Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở lúa việt nam

Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển để trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặ

- -

NGUYỄN THỊ AN TRANG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở

LÚA VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

- -

NGUYỄN THỊ AN TRANG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN Ở

LÚA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học

TS Lã Tuấn Nghĩa

ỘI 2012

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này

M ọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên c ứu khác Các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được công

b ố

Tôi xin hoàn toàn ch ịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

H ọc viên

Nguyễn Thị An Trang

L ỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lã Tuấn

Nghĩa, TS Lê Thanh Hà người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và chỉ bảo và hỗ

tr ợ tôi trong suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu

và hoàn thành lu ận văn này

Tôi xin bày t ỏ lòng biết ơn tới các thầy cô và cán bộ công tác tại Viện Công ngh ệ Sinh học thực phẩm, Viện Đào tạo Sau Đại học- Trường Đại học Bách khoa

Hà N ội đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

t ại trường

Tôi xin chân thành c ảm ơn các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Đa dạng sinh h ọc nông nghiệp – Trung tâm tài nguyên thực vật đã giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình công tác và th ực hiện luận văn

Cu ối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới gia đình, bạn bè và người thân đã động viên, khuyến khích giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình nghiên c ứu

Lu ận văn này được thực hiện với nguồn kinh phí từ chương trình Công nghệ sinh h ọc nông nghiệp

Hà n ội, ngày 19 tháng 2 năm 2013

H ọc viên

M ỤC LỤC

M Ở ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Gi ới thiệu chung về cây lúa 4

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây lúa 4

1.1.2 Nguồn tài nguyên lúa Việt Nam 6

1.2 H ạn hán và cơ chế chống chịu hạn ở thực vật 8

1.2.1 Khái niệm và phân loại hạn hán 8

1.2.2 Phân loại hạn hán đối với cây trồng 8

1.2.3 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn 9

1.2.4 Ảnh hưởng của hạn hán đối với cây lúa 10

1.2.5 Phản ứng của cây lúa với hạn hán 11

1.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 12

1.3.1 Đa dạng di truyền 12

1.3.2 Chỉ thị hình thái 13

1.3.3 Chỉ thị hóa sinh 14

1.3.4 Chỉ thị phân tử ADN 15

1.4 Thành t ựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa 22

1.4.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái 23

1.4.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh 25

1.4.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN 25

1.5 Nghiên c ứu lúa chịu hạn trên thế giới và Việt Nam 26

1.5.1 Nghiên cứu lúa chịu hạn trên thế giới 26

1.5.2 Nghiên cứu lúa chịu hạn ở Việt Nam 28

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 V ật liệu nghiên cứu 30

2.1.1 Các giống lúa nghiên cứu 30

2.2 Hóa ch ất và thiế bị nghiên cứu 32

2.3.Phương pháp nghiên cứu 34

2.3.1 Đánh giá khả năng chịu hạn của dòng/giống lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm 34

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số từ lá lúa 36

2.3.3 Kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN 37

2.3.4 Nhận dạng di truyền các giống lúa bằng chỉ thị SSR 37

2.4 Phân tích x ử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 K ết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng/giống lúa trong phòng thí nghi ệm 41

3.1.1 Kết quả đánh giá tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ rễ mầm đen (héo) ở giai đoạn nảy mầm 41

3.1.2 Đánh giá mức độ chống chịu hạn của 50 dòng/giống lúa 44

3.2 K ết quả đánh giả khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ 46

3.2 K ết quả tách chiết ADN tổng số 48

3.3 K ết quả phản ứng PCR và phân tích đa hình trên gel polyacrylamide 49

3.4 Quan h ệ di truyền liên quan đến tính chịu hạn của các dòng/giống lúa 56

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

4.1 K ết luận 64

4.2 Ki ến nghị 64

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 65

DANH M ỤC VIẾT TẮT

ABA : Abcisis acid

AFLP (Amplified Fragment Length

Polymorphism)

: Đa hình chiều dài đoạn khuếch đại

CSGE : Conformation Sensitive Gel

Electrophoresis

IRRI : Viện nghiên cứu lúa quốc tế

ISSR : Inter Simple Sequencen Repeat

Kb : Kilo base

LED : Late embryogenesis abundant

MAS : Marker Assisted Selection

Content)

