Nghiên cứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α glucosidase từ dịch đậu đen lên men bởi vi khuẩn bacillus subtilis m1

L ỜI CAM ĐOAN Tôi là Dương Thị Ngọc Quỳnh xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đe

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

=======* & *======

DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH

LU ẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Hà N ội - 2013

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

=======* & *======

DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH

LU ẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ THANH HÀ

Hà N ội – 2013

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi là Dương Thị Ngọc Quỳnh xin cam đoan nội dung trong luận văn này với

đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1” là công

trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác

L ỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi

đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà - Viện Công

nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh

học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đã tạo điều kiện, quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành

luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Học viên

Dương Thị Ngọc Quỳnh

M ỤC LỤC

Trang bìa phụ

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục hình

Danh mục bảng

M Ở ĐẦU 1

PH ẦN 1 TỔNG QUAN 3

1.1 T ổng quan về bệnh đái tháo đường (tiểu đường) ở người 3

1.1.1 Giới thiệu về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) 3

1.1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 3

1.1.3 Biến chứng của bệnh đái tháo đường 4

1.1.4 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường 5

1.1.5 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và ở Việt Nam 7

1.2 Enzyme chuy ển hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) 8

1.2.1 Giới thiệu về α - glucosidase 8

1.2.2 Cấu trúc hóa học α – glucosidase 9

1.2.3 Tính chất của α-glucosidases 10

1.3 Ch ất kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors – AGIs) 10

1.3.1 Giới thiệu về chất kìm hãm alpha – glucosidase 10

1.3.2 Phân loại các hoạt chất kìm hãm alpha – glucosidase 11

1.3.2.1 Nhóm Disaccharides 11

1.3.2.2 Nhóm Iminosugars 12

1.3.2.3 Carbasugars và pseudoaminosugars 14

1.3.2.4 Thiosugars 15

1.3.3 Cơ chế kìm hãm α – glucosidase của AGIs và tác dụng trong điều trị đái tháo đường type 2 15

1.3.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng AGIs 18

1.3.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng AGIs trên thế giới 18

1.3.4.2 Tại Việt Nam 19

1.4 Ngu ồn thu nhận và công nghệ sản xuất AGIs 20

1.4.1 Sản xuất AGIs theo phương pháp tổng hợp hóa học 20

1.4.2 Sản xuất AGIs theo con đường tự nhiên 20

1.4.2.1 Sản xuất AGIs từ động vật 20

1.4.2.1 Sản xuất AGIs từ thực vật 21

1.4.2.3 Sản xuất AGIs từ vi sinh vật 24

1.5 Sản xuất AGIs từ đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis 25

1.5.1 Nguồn cơ chất đậu đen 25

1.5.2 Nguồn chủng vi khuẩn Bacillus subtillis 26

PH ẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Nguyên li ệu 29

2.2 Môi tr ường 29

2.3 Hóa ch ất 30

2.4 Thi ết bị 30

2.5 Ph ương pháp 31

2.5.1 Xác định một số tính chất của nguyên liệu đậu đen 31

2.5.2 Lên men và khảo sát điều kiện lên men thích hợp thu hoạt chất kìm hãm α - glucosidase 33

2.5.3 Xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase của dịch chiết sau lên men 33

2.5.4 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase 35

2.5.5 Phương pháp xây dựng phương trình động học của quá trình lên men thu hoạt

chất kìm hãm α – glucosidase 36

2.5.6 Thu hồi hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men bằng chủng Bacillus subtilis M1 37

2.5.7 Khảo sát khả năng loại màu dịch lên men bằng than hoạt tính 38

2.5.8 Xác định giá trị IC50 38

2.5.9 Tính toán thống kê 38

2.5.10 Hiệu suất thu hồi 38

PH ẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Kh ảo sát đặc tính công nghệ nguyên liệu đậu đen 40

3.2 Nghiên c ứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase bởi Bacillus subtilis M1 40

3.2.1 Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp 40

3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 42

3.2.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 43

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp hoạt chất kìm hãm α –glucosidase 44

3.2.5 Nghiên cứu thời gian lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 45

3.3 Động học quá trình sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase và m ối tương quan với mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis M1 trong quá trình lên men 46

3.4 Nghiên c ứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1 50

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình kết tủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase của dịch lên men 50

3.4.2 Khảo sát quá trình cô đặc dịch lên men chứa hoạt chất kìm hãm α - glucosidase

52

3.4.3 Khảo sát phương pháp sấy tạo sản phẩm dạng bột chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 55

3.5 Nghiên c ứu khả năng kìm hãm α – amylase của chế phẩm chứa AGI 57 3.6 Khảo sát khả năng tẩy màu của than hoạt tính với sản phẩm lên men 58

3.7 Đề xuất qui trình lên men và tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1 61

PH ẦN 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

K ẾT LUẬN 64

KI ẾN NGHỊ 64

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 66

DANH M ỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

WHO (World Health Organization) Tổ chức y tế thế giới

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Tỷ lệ phần trăm bệnh nhân đái tháo đường trong độ tuổi 20 – 79 phân chia theo khu vực trên thế giới 7 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có bản

chất là disaccharide……… …12 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase thuộc

chất là Thiosugars 15 Hình 1.7 Ảnh hưởng của chất kìm hãm α-glucosidase đến quá trình trao đổi đường

trong cơ thể 16

Hình 1.8 Cơ chế kìm hãm α-glucosidase của acarbose 17

Hình 1.9 Cấu trúc hóa học của salacinol và kotalanol tách chiết từ cây Salacia 21 Hình 1.10 Khuẩn lạc B subtilis trên môi trường TSA (A) và hình thái tế bào, bào

tử dưới kính hiển vi điện tử độ phóng đại 1000 lần (B) 27 Hình 2.1 Phương trình tạo màu giữa đường khử và DNS acid 34 Hình 3.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt tính kìm hãm α – glucosidase 41 Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 43

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm

α – glucosidase 44 Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt tính kìm hãm α – glucosidase của dịch lên men 46 Hình 3.5 Động học quá trình sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase 48

Hình 3.6 Chế phẩm chứa AGI sau sấy đông khô 56

Hình 3.7 Khả năng kìm hãm α – amylase tụy tạng lợn của chế phẩm chứa AGI 57 Hình 3.8 Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase trước và sau khi lọc than hoạt tính 59

Hình 3.9 Sản phẩm lên men trước và sau khi lọc than hoạt tính 60 Hình 3.10 Quy trình sản xuất chế phẩm hoạt chất kìm hãm α-glucosidase từ đậu

đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1 61

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số α – glucosidase quan trọng 9

Bảng 1.2 Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase từ một số loại thực phẩm 22

Bảng 1.3 Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase của một số loại trà dân gian Việt Nam 23

Bảng 2.1 Thành phân dinh dưỡng các môi trường sử dụng 29

Bảng 2.2 Nghiên cứu các điều kiện lên men 33

Bảng 3.1 Khảo sát đặc điểm nguyên liệu đậu đen 40

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase……… 45

Bảng 3.3 Sự tương quan giữa mật độ vi khuẩn và hoạt tính kìm hãm α - glucosidase của dịch lên men……… 49

