khảo sát giá trị của xét nghiệm tìm và định danh vi khuẩn ở mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán theo dõi nhiễm khuẩn huyết bằng kỹ thuật realtime pcr đa mồi (multiplex real time pcr mrt pcr)

HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM TÌM VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Ở MẪU MÁU CỦA BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN THEO DÕI NHIỄM KH

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM TÌM VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Ở MẪU MÁU CỦA BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN THEO DÕI NHIỄM KHUẨN HUYẾT BẰNG KỸ THUẬT

REALTIME PCR ĐA MỒI (MULTIPLEX REAL TIME PCR: MRT-PCR)

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS BS Lê Xuân Trường

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/ Năm 2018

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

KHẢO SÁT GIÁ TRỊ CỦA XÉT NGHIỆM TÌM VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN Ở MẪU MÁU CỦA BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN THEO DÕI NHIỄM KHUẨN HUYẾT BẰNG KỸ THUẬT

REALTIME PCR ĐA MỒI (MULTIPLEX REAL TIME PCR: MRT-PCR)

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 5/ Năm 2018

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

Họ và tên, học hàm học vị

Chức danh trong quá trình thực hiện nhiệm vụ

Đơn vị công tác

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN Y VĂN 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Tổng quan 2

1.2.1 Nhiễm khuẩn huyết 2

1.2.2 Tổng quan về PCR 7

1.2.3 Các nghiên cứu liên quan 10

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 15

2.2.2 Phương pháp chọn mẫu: 15

2.2.3 Cỡ mẫu nghiên cứu 15

2.2.4 Cách tiến hành 16

2.2.5 Xử lý kết quả 21

2.3 Đạo đức nghiên cứu 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 22

3.1 Kết quả 22

3.1.1 Đặc tính mẫu 22

3.1.2 Tác nhân gây NKH 24

3.1.3 Tỷ lệ dương tính và tương hợp kết quả của cấy máu và MRT-PCR 25

3.2 Bàn luận 27

3.2.1 Đặc tính mẫu 27

3.2.2 Tác nhân gây NKH 27

3.2.3 So sánh kết quả giữa cấy máu và kỹ thuật PCR 28

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN và KIẾN NGHỊ 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG – HÌNH

Bảng 1 Đặc tính mẫu theo tần số và tỷ lệ % 22

Bảng 2 Tần số và tỉ lệ bệnh nhân phân bố theo bệnh nền (n=91) 23

Bảng 3 Tần số và tỉ lệ các biểu hiện đáp ứng viêm hệ thống của các nhóm cấy máu 23

Bảng 4 Tần suất và tỷ lệ % các loại vi khuẩn định danh bằng cấy máu và PCR 24

Bảng 5 Kết quả cấy máu và PCR/ống máu 25

Bảng 6 Kết quả cấy máu và PCR/chai cấy 25

Bảng 7 Thời gian trả kết quả 26

Bảng 8 So sánh tỷ lệ dương tính của cấy máu và PCR 26

Bảng 9 So sánh tỉ lệ dương tính của cấy máu và PCR với các nghiên cứu khác 29

Hình 1 Mối liên quan giữa SIRS, NKH và nhiễm khuẩn 4

Hình 2 Sơ đồ thực hiện PCR.Thực hiện với 2 loại mẫu nghiệm: 19

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

1 Thông tin chung

- Tên đề tài: Khảo sát giá trị của xét nghiệm tìm và định danh vi khuẩn ở mẫu máu của bệnh nhân được chẩn đoán theo dõi nhiễm khuẩn huyết bằng

- Mã số:

- Chủ nhiệm đề tài: PGS TS BS Lê Xuân Trường

Điện thoại: 01269872057 Email: lxtruong1957@gmail.com

- Đơn vị quản lý về chuyên môn: bộ môn Hóa Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TP.HCM

- Thời gian thực hiện: từ tháng 9/2015 đến tháng 01/2018

hơn so với cấy máu Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mong muốn đánh giá các