QTL (quantity trait loci) Locus kiểm soát tính trạng số lượng

RAPD( RADNom Amplified

Polymorphic DNA)

: Đa hình ADN khuếch đại

RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism)

: Đa hình chiều dài đoạn phân cắt

SCARs : Sequence Characterized Amplified Regions

SDS : Sodium Dodecyl Sulphate

SNP (Single Nucleotide

Polymorphism )

SSR (Simple sequence repeat) : Trình tự lặp đơn giản

STMS : Sequence – tagged microsatellite marker

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách 50 mẫu dòng/ giống lúa trong nghiên cứu 30

Bảng 2.2 Danh sách 32 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 32

Bảng 2.3 Thang điểm đánh giá mức chống chiu hạn của lúa sau khi xử lý Saccarin1% và KClO3(3%) 35

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR (thể tích phản ứng 20µl/tube) 37

Bảng 2.5 Các bước phản ứng trong máy PCR 38

Bảng 2.6 Thành phần gel polyacrylamide 8% 38

Bảng 3.1 Tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ rễ mầm đen khi xử lý bằng dung dịch đường Saccarin 1 % và KClO3 3 % 42

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của 50 dòng/giống lúa ở giai đoạn mạ khi xử lý bằng dung dịch KClO3 (3%) trong 7 ngày 47

Bảng 3.3 Số băng ADN, số alen thể hiện, hệ số PIC của các chỉ thị nghiên cứu 50

Bảng 3.4 Tỷ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các dòng/giống lúa nghiên cứu 54

Bảng 3.5 Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây lúa đã được công bố 56

Bảng 3.6 Bảng ma trận tương đồng giữa 50 mẫu giống lúa nghiên cứu 59

DANH M ỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng 5

Hình 1.2 Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n 20

Hình 3.1 Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 41

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mức độ chống chịu hạn của 50 dòng/giống lúa ở giai đoạn nảy mầm 45

Hình 3.3 Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn mạ 46

Hình 3.4 Hình ảnh nhận dạng ADN tổng số của các mẫu dòng/giống lúa 48

Hình 3.5 Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM231 49

Hình 3.6 Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/ giống lúa bằng chỉ thị RM201 49

Hình 3.7 Kết quả nhận dạng di truyền của 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM240 49

Hình 3.8 Kết quả nhận dạng di truyền của 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM255 50

Hình 3.9 Kết quả nhận dạng di truyền 50 dòng/giống lúa bằng chỉ thị RM261 50

Hình 3.10 Sơ đồ hình cây quan hệ giữa các giống 61

M Ở ĐẦU

1 Tính c ấp thiết của đề tài

Lúa trồng (Oryza sativ L.) là cây lương thực lâu đời và phổ biến nhất trên thế

giới [50] Cây lúa được gieo trồng tại 114 quốc gia, tập trung chủ yếu ở Châu Á, Phi,

giao thông Thêm vào đó, các điều kiện bất lợi của môi trường như lũ lụt, hạn hán,

Theo đánh giá của các nhà chuyên môn, khô hạn sẽ là yếu tố chính gây ảnh hưởng đến an ninh lương thực thế giới, nó có thể làm giảm tới 70% năng suất cây trồng

nước trời ( mưa tự nhiên) Tuy nhiên do sự biến đổi khí hậu sẽ làm thay đổi tình hình

tăng 21% để đáp ứng nhu cầu lương thực cho 1,7% dân số tăng mỗi năm

vùng đồi núi nông nghiệp chủ yếu là đất dốc, kém màu mỡ và chưa có hệ thống

tưới tiêu chủ động, canh tác lúa và lương thực chủ yếu nhờ vào nước trời (rainfed)

đối lương thực trong cả nước giữa miền xuôi và miền núi thì cây lúa vẫn là cây

định cư ở những vùng này

Trước tình hình đó, chọn tạo các giống lúa chịu hạn phù hợp với tập quán và điệu kiện canh tác ở các vùng địa phương đang được nhà nước đầu tư Nhiều công

xã hội cao Tuy vậy, phương pháp chọn giống chịu hạn chủ yếu vẫn là truyền thống,

được đánh giá qua biểu hiện hình thái

đã trở nên hiệu quả hơn Trong đó, ứng dụng chỉ thị phân tử như RAPD, SSR, RFLP, AFLP được nghiên cứu và phát triển để trở thành công cụ mạnh mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể

rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo Vì vậy, chúng tôi tiến hành

h ạn ở lúa Việt Nam”

