Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

NGUYỄN THỊ MAI LIÊN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ ỔI ĐÀO SAU KHI SẢN XUẤT NƯỚC ÉP VÀ HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH OXY HÓA THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÀU CHẤT BÉO

NGUYỄN THỊ MAI LIÊN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ ỔI ĐÀO SAU KHI SẢN XUẤT NƯỚC ÉP VÀ HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH OXY HÓA THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÀU CHẤT BÉO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên nghành: Công nghệ Thực phẩm

Khóa học: 2016 - 2020

Thái Nguyên - 2020

NGUYỄN THỊ MAI LIÊN

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ BÃ ỔI ĐÀO SAU KHI SẢN XUẤT NƯỚC ÉP VÀ HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH OXY HÓA THỨC ĂN CHĂN NUÔI GIÀU CHẤT BÉO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên nghành: Công nghệ Thực phẩm

Khóa học: 2016 - 2020 Người hướng dẫn: TS Lương Hùng Tiến

Thái Nguyên - 2020

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Nghiên cứu tách chiết polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất

nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo” là nội dung em lựa chọn để nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp

sau bốn năm theo học chuyên ngành Công nghệ thực phẩm tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, trước tiên

em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, các phòng ban liên quan, Ban chủ nhiệm khoa CNSH - CNTP đã giảng dạy, hướng dẫn để em có những kiến thức như ngày hôm nay

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo hướng dẫn: TS Lương

Hùng Tiến thuộc khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm trường Đại

học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học

Tiếp theo em xin cảm ơn Th.S Lưu Hồng Sơn và các cán bộ thuộc khoa

Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm đã hướng dẫn các kỹ năng trong phòng thí nghiệm, động viên tinh thần và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu để hoàn thành tốt đề tài

Trong quá trình thực hiện nghiên cứu không thể tránh khỏi những thiếu sót nên em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Liên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 18 Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 19 Bảng 3.3 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu 27 Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố và hàm lượng polyphenol

của dịch chiết bã ổi đào 27 Bảng 4.1 Bảng so sánh hàm lượng polyphenol thu được ở các loại dung môi

khác nhau 37 Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến

hàm lượng polyphenol 38 Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng

polyphenol 38 Bảng 4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng

polyphenol 39 Bảng 4.5 Kết quả ma trận thực nghiệm Box- Behnken ba yếu tố chiết Polyphenol

từ bã ổi đào 40 Bảng 4.6 Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết polyphenol từ

bã ổi đào 41 Bảng 4.7 Kết quả đáng giá chỉ tiêu vi sinh vật theo 10TCN 863:2006 44 Bảng 4.8 Chỉ số axit và chỉ số peroxyt ban đầu của thức ăn chăn nuôi 44 Bảng 4.9 Sự biến đổi chỉ số axit và chỉ số peroxyt của thức ăn chăn nuôi có bổ sung

dịch chiết polyphenol trong 30 ngày bảo quản 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Quả ổi 3

Hình 2.2 Lá, Hoa, Quả và hạt, thân và vỏ cây ổi 4

Hình 2.3 a) Quả ổi ruột đỏ b) Quả ổi ruột trắng 4

Hình 2.4 Epicatechin 9

Hình 2.5 Epigalocatechin 9

Hình 2.6 Quercetin 9

Hình 2.7 Kampherol 9

Hình 2.8 Antocyanidin 10

Hình 2.9 Polyphenol 10

Hình 4.1 Bề mặt đáp ứng hàm lượng polyphenol 42

Hình 4.2 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu ở hàm lượng polyphenol 42

Hình 4.3 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết bã ổi đào 43

Hình 4.4 Sơ đồ hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol 46

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỤC LỤC v

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây ổi 3

2.1.1 Đặc điểm thực vật 3

2.1.2 Đặc điểm phân bố và sinh thái 4

2.1.3 Thành phần hóa học của quả ổi 4

2.1.4 Hoạt tính sinh học và công dụng 5

2.2 Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất polyphenol 7

2.2.1 Polyphenol 7

2.2.2 Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol 11

2.3 Gốc tự do, quá trình oxy hóa chất béo 13

2.3.1 Gốc tự do 13

2.3.2 Quá trình oxy hóa 14

2.3.3 Biện pháp hạn chế quá trình oxy hóa 14

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5] 14

2.4.1 Loại dung môi 14

2.4.2 Tỷ lệ dung môi trên nước 15

2.4.3 Thời gian chiết 15

2.4.4 Nhiệt độ chiết 15

2.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15

2.5.1 Trên thế giới 15

2.5.2 Trong nước 17

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu 18

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 18

3.1.2 Hoá chất sử dụng 18

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 19

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu 19

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu 20

3.2.3 Thời gian nghiên cứu 20

3.3 Nội dung nghiên cứu 20

3.4 Phương pháp phân tích 20

3.4.1 Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu 20

3.4.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số 22

3.5 Phương pháp nghiên cứu 22

3.5.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 22

3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 4: Đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol bằng thử nghiệm DPPH và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 28

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu nội dung 5: Hoàn thiện quy trình thu dịch chiết từ bã quả ổi đào 35

3.6 Phương pháp xử lý số liệu 35

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Kết quả đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu 36