ưu và hạn chế của vấn đề trên, hy vọng có thể ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân

tử trong xét nghiêm định danh vi khuẩn ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết để có được tỷ

lệ phát hiện vi khuẩn cao và kết quả sớm hơn

4 Kết quả chính đạt được (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ):

- Về đào tạo: 01 Thạc sĩ chuyên ngành Hóa Sinh

- Công bố trên tạp chí trong nước: Tạp chí Y học TP.HCM, xuất bản năm 2017

5 Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại

Nghiên cứu cho thấy MRT-PCR là một phương tiện kỹ thuật tốt, giúp phát hiện vi sinh vật gây nhiễm khuẩn huyết sớm với tỷ lệ phát hiện tương đương cấy máu, có thể giúp chẩn đoán sớm nhiễm khuẩn huyết, giúp bác sĩ điều trị có thể tiên lượng cũng theo dõi điều trị cho bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết được tốt hơn, nhằm hạn chế biến chứng và nguy cơ tử vong cho đối tượng này

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TỔNG QUAN Y VĂN

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, gây ra do vi khuẩn lưu hành trong máu gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, có thể gây suy đa tạng, gây sốc nhiễm khuẩn với tỉ lệ tử vong rất cao, trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặng của NKH, gây tử vong trên 200.000 người mỗi năm trên thế giới [13] NKH do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ các ổ nhiễm khuẩn ở mô và cơ quan như: da,

mô mềm, cơ, xương khớp, hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu… Khoảng trong một phần ba đến một nửa số trường hợp không tìm thấy nguồn xâm nhập của tác nhân gây bệnh [29] Nhiễm khuẩn và NKH là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở các đơn vị điều trị tích cực (Intensive Care Unit – ICU) ngoài tim mạch, chiếm 40% đến 60% nguyên nhân tử vong [40]

Với các triệu chứng lâm sàng không đặc hiệu của nhiễm khuẩn huyết, và sự cần thiết phải điều trị nhanh chóng và thích hợp, các xét nghiệm, đặc biệt là xét nghiệm vi sinh là rất quan trọng Vai trò quan trọng then chốt trong việc chẩn đoán là xác định được tác nhân gây bệnh Cho đến bây giờ, "tiêu chuẩn vàng" của chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết vẫn là cấy máu Tuy nhiên, thời gian dài chờ đợi kết quả là một bất lợi của phương pháp này

Công nghệ PCR có thể phát hiện deoxyribonucleic acid (DNA) của vi khuẩn trong máu nhanh chóng [13][14][21][32] Việc phát hiện các nucleic acid của vi sinh vật giúp cho chẩn đoán hiệu quả, chính xác và kịp thời NKH Mặt khác, về mặt lý thuyết, kỹ thuật PCR cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao [23] Chẩn đoán PCR xác nhận sự vắng mặt hay

sự hiện diện của tác nhân gây bệnh, cùng với việc xác định chính xác tác nhân và cung cấp thông tin cho các bác sĩ lâm sàng sau vài giờ [14][21][23][32] Điều này giúp hạn chế việc sử dụng kháng sinh phổ rộng và sự phát triển của các sinh vật đa kháng thuốc

Độ nhạy của phương pháp PCR là cao hơn nhiều so với độ nhạy của phương pháp nuôi cấy, và hơn nữa, việc dùng trước kháng sinh không ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm [20] Hiện nay, thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về vai trò của kỹ thuật xét

nghiệm PCR trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết Đa số các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ phát hiện vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR cao hơn [17][26][27][42] Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mong muốn đánh giá các ưu và hạn chế của vấn đề trên, hy vọng có thể ứng dụng rộng rãi kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiêm định danh vi khuẩn ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết để có được tỷ lệ phát hiện vi khuẩn cao và kết quả sớm

hơn

Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát giá trị của xét nghiệm định danh vi khuẩn trong máu bằng kỹ thuật Multiplex real-time polymerase chain reaction (MRT-PCR) ở bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn

huyết bằng cách so sánh với kỹ thuật cấy máu

1.2 TỔNG QUAN

1.2.1 Nhiễm khuẩn huyết

NKH là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại các đơn vị hồi sức cấp cứu không phải tim mạch NKH được chẩn đoán từ 11% đến 25% tất cả bệnh nhân điều trị tại Khoa Hồi sức tích cực Mức độ nghiêm trọng của bệnh thể hiện ở nguy cơ tử vong cao: tử vong do NKH là 30%, do NKH nặng là 50%, và NKH có sốc nhiễm khuẩn tới 80% [19] Tổng số các trường hợp NKH trên toàn thế giới không rõ vì có ít số liệu từ các nước đang phát triển [19] Tại Hoa Kỳ, 2% bệnh nhân nhập viện có nhiễm khuẩn huyết nặng, và 10% bệnh nhân nhập viện vào ICU là bệnh nhân bị nhiễm khuẩn huyết nặng Có hơn 750.000 trường hợp được báo cáo tại Hoa Kỳ mỗi năm [10] Nhiễm khuẩn huyết nặng xảy ra như