2 M ục đích của đề tài

3 N ội dung nghiên cứu của đề tài

tồn nguồn gen

4 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 50

- Địa điểm thực hiện nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được thực

CHƯƠNG 1

1.1.Gi ới thiệu chung về cây lúa

1.1.1 Ngu ồn gốc và phân loại cây lúa

đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều

loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [3]

vùng đầm lầy Đông Nam Á, có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau, sau đó do khí

Cotyledones), b ộ hòa thảo có hoa (Graminales), họ hòa thảo (Graminae), lúa trồng

trong đó có hai loài lúa trồng Loài Oryza sativa L trồng phổ biến trên thế giới và

vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh

Indica (được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, Thái Lan,

Ấn Độ, Mianma), có đặc điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng

rộng hơn hạ Indica, chỉ được trồng ở vài nơi thuộc Indonesia [13]

Theo điều kiện sinh thái, cây lúa chia làm hai loại, lúa cạn và lúa nước Lúa

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì lúa cạn do lúa nước biến đổi thành và

năng sinh trưởng phát triển bình thường trên ruộng có nước Đây là một đặc tính nông học của lúa cạn, khác với cây lúa trồng khác

là năng suất thấp

nhất định, hiệu suất sử dụng nước và tiềm năng năng suất cao [27]

Năng suất của các giống lúa cạn thường thấp do hai nguyên nhân chủ yếu:

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hóa hai loài lúa trồng

1.1.2 Ngu ồn tài nguyên lúa Việt Nam

đất cao rộng lớn ở nam Trung Bộ, hai đồng bằng lớn là đồng bằng sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long

đồng bằng sông Cửu Long lúa dại là nguồn lương thực quan trọng của nhân dân địa phương Cho đến thập kỷ 70 của thế kỷ 20, nông dân Nam Bộ vẫn còn nghề lượm lúa dại để lấy gạo ăn Ở Việt Nam có 4 loài lúa hoang dại [23]

cao nhất thế giới

- Oryza granulata : Ở các tỉnh vùng Tây Bắc, đang được các nhà khoa học khai thác nguồn gen chịu hạn

địa phương có đặc tính di truyền khác nhau:

lương thực chính nuôi sống các dân tộc ít người, và là một trong những nhóm lúa có

sự đa dạng di truyền cao nhất thế giới

ôn, chịu chua phèn, chịu đất nghèo lân, chịu rét trong thời kỳ mạ và thời kỳ lúa trỗ

nhất vô nhị

Lan là 3 nhóm giống lúa thơm chính trên thế giới

cạnh đó, có những giống lúa địa phương còn có khả năng chịu mặn, chịu phèn,

và có năng suất cao [15]

1.2 H ạn hán và cơ chế chống chịu hạn ở thực vật

1.2.1 Khái ni ệm và phân loại hạn hán

phát triển của cây

đối với sản suất lúa khoảng 1,024 triêu đôla [65]

1.2.2 Phân lo ại hạn hán đối với cây trồng

 H ạn không khí

Hạn không khí thường có đặc trưng là nhiệt độ cao (390 - 420C) và độ ấm thấp

nam nước Pháp làm ảnh hưởng nghiệm trọng đến một số loại cây trồng như phong lan, cam, chanh,đậu tương…[11]

khí thường gây ra hiện tượng héo tạm thời, vì nhiệt độ cao, ẩm thấp làm cho tốc độ thoát hơi nước nhanh vượt quá mức bình thường, lúc đó rễ hút nước không đủ để bù đắp lại lượng nước mất, cây lâm vào trạng thái mất cân bằng về nước Mức độ phản ứng của cây đới với sự mất nước sẽ tùy thuộc vào giai đoạn phát triển của chúng Riêng đối với cây lúa hạn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đặc biệt vào thời kỳ bắt đầu hình thành các cơ quan sinh sản cho đến lúc kết thúc quả trình thụ phấn Hạn không

thiếu) làm cho hạt phấn không có khẳ năng nảy mầm, quá trình thụ tinh không xảy

ra và hạt bị nép [11]

 H ạn đất

năng giữ nước của đất Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đất tăng cao đến