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của quá trình kết tủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase của dịch lên men 51

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của kết tủa cồn đến IC50 và hiệu suất thu hồi DNJ…………52

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm của dịch lên men khi cô đặc ở áp suất thường……… …… 53

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm của dịch lên men khi cô đặc ở áp suất chân không……… 54

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của phương pháp sấy đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase .55

Bảng 3.9 Hoạt tính kìm hãm α – amylase của các mẫu chế phẩm……… 58

1

M Ở ĐẦU

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, mức đô thị hóa nhanh đặc biệt ở các nước đang phát triển trên thế giới là những thay đổi về lối sống, chế độ dinh dưỡng,

ô nhiễm môi trường dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng của các căn bệnh mang tính

xã hội Bên cạnh các căn bệnh đang là mối đe dọa sức khỏe của nhân loại như bệnh tim mạch, ung thư thì đái tháo đường là một trong những bệnh hiểm nghèo với tỷ lệ

tử vong chiếm vị trí thứ ba chỉ sau hai căn bệnh kể trên Chính vì vậy Tổ chức Y tế

Thế giới đã khuyến cáo đái tháo đường là bệnh đặc biệt nghiêm trọng đe dọa đến

sức khỏe và sự phát triển kinh tế ở tất cả các quốc gia trên thế giới

Theo thống kê của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, năm 2010 có khoảng

285 triệu người mắc bệnh trong đó đái tháo đường type 2 chiếm khoảng 85 - 95%

tổng số bệnh nhân đái tháo đường trên thế giới Ước tính đến năm 2030 con số đó tăng lên 438 triệu người Việt Nam là một quốc gia đang phát triển và cũng là một trong những quốc gia có tỉ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế giới Tỷ

lệ dân số mắc đái tháo đường hiện tại tăng lên hơn 6% so với chỉ có 2,7% trong năm

2001 Theo Tổng hội Y học Việt Nam dự báo sẽ có từ 7 - 8 triệu bệnh nhân đái tháo đường vào năm 2025, hơn 90% trong số đó thuộc type 2

Bệnh đái tháo đường là bệnh mãn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm như

bệnh tim mạch vành, suy thận, tai biến mạch máu não, mù mắt, liệt dương, hoại thư… Vì vậy phòng và điều trị bệnh đái tháo đường là một vấn đề bức thiết Ngày nay, y học đã tìm ra nhiều hướng điều trị căn bệnh mãn tính này như tiêm insulin, dùng các loại thuốc nhóm sulphonylureas, glinides, metformin, thiazolidinedione và

hoạt chất kìm hãm α – glucosidase (AGIs) Trên thị trường có một số dược phẩm có bản chất là các hoạt chất kìm hãm α-glucosidase như acarbose, miglitol và voglibose được sử dụng rộng rãi 1-deoxynojirimycin (DNJ) là hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có công thức cấu tạo tương tự miglitol

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất AGIs nói chung và DNJ nói riêng từ nguồn đậu tương lên men Tuy nhiên, những nghiên cứu về tổng

2

hợp AGIs từ đậu đen vẫn còn hạn chế và là hướng đi mới ở Việt Nam Trong khi

đó, các chế phẩm có chất kìm hãm α – glucosidase dùng cho bệnh nhân đái tháo đường ở nước ta đều là nhập khẩu với giá thành cao

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên c ứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1”

Đề tài thực hiện với mục đích và nội dung sau:

1 Mục đích của đề tài:

- Tìm điều kiện thích hợp cho quá trình tạo AGIs bằng quá trình lên men đậu đen

bởi Bacillus subtilis

- Tìm điều kiện tách chiết và thu hồi hoạt chất kìm hãm α-glucosidase từ đậu đen lên men

2 Nội dung của đề tài, các vấn đề cần giải quyết:

- Nghiên cứu điều kiện (ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian, các chất bổ sung) nâng cao sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α-glucosidase khi lên men đậu đen bằng vi khuẩn Bacillus subtilis M1

- Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách chiết, thu hồi và tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α-glucosidase từ đậu đen len men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1

3

PH ẦN 1 TỔNG QUAN 1.1 T ổng quan về bệnh đái tháo đường (tiểu đường) ở người

1.1.1 Gi ới thiệu về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), “Đái tháo đường là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng sự tăng đường máu do hậu quả của việc mất hoàn toàn insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết hoặc hoạt động của insulin" [2]

Ở bệnh nhân ĐTĐ quá trình vận chuyển glucose không hoạt động bình thường, tụy tạng không hoặc sản xuất thiếu hụt insulin hay cơ thể không điều khiển

việc sử dụng insulin để đưa glucose vào tế bào Do đó glucose tồn tại trong máu làm

chỉ số đường huyết tăng cao hơn mức bình thường, khi đó dẫn đến bệnh ĐTĐ Khi đường huyết tăng cao vượt qua khả năng lọc cân bằng của thận, kết quả là đường sẽ theo nước tiểu ra ngoài

1.1.2 Phân lo ại bệnh đái tháo đường

Đái tháo đường type 1

Đái tháo đường type 1 chiếm tỷ lệ khoảng 5 - 10% tổng số bệnh nhân ĐTĐ

thế giới Nguyên nhân do tế bào beta bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt insulin tuyệt đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn) Theo một số nghiên

cứu, các kháng nguyên bạch cầu người (HLA) chắc chắn có mối liên quan chặt chẽ

với sự phát triển của ĐTĐ type 1 [10] ĐTĐ type 1 phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen

và thường được phát hiện trước 40 tuổi Nhiều bệnh nhân, đặc biệt là trẻ em và trẻ

vị thành niên biểu hiện nhiễm toan ceton là triệu chứng đầu tiên của bệnh [23]

Đái tháo đường type 2

Đái tháo đường type 2 chiếm tỷ lệ khoảng 90 - 95% ĐTĐ trên thế giới, thường gặp ở người trưởng thành trên 40 tuổi Đặc trưng của ĐTĐ type 2 là kháng insulin đi kèm với thiếu hụt tiết insulin tương đối Đặc điểm lớn nhất trong sinh lý

của bệnh ĐTĐ type 2 là có sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường trong

4

cơ chế bệnh sinh Người mắc bệnh ĐTĐ type 2 có thể điều trị bằng cách thay đổi thói quen, kết hợp dùng thuốc để kiểm soát glucose máu, tuy nhiên nếu quá trình này thực hiện không tốt thì bệnh nhân cũng sẽ phải điều trị bằng cách dùng insulin

Đái tháo đường thai nghén (ĐTĐTN)

Đái tháo đường thai nghén xảy ra ở phụ nữ có thai, có glucose máu tăng, gặp khi có thai lần đầu Sự tiến triển của ĐTĐTN sau sinh theo 3 khả năng: bị đái tháo đường, giảm dung nạp glucose và bình thường [4]