là kết quả của cả nhiễm khuẩn ở cộng đồng và nhiễm khuẩn bệnh viện Viêm phổi, nhiễm khuẩn từ ổ bụng, và nhiễm khuẩn đường tiết niệu là nguyên nhân phổ biến nhất của NKH [25] Tại Việt Nam, thống kê của Bộ Y Tế năm 1990, cho thấy tần suất mắc NKH là 15/100.000 dân [2]

Các yếu tố nguy cơ bao gồm tuổi già hay trẻ nhỏ, suy giảm miễn dịch hay trên một

cơ địa có bệnh trước như ung thư, đái tháo đường, chấn thương nặng hoặc bị bỏng [35]

1.2.1.1 Định nghĩa

Năm 1991, một hội nghị đồng thuận giữa Hiệp Hội Lồng ngực Hoa Kỳ - American College of Chest Physicians (ACCP) và Hội Y học Săn sóc tích cực - Society of Critical

Care Medicine (SCCM) được tổ chức tại Mỹ Dựa trên kết quả của hội nghị này, năm

1992, ACCP và SCCM công bố các định nghĩa về NKH và các hội chứng liên quan [12] (hình 1) Định nghĩa này được trình bày như sau:

một nhiễm khuẩn

là NKH với rối loạn chức năng nội tạng hoặc giảm tưới máu mô (biểu hiện như tụt huyết áp, tăng lactate, hoặc giảm lượng nước tiểu, hoặc biến đổi tình trạng tâm thần kinh cấp tính)

với liệu trình bù dịch thỏa đáng

SIRS): Là đáp ứng viêm của cơ thể đối với các tác nhân cấp tính khác nhau, đặc trưng bởi sự hiện diện của hai hay nhiều hơn các triệu chứng lâm sàng sau:

+ Nhiệt độ tăng > 38°C hoặc < 36°C

+ Tần số tim > 90 lần/phút (> +2SD so với giá trị bình thường theo tuổi ở trẻ em) + Tần số thở > 20 lần/phút (> +2SD so với giá trị bình thường theo tuổi ở trẻ em) hoặc PaCO2 < 32 mmHg (tự thở)

+ Bạch cầu máu ngoại biên >12.000/mm3 hoặc <4.000/mm3, hoặc có >10% bạch cầu non (bạch cầu dạng đũa)

Hình 1 Mối liên quan giữa SIRS, NKH và nhiễm khuẩn [18]

1.2.1.2 Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết

Dựa vào có ít nhất hai tiêu chuẩn hệ thống hội chứng đáp ứng viêm toàn thân (SIRS) do liên quan tới nhiễm khuẩn

Cấy máu dương tính là “tiêu chuẩn vàng” để chẩn đoán NKH Cấy máu được khuyến cáo tốt nhất là trước các kháng sinh được bắt đầu Tuy nhiên, xác nhận vi khuẩn có mặt trong máu thường ít hơn 30% bằng phương pháp cấy máu [41] Có thể xác định sớm sự hiện diện của vi khuẩn trong máu bằng phương pháp PCR [13][14][23] [37]

1.2.1.3 Triệu chứng

Ngoài các triệu chứng liên quan đến các nguyên nhân gây NKH, NKH thường kết hợp với sốt hoặc nhiệt độ cơ thể thấp, thở nhanh, nhịp tim tăng, rối loạn tri giác [24] Sốt là biểu hiện lâm sàng thường gặp trên bệnh nhân NKH, có thể kèm rét run Đây là triệu chứng khá phổ biến và cũng là một trong các triệu chứng quan trọng mà bệnh nhân đi khám Sốt khởi phát đột ngột thường do một tình trạng nhiễm khuẩn nặng Ở trẻ sơ sinh thường gặp giảm thân nhiệt [33]

Nhịp thở: thở nhanh là một biểu hiện sớm của NKH, có thể có trước khi sốt và rét run Do tác động của nội độc tố và các hóa chất trung gian lên trung tâm hô hấp ở hành

trong máu tăng quá cao sẽ có tác động ngược gây ức chế trung tâm hô hấp làm thở chậm lại, thậm chí có những cơn ngưng thở [39]