đất có thể xảy ra ở bất kỳ vùng đất nào và thường xảy ra nhiều ở những vùng có điều kiện khí hậu, địa hình, địa chất, thổ nhưỡng đặc thù như sa mạc ở Châu Phi, đất đồi trọc của Châu Á, mùa ít mưa nhất và nhiệt độ thấp ở châu Âu Tóm lại hạn đất tác động trực tiếp lên bộ phận rễ của cây làm ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây nói chung [11]

 H ạn toàn diện

hàm lượng nước trong lá giảm nhanh dần đến nồng độ dịch bào tăng lên, mặc dù sức hút nước từ rễ của cây cũng tăng nhưng lượng nước trong đất đã cạn kiệt không đủ

suất lúa vào các tháng cuối hè

1.2.3 Cơ sở di truyền của tính chịu hạn

(Component traits) Trong đó người ta nhận thấy rằng cơ chế chống chịu khô hạn

cơ bản là giống nhau ở các loài cây trồng Đặc biệt sự giống nhau thể hiện ở mức

độ phân tử rõ ràng hơn so với sinh lý học và hình thái học Do vậy chúng ta có thể nghiên cứu từ một cây rồi suy diễn ra đối với nhiều cây khác [65]

Đáp ứng lại hiện tượng stress do khô hạn, cây trồng có một cơ chế rất tiến bộ

trường,vật lý, hóa học (Soltis và Soltis, 2003) Để chống chịu với điều kiện khô hạn

trehalose, betaine và mannitol, đóng vai trò như những thể bảo vệ thẩm thấu (osmoprotestant), trong vài trường hợp, chúng ổn định được các phân tử chức năng dưới điều kiện bị stress [70], giảm nồng độ các hoocmon kích thích (Auxin,

cường độ thoát hơi nước, ABA xúc tiến quá trình tổng hợp protein và amino axit có

(Late embryogenesis abundant) cũng được chú ý trong điều kiện bị stress do thiếu nước [87] Protein này có chức năng ổn định màng tế bào [87] Sự thể hiện của protein LEA và đặc điểm cấu trúc đại phân tử của nó cho thấy vai trò bảo vệ cây

kinase, DREB genes, calcium – dependent protein kinase, endo – 1,3 – glucanase,

năng hoạt động kênh nước, Expansin chức năng điều khiển sự mở rộng của thành tế

1.2.4 Ảnh hưởng của hạn hán đối với cây lúa

Nước vừa là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng là các quá trình

vậy việc cung cấp nước cho cây là biện pháp canh tác và hướng nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn của cây trồng là mục tiêu tạo ra giống luôn được quan tâm

và mô bị tổn thương và chết [78]

Đối với cây lúa, đặc biệt là lúa nước thì Paleg (1991)[61] cho rằng nếu lượng nước trong đất chỉ còn 50% lượng nước cần thiết thì mức độ ảnh hưởng năng suất

phụ thuộc vào giai đoạn phát triển:

trỗ bông

đang trỗ bông và thụ phấn

địa phương phải hủy bỏ lúa đang trong thời kỳ đẻ nhánh để cấy lúa lại

kiện hạn hán [62]

1.2.5 Ph ản ứng của cây lúa với hạn hán

nước Đồng thời phiến lá mỏng hơn, nhiều lông hơn để hạn chế sự tích tụ nhiệt [92]

đó là nâng cao hiệu suất quang hợp trước khi xảy ra hiện tượng đóng khí khổng khi

gặp điều kiện hạn[92]

cường độ bức xạ trên bề mặt lá tăng cường ánh sáng đi xuống dưới và duy trì trạng thái thoát hơi nước bề mặt lá ở mức độ tối thiểu [92]

đó vận chuyển lên lá, đẩy nhanh tốc độ già hóa của lá, đóng khí khổng làm giảm sự

hiện tượng tăng bề mặt lá [92]

nước tầng sâu Khi bắt đầu gặp điều kiện hạn ở giai đoạn cây con, khối lượng rễ và

tỉ lệ rễ/thân lá tăng lên, sinh nhiều rễ đốt vì rễ đốt có thể đâm sâu vào các lớp đất, do