4.1.1 Kết quả xác định trọng lượng khô của nguyên liệu 36

4.1.2 Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số 36

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào 37

4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi và nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol 37

4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi trên nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol 37

4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol 38

4.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol 39

4.3 Thử nghiệm tách chiết trên điều kiện tối ưu 40

4.3.1 Kết quả thử nghiệm tối ưu hóa quá trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào 40 4.4 Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 42

4.4.1 Kết quả xác định khả năng chống oxy hóa của dịch chiết bã ổi đào thông qua khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 42

4.4.2 Kết quả ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 44

4.4.3 Khảo sát hàm lượng chất béo có trong thức ăn chăn nuôi giàu chất béo 44

4.5 Hoàn thiện quy trình tách chiết polyphenol từ bã ổi đào 46

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây việc tiêu thụ nhiều loại nước trái cây nhiệt đới có giá trị dinh dưỡng đã tăng lên đáng kể Quả ổi là một nguồn thực phẩm có nhiều chất chống oxy hóa như polyphenol và β-carotenes [9, 10 và 11] Trong ổi cũng có một lượng lớn vitamin như axit ascorbic [11] và là một nguồn chứa rất nhiều các khoáng chất quan trọng như photpho, canxi, và sắt [10, 12] Hơn nữa, quả ổi có thể được làm thành nhiều dạng sản phẩm thực phẩm nhờ có mùi hương rất đặc biệt Quả ổi còn được sử dụng để sản xuất sản phẩm nước ép công nghiệp hay phối trộn với các loại nước ép khác Sau khi sản xuất nước ép ổi đào, lượng bã còn lại cũng

có thể được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Các nghiên cứu đã được tiến hành trên lượng bã còn sót lại từ quá trình sản xuất nước ổi ép cho thấy vẫn còn các hợp chất polyphenol như axit polyphenol và flavonoid, là các hợp chất chống oxy hóa.Việc tái sử dụng một cách hiệu quả lượng bã quả ổi thừa có thể là nguồn cung cấp polyphenol quan trọng, thể hiện qua nghiên cứu gần đây của Jimenez-Escrig và cộng sự [13] Vì vậy tách chiết triệt để các hợp chất có giá trị từ bã quả ổi sau khi ép giúp tránh lãng phí một cách có hiệu quả Việt Nam là một quốc gia nhiệt đới sản xuất nhiều loại nước trái cây như: ổi, măng cụt, sầu riêng, Quả ổi là một trong những loại trái cây hàng đầu được phân phối trên toàn quốc Tuy nhiên việc bảo quản còn nhiều hạn chế, do thực tế quả ổi rất dễ thâm sạm, hư hỏng và không thể cất giữ trong một thời gian dài nếu như không có nguồn ra là các nhà máy sản xuất hoặc siêu thị sẽ dẫn đến giá bán giảm và dẫn đến thua lỗ cho nông dân Do đó, nghiên cứu này nhằm mục đích tận dụng triệt để các hoạt chất còn sót lại trong bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép của các nhà máy để sử dụng làm sản phẩm phụ phẩm

có giá trị Các polyphenol không chỉ là các hoạt chất đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe của con người mà chúng còn đóng vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe của vật nuôi Bên cạnh đó thức ăn thành phẩm rất dễ bị oxy hóa đặc biệt đối với thức ăn thành phẩm có hàm lượng chất béo cao hoặc thức ăn được bảo quản trong thời gian dài ở điều kiện không thuận lợi gây ra mùi khó chịu và làm hao hụt dinh dưỡng trong thức ăn của vật nuôi

Từ lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tách chiết

polyphenol từ bã ổi đào sau khi sản xuất nước ép và hướng tới ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa thức ăn chăn nuôi giàu chất béo”

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào sau khi sản xuất nước ép ổi đào

- Đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết và hướng tới ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

1.3 Yêu cầu

- Đánh giá được thành phần nguyên liệu ban đầu

- Nghiên cứu lựa chọn được một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp

- Tối ưu hóa được điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn

- Đánh giá được hoạt tính sinh học của dịch chiết polyphenol và thử nghiệm kiểm soát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết polyphenol trong việc bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

- Hoàn thiện được quy trình tách chiết dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích

1.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Tạo ra quy trình tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào và đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết

Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn

Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy được kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục vụ cho cho công tác sau này

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Góp phần gia tăng hiệu quả kinh tế cho người dân trồng ổi với khả năng tận dụng phụ phẩm từ quả ổi

Hướng tới ứng dụng thử nghiệm polyphenol từ bã quả ổi vào bảo quản thức

ăn chăn nuôi ngăn ngừa sự oxy hóa chất béo

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây ổi

Ổi (danh pháp khoa học: Psidium guajava) là loài cây ăn quả thường xanh

lâu năm, thuộc họ Đào kim nương, có nguồn gốc từ Brasil được Carl Linnaeus mô

tả khoa học đầu tiên vào năm 1753

Cây Ổi thuộc:

Hình 2.1 Quả ổi

2.1.1 Đặc điểm thực vật

Chi Psidium có 3 loài chính là:

- Psidium littorale Raddi (ổi xẻ): cây gỗ nhỏ, cao khoảng 6m, nhánh tròn Lá

không có lông Hoa đơn độc mọc ở nách lá, màu trắng [2]