Nhịp tim nhanh là biểu hiện thường gặp trong giai đoạn sớm của NKH Huyết áp

có thể tăng nhẹ Nhưng khi nhiễm khuẩn tiến triển nặng thì cung lượng tim giảm, mạch nhẹ có thể chậm lại, huyết áp giảm [36] Sự sụt giảm huyết áp trong NKH có thể dẫn đến sốc

Thay đổi tri giác biểu hiện ở nhiều mức độ khác nhau do tình trạng thiếu oxy, tăng

Các biểu hiện về da: thời gian phục hồi màu da chậm <3 giây Da nổi bông là những dấu hiệu nặng trong NKH Mặt khác khi NKH có đông máu nội mạch lan tỏa (DIC: Disseminated Intravascular Coagulation), có thể gây hoại tử mô đầu ngón tay, ngón chân, tai

Ổ nhiễm khuẩn: ngoài biểu hiện toàn thân, bệnh nhân có thể có dấu hiệu tại các cơ quan, gợi ý ổ nhiễm khuẩn nguyên phát hay thứ phát Các tổn thương da có thể gặp dưới dạng đỏ da lan tỏa, mụn mủ, bóng nước, viêm mô tế bào Đó là những dấu hiệu gợi ý đường vào, tác nhân gây bệnh giúp người thầy thuốc chẩn đoán nguyên nhân

Nhiễm khuẩn hệ tiết niệu-sinh dục: là ổ nhiễm khuẩn nguyên phát hay gặp của NKH ở nữ giới Triệu chứng gồm đau hố chậu hay đau vùng hông, tiểu rát, tiểu buốt, tiểu khó, tiểu nhiều lần…NKH diễn tiến nhanh, nếu không được chẩn đoán và điều trị kịp thời, bệnh diễn tiến thành NKH nặng, sốc NKH, suy đa cơ quan và tử vong [35] Các suy

chức năng chức năng cơ quan có thể xảy ra [9]:

- Phổi: hội chứng suy hô hấp cấp

- Não: các triệu chứng bao gồm kích động, lú lẫn, hôn mê Nguyên nhân có thể bao gồm thiếu máu, xuất huyết, hình thành các cục máu đông trong mạch máu nhỏ, vi áp-xe, hoại tử đa ổ chất trắng não

- Gan: rối loạn chức năng tổng hợp protein biểu hiện sâu sắc như rối loạn đông máu

do không có khả năng tổng hợp các yếu tố đông máu, và rối loạn chuyển hóa bilirubin, làm nồng độ bilirubin tự do huyết thanh tăng

- Thận: lượng nước tiểu giảm hoặc không có nước tiểu, bất thường điện giải nước tiểu

- Tim: suy tim tâm thu và tâm trương, có thể do các tín hiệu hóa học làm giảm chức năng tế bào cơ tim, tổn thương tế bào

1.2.1.4 Biểu hiện cận lâm sàng

Công thức máu: số lượng bạch cầu là xét nghiệm liên quan đến tình trạng nhiễm khuẩn

dấu hiệu viêm và nhiễm khuẩn Bệnh nhân sốt có giảm bạch cầu đa nhân trung tính có

Tiểu cầu phản ứng trong giai đoạn cấp, có thể tăng hoặc giảm Tiểu cầu giảm trong NKH

có DIC

Cấy máu: là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán Cấy máu cũng cung cấp kháng sinh đồ cho điều trị Cấy máu cần được thực hiện trước khi dùng kháng sinh, tốt nhất khi bệnh nhân đang lạnh run trước khi sốt hay khi đang sốt Cấy ít nhất 2 lần ở 2 vị trí khác nhau Cấy bệnh phẩm khác như mủ da, mủ ổ áp-xe, dịch khớp, dịch màng phổi, dịch màng bụng, đàm, dịch hút phế quản, nước tiểu, dịch não tủy… khi nghi ngờ nhiễm khuẩn ở những nơi này Các xét nghiệm này hỗ trợ cho chẩn đoán đường vào của vi khuẩn và điều trị

Xét nghiệm đánh giá chuyển hóa: kali máu tăng có thể là triệu chứng của suy thận hay ly giải cơ trong NKH [4][43] Nồng độ bicarbonate tăng hay giảm là biểu hiện rối loạn chuyển hóa