đó tăng cường khả năng hấp thụ nước đồng thời khi gặp hạn tốc độ dài của rễ lớn hơn tốc độ dài của lá Ở các giống lúa chịu hạn (CH5; 103S - R20 và Toitsu) Chiều

nước lớn

cũng làm tăng khả năng chống đổ [92]

1 3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

1.3.1 Đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay Giữ gìn và bảo tồn đa

cấp độ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất, nhưng đa dạng di truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hóa và thích

đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [72]

Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở nguồn gen và kiểu gen trong

thể hiện ra bên ngoài để tạo ra các dạng khác biệt nhau [12]

điểm hình thái Với các phương pháp phân tích mới, người ta đã thấy rằng biến dị di

trong như dưới loài, thứ và quần thể Xét về thực chất, mức độ đa dạng di truyền

hệ gen hay không

thu được ưu thế lai cao nhất Đó là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nòi giống,

cảnh [15]

1.3.2 Ch ỉ thị hình thái

giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận)

hạn chế: (i): Số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thị hình thái chịu tác động

gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được Vì thế cho đến nay, các nhà

sinh hóa và chỉ thị ADN để đạt được kết quả chính xác nhất [4]

1.3.3 Ch ỉ thị hóa sinh

nhau Điện di protein trên gel là phương pháp hữu hiệu có thể giúp phân biệt, nhận

được sử dụng như những chỉ tiêu đánh giá, phân biệt các sinh vật được gọi là chỉ thị

tác động của điện trường, các isozyme biến tính sẽ phân tích trên gel dựa trên khối lượng và độ tích điện Từ sự đa hình các băng điện di thu được sec giúp nhận diện

So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hóa sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein

(protein, enzyme…) không cho sự đa hình rõ ràng Cho nên loại chỉ thị này cũng chưa phản ánh thật chính xác bản chất di truyền của mỗi tính trạng Do đó khả năng ứng dụng của chỉ thị hóa sinh còn hạn chế rất nhiều Bởi vậy trong hầu hết những

1.3.4 Ch ỉ thị phân tử ADN

được sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc

giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, dùng để lựa

chọn tổ hợp lai

thị di truyền phân tử có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô

1.3.4.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)

Năm 1980, Botstein và cs đã phát minh ra phương pháp RFLP (đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn)

những đoạn có kích thước khác nhau Khi điện di những đoạn này sẽ phân bố ở

được chuyển lên màng cellulose băng nylon Trong quá trình lai ADN tiếp theo, nếu

được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau [10]

RFLP là chỉ thị đồng trội được sử dụng phổ biến trong tạo giống cây trồng với nhiều

tích đa hình di truyền Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời

1.3.4.2 Ch ỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chi ều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc

trưng để xác định mức độ quan hệ giữa các giống, loài và là nguồn chỉ thị di truyền cho lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các đặc điểm hình thái, năng suất, chất lượng hoặc các locus gen khác [81]

hợp (adapter)

• Khuếch đại tiền chọn lọc bằng cặp mồi tiền chọn lọc

nhau

• Phân tích trên gel các đoạn ADN được nhân lên

lượng lớn các đoạn cắt giới hạn (50 - 100 đoạn) Mỗi đoạn bao gồm một phần cố định dài hơn 15bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn và một phần thay đổi

được xác định bằng sự có mặt hoặc không có mặt của một phân đoạn ADN Sản

sản phẩm

Ưu điểm: là một kỹ thuật có độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ

trong lập bản đồ hệ gen (Thomas và cs 1995) và chọn giống (Vos và cs 1995) [81]

AFLP cho đa hình cao, vì vậy kỹ thuật AFLP hứa hẹn cho phép xem xét kỹ sự

đa hình ở một số lượng lớn locus trong một thời gian rất ngắn và đòi hỏi một lượng rất

lý tưởng cho hàng loạt nghiên cứu di truyền (Maughan và cs 1996) [81]

Nhược điểm: AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân

cho nghiên cứu là tương đối cao [81], [47]

1.3.4.3 Ch ỉ thị RAPD (RADNom Amplified Polymorphic DNA – ADN đa hình được nhân bội ngẫu nhiên)

Năm 1990, William và Welsh trong nghiên cứu độc lập đã phát triển chỉ thị

hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên bằng sử dụng một mồi đơn chứa

dụng các đoạn mồi đơn dài 10 nucleotide và có trình tự tùy ý để phân tích đa

RAPD đã được thống nhất theo phương pháp của William và cs (1990) là sử

tự ngẫu nhiên [8]

