 3 4 Độ ẩm các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm 18

Bảng 3 5 Độ tro toàn phần các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm 18

Bảng 3 6 Đường kính vòng kháng C albicans của các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm 20

Bảng 3 7 Số lượng khúm nấm C albicans trên đĩa thạch 22

Bảng 4.1 Tóm tắt kết quả nghiên cứu 24

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Chồi nấm và sợi giả của C albicans khi nhuộc Gram dưới kính hiển vi 3

Hình 2 1 Các dược liệu trong bài thuốc Dị hoàng thang 8

Hình 2 2 Các dược liệu trong bài thuốc Dị hoàng thang sau sơ chế 9

Hình 2 3 Sơ đồ tổng quát quy trình chiết cao Dị hoàng thang 10

Hình 2 4 So sánh huyền dịch vi nấm với ống McFarland 0.5 12

Hình 2 5 Lấy và láng huyền dịch vi nấm lên đĩa thạch 12

Hình 2 6 Xác định và đo vòng kháng nấm 13

Hình 3 1 Tác động kháng C albicans bằng khoanh giấy khuếch tán của Fluconazole 15

Hình 3 2 Hoạt tính kháng C albicans của các vị thuốc thành phần bài thuốc Dị hoàng thang 16

Hình 3 3 Cao chiết nước các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm 18

Hình 3 4 Hoạt tính kháng C albicans của các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm 19

Biểu đồ 3 1 Hoạt tính kháng C albicans của các cao chiết bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm 21

viii

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Đánh giá tác động kháng Candida albicans của bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm trên in vitro

- Mã số:

- Chủ nhiệm đề tài:

a) ThS DS Lê Thị Lan Phương

Điện thoại: 0907748591 Email: ltlphuong@ump.edu.vn b) ThS Phan Thị Mỹ Linh

Điện thoại: 0931101250 Email: phanlinh173@ump.edu.vn

- Đơn vị quản lý về chuyên môn: Khoa Y học Cổ Truyền – Phòng Thí nghiệm Y Dược Cổ Truyền

- Thời gian thực hiện: Từ 05/2017 đến 05/2018

2 Mục tiêu:

Đánh giá tác động kháng nấm Candida albicans trên in vitro của cao chiết nước

bài thuốc Dị hoàng thang khi gia giảm

3 Nội dung chính:

• Chiết xuất cao nước các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm

• Khảo sát một số tiêu chuẩn của các cao chiết nước bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm

• Khảo sát tác động kháng C albicans của các cao chiết nước bài thuốc Dị hoàng

thang gia giảm bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán và xác định nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) sự phát triển C albicans

4 Kết quả chính đạt được:

Qua khảo sát sơ bộ khả năng kháng C albicans bằng khoanh giấy khuếch tán các

vị thành phần của bài thuốc Dị hoàng thang: Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bá, Xa tiền

tử, Bạch quả cho kết quả ở cùng một nồng độ khảo sát Hoàng bá là thành phần chính

trong bài thuốc có khả năng kháng C albicans tốt nhất Do đó, tiến hành gia giảm vị

Hoàng bá ở các lượng 6 g, 10 g và 12 g (vị Hoàng bá trong bài thuốc gốc ở nghiên cứu trước là 8 g)

Nghiên cứu cho thấy tác động kháng nấm C albicans trên in vitro của cao chiết

nước các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm DHT (6), DHT (8), DHT (10) và DHT (12)

tỷ lệ thuận với lượng Hoàng bá khi gia giảm Do đó, để tăng hiệu quả kháng nấm

C.albicans của bài thuốc Dị hoàng thang có thể gia thêm lượng vị Hoàng bá trong bài

thuốc lên 10 g, 12 g

Hiện nay, bệnh nhiễm các loài nấm Candida rất phổ biến trong cộng đồng, ngày

càng khó khăn hơn để chữa trị và ảnh hưởng rất nhiều đến đời sống của người bệnh Với kết quả nghiên cứu tiền đề trước đó và nghiên cứu này của nhóm cho thấy bài thuốc Dị

hoàng thang có nguồn gốc từ tự nhiên là một lựa chọn sử dụng để kháng Candida albicans

của phụ nữ là nơi dễ dàng bị nấm Candida ký sinh tại chỗ, phát triển và gây bệnh nhất

[14] Có đến 75% phụ nữ bị nấm âm đạo ít nhất một lần trong đời và một trong ba tác

nhân chính gây viêm nhiễm âm đạo là do C albicans [2]