Đánh giá chức năng gan, thận:

có suy cơ quan và tiên lượng nặng [43]

gan là hậu quả của hủy tế bào gan, có thể gặp trong NKH nặng

Khí máu động mạch: kiềm hô hấp xảy ra trong giai đoạn sớm và toan chuyển hóa

ở giai đoạn trễ Khi NKH nặng, tưới máu mô giảm, sẽ có toan chuyển hóa nặng Giảm

Hiện nay có nhiều chất chỉ điểm sinh học trong chẩn đoán nhiễm khuẩn đã được nghiên cứu và ứng dụng, trong đó các chất chỉ điểm sinh học được quan tâm nhiều như procalcitonin (PCT), C-reactive protein, cytokine (interleukin: IL-6, IL-8, IL-10, TNF), nội độc tố [5][30] Một số cytokine đã được nghiên cứu nhiều và đã có những ứng dụng bước đầu

Định lượng C-reactive protein đã được sử dụng nhiều năm qua để chẩn đoán các bệnh lý viêm nhiễm cấp tính, trong đó có NKH Khi có viêm, C-reactive protein được gan tổng hợp do kích thích của các cytokine khi cơ thể bị nhiễm khuẩn [4]

Định lượng PCT: PCT được sản xuất bởi tế bào C của tuyến giáp và là một tiền chất của calcitonin Khi cơ thể bị nhiễm khuẩn, PCT có thể được sản xuất ra từ bạch cầu đơn nhân và gan Ở những nhiễm khuẩn nặng có hội chứng đáp ứng viêm toàn thân, PCT

sử dụng để phân biệt NKH với các SIRS không do các nguyên nhân không nhiễm khuẩn [41]

- Sinh học phân tử: phát hiện và định danh vi khuẩn trong máu ở những bệnh nhân được chẩn đoán NKH Có thể dùng kỹ thuật Multiplex Real Time PCR hay phương pháp

1.2.2 TỔNG QUAN VỀ PCR

Kỹ thuật PCR do Kary Mullis đề suất ra vào năm 1985, đây là phương pháp để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó, có độ nhạy rất cao, chỉ cần một khối lượng ban đầu rất hạn chế Ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào năm 1993 cho thành tựu này Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase Và nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việc tách dòng và thao tác với DNA dễ dàng và hiệu quả hơn DNA polymerase có trong sinh vật sống, nó thực hiện chức năng nhân đôi DNA khi tế bào phân chia

Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng 96°C Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy, vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA polymerase lấy từ vi khuẩn sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C DNA polymerase từ sinh vật này có thể ổn định ở nhiệt độ cao, và khi dùng trong PCR

nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA Do đó, không cần phải thêm DNA polymerase vào mỗi chu kỳ Quá trình sao chép DNA đơn giản và tự động hơn

Một trong những DNA polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ vi khuẩn ưa nhiệt và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến sai trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’ Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai và có thể làm giảm một cách đáng kể các sai sót xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.- 23 -

Real Time PCR

Real Time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DNA đích trong ống nghiệm, thành hàng tỉ bản sao, được hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau đó để phát hiện sản phẩm nhân bản (như điện di sản phẩm PCR trên thạch hoặc lai với các đoạn

dò đặc hiệu trên màng, giếng, )

Real Time PCR là một cải biên của phương pháp PCR dựa trên chức năng 5’-3’ polymerase của Taq DNA polymerase do Holland và cộng sự công bố năm 1991 Trong phản ứng Real Time PCR, người ta thường sử dụng hai tác nhân phát huỳnh quang bao

gồm tác nhân gắn vào DNA mạch đôi (Ethidium Bromide, SYBR Green, EvaGreen .) hoặc tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (FAM, HEX )

Tác nhân liên kết với mạch đôi DNA

Trong phản ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch đôi do quá trình nhân bản thì các tác nhân liên kết với DNA mạch đôi như SYBR Green, EvaGreen sẽ liên kết với các sản phẩm vừa được tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn so với trạng thái tự do trong dung dịch Loại tác nhân huỳnh quang này có thể sử dụng được cho mọi trình tự đích nên chi phí sẽ thấp Độ đặc hiệu của sản phẩm phải được kiểm tra chặt chẽ thông qua một bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc - phân tích đường cong nóng chảy

Các tác nhân dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu rất đa dạng như FAM, HEX, TAMRA, Texas Red, Cy3, Cy5, …, được sử dụng với nhiều loại mẫu dò khác nhau:

- Mẫu dò lai (hybridization probe): gồm hai mẫu dò có vị trí bắt cặp gần nhau trên

mạch khuôn và một hoặc hai mồi Các mồi cho phép nhân bản trình tự đích trong phản ứng PCR Mẫu dò phía đầu có mang nhóm huỳnh quang ở đầu 3’, và mẫu dò phía đuôi mang nhóm huỳnh quang đầu 5’ Khi 2 mẫu dò bắt cặp trên cùng một trình tự DNA, nhóm huỳnh quang “cho” và nhóm “nhận” trên 2 mẫu dò sẽ gây ra hiệu ứng chuyển năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer) (hình 1.4) Hiệu ứng này được ghi nhận mỗi khi có

sự bắt cặp của mẫu dò 5’ và mẫu dò 3’ lên những trình tự mới được tạo thành trong quá trình PCR

- Mẫu dò thủy giải (Hydrolysis probe): thông dụng nhất là TaqMan probe, còn gọi

là kỹ thuật 5’ nuclease Mẫu dò được đánh dấu đầu 5’ bằng nhóm phát huỳnh quang, và đầu 3’ bằng nhóm dập tắt huỳnh quang Nhóm “dập” sẽ ngăn sự phát huỳnh quang của nhóm “phát” khi mẫu dò ở trạng thái nguyên vẹn Trong quá trình tổng hợp mạch mới, hoạt tính 5’ exonuclease của Taq polymerase sẽ cắt rời nhóm “phát” khỏi mẫu dò, khiến nó không còn chịu tác động của nhóm “dập” Lúc đó nhóm “phát” sẽ phát tín hiệu huỳnh quang và thiết bị tự động được ghi nhận

- Mẫu dò dạng “kẹp tóc” (hairpin probe) điển hình như “Đèn hiệu phân tử”

“Molecular beacon”: bao gồm một trình tự bổ sung đặc hiệu với trình tự đích nằm giữa hai trình tự lặp lại đảo ngược Các nhóm “phát” và “dập” được gắn vào hai đầu mút của mẫu dò Do đó, sự phát huỳnh quang không xảy ra khi mẫu dò ở dạng

tự do (cấu hình “kẹp tóc”) trong dung dịch Khi mẫu dò bắt cặp với trình tự đích,

nó sẽ duỗi dài khiến hai nhóm “phát” và “dập” tách xa Lúc đó, tín hiệu huỳnh quang được phát ra và ghi nhận

Trong mọi trường hợp vừa nêu, cường độ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với hàm lượng sản phẩm đích đang được nhân bản trong phản ứng Các tín hiệu huỳnh quang phát

ra sẽ được các đầu dò của máy luân nhiệt Real Time PCR thu nhận và xử lý Khi cường

độ tín hiệu huỳnh quang của mẫu vượt qua đường tín hiệu huỳnh quang nền của phản ứng thì mẫu được xem là dương tính và người ta lấy thời điểm vượt qua đó (biểu hiện qua giá trị chu kỳ ngưỡng – CT: Cycle Threshold) để so sánh với một đường cong chuẩn đã biết

để suy ra nồng độ trình tự DNA đích trong mẫu thử nghiệm ban đầu Đường cong chuẩn được xây dựng từ chu kỳ ngưỡng của các mẫu chuẩn có chứa sản phẩm đích đã biết trước nồng độ

Multiplex Real Time PCR

Multiplex Real Time - PCR (MRT-PCR) là một cải tiến của kỹ thuật Real Time PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng Nhiệt độ gắn của các mồi phải khá tương đồng (khác biệt dưới 10°C) để đảm bảo được tính cân đối trong quá trình khuếch đại các sản phẩm khác nhau, tránh hiện tượng không thể phát hiện được một sản phẩm khuếch đại nào đó

Do vậy, thiết kế mồi cho tất cả các cặp mồi được tối ưu hóa để tất cả các cặp mồi có thể làm việc việc ở cùng một nhiệt độ trong chu kỳ của PCR [15]

MRT-PCR đã giúp phát hiện nhiều tác nhân lây nhiễm khác nhau trong cùng một giếng phản ứng