Điểm khác của RAPD so với các chỉ thị khác là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào trong hệ gen khi tìm được vị

vào độ dài và vị trí các đoạn mồi, kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc ADN

ADN khác nhau được nhân bản

thân thuộc giữa các quần thể, loài vi sinh vật, giống cây trồng hay các cá thể để phục

như chỉ thị phân tử để xác định kiểu gen kiểm soát hoặc liên quan đến một tính trạng nào đó ở sinh vật

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD nếu hai cá thể có

này sẽ thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể nghiên cứu [81]

Ưu điểm: Nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích là thấp, không cần biết

những thông tin về trình tự , dễ dàng phân tích cho số lượng mẫu lớn

Nhược điểm: Đây là một kỹ thuật nhạy cảm, phụ thuộc vào điều kiện thí

đồng trội nên không thể nhân biết được cá thể dị hợp tử Khó nhận biết những đoạn cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen [31]

Để khắc phục những hạn chế này người ta nhân những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế mồi những đoạn dài khoảng 20bp từ cả hai đầu gọi là chỉ thị SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions)

1.3.4.4 Ch ỉ thị SSR (Simple sequence repeat)

nucleotide đơn giản Hiện nay, hơn 15000 chỉ thị SSR đã được thiết lập (www.gramene.org, 2006), phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa [37] Nhiều

công trình sử dụng chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền đã được công bố [49],[46],[55],[58] Ngoài ra, chỉ thị SSR còn được dùng để chọn lọc tính kháng

tương (Lương Thị Thu Hương, 2006), xây dựng bản đồ liên kết (Zhao, 1993)… [7],[5],[41] Chỉ thị SSR có hai ưu điểm lớn so với các chỉ thị ADN khác

Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn

các loài có mối quan hệ di truyền gần gũi [7],[66]

hợp tử ở locut đó (chỉ thị đồng trội)

[7], [41], [48], [77], điều này rât phù hợp với các nghiên cứu di truyền quẩn thể như đánh giá đa dạng di truyền, lập bản đồ gen, chọn giống phân tử… Một số nghiên

AFLP, RAPD… đã khẳng định những ưu điểm của SSR so với các chỉ thị trên (Garcia và cs, 2004) [[36], [74]

Hình 1.2 Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT) n

tượng nghiên cứu Quy trình phát triển chỉ thị SSR gồm hai giai đoạn chính là xác định các trình tự lặp trên hệ gen và thiết kế mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự đó, đây là

phá đầy đủ Theo Brown và cs (1996)[28][31], có ba hướng chính trong phát triển

và thiết kết mồi SSR [54]

phương pháp khác nhau và được ứng dụng ở một số đối tượng như khoai tây

hàng EST thì việc phân lập và phát triển chỉ thị SSR dựa trên cơ sở trình tự sẵn có

đã trở thành hướng đi nhanh chóng, đơn giản, ít tốn kém và ngày càng phổ biến [34], [75]

1.3.4.5 Ch ỉ thị ISSR (Inter – Simple Sequencen Repeat)

hướng ngược chiều nhau sử dụng một loại mồi duy nhất (dài 15-25 nucleotit) có

để thiết kế mồi ISSR thì số lượng IRRS gần như là không giới hạn [43],[47]

truyền

marker) và DAMD-PCR (Direct Amplification of Minisatellite ADN marker [47]

1.3.4.6 Ch ỉ thị ADN dựa trên trình tự ADN

Trong số nhiều dạng đột biến xảy ra tự nhiên trong hệ gen, sự thay đổi một nucleotit (các đột biến điểm hay hiện tượng đa hình nucleotit đơn- SNP)( Single

có lợi cho cơ thể [43] SNP là chỉ thị rất phù hợp cho nghiên cứu đa dạng di tryền và

đa dạng quần thể bởi số lượng lớn (mỗi 1000bp hệ gen có một SNP) và có thể áp

cứu đáp ứng thuốc) Đến nay, SNP đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền thực vật [63]

đặc hiệu các vùng bảo thủ rADN, STS… [72]