Hiện tại để điều trị viêm âm đạo do nấm Candida gây ra có thể dùng kháng sinh

theo đường uống hoặc đặt âm đạo hoặc kem bôi ngoài [1] Tuy nhiên sự viêm nhiễm do Candida thường tái đi tái lại nhiều lần thậm chí có những phụ nữ bị nhiễm nấm suốt đời dẫn đến người bệnh phải sử dụng thuốc lâu ngày có thể làm ảnh hưởng đến đời sống sinh hoạt thường trực của người bệnh và có nhiều tác dụng phụ không mong muốn do

vô tình tiêu diệt các vi sinh vật có lợi hoặc có thể dẫn đến tình trạng kháng thuốc khiến cho việc chữa trị ngày càng khó khăn hơn Do đó, ngày càng có nhiều người tìm đến nguồn thuốc y học cổ truyền, các dược liệu có nguồn gốc tự nhiên để điều trị bệnh

Trong y học cổ truyền, không có khái niệm tương đồng về bệnh viêm âm đạo do

nhiễm nấm Candida mà có chứng Đới hạ Tùy vào các thể bệnh trên lâm sàng mà các

các bài thuốc điều trị thích hợp Trong đó, Dị hoàng thang là một bài thuốc cổ phương, theo y học cổ truyền bài thuốc này trên lâm sàng phép chữa là giúp bổ chỗ hư yếu của nhâm mạch, trừ thấp, thanh thận hoả, do đó bài thuốc dùng chữa chứng hoàng đới và các chứng đới khác thuộc đới hạ [8] Bài thuốc gồm có Hoàng bá, Xa tiền tử, Khiếm thực, Hoài Sơn và Bạch quả Trong đó, Hoàng bá được cho là quy vào hạ tiêu, thanh thấp nhiệt, chữa các bệnh liên quan đến các bộ phận bên dưới như bàng quang, tiết niệu, đường sinh dục, Xa tiền tử có tác dụng ức chế đối với một số vi trùng bệnh ngoài da, Khiếm thực, Bạch quả, Hoài sơn dùng chữa chứng đới hạ [4]

Nhằm góp phần tìm kiếm một bài thuốc y học cổ truyền có nguồn gốc từ những

thảo dược trong tự nhiên có tác dụng kháng Candida albicans chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu và chứng minh được cao chiết nước bài thuốc Dị hoàng thang có tác dụng

kháng C albicans ở nồng độ 1000 mg/mL và 2000 mg/mL, giá trị MIC là 1000 mg/mL

[6] Như vậy cao chiết nước Dị hoàng thang ban đầu cho thấy có tác dụng kháng nấm

C albicans, tuy nhiên nồng độ cao chiết để có tác dụng kháng nấm là khá cao (từ 1000

mg/mL trở lên) Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu

quả kháng C albicans của bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm trên in vitro nhằm đưa ra

khuyến cáo về liều lượng các vị sử dụng trong bài thuốc khi muốn làm tăng tác dụng

điều trị bệnh nhiễm nấm do C albicans

Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát tác động kháng C albicans của các cao chiết

nước bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán và

xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sự phát triển C albicans.

3

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 1.1 Bệnh nhiễm nấm Candida

1.1.1 Sơ lược về nấm Candida

Candida spp là loại nấm hoại sinh ở da và niêm mạc thuộc họ nấm men, hình

tròn hay hình xoan Nhuộm Gram có thể thấy cả sợi nấm là một đoạn thẳng đầu cuối tròn, kích thước 3-5 µm (Hình 1.1) [15]

Hình 1.1 Chồi nấm và sợi giả của Candida albicans khi nhuộc Gram dưới kính hiển

vi [13]

Candida có gần 80 loài, là vi sinh vật thường trú bình thường của gần 25% phụ

nữ, Candida thường hoại sinh trên lớp niêm mạc âm đạo, ở người bình thường khỏe mạnh người ta tìm thấy vi nấm Candida trong âm đạo ở 39% người được thử Tần suất của Candida trong trực tràng gấp 3 đến 4 lần so với trong miệng và gấp 2 lần so với

trong âm đạo [13]

Trong một số điều kiện nhất định, vi nấm Candida chuyển từ trạng thái hoại sinh

sang trạng thái ký sinh gây bệnh, đặc trưng của trạng thái ký sinh là số lượng vi nấm tăng lên rất nhiều, có sự thành lập các sợi nấm giả cho phép vi nấm len lỏi giữa các tế bài ký chủ và xâm nhập sâu hơn [13]