1.2.3 Các nghiên cứu liên quan

Ngoài nước

Đã có nhiều báo cáo nghiên cứu về các đánh giá lâm sàng của MRT-PCR trong chẩn đoán NKH với các quần thể bệnh nhân khác nhau Các kết quả thực hiện kỹ thuật được

mô tả ban đầu là của Lehmann và cộng sự [22] Sau đó, các thử nghiệm đã được đánh giá chủ yếu ở những bệnh nhân ICU người lớn trong các nghiên cứu đa trung tâm [11][42] Trong những nghiên cứu trên bệnh nhân nghi ngờ NKH, NKH nặng và sốc nhiễm khuẩn,

tỉ lệ dương tính cho MRT-PCR là cao hơn so với cấy máu đáng kể Tỉ lệ dương tính cho MRT-PCR dao động từ 25% đến 35%, trong khi đó của cấy máu dao động giữa 13% và 21% [25]

Mancini N và cộng sự [28] nghiên cứu 103 mẫu với MRT-PCR thực hiện với LightCycler SeptiFast, Roche Molecular Systems và cấy máu bởi máy- 28 - BacT/Alert (BioMerieux) Có 21 trường hợp (20,4%) cấy máu dương tính và 34 trường hợp (33%) PCR dương tính Trong 14 ca không tương hợp, cấy máu âm tính và PCR dương tính, có

12 ca kết quả trước đó tương hợp khi mẫu được lấy trước khi dùng kháng sinh, và 2 ca PCR dương tính với loại mầm bệnh khó mọc khi nuôi cấy (Aspergillus fumigatus)

Tsalik EL và cộng sự nghiên cứu mẫu máu của 306 bệnh nhân khoa cấp cứu được chẩn đoán NKH từ tháng 7/2003 đến tháng 2/2009 ở Veterans Affairs Medical Center và Duke University Medical Center (USA) [38] Phát hiện và định danh tác nhân NKH bằng

2 phương pháp cấy máu và MRT-PCR Cấy máu sử dụng hệ thống cấy máu tự động BacT/Alert (BioMerieux) và BD Bactec (Becton Dickinson) DNA được chiết xuất bằng cách sử dụng bộ SeptiFast, MRT-PCR sử dụng LightCycler SeptiFast (Roche) Tỉ lệ cấy máu dương là 66/306 = 21.6% Tỉ lệ PCR dương là 53/306 = 17.3% Nghiên cứu kết luận Real Time PCR có tiềm năng thay thế cho phương pháp cấy máu thông thường

Schaub N và cộng sự [34] nghiên cứu 110 bệnh nhân người lớn từ 6/2007 đến 01/2009 ở khoa cấp cứu bệnh viện đại học Basel (Switzerland) được chẩn đoán nghi ngờ NKH Cấy máu thực hiện với máy BacT/Alert (BioMerieux) và MRT-PCR thực hiện với LightCycler SeptiFast (Roche Diagnostics) Kết quả có 78 bệnh nhân (71%) âm tính với

cả 2 kỹ thuật PCR và cấy máu (PCR‒/BC‒), 16 bệnh nhân (15%) dương tính với cả 2 kỹ thuật (PCR+/BC+), bệnh nhân (10%) âm tính với PCR và dương tính với cấy máu (PCR‒/BC+), 5 bệnh nhân (5%) dương tính với PCR và âm tính với cấy máu

(PCR+/BC‒) Cấy máu dương là 24.5% và PCR dương là 19,1% Các vi khuẩn định danh

được bao gồm: E coli, Klebsiella pneumoniae/oxytoca, P aeruginosa, S aureus, Str Pneumoniae, Str pyogenes Kết luận: MRT-PCR có giá trị chẩn đoán nhanh NKH và tìm

ra tác nhân gây bệnh có thể so sánh với cấy máu

Westh H [42] và cộng sự (2009) nghiên cứu 558 cặp mẫu từ 359 bệnh nhân đa trung tâm Tỉ lệ dương tính là 17% đối với cấy máu và 26% cho MRT-PCR (SeptiFast)

96 vi sinh vật được phân lập với cấy máu, và 186 vi sinh vật đã được xác định với PCR Với MRT-PCR, 186 vi sinh vật đã được xác định, 12 trong số đó được xem là nhiễm Trong số 174 vi sinh vật có liên quan về mặt lâm sàng xác định với MRT-PCR,

MRT-50 (29%) đã được phát hiện bởi cấy máu Hơn một nửa trong số các vi sinh vật được xác định với MRT-PCR nhưng không được phát hiện bởi cấy máu cũng được tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm khác lấy từ bệnh nhân Kết luận: việc sử dụng MRT-PCR có lợi thế đáng kể trong việc phát hiện tác nhân gây NKH