1.3.4.7 M ột số loại chỉ thị ADN khác

trí nucleotit khác nhau cũng có thể mang hình dạng khác nhau Bằng phương pháp điện di có thể phát hiện được sự đa hình (về hình dạng) giữa các đoạn ADN này (chỉ

Electrophoresis) [47], [84]

được phát triển và ứng dụng, làm phong phú hơn những công cụ sử dụng trong

chính xác và chi tiết hơn Tuy nhiên, các chỉ thị này yêu cầu kĩ thuật và chi phí cao hơn các loại chỉ thị ADN trước (RAPD, SSR…) Đây chính là điểm cơ bản hạn chế

1.4 Thành t ựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền lúa

Lúa là cây lương thực chủ đạo trong nền nông nghiệp của nhiều nước trong

được nhiều quốc gia quan tậm Vì vậy, đến nay các nhà chọn giống đã sử dụng

lượng gạo tốt, kháng với sâu bệnh chính và chống chịu những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn [1], [39]

trạng được nhắm đến trong quá trình lại tạo bị thu hẹp, bởi vậy giữa các giống lúa

canh tác như thay thế giống truyền thống bằng giống lúa lai làm mất dần đi nguồn

giống là yêu cầu rất cấp thiết

1.4.1 Nghiên c ứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hình thái

thành hai nhóm là Indica và Japonica [24]

Chang và cs., [32] xác định tính trạng chiều dài hạt thóc và tỷ lệ dài hạt/rộng

tiêu như độ dài của trụ gian lá mầm, độ phân hủy kiềm, chiều dài/rộng hạt, phản ứng

phương trên 1000 giống thu thập từ các nước Ấn Độ, Đông Dương, Trung Quốc và

phân tích tương quan 11 tính trạng cho thấy các giống lúa nghiên cứu được chia

thành hai nhóm (i) nhóm bắt màu dung dịch phenol (dạng hình Indica) và (ii) Là

Ở Việt Nam, đặc điểm hình thái được sử dụng phổ biến trong đánh giá các

Năm 2006, Lưu Ngọc Trình đã đánh giá đầy đủ 60 tính trạng hình thái nông học của

1.4.2 Nghiên c ứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh

Đánh giá đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị hóa sinh được sử dụng rộng rãi từ

đẳng men (isozym) của hai loại lúa trồng Châu Á (Oryza sativa) và lúa trồng Châu

Indica và Japonica

đó nhóm Indica và Japonica là hai nhóm đối cực theo phân loại của Chang (1976)

Javanica là lúa Japonica nhiệt đới

Cho đến nay, các nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua chỉ thị hóa sinh của

Năm 1999, Nguyễn Văn Tạo đã phân tích đa dạng di truyền 53 lúa miền Nam

trong giống [60]

1.4.3 Nghiên c ứu đa dạng di truyền lúa bằng chỉ thị ADN

AFLP, SSR…

trước trình tự ADN, RAPD là chỉ thị được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu

đa dạng di truyền lúa Virk và cs., (1995) [80] đã nghiên cứu đa dạng di truyền lúa

và xác định các giống trùng lặp với 47 mẫu của 44 giống trong tập đoàn nguồn gen lúa đang bảo quản tại IRRI Bùi Chí Bửu và cs., 1999 [2], đã sử dụng 20 chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền 72 giống lúa địa phương Việt Nam

Do có nhược điểm kém ổn định nên một số nghiên cứu đã kết hợp chỉ thị

trên đều có thể áp dụng tốt cho nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa [56]

chọn giống lúa lai

động di truyền trong giống của 71 giống lúa Kết quả cho thấy các giống lúa địa phương có mức đa dạng, hỗn tạp và dị hợp tử cao hơn các giống lúa cải tiến Cả hai phương pháp này đều cho thấy số lượng alen ở các giống lúa địa phương cao hơn

nương Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt di truyền giữa nhóm 2 và nhóm 3 liên

quan đến biến dị di truyền trong phân loài phụ lúa Japonica

1.5 Nghiên c ứu lúa chịu hạn trên thế giới và Việt Nam

1.5.1 Nghiên c ứu lúa chịu hạn trên thế giới

được bắt đầu với phân tích QTL bản đồ di truyền lúa bao phủ toàn bộ hệ gen lúa

liệu có liên quan Ware và cs, (2002) [83]

cs (2004) [45]