1.1.2 Bệnh nhiễm nấm Candida âm đạo

Niêm mạc âm hộ, âm đạo phụ nữ là nơi nấm Candida dễ ký sinh và gây bệnh

nhất Có đến 75% phụ nữ trên thế giới trải qua ít nhất một lần viêm âm đạo do vi nấm trong đời và 5-8% trong số này bị tái phát 4 lần trong một năm [2,13,15]

Chủng nấm gây bệnh chủ yếu là Candida albicans chiếm tới 85-90% Bệnh

không gây tử vong nhưng nếu không được điều trị, lần dần có thể dẫn tới viêm nhiễm đường sinh dục, gây vô sinh và tạo điều kiện cho bệnh ung thư cổ tủ cung phát triển [2]

1.1.3 Điều trị

Điều trị chính đối với viêm âm đạo do nấm Candida là dùng đường tại chỗ một

trong các loại Imidazoles tổng hợp như miconazole, clotrimazole, butoconazole, tioconazole và terconazole dạng cream hoặc dạng viên đặt âm đạo [2]

Trên bệnh nhân viêm âm hộ âm đạo không phức tạp, thuốc kháng nấm tại chỗ được dùng từ 1 đến 3 ngày, hoặc fluconazole uống một liều duy nhất Bệnh nhân viêm

âm đạo phức tạp, azole tại chỗ được khuyến cáo dùng từ 7 đến 14 ngày Nếu dùng đường uống, liều thứ hai của fluconazole (150 mg) sau 72 giờ khi sử dụng liều đầu tiên được khuyến cáo Để điều trị viêm âm đạo có biến chứng (hay tái phát, triệu chứng nặng) thì yêu cầu thời gian điều trị dài hơn: 7 đến 14 ngày cho thuốc tại chỗ hoặc ba liều fluconazole đường uống cách nhau mỗi 3 ngày (ví dụ, ngày 1, 4, 7) được lựa chọn Sau khi khởi đầu điều trị, duy trì điều trị sẽ giúp ngăn ngừa tái phát triệu chứng Fluconazole uống (như 100-, 150-, hoặc 200 mg) mỗi tuần trong 6 tháng là điều trị hàng đầu [2,13]

1.2 Chứng đới hạ theo y học cổ truyền

Trong Y Học Cổ Truyền không có khái niệm tương đồng về bệnh viêm âm đạo

do nhiễm nấm Candida mà có chứng đới hạ

Theo quan điểm Y Học Cổ Truyền, Đới hạ được hiểu theo hai nghĩa [12]:

• Theo nghĩa rộng (Nội kinh): Đới hạ là bệnh phát sinh ở phần dưới lưng quần, bao gồm tất cả các bệnh thuộc kinh đới, thai sản

• Theo nghĩa hẹp: Đới hạ dùng để chỉ một chất dịch dẻo, nhớt, chảy từ trong âm đạo ra liên miên không dứt, thường hay gọi là khí hư hay huyết trắng (Bạch đới)

Chứng đới hạ là các chứng thuộc thấp Nếu thận khí bất túc, tỳ vận hoá kém hoặc nhâm mạch hư yếu, đới mạch bất cố gây khí hư ra nhiều, sắc màu có tính chất thay đổi gọi là bệnh đới hạ Tùy vào màu sắc dịch chiết chảy xuống mà chia thành bạch đới, xích đới, hoàng đới, hắc đới, thanh đới [12]

Có 3 nguyên nhân chính gây bệnh đới hạ [12]:

Nội nhân

• Do tỳ hư thấp đình trệ

• Do can khí uất, nhiệt theo kinh can dồn xuống xung – nhâm

• Do thận hư, xung – nhâm thương tổn gây nên đới hạ

Ngoại nhân

5

• Do phong hàn thấp nhiệt nhân lúc bào cung hư yếu xâm nhập vào gây nên bệnh đới hạ

• Bất nội ngoại nhân:

• Do chửa đẻ, phòng dục quá độ, nạo sảy nhiều lần

• Do ăn uống no say quá mà giao hợp, hoặc dùng nhiều chất cao lương mỹ vị hoặc uống dạng thuốc khô táo lâu ngày tổn thương tới âm huyết làm dương khí bị nén xuống cũng tạo thành chứng đới hạ

Trên lâm sàng có các thể: Thể do tỳ hư, thể do can khí uất, thể do thận hư, thể do thấp nhiệt Tùy vào các thể mà có các biểu hiện lâm sàng khác nhau và các bài thuốc Y học Cổ truyền để điều trị khác nhau