Ngoài ra còn một số thể hiếm gặp khác liên quan đến một số bệnh, sử dụng thuốc hoặc tiếp xúc với hoá chất

1.1.3 Bi ến chứng của bệnh đái tháo đường

Biến chứng cấp tính

Biến chứng cấp tính thường là hậu quả của chẩn đoán muộn, nhiễm khuẩn

cấp tính hoặc điều trị không thích hợp Trong đó hôn mê nhiễm toan ceton và hôn

mê tăng áp lực thẩm thấu là hai biến chứng nguy hiểm Nhiễm toan ceton là biểu

hiện nặng của rối loạn chuyển hóa gluxit do thiếu insulin gây tăng glucose máu, tăng phân hủy lipid, tăng sinh thể ceton gây toan hóa tổ chức với tỷ lệ tử vong cao

từ 5 - 10% Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu là tình trạng rối loạn chuyển hóa glucose

nặng, đường huyết tăng cao Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu chiếm 5 - 10% Ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 nhiều tuổi, tỷ lệ tử vong từ 30 - 50% [10]

Biến chứng mạn tính

Biến chứng tim - mạch: các nghiên cứu cho thấy nồng độ glucose máu cao làm tăng nguy cơ mắc các bệnh mạch vành, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp và các biến chứng tim mạch khác Người ĐTĐ có bệnh tim mạch là 45%, nguy cơ mắc

bệnh tim mạch gấp 2 - 4 lần so với người bình thường

Biến chứng thận: bệnh thận do ĐTĐ khởi phát bằng tăng protein niệu, sau đó khi chức năng thận giảm xuống, ure và creatinin sẽ tích tụ trong máu Bệnh thận do ĐTĐ là nguyên nhân thường gặp nhất gây suy thận giai đoạn cuối

5

Bệnh lý mắt: đục thủy tinh thể và bệnh lý võng mạc là những bệnh lý về mắt

do biến chứng của bệnh ĐTĐ hay gặp nhất Trong đó đục thuỷ tinh thể là tổn thương thường gặp và tương quan với thời gian mắc bệnh cũng như mức độ tăng đường huyết kéo dài Bệnh lý võng mạc ĐTĐ biểu hiện nhẹ bằng tăng tính thấm mao mạch, ở giai đoạn muộn hơn bệnh tiến triển đến tắc mạch máu, tăng sinh mạch máu với thành mạch yếu dễ xuất huyết gây mù loà

Bệnh lý thần kinh: biến chứng thần kinh do ĐTĐ được chia thành các hội

chứng lớn như viêm đa dây thần kinh, bệnh đơn dây thần kinh, bệnh thần kinh thực

vật, bệnh thần kinh vận động gốc chi

Bệnh lý bàn chân: là sự phối hợp của tổn thương mạch máu, thần kinh ngoại

vi và cơ địa dễ nhiễm khuẩn do glucose máu tăng cao Tỷ lệ cắt cụt chân của người

bị biến chứng bàn chân ĐTĐ của Việt Nam cũng khá cao, khoảng 40% tổng số người có bệnh lý bàn chân ĐTĐ [9]

1 1.4 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường

Đái tháo đường là căn bệnh mạn tính, vì vậy quá trình điều trị của người

bệnh nhằm mục đích ổn định đường huyết ở mức bình thường và hạn chế đến mức

thấp nhất các biến chứng Phương pháp điều trị phụ thuộc vào dạng thức bệnh mắc

phải

Đái tháo đường type 1: ĐTĐ type 1 còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin, vì vậy

với bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ type 1 thì việc tiêm insulin là giải pháp bắt buộc để duy trì chỉ số đường huyết ở mức cho phép và hạn chế các biến chứng đặc biệt là nhiễm cetone máu Việc áp dụng liều lượng insulin cần thiết phụ thuộc vào tình

trạng bệnh cũng như chế độ dinh dưỡng và vân động của mỗi bệnh nhân

Đái tháo đường type 2: quá trình điều trị của bệnh nhân ĐTĐ type 2 chủ yếu

dựa vào các loại thuốc hạ đường huyết và kết hợp tiêm bổ sung insulin trong một số trường hợp cần thiết như biến chứng, hôn mê hay thời kỳ bệnh nặng Hiện nay có 6 nhóm thuốc giúp cải thiện quá trình chuyển hóa glucose cho bệnh nhân ĐTĐ type 2

gồm: sulphonylureas, glinides, metformin, thiazolidinedione, chất kìm hãm

6

dipeptidyl peptidase IV và hoạt chất kìm hãm α – glucosidase Việc lựa chọn sử

dụng thuốc có chứa loại hoạt chất nào tùy thuộc vào bản chất của quá trình rối loạn

hấp thu glucose theo hướng kháng insulin hay suy giảm bài tiết insulin

- Sulphonylureas: là hoạt chất trực tiếp kích thích tiết insulin của các tế bào beta Sulphonylureas giúp giảm chỉ số đường huyết HbA1c từ 1-2% và giảm sự

tiến triển của các biến chứng vi mạch đến 25% Tuy nhiên, việc sử dụng sulphonylureas thường dẫn đến các tác dụng phụ như tăng cân và có thể gây hạ đường huyết đặc biệt là ở người cao tuổi, bệnh nhân suy thận hoặc bệnh gan Do

vậy sulphonylureas thường được sử dụng ở các thế hệ thuốc thứ 2 hoặc thứ 3 [41]

- Glinides: là một thế hệ mới của sulphonylurea có tác dụng kích thích tiết insulin sớm giúp giảm tăng đường huyết sau bữa ăn do vậy được sử dụng đều đặn sau mỗi bữa ăn Glinides không gây ra các tác dụng phụ như sulphonylureas do vậy

nó được khuyến cáo sử dụng cho các bệnh nhân suy thận và bệnh gan

- Thiazolidinediones: thiazolidinediones giúp cải thiện độ nhạy cảm của insulin bằng cách cải thiện hoạt động đáp ứng tế bào của chúng, tuy nhiên không tăng cường sản xuất insulin Một tác dụng phụ phổ biến của thiazolidinediones là gây tích lũy chất béo dưới da

- Metformin: giống như thiazolidinediones, metformin giúp tăng hoạt tính cho insulin, có thể làm giảm HbA1c hiệu quả như sulphonylureas và insulin mà không gây hạ đường huyết hoặc tăng cân tuy nhiên thường xuyên gây ra tình trạng

phụ thuộc liều dùng sau nhiều năm điều trị [40]

- Hoạt chất kìm hãm α-glucosidase: hiện nay trên thị trường có một số dược

phẩm có bản chất là các hoạt chất kìm hãm α-glucosidase như acarbose (U.S Pat

No 5643874), miglitol (U.S Pat No 4639436) và voglibose (U.S Pat No 6200958) Các hoạt chất này làm chậm lại quá trình hấp thụ carbohydrate từ ruột do

đó giúp chỉ số đường huyết ổn định cả lúc trước và sau ăn Một số tài liệu đã được chứng minh rằng hoạt chất kìm hãm α-glucosidase như acarbose có khả năng ngăn chặn hoặc trì hoãn sự tiến triển của tình trạng suy giảm dung nạp glucose (IGT) đến