Trên thế giới nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu

điều kiện bị stress do khô hạn, bằng phương pháp cDNA microarray Các giống đã được sử dụng IRAT109, Haogelao, Han 297 (lúa cạn) Zhongzuo 93, Yuefu,

được khả năng chống chịu stress do khô hạn trong lúa nước và những loài cây trồng

có liên quan gần về huyết thống [79]

Đã phát hiện được 32 locus tính trạng số lượng QLT của lúa liên kết gen kháng hạn

đã được xác định nằm trên các NST số 1, 2, 4, 8 và 9 [64],[90], [88] Các gen kháng

lượng Abscicis acid; điều hòa khí khổng (stomatal regulation); Trạng thái nước của

lá (leaf water status) và hình thái rễ (root morphology) [91]

lúa dài, trọng lượng rễ dài / thân chồi, trọng lượng rễ dài / số chồi, chiều dài rễ tối

đa, độ dầy của rễ, trọng lượng rễ tổng số liên quan tới khả năng chịu hạn của lúa

thiết lập bản đồ QTL

Các tính trạng số lượng (QTL) ở cây lúa ở giai đoạn mạ: tổng số rễ, thể tích rễ,

số chồi, tỉ lệ rễ /chồi, chiều dài rễ tối đa, điểm chống chịu khô hạn, độ dày của rễ,

C039/Moroberekan, IR64/Azucena, Palawan/1R42, Tesanai2/CB và Waiyin/CB,

với các QTL

1.5.2 Nghiên c ứu lúa chịu hạn ở Việt Nam

vùng canh tác khó khăn Các nhà sinh lý cho rằng, áp suất thẩm thấu đóng vai trò

đây khẳng định: áp suất thẩm thấu cũng liên quan đến tỷ lệ nảy mầm và đề nghị sử

được, tác giả đề xuất một mô hình chọn giống lúa chịu hạn Với thí nghiệm đánh giá

lọc các giống lúa chịu hạn

Trong giai đoạn 1995-1997, Vũ Tuyên Hoàng, Trương Văn Kính và cộng sự

nước tưới Đó là các giống CH5, CH7 và giống CH132 Năm 2002, giống CH5 được công nhận là giống quốc gia với những ưu điểm về khả năng chống chịu hạn,

về nước

Hinh, Trương Văn Kính (2002) [22] công bố vai trò của gen chống hạn trong sự

điều chỉnh hàm lượng proline trong lá lúa trong điều kiện môi trường thay đổi Trong điều kiện khủng hoảng nước, hàm lượng proline có sự khác nhau giữa các

proline trong lá cao, đặc điểm chịu hạn và mức suy giảm năng suất thấp Sự khác

gen đối với cơ chế chống lại sự mất nước ở điều kiện gieo trồng cạn

Ở Việt Nam, nghiên cứu nguồn gen chịu hạn ở mức độ phân tử đã được tiến

nương sử dụng chỉ thị phân tử do tổ chức Rockefeller tài trợ đã được tiến hành tại

[20][16]

Năm 2010, Nguyễn Thị Lang và cs [14] đã xác định được 42 giống/dòng lúa có

cũng thiết lập bản đồ QLT điều khiển chống chịu khô hạn trên quần thể BC2F2 tổ

kiểu hình tập trung vào 3 tính trạng chống chịu hạn vào thời kì trỗ hoa, chiều dài rễ,

số 2, 3, 4, 8, 9, 10 và 12

bằng chỉ thị chỉ thị SSR được xây dựng từ 12 nhiễm sắc thể của lúa Kết quả đã cho ra

234 đa hình và tìm được 46 locus Trong số 50 chỉ thị SSR sử dụng, 45 chỉ thị cho đa hình tại 46 locus giữa các giống lúa nếp nghiên cứu, 44 trong tổng số 45 chỉ thị cho đa

locus biến động từ 2 đến 10, đạt trung bình 5 alen Chỉ thị cho số lượng alen nhiều nhất

còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn giống lúa chất lượng cao [21]

CHƯƠNG 2

2.1 V ật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các gi ống lúa nghiên cứu

Qua đánh giá sơ bộ chúng tôi đã lựa chọn 50 mẫu giống lúa được cung cấp

B ảng 2.1 Danh sách 50 mẫu dòng/ giống lúa trong nghiên cứu