- Psidium cujavillus Burm (ổi cảnh): cây gỗ nhỏ, cao 2 - 3m, nhánh non

vuông Lá có phiến nhỏ, dài 3 - 5cm, rộng 1 - 1,8cm; gân phụ 11 - 15 cặp, cuống lá dài 1 - 2mm Hoa trắng, đơn độc mọc ở kẽ lá, cọng ngắn, lá đài dày, nhiều nhị Quả tròn, to khoảng 2 - 3,5cm, hột nhiều, nhỏ [2]

- Psidium guajava L là cây gỗ cao 3 - 5m, cành non vuông, có lông mềm,

cành già hình trụ nhẵn Thân có vỏ mỏng, trơn nhẵn, khi già bong ra từng mảng Lá đơn, mọc đối, hình bầu dục, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ Hoa trắng mọc đơn độc hoặc tập trung 2 - 3 cái ở kẽ lá, có 4 - 5 cánh hoa, rất nhiều nhị, chỉ nhị rời, bao phấn có trung đới rộng, bầu dưới 5 ô dính vào ống đài Quả hình

cầu, khi xanh có vị chua chát, khi chín màu vàng, ruột màu đỏ, trắng hoặc vàng, có

vị ngọt Quả mọng, ở đầu quả có sẹo của đài tồn tại, có rất nhiều hạt hình thận [3]

Hình 2.2 Lá, hoa, quả và hạt, thân và vỏ cây ổi

2.1.2 Đặc điểm phân bố và sinh thái

Ở Việt Nam, ổi là cây ăn quả quan trọng được trồng hầu như ở khắp các địa phương cả vùng đồng bằng và vùng miền núi, tuy nhiên chúng không có ở những vùng cao trên 1500m Ổi trồng có khoảng 7 - 10 giống khác nhau, là cây ưa sáng, sinh trưởng phát triển tốt trong một giới hạn rộng của vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, ra hoa và quả hàng năm [4]

Hình 2.3 a) Quả ổi ruột đỏ b) Quả ổi ruột trắng

2.1.3 Thành phần hóa học của quả ổi

Thành phần hóa học của quả ổi bao gồm: Flavonoid, tanin, tinh dầu, vitamin

- Tinh dầu: β-carophylen (24,1%), nerolidol (17,3%), 3-phenyl acetat (5,3%), carophyllen oxid (5,1%) [20]

- Các thành phần khác:

+ Quả ổi rất giàu giá trị dinh dưỡng Phân tích thành phần hóa học của quả ổi ở

Ấn Độ cho thấy: nước (81,7%), protein (0,9%), chất béo (0,3%), sợi (5,2%), các hydrat carbon chủ yếu ở dạng đường khử (11,2%), các hợp chất vô cơ (0,7%), Ca, Mg, acid oxalic, P, Fe, Na, Cu, sulfua, thiamin, riboflavin, acid nicotinic, vitamin C [4]

+ Hàm lượng vitamin C trong quả ổi gấp 4 - 10 lần quả chanh, chúng thay đổi khá nhiều, trung bình từ 100 - 1000mg/100g, nhiều nhất ở phần vỏ quả rồi đến phần cùi [4]

+ Hạt ổi chiếm 6 - 12% trọng lượng quả và có khoảng 14% một chất dầu béo

có mùi thơm [4]

2.1.4 Hoạt tính sinh học và công dụng

Ổi không chỉ là một nguồn thực phẩm dinh dưỡng mà còn giống như một loại thuốc dân gian được sử dụng rộng rãi ở các khu vực cận nhiệt đới trên toàn thế giới [21] Người ta biết rằng ổi thường được sử dụng ở nhiều nơi trên thế giới để chữa nhiều bệnh như tiêu chảy, hạ sốt, kiết lỵ, viêm dạ dày ruột, tăng huyết áp, tiểu đường, sâu răng, giảm đau

Hoạt động kháng khuẩn

Quả ổi có hoạt tính kháng khuẩn cao, chúng chứa các hoạt chất chống ung thư và chống oxy hóa Có rất nhiều hợp chất như axit Gallic, galangin, kaempferol, homogentisic acid và cyanidin 3-glucoside được tìm thấy trong vỏ, hạt và bã của quả ổi theo nghiên cứu của Chen Y và cộng sự [22]

Hoạt động chống tiêu chảy

Tiêu chảy là một trong những vấn đề sức khỏe phổ biến và được công nhận

và là vấn đề toàn cầu Nó rất phổ biến ngay cả ở các nước phát triển Ước tính có khoảng 2,2 triệu người chết hàng năm do tiêu chảy; hầu hết trong số họ, là trẻ em hoặc trẻ sơ sinh [23]

Quả ổi được sử dụng để điều trị tiêu chảy do độc tố E coli hoặc S aureus theo nghiên cứu của Vieira RHSF và cộng sự [24]

Chiết xuất từ quả ổi có hoạt tính chống tiêu chảy và nó được sử dụng để điều trị và phòng ngừa tiêu chảy theo nghiên cứu của Ojewole J và cộng sự [25]