7

bệnh ĐTĐ Đây là một hướng mới đang được chú ý nghiên cứu và ứng dụng khả quan trong điều trị bệnh ĐTĐ

1.1.5 Tình hình b ệnh đái tháo đường trên thế giới và ở Việt Nam

Trong những năm gần đây, tỷ lệ ĐTĐ gia tăng mạnh mẽ trên toàn cầu, WHO

đã lên tiếng báo động vấn đề nghiêm trọng này trên toàn thế giới

Theo thống kê của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, năm 2010 có khoảng

285 triệu người mắc bệnh và 344 người suy giảm hấp thu glucose, trong đó bệnh ĐTĐ type 2 chiếm khoảng 85 - 95 % tổng số bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới Ước tính đến năm 2030 con số đó tăng lên 438 và 472 triệu người [55]

Theo đánh giá của hiệp hội đái tháo đường quốc tế, các nước đang phát triển

có tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ cao hơn các nước phát triển và chưa phát triển Trong

đó, nơi có số lượng bệnh nhân ĐTĐ cao nhất là khu vực Đông Thái Bình Dương (26,9 %) và Đông Nam Á (20,6%), thấp nhất là khu vực châu Phi (4,2%) [55]

Hình 1.1 T ỷ lệ phần trăm bệnh nhân ĐTĐ trong độ tuổi 20 – 79 phân

chia theo khu v ực trên thế giới

0 5 10 15 20 25 30

4.2

9.3 20.6

8

Việt Nam là một quốc gia đang phát triển có tốc độ gia tăng bệnh ĐTĐ nhanh nhất thế giới Tỷ lệ dân số mắc ĐTĐ hiện tại tăng lên hơn 6% so với chỉ có 2,7% trong năm 2001 Theo Tổng hội Y học Việt Nam dự báo sẽ có từ 7 - 8 triệu người bị bệnh ĐTĐ vào năm 2025, hơn 90% trong số đó thuộc type 2

1.2 Enzyme chuy ển hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20)

1.2.1 Gi ới thiệu về α - glucosidase

Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) là một enzyme thủy phân thuộc nhóm glucosidase (α-, β-, và α-1,3-glucosidase), có tác dụng chuyển hóa các cơ chất là oligo hay polysaccharite thành glucose [19] Alpha – glucosidase thường được chia thành ba nhóm I, II và III dựa trên nguồn cơ chất đặc hiệu Nhóm I bao gồm maltase

và isomaltase thủy phân các cơ chất đồng thể như maltooligosaccharides thành glucose chậm hơn so với các cơ chất dị thể như các hoạt chất glucosides vòng thơm điển hình là phenyl α – glucopyranoside hay p – nitrophenyl α – glucopyranoside Ngược lại, nhóm II thủy phân mạnh các hơp chất maltooligosaccharides như maltose và isomaltose α – glucosidase thuộc nhóm III, ngoài maltooligosaccharides còn có thể thủy phân α – glucan thành đường đơn [21]

Alpha glucosidase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó, enzym thuộc nhóm I thu được từ vi khuẩn, nấm men và một số loài côn trùng, nhóm II từ nấm mốc và nhóm III từ thực vật hoặc động vật [21]

Các chế phẩm α- glucosidase trên thị trường có nhiều nguồn gốc khác nhau

như: từ vi khuẩn (Bacillus stearothermophilus …), từ nấm men (Saccharomyces

động vật (chuột, thỏ, lợn …)

mạc với chức năng thủy phân maltose, dextrin beta và một số loại cyclodextrins

1.2.2 C ấu trúc hóa học α – glucosidase

Alpha – Glucosidase có khối lượng phân tử khoảng 125kDa gồm nhiều đơn phân alpha – Glucose liên kết với nhau [27]

Dựa vào sự tương đồng của trình tự gene, α – glucosidases chủ yếu được phân thành hai họ đặc trưng lớn là GH13 và GH31 và hai họ nhỏ là GH4 và GH97

Họ GH13 có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm men và côn trùng trong trình tự gen cùng

có bốn trình tự tương đồng được coi là vùng bảo thủ gồm vùng 1, 2 ,3 và 4 mã hóa cho các acid amin quan trọng tham gia vào quá trình xúc tác phản ứng Họ GH31 thuộc về nhóm II và III với nguồn thu nhận từ nấm mốc, thực vật và động vật Trong nhóm họ này không tìm thấy sự tương đồng trong cấu trúc gen của vùng xúc tác phản ứng Tuy nhiên theo nghiên cứu của Nakai và cộng sự cho thấy có sự khác

biệt trong sắp xếp các acid amin ở vùng C – terminal của các enzyme thuộc nhóm

II và III, điều đó quyết định đến cơ chất đặc hiệu của các enzyme [19]

Hiện nay mới chỉ có ba cấu trúc hoàn chỉnh của α – Glucosidase được gửi

10

trên ngân hàng dữ liệu protein (PDB) Các cấu trúc đó là GH31 Mal từ Sulfolobus

số 1lwj và 1lwh, GH97 Susb của Bacteroides thetaiomicron với mã vpi – 5482 và

vpi – 2d73 [56]

1.2.3 Tính ch ất của α-glucosidases

Alpha glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ 4 - 4,5, là enzyme có khả năng phân cắt các liên kết ở vị trí α-1,4, α-1,3 và α-1,2 D-glycoside ở đầu không khử của các di-, oligo-, polysaccharide và giải phóng ra D-glucose có thể hấp thu trực tiếp vào máu [27]

Alpha glucosidase có tác dụng thủy phân đường maltose, đường sucrose nhưng không thủy phân được tinh bột

1.3 Ch ất kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors – AGIs) 1.3.1 Gi ới thiệu về chất kìm hãm alpha – glucosidase

Chất kĩm hãm enzyme là chất làm giảm hoạt độ enzyme nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ và hữu

cơ [12]

Chất kìm hãm enzyme được chia thành hai loại là kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh Các hoạt chất AGIs là các hoạt chất kìm hãm cạnh tranh Với bản chất là các disaccharides, pseudooligosaccharide, thiosugars, polyhydroxylated alkanoid, carbasugar, pseudoaminosugar,…[14]

AGIs là hoạt chất có thể thu nhận từ nhiều con đường khác nhau như nguồn

thực vật, động vật hay nuôi cấy vi sinh vật và bằng phương pháp tổng hợp hóa học

Năm 1970, người ta nhận ra rằng việc sử dụng các chất kìm hãm α – glucosidase có thể kiểm soát sự hấp thụ carbohydrat và hỗ trợ điều trị cho những người mắc bệnh ĐTĐ một cách hiệu quả