Guido M và cộng sự [17] (2012) nghiên cứu 166 mẫu máu từ bệnh nhân bệnh máu

ác tính có sốt giảm bạch cầu, được theo dõi nhiễm khuẩn huyết 13,9% dương tính với cấy máu, và 22,9% dương tính với MRT-PCR Kết luận: MRT-PCR cải thiện phát hiện nhiễm khuẩn huyết ở bệnh nhân giảm bạch cầu có sốt Nghiên cứu sâu hơn để đánh giá những lợi thế và lợi ích lâm sàng của xét nghiệm sinh học phân tử trong chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết

Bloos F và cộng sự [11] (2012) nghiên cứu từ 50 giường ICU của một bệnh viện trường đại học Trong 245 bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết, 311 mẫu cấy máu đồng thời làm MRT-PCR đã thu được kết quả như sau: có 45 (14,5%) cấy máu dương tính và 94 (30,1%) PCR dương tính Thời gian trung bình để dương là 24,2 giờ (18,0; 27,5) cho PCR và 68 giờ (52,2; 88,5) cho cấy máu (p<0,01) Các kết quả của nghiên cứu này ủng hộ giả thuyết rằng PCR cho kết quả nhanh hơn, có tỉ lệ dương tính cao hơn, và giúp điều chỉnh kháng sinh sớm hơn

Leonella Pasqualini và cộng sự [31] nghiên cứu 391 bệnh nhân được chẩn đoán nghi ngờ NKH ở khoa nội của bệnh viện Đại học Perugia, Italy, từ tháng 3/2010 đến

tháng 8/2011, với cấy máu và MRT-PCR (SeptiFast) Tìm thấy tác nhân gây bệnh trong 22% trường hợp Tỉ lệ dương tính là 15,3% đối với cấy máu và 15,6% cho MRT-PCR

Lodes U và cộng sự [26] (2012) nghiên cứu 148 mẫu từ 104 bệnh nhân ICU được chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết 39,9% (n = 59) dương tính với MRT-PCR (Septifast) và 20,3% (n = 30) dương tính với cấy máu Trong 11,4% MRT-PCR phát hiện nhiều vi sinh vật Trong 25 trường hợp (16,9%, n = 148), việc xác định nhanh chóng của các mầm bệnh liên quan bằng MRT-PCR giúp điều chỉnh kịp thời điều trị Nghiên cứu kết luận MRT-PCR cải thiện phát hiện tác nhân gây bệnh ở bệnh nhân được chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết, và giúp điều trị thành công

Idelevich E và cộng sự [18] (2013) quan sát thấy rằng thời gian trung bình từ khi lấy mẫu máu đến khi trả kết quả MRT-PCR (SeptiFast) là 19 h, trong khi thời gian từ khi lấy mẫu máu đến khi báo kết quả nhuộm của Gram từ cấy máu dương tính là 32 h, và đến khi có định danh và khánh sinh đồ mất trung bình 58 h

Tomasz Gosiewski và cộng sự [16] (Poland) công bố tháng 6/2014 rằng: kết quả nghiên cứu trên 102 mẫu máu từ các bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ NKH, thì có 18.6% dương tính với cấy máu với máy cấy máu BacT/Alert (BioMerieux), và 69,6% dương tính khi sử dụng kỹ thuật MRT-PCR Kết quả cho thấy một sự khác biệt có

ý nghĩa

Nghiên cứu trong nước

Chúng tôi chỉ tìm thấy một nghiên cứu trong nước được công bố Nghiên cứu tại viện Nhi Trung ương 2012 của tác giả Phùng Thị Bích Thủy và cộng sự [6] Nghiên cứu ở 30 trẻ

em điều trị tại khoa hồi sức cấp cứu, Bệnh viện Nhi trung ương với chẩn đoán NKH, xác định bằng phương pháp cấy máu và MRT-PCR, trong khoảng thời gian từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2012 Kết quả: với kỹ thuật MRT-PCR phát hiện dương tính 43,3%, trong khi đó với phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3% Trường hợp cấy máu dương tính thì cũng dương tính bằng kỹ thuật MRT-PCR Kết luận: áp dụng qui trình, ứng dụng kỹ thuật Real Time PCR trong chẩn đoán NKH cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao, bên cạnh đó rút ngắn được thời gian chẩn đoán so với phương pháp cấy máu truyền thống