Hoạt động chống viêm

Chiết xuất từ quả ổi cho thấy Phenol là một hợp chất quan trọng có trong quả ổi

và rất quan trọng trong hoạt động chống dị ứng và chống viêm thể hiện trong nghiên cứu của Denny C và cộng sự [26] Một nghiên cứu khác của Roy CK cho thấy chiết xuất từ quả ổi có hiệu quả trong điều trị viêm gan và sản xuất huyết thanh [27]

Hoạt động chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các phân tử làm chậm quá trình oxy hóa Các phản ứng oxy hóa có thể tạo ra các gốc tự do gây tổn hại cho các tế bào bằng cách bắt đầu các phản ứng khác nhau Các gốc tự do gây tổn hại cho các tế bào gây ung thư

và nhiều bệnh khác Chất chống oxy hóa bao gồm beta-carotene, lycopene, vitamin

C, E và A, polyphenol và một số chất khác Phản ứng oxy hóa là một trong những phản ứng phá hủy quan trọng nhất Các gốc tự do gây ra rất nhiều rối loạn ở người như rối loạn thần kinh, ung thư, nhiễm virus Các gốc tự do này tác động gây ra các phản ứng oxy hóa qua nghiên cứu của Masuda T và cộng sự [28]

Quả ổi rất giàu chất chống oxy hóa rất hữu ích trong việc làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh như rối loạn chức năng não, viêm, bệnh tim, ung thư, xơ cứng động mạch

và viêm khớp [29] Trong trái cây, chất oxy hóa dồi dào nhất là polyphenol và axit ascorbic Các polyphenol chủ yếu là flavonoid và chủ yếu hiện diện ở dạng glycoside và ester [30]

Quả ổi có hàm lượng cao axit protocatechuic, quercetin, axit ferulic, axit ascorbic, quercetin, axit gallic và axit caffeic là những chất chống oxy hóa quan trọng [31, 32]

2.2 Giới thiệu chung về polyphenol và cơ chế chống oxy hóa của hợp chất polyphenol [5]

2.2.1 Polyphenol

Polyphenol là các hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng Benzen,

của cấu tạo hóa học người ta chia ra các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính:

+ Nhóm hợp chất phenol C6-C1

Có đặc điểm trong cấu tạo phân tử gồm vòng benzen liên kết với nhóm COOH Đại diện thường gặp:

- Galic acid: có nhiều ở thực vật ở cả dạng tự do và liên kết:

- Vallinin: Có mùi thơm đặc biệt, ở dạng glycoside, có nhiều trong quả và được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp xà phòng, công nghiệp thực phẩm với tư cách là chất thơm

- Protocatechin acid: Có nhiều trong hành, tỏi

- Gentizic acid: Có nhiều trong cacao

- Flavanol: còn được biết đến như là flavan-3-ol hay catechin và galocatechin,

là cấu tử của hợp chất tanin có trong nhiều loại hoa quả, trà xanh, rượu đỏ và socola (Yang et al., 2001), còn gallocatechin epigallocatechin và epigallocatechin gallate được tìm thấy ở các loại hạt họ đậu và chè (Arts et al, 2000a, Arts et al., 2000b) [12]

Hình 2.4 Epicatechin Hình 2.5 epigalocatechin

- Flavon: Rất phổ biến trong thực vật, có nhiều trong tỏi, hành, chè, dâu tây , có màu vàng và ở dạng glycoside, thường gặp là flavonol Flavonol thường ở dạng glycoside có muôn hình muôn vẻ khác nhau, thường gặp là Kampherol và Quercetin [6] Sự tạo thành flavonols glycosides được quyết định bởi hoạt động của ánh sáng, vì thế chúng chủ yếu được tìm thấy ở lá và vỏ quả (Hermann, 1976) [12]

Hình 2.6 Quercetin Hình 2.7 Kampherol

- Anthocyanin: Các hợp chất thuộc nhóm này đều là các sắc tố quan trọng của hoa quả Chúng là chất màu tan trong nước, cho màu đỏ, tím, xanh dương, vàng của hoa quả và nhiều loại thực vật khác Các anthocyan đều là các glycoside trong

đó phần aglucon là anthocyanidin Các anthocyanin hòa tan trong nước còn antocyanindin thì không hòa tan trong nước Điều lưu ý là trong cấu tạo của anthocyanidin, nguyên tử oxi trong vòng pyran có hoá trị tự do Tuy nhiên đã không xác định được một cách chắc chắn rằng nguyên tư nào hoặc oxi hoặc cacbon mang

điện tích dương tự do, vì thế thường biểu diễn cấu tạo của anthocyan bằng công thức trung hoà

Nhờ có điện tích dương tự do mà Anthocyanidin mang tính chất của cation trong môi trường acid và mang tính chất anion trong môi trường kiềm, nghĩa là có khả năng tạo muối với acid và base [13]

Tuỳ theo pH môi trường mà trạng thái tích điện của Antocyan thay đổi, theo

đó màu sắc cũng thay đổi Các muối cation của Antocyan đều có màu đỏ với những sắc thái màu khác nhau: vàng nhạt, tím, xanh nhạt Các muối anion của Antocyan

có màu xanh Nhiều hoa của thực vật màu hồng khi luộc chin chuyển thành màu xanh, điều này chứng tỏ sự thay đổi pH dịch tế bào về phía kiềm [6]

- Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này sẽ ngưng tụ với nhau để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là Flobafen

2.2.2 Cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất polyphenol

Theo Jovanovic (2000); Nicole (2001); Marfak (2003); Van Camp, (2005) trích dẫn bởi Chirinos Gallardo [12], cơ chế kháng oxi hoá của các chất phenol:

Cơ chế 1: Vô hoạt các gốc tự do

Polyphenol có cấu trúc dạng vòng, các điện tử chuyển động liên tục trong các liên kết đôi cách bởi liên kết đơn có tác dụng như những chiếc bẫy đối với gốc tự

do Gốc tự do là các nguyên tử hay phân tử có electron lớp ngoài không cặp đôi và

vì vậy có hoạt tính rất cao Chúng rất dễ phản ứng với các phân tử các chất xung quanh như DNA, lipid màng v.v gây nên hiện tượng lão hóa hoặc ung thư Nếu các gốc tự do gặp polyphenol thì chúng sẽ nhường electron không cặp đôi cho polyphenol và trở về trạng thái bền vững Electron không cặp đôi trong polyphenol

bị "nhốt" lại Electron này chạy hết vòng benzene này sang vòng benzene khác mà không ảnh hưởng gì nhiều lắm đến cấu trúc của các vòng benzene [6]

Cơ chế 2: Tạo phức dạng chelat với các ion Fe2+ và Cu+

Polyphenol còn có khả năng ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do bằng cách “bắt giữ” các ion kim loại Các kim loại có chức năng sinh lí quan trọng trong

cơ thể con người như vận chuyển oxi (Fe trong hemoglobin), cofactor của nhiều enzyme (Fe đối với catalase, Cu đối với superoxyde dismutase) Tuy nhiên, chúng cũng là những tác nhân của việc hình thành các gốc tự do hoặc bằng cách cắt bỏ hydrogen của lipid tạo gốc tự do peroxide hoặc tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss

Thứ nhất, các ion kim loại có thể gây ra kích thích cắt bỏ hydrogen của lipid chưa bão hòa thành gốc lipid:

Các ion kim loại cũng có thể phân tách hydro thành dạng alkoxyl và gốc peroxyl, gây ra kích thích sự oxi hóa lipid:

Các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber-Weiss:

Cơ chế 3: Kìm hãm enzyme xanthine oxydase

Hoạt động của xanthine oxidase cũng là một nguồn tạo các gốc tự do Khi có mặt của oxi, enzyme này xúc tác sự oxi hóa xanthine thành acid uric, phân tử oxi nhận điện tử và trở thành ion superoxide

Các flavonoid có cấu tạo vòng A giống như vòng purin của xanthine được coi như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxidase do đó ngăn ngừa sự tạo ion superoxide (Nicole, 2001) [12]

Nhiều hợp chất phenol đã thể hiện những tác dụng tốt của chúng đối với cơ thể con người trên cơ sở khả năng chống oxi hóa Các flavonoid có tác dụng bảo vệ

cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạnh, tai biến mạnh, lão hóa, thoái hóa gan, tổn thương do bức xạ Flavonoid làm bền thành mạch, được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạnh, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc, Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt có trong lá diếp cá, cây râu mèo Nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim

Ngày nay, những dược liệu và hoa quả có hàm lượng flavonoid cao đã được khai thác và chiết xuất, nghiên cứu, sản xuất thành sản phẩm: Thuốc viên, thuốc nước, rất tiện ích khi sử dụng

2.3 Gốc tự do, quá trình oxy hóa chất béo [5]

2.3.1 Gốc tự do

Gốc tự do là các nguyên tử không trọng vẹn, số điện tử vòng ngoài của nó là

số lẻ nên không bền vững, nó phải kết hợp với một nguyên tử khác để có số điện tử chẵn để bền vững Sự bền vững này chỉ trong chốc lát, chính nó lại tạo ra một nguyên tử không trọng vẹn khác và tiếp tục kết hợp một nguyên tử khác rồi trở thành nguyên tử không trọn vẹn và tiếp tục chu kì bất tận như thế Phản ứng hóa học của nó rất mãnh liệt và nó sẽ kéo theo một điện tử của phân tử khác về nó, cho

ra những phân tử khác bị hư hại hay bị oxy hóa Một khi phân tử bị oxy hóa rồi thì phân tử đó sẽ tự mất đi tất cả các chức năng vốn có của nó, tiếp đó chính nó lại là tác nhân oxy hóa các phân tử xung quanh nó, làm hư hại các tế bào của các phân tử xung quanh Và quá trình này cứ tiếp tục như thế sẽ tạo thành các tế bào không bình thường dẫn tới các loại bệnh như: Xơ vữa động mạch, ung thư

Thông thường, các gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxy hóa nội tại bằng các hợp chất như glutathione, vitamin E, vitamin C và các enzyme superoxide dismutase Ngoài ra cơ thể còn có các tế bào như neutrophill, monocyte, B- cell Có khả năng chống lại các yếu tố oxy hóa ngoại lai xâm nhập