α-glucosidase

11

1.3.2 Phân lo ại các hoạt chất kìm hãm alpha – glucosidase

Hiện nay có nhiều tiêu chí khác nhau để phân loại các hoạt chất kìm hãm α – glucosidase, tuy nhiên phân loại dựa vào công thức cấu tạo được sử dụng nhiều hơn

cả Theo tiêu chí này các hoạt chất kìm hãm α – glucosidase được chia ra làm bốn nhóm chính gồm có: disaccharides, iminosugars, carbasugars và pseudoaminosugars,

cuối cùng là thiosugars

1.3.2.1 Nhóm Disaccharides

Kojibiose, nigerose và trehalose là nhưng hoạt chất có bản chất là disaccharides Việc nghiên cứu và tách chiết được các hoạt chất này đã mở ra những hướng đi mới trong sản xuất thuốc điều trị bệnh ĐTĐ type 2

đầu tiên vào năm 1953 từ dịch chiết có tên là koji, một sản phẩm của quá trình lên men gạo bởi Aspergillus oryzae và là hoạt chất kìm hãm α - glucosidase nhóm I

thức cấu tạo có liên kết α - 1, 2 glycoside, có khả năng kìm hãm α - glucosidase nhóm II

glucose, trehalose được chiết xuất từ hạt của cây mướp đắng (Mormodica

công nghệ thực phẩm và sản xuất mỹ phẩm và gần đây đã được sử dụng trong điều

trị loãng xương [14]

12

Hình 1.2 Công th ức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có

b ản chất là disaccharide 1.3.2.2 Nhóm Iminosugars

Iminosugars là các polyhydroxylated alkaloid, trong đó các đơn phân là monosaccharide mà vòng pyranoza có một oxy được thay thế bởi nito do đó vẫn thường gọi là các hoạt chất “giả đường”, Cấu trúc alkaloid polyhydroxylated chứa ít

nhất hai nhóm hydroxyl và một nguyên tử nitơ dị vòng [36]

Iminosugars thu nhận từ thực vật hoặc vi sinh vật là những hoạt chất có tiềm năng to lớn trong y dược học bởi khả năng kìm hãm glucosidase Iminosugars có

trọng lượng phân tử thấp và có khả năng kìm hãm α – glucosidase bởi có cấu trúc

và điện tích tương tự như oxacarbenium ion – một sản phẩm trung gian của quá trình cắt liên kết glycoside các nguồn cơ chất cacbonhydrat bởi glucosidase [14]

Dựa vào cấu trúc iminosugars được chia làm năm lớp sau: piperidines, pyrrolidines, indolizidines, pyrrolizidines và nortropanes

- Piperidines: Nojirimycin, 1-deoxynojirimycin, glycosylated deoxynojirimycin

và isofagomine là những hoạt chất được chú ý nghiên cứu và ứng dụng sản xuất thuốc điều trị bệnh ĐTĐ type 2 thuộc lớp piperidines

phát hiện vào năm 1966, là sản phẩm tạo thành trong quá trình sinh trưởng của các

chủng Bacillus, Streptomyces, dịch chiết lá dâu tằm, được biết đến như một chất

kháng sinh và chất kìm hãm α-và β-glucosidases [14]

Kojibiose Nigerose Trehalose

13

chú ý mạnh mẽ trong ngành y học, công nghệ sinh học và thực phẩm bởi các hoạt tính sinh học mà nó mang lại Dựa vào khả năng kìm hãm α, β – glucosidase, mà

hoạt chất này có tác dụng điều trị sự mất cân đối của quá trình trao đổi chất có liên quan đến carbonhydrat như ĐTĐ, DNJ còn được biết đến với vai trò là một hoạt

chất tiềm năng trong việc điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, bệnh liên quan đến virus (HIV, HBV ) [1]

1-deoxynojirimycin đã được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị tăng đường huyết sau

ăn ở bệnh nhân đái ĐTĐ [32]

- Pyrrolidines: một AGI điển hình thuộc lớp Pyrrolidines là

1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol, được chiết xuất lần đầu tiên từ quả một cây họ đậu có tên khoa

Carbasugars là các hoạt chất trong đó nguyên tử oxy của vòng pyranose được thay thế bằng carbon Trong đó pseudoaminosugars là nhóm hoạt chất được quan tâm chú ý với công thức cấu tạo có nguyên tử oxy của vòng pyranose được thay thế

bằng cacbon, nguyên tử oxy trong liên kết glycoside được thay thế bằng nitơ với công thức tương tự D - glucose

Một trong những đại diện quan trọng nhất của lớp này là hoạt chất acarbose

với khả năng kìm hãm α – glucosidase trên phạm vi rộng từ nhiều nguồn thu nhận khác nhau như vi khuẩn, nấm mốc và thực vật

Voglibose là một ví dụ của lớp pseudoaminosugars đã được sử dụng để điều

trị bệnh ĐTĐ ở Nhật Bản từ năm 1994 Người ta thấy rằng hoạt chất này có hoạt

lực mạnh hơn từ 20 đến 30 lần so với acarbose và ít tác dụng phụ hơn [32]

Pyrrolidines Castanospermine Pyrrolizidines Nortropanes

15

Hình 1.5 Công th ức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có

b ản chất là Carbasugars 1.3.2.4 Thiosugars

Thiosugars là một nhóm các hoạt chất cacbonhydrate mà trong đó nguyên

tử oxy trong vòng pyranoza được thay thế bởi một nguyên tử lưu huỳnh D-xylopyranose là thiosugar đầu tiên được tổng hợp vào năm 1961 và 5-Thio-D-glucopyranose được tổng hợp vào năm 1962 với khả năng tăng cường tiết insuline [14]

5-Thio-Hình 1.6 Công th ức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có

Acarbose Voglibose

5-Thio-D-xylopyranose 5-Thio-D-glucopyranose

16

của α- glucosidase, maltose bị thủy phân thành các monosaccharide tại ruột non Các nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng AGIs có thể kìm hãm α – glucosidase nên ngăn cản sự tạo thành monosaccharide từ disaccharide làm cho quá trình tổng hợp insulin diễn ra dễ dàng hơn [33]

Hình 1.7 Ảnh hưởng của chất kìm hãm α-glucosidase đến quá trình trao đổi

đường trong cơ thể

AGIs có cấu trúc tương tự các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân tinh bột, bên cạnh đó các hoạt chất này còn có những liên kết đặc trưng khác biệt so với các oligosaccharride tự nhiên tạo ra bởi hệ enzyme đường ruột, chính nhờ những liên kết đó mà AGIs không bị thủy phân bởi hệ enzyme đường ruột Acarbose là một ví dụ, với cấu trúc như một oligosaccharide có liên kết nitơ trong phân tử giúp acarbose không bị thủy phân đồng thời nó cũng tạo ái lực với α – glucosidase nên có tác dụng cạnh tranh vị trí tiếp xúc trung tâm hoạt động của α - glucosidase với oligosaccharide từ tinh bột Do vậy động học quá trình kìm hãm của AGIs với α – glucosidase là kìm hãm cạnh tranh [14, 17]