1.3 Bài thuốc Dị hoàng thang

1.3.1 Cơ sở lý luận của bài thuốc

Đây là bài thuốc có thể đặc trị tất cả các chứng thuộc đới hạ [12]

Thành phần: Bài thuốc gồm 5 vị:

Hoài sơn 40g Khiếm thực 40g Hoàng bá 8g

Xa tiền tử 4g Bạch quả 10 trái

Trong đó Hoài sơn và Khiếm thực giúp bổ chỗ hư yếu của Nhâm mạch, lợi thủy trừ được thấp Bạch quả dẫn thuốc vào mạch Nhâm khiến công hiệu của bài thuốc thêm nhanh chóng Hoàng bá mát cho tạng Thận để dẹp hư hỏa [12]

1.3.2 Các dược liệu trong bài thuốc

Hoài sơn (Dioscoreae persimilis) [5]

Vị thuốc là rễ củ đã chế biến, phơi hay sấy khô của cây Hoài sơn, họ Củ nâu

Thành phần hóa học

Hoài sơn chứa tinh bột 63,25%, protid 6,75% và glucid 0,45% Còn có mucin là một protein nhớt, và một số chất khác như allantoin, cholin, arginin, men maltose, saponin có nhân sterol Gần đây phát hiện thêm một số giống dioscorea chất saponin có nhân sterol

Công dụng

• Chất muxin hòa tan trong nước trong điều kiện acid và nhiệt độ thích hợp sẽ phân giải thành chất protid và hydrat cacbon có tính chất bổ

• Ở nhiệt độ 45-55oC khả năng thủy phân chất đường của men trong hoài sơn rất cao, trong acid loãng trong 3 giờ có thể tiêu hóa 5 lần lượng đường

• Ngoài giá trị dinh dưỡng, thuốc có giá trị giúp tiêu hóa thức ăn chất bột

Khiếm thực (Semen Euryales) [5]

Vị thuốc là hạt phơi của cây khiếm thực

Hoàng bá (Cortex Phellodendri amurensis) [5]

Vị thuốc là vỏ thân cạo sạch vỏ ngoài của cây hoàng bá

Thành phần hóa học

Trong hoàng bá có chứa 1,6% Berberine và một ít panmatin, ngoài ra còn những chất có tinh thể và obakulacton, chất béo, hợp chất sterolic

Công dụng

Nhiều thí nghiệm chứn gminh tác dụng kháng sinh của hoàng bá có thể ức chế

các vi trùng Staphyllococcus, lỵ, thổ tả, Salmonella, ngoài ra còn dùng chữa hoàng đản,

trĩ hậu môn, phụ nữ bị xích bạch đới

Xa tiền tử (Semen Plantaginis) [5]

Vị thuốc là hạt phơi hay sấy khô của cây mã đề

Bạch quả (Ginkgo biloga L.) [5]

Vị thuốc là quả của cây bạch quả

Thành phần hóa học

7

Nhân chứa 5,3% protein, 1,5% chất béo, 68% tinh bột, 1,57% tro và 6% đường

Vỏ quả chứ aginkgolic acid, bilobol và ginnol

Công dụng

Bạch quả có tác dụng tiêu đờm, ích phổi, trừ được hen, khỏi chứng hư tiểu tiện, hết được chứng khí hư, bạch đới

1.3.3 Các công trình nghiên cứu liên quan

Theo tài liệu Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của GS TS Đỗ Tất Lợi, Hoàng bá được cho là quy vào hạ tiêu, thanh thấp nhiệt, chữa các bệnh liên quan đến các bộ phận bên dưới như bàng quang, tiết niệu, đường sinh dục Ngoài ra các vị khác như Xa tiền tử có tác dụng ức chế đối với một số vi trùng bệnh ngoài da, Khiếm thực, Bạch quả, Hoài sơn dùng chữa chứng đới hạ [12]

Hoàng bá ở nồng độ 400 µg/ khoanh giấy ức chế đáng kể các chủng nấm Candida như C albicans, C glabrata, C krusei, C parapsilosis, nghiên cứu này cũng cho thấy

các thành phần hoạt động kháng nấm chủ yếu là Berberin và Palmatin, nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) bởi Berberin đối với C albicans là 125-250 mg/L, C krusei là 4 mg/L,

C parapsilosis >500 mg/L, bởi Palmatine đối với C parapsilosis là 15,6 mg/L [9]