17

Hình 1.8 Cơ chế kìm hãm α-glucosidase của acarbose

Các kết quả nghiên cứu cho thấy, chất kìm hãm α-glucosidase có tác dụng gia tăng nồng độ peptit - 1 dạng glucagon (GLP-1) và peptit-2 dạng glucagon (GLP-2) trong huyết tương GLP-1 và GLP-2 là các hormon được sinh ra từ tế bào Langerhans nội tiết nằm trong vùng ngoại biên của ruột non và ruột kết GLP-1 kích thích sự tiết insulin phụ thuộc glucose và sự sinh sôi tế bào beta GLP-2 cải thiện cấu trúc, chức năng của ruột non bằng cách tăng cường cấu trúc của lông nhung và tăng hoạt tính vận chuyển vào enzym GLP-2 làm giảm viêm ruột GLP-1 và GLP-2 được tạo ra khi có sự kích thích thần kinh, hormon hoặc các yếu tố dinh dưỡng Chất kìm hãm α-glucosidase tự nhiên có khả năng ngăn cản sự phá hủy carbonhydrat nên kéo dài thời gian có mặt của carbonhydrat trong ruột Do vậy một lượng lớn carbonhydrat sẽ đến vùng ngoại biên của ruột non và tương tác với tế bào Langerhans làm tăng sự tiết GLP-1 và GLP-2 Người

ta cho rằng khi có mặt glucose ở ngoại biên ruột non, glucose sẽ bị lên men tạo các acid béo chuỗi ngắn kích thích sự sản xuất và tiết GLP-1 và GLP-2 hoặc quá trình vận chuyển glucose phụ thuộc vào Na+ khi qua màng tế bào L sẽ kích thích

18

sự tiết GLP-1 và GLP-2 Nồng độ GLP-1 trong huyếttương tăng sẽ thúc đẩy quá trình kiểm soát glycemic và cản trở sự có mặt glucose trong máu [16]

1.3.4 Tình hình nghiên c ứu và ứng dụng AGIs

1 3.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng AGIs trên thế giới

Song song với sự ra tăng số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ trên thế giới là mối quan tâm của các nhà khoa học cũng như các hãng dược phẩm đến việc nghiên cứu

và ứng dụng AGIs Có hai hướng nghiên cứu và ứng dụng AGIs, đó là tạo các sản phẩm dược phẩm tinh khiết sử dụng theo đường uống và thực phẩm chức năng có chứa AGIs

Acarbose được sản xuất đầu tiên từ những năm 1970, tuy nhiên đến năm

1990 hãng Glucobay của Đức mới lần đầu tiên đưa ra thị trường một loại thuốc có

chứa acarbose được sử dụng điều trị ĐTĐ type 2 Năm 1996, acarbose đã được

giới thiệu trên thị trường Mỹ với tên là Precose [46] Hiện nay, các sản phẩm dược

phẩm chứa acarbose vẫn chiếm thị phần lớn trong các sản phẩm thuốc điều trị ĐTĐ type 2 ở trên thế giới và tại Việt Nam, với nhiều tên thương mại như:

Glucobay (Đức), Precose (Bắc Mỹ), Prandase (Canada), Dorobay (Việt Nam)

Nhật Bản và Trung Quốc là hai nước đi đầu trong sản xuất các sản phẩm

thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ type 2 Công ty Nippon

của Nhật Bản – một công ty nổi tiếng chuyên cung cấp chất bổ sung cho sản xuất

thực phẩm chức năng đã sản xuất được AGIs từ đậu tương lên men [34] Tháng 6

19

năm 2008, hoạt chất chiết từ touchi đã được cấp phép lưu hành tại thị trường Châu

Âu Đã có nhiều công trình nghiên cứu về thu nhận AGIs ứng dụng cho sản xuất

thực phẩm chức năng từ các nguồn đậu tương, đậu đen lên men của các nhà khoa

học và tạo ra các sản phẩm như douchi, tochi 1-DNJ…[18, 35]

1.3 4.2 Tại Việt Nam

Hiện nay, tại Việt Nam tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ ngày càng tăng Tuy nhiên,

việc sản xuất thuốc chữa loại bệnh này theo hướng kìm hãm α-glucosidase vẫn chưa

có bất kỳ sản phẩm nào [11] Những loại thuốc hay thực phẩm chức năng có chứa

AGIs trên thị trường Việt Nam đều là các sản phẩm nhập khẩu hoàn toàn từ nước ngoài, được quảng cáo có khả năng chữa bệnh ĐTĐ với giá thành cao Các loại thuốc này là: Salfamid hạ đường huyết, Biguanide, nhóm Thiazolidinediones , viên giáp xác Tianshi, tảo xoắn Tianshi, …

Trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu và sản xuất

thực phẩm chức năng cho người bệnh tiều đường như rau má hòa tan-XOS có chứa xylooligosaccharides (XOS), chanh leo hòa tan-XOS, đường chức năng bổ sung protein giàu crom hữu cơ từ nấm men Saccharomyces cerevisiae có tác dụng phòng

chống bệnh ĐTĐ type 2 cũng đã và đang được nghiên cứu [8]

Trương Hương Lan và cộng sự đã xác định được một số nguyên liệu có hoạt tính sinh học từ đại mạch, vừng trắng, mướp đắng sử dụng cho sản xuất thực phẩm

chức năng có tác dụng là giảm hàm lượng đường trong máu

Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột lá dâu tằm ứng dụng sản xuất trà dâu

uống liền, trà dâu túi lọc chứa 1-deoxynojirimicin (DNJ) là đề tài nghiên cứu của Đặng Hồng Ánh và cộng sự đã thu được những kết quả nhất định về tác dụng kìm hãm α – glucosidase của DNJ [1] Hiện nay đã có nhiều đề tài nghiên cứu sản xuất AGIs từ các loài vi sinh vật khác nhau trên môi trường đậu tương, tuy nhiên nghiên

cứu công nghệ lên men sản xuất AGIs từ đậu đen là một hướng đi mới, cần thiết có

những nghiên cứu sâu và hoàn thiện

20

1.4 Ngu ồn thu nhận và công nghệ sản xuất AGIs

1.4.1 S ản xuất AGIs theo phương pháp tổng hợp hóa học

Dựa vào cấu trúc của AGIs trong tự nhiên, các nhà khoa học đã nghiên cứu

và tổng hợp thành công AGIs theo con đường hóa học từ nhiều năm nay

Năm 1986, dihydroacarbose đã được tổng hợp cho thấy khả năng kìm hãm α – glucosidase tương tự acarbose với hoạt lực cao [34]

Năm 2005, Woo Duck Seo và cộng sự đã tổng hợp được 20 hoạt chất có khả năng kìm hãm α – glucosidase dựa vào cấu trúc hóa học của Chalcones (AGIs từ

một số loại lá ăn được ở Hàn Quốc)

Voglibose là dẫn xuất chứa nito của valiolamine được tổng hợp để làm tăng

khả năng kìm hãm α – glucosidase Chất này còn có khả năng kìm hãm maltase và sucrase [20]

Ngoài ra một số chất hóa học cũng được ghi nhận có khả năng kìm hãm α – glucosidase như: sulfonamide, các dẫn xuất của xanthone và deoxy salaccious Tuy nhiên các hoạt chất tổng hợp theo con đường hóa học thường gây tác dụng phụ như

rối loạn chức năng gan và các triệu chứng liên quan đến đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa Vì vậy tổng hợp AGIs theo con đường tự nhiên được quan tâm nhiều hơn do tính an toàn cao, chi phí thấp

1.4.2 S ản xuất AGIs theo con đường tự nhiên

1 4.2.1 Sản xuất AGIs từ động vật

Hiện nay sản xuất AGIs từ động vật chưa thu nhận được nhiều kết quả ngay

cả trên thế giới và ở Việt Nam Năm 2009 các nhà khoa học Việt Nam và Hàn Quốc

đã thu nhận được AGIs từ Stichopus Japonicas (Hải Sâm) Quá trình nghiên cứu sử

dụng hexan và methanol làm dung môi tách chiết Kết quả cho thấy khả năng kìm hãm α – glucosidase thu từ nấm men của dịch chiết bằng hexan ở nồng độ 10µg/ml đạt cao nhất là 98% Trong khi nếu chiết bằng methanol nồng độ 0,5mg/ml thì hoạt

lực kìm hãm đạt 68% Từ dịch chiết của hải sâm các nhà khoa học đã tìm ra được

21

ba hoạt chất AGIs (1, 2, 3) có khả năng kìm hãm α – glucosidase của

glucosidase của Bacillus stearothemophilus với giá trị IC50 lần lượt là 2,49; 0,24; 0,21µg/ml Từ những kết quả trên tác giả đưa ra nhận định AGIs chiết xuất từ hải sâm có tiềm năng như thực phẩm chức năng và các hoạt chất này có thể được sử

dụng để ngăn ngừa bệnh ĐTĐ do khả năng kìm hãm α – glucosidase của chúng tương đối cao [31]

Sri Lanka sử dụng như một loại thuốc dân gian từ rất lâu đời

Hình 1.9 C ấu trúc hóa học của salacinol và kotalanol tách chiết từ cây Salacia

Salacinol và kotalanol có được xếp vào nhóm thiosugars do có phân tử lưu

huỳnh trong công thức cấu tạo, có khả năng kìm hãm maltase, sucrase và isomaltase

ở chuột với giá trị IC50 lần lượt là 3,2; 0,84; 0,59µg/ml [47]

Năm 2002, F.Ye và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết thảo mộc Trung Quốc có tên là Ramulus mori (Sangzhi) với nước nóng theo tỷ

lệ 1:12 (w/v) trong 2h và được thử nghiệm trên chuột cùng so sánh với acarbose

22

[15] Khi chuột bị gây ĐTĐ bằng alloxan và được cho uống dịch chiết này kết quả

là làm giảm lượng đường huyết sau ăn, ổn định lượng đường trong máu lúc đói Tuy nhiên chất chiết này không gây ảnh hưởng đến sự hấp thụ glucose trong ruột non

của những con chuột bình thường Kết quả này cũng tương tự như những thí nghiệm với acarbose

Gần đây Li và cộng sự đã công bố dịch chiết của hoa Punica granatum (hoa

Lựu) có khả năng kìm hãm α – glucosidase cao với giá trị IC50 = 1,8µg/ml [29]

Bên cạnh việc tìm kiếm và thu nhận AGIs từ các loài thực vật hoang dại, các nhà khoa học cũng đã tìm ra nhiều hoạt chất AGIs từ nguồn thực phẩm quen thuộc trong cuộc sống như các loại trà, hoa quả và các nguồn thực phẩm khác Theo công trình nghiên cứu của Matsui và cộng sự đã tách chiết và xác định HTKH α – glucosidase từ một số loại thực phẩm Kết quả cho thấy chất chiết từ trà xanh có HTKH α – glucosidase từ nấm men bánh mỳ và từ ruột non chuột cao nhất với IC50

23

Năm 2007, Trương Tuyết Mai và cộng sự đã công bố năm loại cây thường được sử dụng trong dân gian như một loại trà uống ở nước ta có chứa hoạt chất AGIs Trong đó nước chiết từ nụ vối có hoạt tính cao nhất là 68,2%

B ảng 1.3 Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase của một số loại trà dân gian

Trong dân gian, lá dâu tằm vẫn được biết đến là một loại thuốc với nhiều công dụng chữa bệnh khác nhau như tăng huyết áp, phát ban, đau mắt đỏ, mỡ máu…Một trong những alkaloid chiếm tỷ lệ cao nhất trong lá dâu tằm là 1-deoxynojirimycin (DNJ) DNJ kìm hãm hoạt động của α-glucosidase do vậy ngăn

cản sự phân hủy tinh bột thành đường đơn làm quá trình giải phóng và hấp thụ đường vào máu chậm nên giảm sự tăng nhanh đường trong máu sau ăn Bên cạnh

đó trong thành phần lá dâu tằm còn chứa nhiều polyphenol mà điển hình là resveratrol Hoạt chất này giúp làm tăng tính nhạy cảm của thụ thể insuline, do đó tăng vận chuyển đường vào tế bào Như vậy hoạt chất trong dịch chiết từ lá dâu tằm

vừa kìm hãm sự tổng hợp mới vừa thúc đẩy hấp thụ đường vào các tế bào

Ngoài ra còn rất nhiều loài thực vật chứa AGIs đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công nhận Hiện nay các sản phẩm chứa AGIs từ thực vật chủ yếu dưới dạng thực phẩm chức năng, do quá trình tách chiết thu nhận AGIs tinh khiết từ

thực vật trên qui mô công nghiệp có chi phí cao và không đơn giản

24

1 4.2.3 Sản xuất AGIs từ vi sinh vật

Nghiên cứu sản xuất AGIs từ vi sinh vật đã và đang thu hút được sự chú ý

của các nhà khoa học và các nhà sản xuất bởi các ưu điểm sau: tính an toàn khi sử

dụng, hoạt tính AGIs cao, ít có tác dụng phụ với đối tượng sử dụng, dễ sản xuất trên quy mô công nghiệp với chi phí thấp Những nghiên cứu cũng như ứng dụng sản

xuất AGIs chủ yếu thực hiện trên hai đối tượng vi sinh vật là nấm mốc và vi khuẩn

trong đó tập trung chủ yếu ở một số loài sau: Aspergillus oryzae, Streptomyces,

Actinoplanes, Penicillium và Bacillus subtilis

Các sản phẩm touchi lên men từ đậu tương bởi Aspergillus oryzae,

Theo Jingchen và cộng sự sản xuất touchi từ đậu tương lên men bởi Aspergillus

– glucosidase tăng lên nhanh chóng so với đậu tương ban đầu và còn tiếp tục tăng lên ở giai đoạn lên men thứ cấp Tác giả cũng đưa ra kết luận rằng HTKH α – glucosidase của touchi được lên men bởi Aspergillus oryzae cao hơn nhiều so với

sản phẩm lên men của Actinoplanes elegans và Rhizopus arrhizus

Năm 2002, Kwon và cộng sự đã công bố CKD-711 và CKD-711a là AGIs

mới thu được từ dịch lên men của Streptomyces sp CK 4416 HTKH của hai hoạt

chất này đã được so sánh với acarbose, kết quả cho thấy khả năng kìm hãm maltase

và sucrase của CKD – 711 tương đương với acarbose, với amylase kém hơn acarbose 2 lần Khả năng kìm hãm các enzyme kể trên của CKD-711a kém hơn CKD-711 [27]