Các chủng nấm Cadnida như C albicans, C stealoidea, C kruesie cũng nhạy

cảm với cao chiết methanol từ hạt Khiếm thực cụ thể ở 200 μL/ khoanh giấy với vùng kháng khuẩn từ 7-8 mm, ở 400μL/ khoanh giấy có vùng kháng nấm từ 9-18 mm [1] Nhóm các nhà nghiên cứu Hàn Quốc đã cho thấy chiết xuất nước từ Xa tiền tử 10

mg/ khoanh giấy cho thấy tác dụng ức chế nhẹ C albicans, C tropicalis và G vaginalis

với vùng kháng nấm từ 7-16 mm [7]

Trong nghiên cứu tiền đề trước đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu “Đánh giá

tác động kháng Candida albicans của cao chiết Dị Hoàng thang trên in vitro” tại Phòng

thí nghiệm Y Dược Cổ truyền – Khoa Y học Cổ truyền và kết quả cho thấy cao chiết nước bài thuốc Dị Hoàng thang ở nồng độ 2000 mg/mL và 1000 mg/mL cho vòng kháng

C albicans lần lượt 12,67 mm và 8,83 mm Nồng độ 1000 mg cao chiết nước/mL ức chế tối thiểu sự phát triển của C albicans sau 24-48 giờ nuôi cấy [11].

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các dược liệu trong bài thuốc Dị hoàng thang: Hoài sơn, Khiếm thực, Hoàng bá,

Xa tiền tử, Bạch quả được mua tại nhà thuốc Viện Y Dược học Dân tộc TP Hồ Chí Minh đạt tiêu chuẩn cơ sở Tất cả các dược liệu được lưu mẫu tại Phòng thí nghiệm Y dược cổ truyền – Khoa Y Học Cổ Truyền – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh

Hình 2 1.Các dược liệu trong bài thuốc Dị hoàng thang

Chủng nấm Candida albicans là chủng chuẩn quốc tế mã ATCC 90028TM của hãng Microbiologics – Mỹ được cung cấp bởi Cty TNHH Thiết bị Khoa học Lan Oanh (Dạng đông khô KwikStik, LOT 264-30-2, hạn sử dụng 31/03/2019)

Ống nghiệm, bercher, ống đong, bình định mức, đũa thủy tinh, đĩa petri, kẹp, pipet và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

Giấy Whatman số 4 (2,5 micron, Đức)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất cao bài thuốc Dị hoàng thang

Sơ chế dược liệu trong bài thuốc Dị hoàng thang [12]

• Hoài sơn, khiếm thực: Cho dược liệu sạch vào chảo, sao nhỏ lửa đến khi mặt ngoài có màu vàng thổ, trong ruột có màu nguyên liệu, mùi thơm

• Hoàng bá: Cho dung dịch muối nồng độ 20% vào dược liệu, tẩm đều khoảng 1 giờ, đem sao lửa nhỏ đến khi mặt ngoài dược liệu vàng già

• Xa tiền tử: Tẩm đều với rượu (35 – 40o) để khoảng 2 giờ rồi sao cho ráo

• Bạch quả: đập nát

Hình 2 2 Các dược liệu trong bài thuốc Dị hoàng thang sau sơ chế

Chiết xuất cao nước bài thuốc Dị hoàng thang: Cân chính xác lượng dược liệu theo bài thuốc Các bài thuốc Dị hoàng thang gia giảm vị Hoàng bá được sắc riêng từng bài (5 vị thành phần) với nước theo tỷ lệ dược liệu : nước là 1:10 (kl/tt), thu dịch chiết,

lọc qua vải mỏng sạch, cô cách thủy và sấy ở nhiệt độ ≤ 50oC để thu dạng cao đặc (hình 2.3) [8]

Hiệu suất chiết cao

%H = 𝑀𝐶𝑎𝑜

Trong đó: %H: Hiệu suất chiết cao (%)

𝑀𝐶𝑎𝑜: Khối lượng cao chiết được (g)

𝑀𝐷ượ𝑐 𝑙𝑖ệ𝑢: Khối lượng tổng dược liệu của bài thuốc mang đi chiết (g)

Hình 2 3.Sơ đồ tổng quát quy trình chiết cao Dị hoàng thang

Dược liệu đã sơ chế

Dịch chiết 2

Dược liệu : Nước cất = 1:10

Ngâm 30’; Đun sôi 60’

Cô cách thủy Sấy khô

Dược liệu : Nước cất=1:10

Đun sôi 30’

Cao đặc/ khô