Acarbose (pseudotetrasaccharide được tách chiết từ dịch lên men loài

0.5µM [37] Nó là chất bột mầu trắng, có tác dụng kìm hãm cạnh tranh glucosidase ở niêm mạc ruột, làm chậm quá trình thủy phân các di-, oligo-, poly-saccharide thành monosaccharide là dạng có thể hấp thụ được Acarbose không làm

Từ năm 1984, Stein và cộng sự đã tìm ra hoạt chất 1-deoxynojirimycin từ

sản phẩm lên men của chủng Bacillus subtilis DSM 704 [39] Những năm gần đây

các nhà khoa học Trung Quốc đã nuôi cấy chủng Bacillus subtilis B2 từ các nguồn

cơ chất khác nhau và thu nhận được DNJ có hoạt tính cao nhất trong môi trường có 4,5% đậu tương nghiền Sau quá trình tinh sạch đã tính được giá trị IC50 là 0,2µg/ml Bằng phương pháp khối phổ các nhà khoa học đã xác định chính xác công thức cấu tạo của DNJ thu được từ dịch lên men đậu tương bởi Bacillus subtilis

B2 [48, 50]

1.5 Sản xuất AGIs từ đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis

1.5.1 Ngu ồn cơ chất đậu đen

Đậu đen có tên khoa học là Vigna cylindrica Skeels hay là Vigna unguiculata theo phân loại khoa học đậu đen thuộc: Bộ (ordo): Fabales, họ (familia): Fabaceae , chi (genus): Vigna, loài (species): V.unguiculata [58]

Đậu đen là loài cây họ đậu mọc hằng năm, toàn thân không lông Lá kép gồm 3 lá chét mọc so le, lá chét giữa to và dài hơn lá chét hai bên Hoa màu tím nhạt Quả giáp dài, tròn, trong chứa 7 đến 10 hạt màu đen Đậu đen được trồng rất nhiều tại vùng nhiệt đới như Châu Á, Nam Mỹ như Việt Nam, Trung Quốc, Brazil Đậu đen không chỉ được dùng trong chế biến các loại thực phẩm như nước tương, tương khô và bột đậu mà còn dùng như một loại dược liệu

So với đậu tương, đậu đen có thành phần dinh dưỡng cao, trong hạt đậu đen

có chứa hàm lượng protein: 21-24% , lipid: 1,7 – 2,5 %, glucid: 46 - 53%, tro 1, 3 -

Bên cạnh các giá trị về dinh dưỡng, đậu đen còn chứa nhiều thành phần có

hoạt tính sinh học hữu ích Với hàm lượng chất xơ hòa tan cao, đậu đen là thực

phẩm rất có ích cho quá trình chuyển hóa glucose ở bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ Qua nghiên cứu các nhà khoa học phát hiện thấy, chất xơ hòa tan có khả năng hấp thụ nước trong dạ dày và hình thành loại gel làm giảm quá trình chuyển hóa carbohydrate có trong đậu đen do vậy không xuất hiện tình trạng tăng đường huyết sau khi ăn Sự có mặt của chất xơ còn làm giảm cholesterol, nó liên kết với acid mật

- thành phần làm tăng cholesterol Do không được cơ thể hấp thụ nên khi đào thải

ra ngoài, chất xơ mang theo cả acid mật và kết quả hàm lượng cholesterol của cơ

thể giảm theo Ngoài ra, do có chứa các chất xơ không hòa tan nên đậu đen có tác

dụng giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh táo bón, rối loạn tiêu hóa và các chứng bệnh khó

chịu có liên quan

Hiện nay trên thị trường có một số thực phẩm chức năng có chứa AGIs là sản

phẩm lên men trên cơ chất đậu đen bởi nấm mốc Aspergillus oryzae đã được công

nhận có tác dụng kiểm soát đường huyết, đó là các sản phẩm lên men truyền thống

của Nhật Bản với tên gọi là Touchi và Trung Quốc có tên gọi Douchi

1.5.2 Nguồn chủng vi khuẩn Bacillus subtillis

Nazi của Đức Ban đầu nó được sử dụng để điều trị các chứng bệnh viêm ruột, viêm

đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis

được biết đến là vi khuẩn bắt buộc ở đường ruột và ứng dụng nhiều trong sản xuất

chế phẩm probiotic trong y học, thực phẩm, chăn nuôi,

27

Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc bộ:

0,8 µm x 1,8 – 3 µm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, có khả năng di động nhờ lông roi Có khả năng sinh nội bào tử nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8µm Bào tử là một hình thức tiềm sinh của vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều kiện bất lợi như: môi trường nghèo dinh dưỡng, nhiệt độ, pH không thích hợp, môi trường tích luỹ nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi… Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm để trở về dạng tế bào sinh dưỡng

Hình 1.10 Khuẩn lạc B subtilis trên môi trường TSA (A) và hình thái tế bào,

bào t ử dưới kính hiển vi điện tử độ phóng đại 1000 lần (B)

tối ưu 37oC, thích hợp nhất với pH = 7,0 – 7,4 Trên môi trường thạch đĩa TSA (Tryptic Soy Agar) tạo khuẩn lạc có dạng hình tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm

sẩm màu, phát triển chậm, màu vàng xám, đường kính 3 - 5mm Sau 1- 4 ngày bề

mặt nhăn Trong môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) Bacillus subtilis phát triển

làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tan

đều khi lắc lên Trong quá trình sinh trưởng Bacillus subtilis cần nguồn dinh dưỡng

có chứa các nguyên tố C, H, O, N và các nguyên tố khoáng, vi lượng

Bào tử

Tế bào sinh dưỡng

28

protease, cellulase, pectinase… trên các nguồn cơ chất tương ứng Ngoài ra chúng còn có tính đối kháng với các loài vi khuẩn khác trong cùng môi trường sống do có

khả năng tiết ra ngoài môi trường xung quanh các hoạt chất kháng sinh như subtilin

và bacitracin Đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh và được sử dụng phổ

biến trong tạo chế phẩm probiotic trong y học và chăn nuôi [44]

Phần lớn chúng tồn tại ở trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng

10 - 100 triệu CFU/g [44]

lên men truyền thống tại một số nước Châu Á: Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Thái Lan và Việt Nam với các sản phẩm nổi tiếng như Natto, ChungKooKjang,

tương bần Từ đầu thế kỷ XX đến nay, Bacillus subtilis đã được sử dụng làm nguồn

giống cho sản xuất enzyme ngoại bào và được tổ chức JECFA FAO/WHO 1987

chấp nhận cho phép ứng dụng trong thực phẩm