Tuy nhiên trong các tế bào có thể xuất hiện các hiện tượng các gốc tự do được tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên ngoài như các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, do ozone, bức xạ, tia UV, nhiễm phóng xạ, do thuốc lá, môi trường ôi nhiễm Các gốc tự do dư thừa trong khi cơ thể thiếu các yếu

tố bảo vệ để ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipit không bão hòa của

tế bào, làm giảm khả năng bảo vệ các tế bào dẫn đến sự xâm nhập các tác nhân gây bệnh từ bên ngoài oxy hóa các nucleotid căn bản làm thay đổi cấu trúc ADN, dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu trúc protein hoặc hoạt hóa enzyme trong các quá trình trao đổi chất gây bệnh

2.3.2 Quá trình oxy hóa

Quá trình oxy hóa là quá trình phản ứng hóa học xảy ra, trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa có khă năng tạo gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật

2.3.3 Biện pháp hạn chế quá trình oxy hóa

Để hạn chế sự oxi hóa, một số biện pháp sau thường được sử dụng:

- Loại bỏ oxi trong thực phẩm bằng cách đóng gói chân không hoặc sử dụng glucose-oxidase

- Bảo quản trong nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng Trong trường hợp này, tốc

độ oxi hóa giảm rõ rệt Tuy nhiên, phương pháp này không áp dụng được đối với các loại trái cây, rau củ quả có chứa lipoxygenase Sự ngăn ngừa hư hỏng thực phẩm chỉ có thể đạt được sau khi xử lí nhiệt

- Thêm các chất chống oxi hóa: Các chất chống oxi hóa ngoài khả năng loại bỏ các gốc tự do còn hạn chế đáng kể sự phân hủy hydroperoxide thành các sản phẩm thứ cấp khác Các chất chống oxi hóa thường sử dụng trong bảo quản dầu mỡ là vitamin E, BHA, BHT Các chất chống oxi hóa tự nhiên như plyphenol, carotenoid cũng được nghiên cứu bổ sung vào dầu mỡ để ngăn ngừa quá trình oxi hóa

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết polyphenol [5]

2.4.1 Loại dung môi

Dung môi có vai trò rất quan trọng trong quá trình tách chiết polyphenol từ thực vật Độ phân cực của dung môi sẽ ảnh hưởng đến độ hòa tan của các hợp chất phenol vào dung môi do đó ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách của quá trình Thêm vào đó, việc lựa chọn dung môi sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến công đoạn tinh sạch dịch chiết Nhìn chung, việc lựa chọn dung môi tách chiết bao giờ cũng dựa trên hai tiêu chí: Loại chất chủ đạo muốn tách và sự thuận tiện cho công đọan tinh sạch về sau Mỗi loại chất khác nhau trong nhóm phenolic lại thích hợp với những dung môi chiết khác nhau Phenolic có glicosid hóa thường tan nhiều trong nước nên dung môi thường sử dụng là nước và hỗn hợp nước với methanol hoặc ethanol hoặc aceton (Rice-Evans ea at, 1997) Ngược lại, phenolic ít phân cực như isoflavones, flavanones thường tan nhiều hơn trong dung môi kị nước Ngoài ra, aceton và

methanol là dung môi thích hợp để chiết flavanol, methanol thì là tốt nhất cho chiết catechin

2.4.2 Tỷ lệ dung môi trên nước

Polyphenol là một nhóm các hợp chất vô cùng đa dạng, có thể tồn tại ở dạng

tự do hoặc ở dạng liên kết với các đường (Dạng glycosid) Để tách được polyphenol

ở dạng glycoside, nước thường được thêm vào dung môi tách Trong các loại nguyên liệu khác nhau, tỷ lệ hợp chất phenol glycoside hóa khác nhau do đó tùy thuộc vào loại nguyên liệu mà tỷ lệ dung môi/ nước cần được xác định cho phù hợp

để tăng hiệu quả chiết cũng như quyết định chi phí thực hiện cả quá trình

2.4.3 Thời gian chiết

Thời gian chiết là một nhân tố ảnh hưởng tới sự thu hồi polyphenol cũng như chất lượng của dịch chiết Thời gian chiết ngắn cho hiệu suất thu hồi thấp, tuy nhiên thời gian chiết quá dài khiến polyphenol dễ bị oxi hoa và làm giảm hiệu suất sử dụng thiết bị Thời gian chiết thay đổi từ 1phút đến 24 giờ (Shahidi & Nack, 2004)

2.4.4 Nhiệt độ chiết

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng không những ảnh hưởng tới hiệu suất chiết mà còn ảnh hưởng tới chi phí và chất lượng của dịch chiết polyphenol Nhiệt độ làm giảm độ nhớt của dung dịch, tăng tốc độ thẩm thấu của dung môi vào tế bào và tăng hiệu suất trích li Tuy nhiên, tiến hành chiết ở nhiệt độ quá cao thì vừa tốn cho phí

ổn nhiệt vừa tăng nguy cơ giảm chất lượng của dịch chiết do phản ứng nâu hóa

2.5 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

+ Phân tích quercetin: bằng máy đo quang phổ

+ Xác định hàm lượng Axit Galic bằng: phương pháp đo màu Folin quy Ciocalteau + Xác định lượng tanin bằng: phương pháp chuẩn độ

+ Phân tích Apigenin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

Kết quả thu được từ nghiên cứu trên:

+ Bã ổi đào sau khi chiết xuất polyphenol có trọng lượng khô là 28,42% và hàm lượng chất chống oxy hóa dạng polyphenol như sau: 0,40 mg/100g, quercetin, 8,70 mg/100g axit gallic, 62,60 mg/100g tanin, và không có phát hiện của apigenin Nghiên cứu khám phá ứng dụng của bốn dung môi hữu cơ và nước để chiết xuất hợp chất polyphenol từ bã ổi đào sau chế biến nước ép ổi Nghiên cứu cho thấy phần còn lại của hàm lượng polyphenol tổng của bã ổi 9.59 mg/100g Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất thu được bằng cách sử dụng metanol làm dung môi và cao thứ hai thu được bằng cách sử dụng nước làm dung môi

Hàm lượng polyphenol cao nhất là kết quả của hỗn hợp metanol và nước ở các nồng độ khác nhau, trong đó tỷ lệ tối ưu là 60% metanol/nước, sau đó là 50% metanol/nước Biến thể trong tổng hàm lượng polyphenol phụ thuộc vào điều kiện dung môi và nồng độ giữa các dung môi Hàm lượng polyphenol tổng là cao nhất khi sử dụng tỷ lệ bã trên dung môi là 1g bã còn lại đến 25ml metanol/nước 60%

180 phút được chọn là thời gian lý tưởng để tách chiết polyphenol

- Seokwon Seo, Soojung Lee, Marcus L Elam, Sarah A Johnson, Jonghoon Kang, Bahram H Arjmaandi, đã cùng nhau: “Nghiên cứu tìm ra dung môi chiết tốt nhất với lá ổi để cho hiệu quả chống oxy hóa cao”, sử dụng những phương pháp:

+ Xét nghiệm hàm lượng hợp chất Phenolic bằng phương pháp: Folin Ciocalteu + Xét nghiệm hàm lượng Flavonoid bằng phương pháp của Moreno

+ Thử nghiệm khử gốc 2, 2-Diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH)

+ Hoạt động của ABTS-Scavenging được đánh giá theo phương pháp được

mô tả bởi Re et al

+ Hoạt tính khử gốc oxit nitric (NO) được đo bằng thuốc thử Greiss

+ Hoạt động quét nitrite: hoạt tính quét nitrite được đánh giá dựa trên độ hấp thụ ở bước sóng 520nm bằng máy quang phổ UV theo phương pháp được báo cáo bởi kato et al

+ Phân tích thống kê

Từ việc nghiên cứu trên họ đã thu được kết quả:

+ Hàm lượng hợp chất phenolic của chiết xuất nước cao hơn chiết xuất ethanol và metanol tinh khiết Hơn nữa, hàm lượng hợp chất phenolic của chiết xuất

hydroethanolic cao hơn chiết xuất nước Hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất hydroethanolic cao hơn so với chiết xuất nước và cao đáng kể trong chiết xuất hydroethanolic 50% có hàm lượng hợp chất phenolic cao nhất

2.5.2 Trong nước

Nghiên cứu: “Tối ưu hóa chiết polyphenol từ lá ổi bằng phương pháp bề mặt đáp ứng”, của Hồ Bá Vương, Nguyễn Xuân Duy, Nguyễn Anh Tuấn sử dụng những phương pháp:

+ Thu mẫu: từ những lá ổi già từ một cây ổi

+ Bố trí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết: Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response Surface Methodology) được lựa chọn để tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol từ lá ổi

+ Xác định hàm lượng polyphenol tổng theo phương pháp của Singleton et

al (1999)

+ Xác định hoạt tính chống oxi hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH (được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh)

Và kết quả thu được:

+ Nghiên cứu đã xây dựng được mô hình toán học mô tả ảnh hưởng của bốn nhân tố chiết (nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ dung môi/nguyên liệu và nồng độ ethanol) đến hàm lượng polyphenol từ lá ổi xẻ Các giá trị tối ưu để chiết polyphenol từ lá ổi

phút và tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 70/1(ml/g) Tại điều kiện chiết tối ưu, hàm lượng polyphenol thu được là 233,76mg GAE/g chất khô Dịch chiết polyphenol thu được

ở điều kiện tối ưu thể hiện hoạt tính chống oxi hóa cao đối với phép thử khả năng thu gốc tự do DPPH, với giá trị IC50 là 2,1μg/ml Những phát hiện trên chỉ ra tiềm năng sử dụng lá ổi xẻ như một nguồn chiết xuất chất chống oxi hóa tự nhiên để nâng cao khả năng ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm chức năng

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, địa điểm, vật liệu và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Dịch chiết polyphenol từ bã ổi đào được tách chiết tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Vật liệu nghiên cứu:

- Quả ổi đào có độ chín 90% (Vỏ màu xanh nhạt, có mùi thơm, vị ngọt vừa phải, vẫn còn độ cứng vừa phải chưa bị mềm) được thu mua tại chợ Minh phương (Việt Trì - Phú Thọ) Quả được lựa chọn đồng đều về kích thước, màu sắc, độ chín, không bị dập nát, sâu bệnh, thối hỏng Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên

- Thức ăn chăn nuôi giàu chất béo: Cám lợn với hàm lượng chất béo 5,6%

3.1.2 Hoá chất sử dụng

Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

3.1.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 3.2 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Cùng các trang thiết bị, dụng cụ khác phục vụ nghiên cứu của phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

3.2 Phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu một số thông số tách chiết thu dịch chiết tổng từ bã ổi đào

Tối ưu hóa các điều kiện của quá trình tách chiết polyphenol

Phân tích, đánh giá tác dụng của dịch chiết polyphenol

3.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Phòng thí nghiệm hóa sinh và vi sinh Khoa Công nghệ Sinh học

và Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

3.2.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện: từ 12/2019 - 5/2020

3.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu

- Trọng lượng khô của nguyên liệu

- Hàm lượng polyphenol trong nguyên liệu

Nội dung 2: Nghiên cứu lựa chọn một số thông số tách chiết polyphenol thích hợp

- Nghiên cứu lựa chọn dung môi thích hợp

- Nghiên cứu thời gian chiết thích hợp

- Nghiên cứu nhiệt độ chiết thích hợp

Nội dung 3: Tối ưu hóa điều kiện chiết polyphenol trên dung môi đã chọn Nội dung 4: Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm polyphenol và ứng dụng bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của polyphenol bằng thử nghiệm DPPH

- Ứng dụng kiểm soát quá trình oxy hóa trong quá trình bảo quản thức ăn chăn nuôi giàu chất béo

Nội dung 5: Hoàn thiện quy trình dựa trên các thông số công nghệ đã phân tích

- Quy trình tách chiết polyphenol

3.4 Phương pháp phân tích

Phương pháp phân tích nội dung 1: phương pháp Đánh giá thành phần nguyên liệu ban đầu

3.4.1 Xác định trọng lượng khô của nguyên liệu

Sử dụng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5631:1991

Nguyên tắc:

Dùng sức nóng để tách ẩm trong vật liệu, đồng thời giữ lại tất cả các chất có trong vật liệu Do đó nhiệt độ sấy không được quá cao hay quá thấp

Nhiệt độ quá cao thì ẩm sẽ bốc hơi nhanh nhưng dễ gây hiện tượng làm thay đổi tính chất hóa học của các chất, nhất là các chất có tính bay hơi thoát đi sẽ làm ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Nhiệt độ quá thấp thì hơi thoát ra chậm, làm kéo dài thời gian và các chất bị biến đổi Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi

- Xác định độ ẩm TCVN 5613 – 1991

- Bản chất của phương pháp: Phương pháp dựa trên việc sấy mẫu bã quả ổi đào đến khối lượng không đổi trong điều kiện xác định

- Thiết bị và vật liệu để tiến hành xác định độ ẩm, cần sử dụng:

+ Cân phân tích với sai lệch cho phép không vượt quá 0,001g

+ Tủ sấy đảm bảo điều chỉnh được nhiệt độ (105˚C) hoặc (120˚C)

+ Chén cân bằng thủy tinh, sứ hoặc nhôm đường kính 50mm và có nắp đậy kín + Bình hút ẩm

Cách tiến hành:

cho đến khi trọng lượng không đổi Để nguội trong bình hút ẩm 20-25 phút và sau

đó cân với trọng lượng chính xác

- Sau đó cho vào cốc khoảng 10 g mẫu Cân tất cả ở cân phân tích một cách chính xác

lượng không đổi

- Sấy xong, làm nguội trong bình hút ẩm (20 - 25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác

(20-25 phút) và đem cân ở cân phân tích một cách chính xác tới khi trọng lượng không đổi

- m: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g)

- m₁: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

3.4.2 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số

Hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết bã quả ổi đào được xác định bằng phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ như sau: dịch chiết từ bã quả ổi đào được pha loãng đến một tỷ lệ nhất định, sau đó 0,1

ml dịch chiết đã pha loãng được trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc

phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế Gallic acid được dùng làm chất chuẩn Hàm lượng polyphenol tổng số được biểu diễn theo mg đương lượng gallic acid (Gallic Acid Equivalent-GAE) trên 1g chất khô (Dry Weight-DW) hay mg GAE/g DW

Tính kết quả:

TPC = X * V * k / v * m * (1 - w)

Trong đó:

- TPC là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g DW)

- X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/ml)

- V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu bã quả ổi đào (ml)

- K là hệ số pha loãng

- V là thể tích dịch chiết được sử dụng (ml)

- m là khối lượng mẫu thí nghiệm (g)

- w là độ ẩm của mẫu (%)

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu

Quả ổi đào có độ chín 90% được thu hái về mang đi loại bỏ tạp chất, sâu bệnh, thối hỏng Rửa quả bằng nước sạch, để khô tự nhiên sau đó mang đi xay lấy

bã Bã của quả ổi đào được tách chiết bằng phương pháp trích ly trong điều kiện:

nguyên liệu so với dung môi chiết là 1/10 (w/v) Dịch chiết thu được sau khi tách chiết được mang đi xác định hàm lượng polyphenol

3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

3.5.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: phương pháp xác định một số thông

số tách chiết polyphenol từ bã quả ổi đào

Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được sử dụng Thí nghiệm sau kế thừa kết quả nghiên cứu của thí nghiệm trước

 Tách chiết polyphenlol từ bã ổi đào:

Ổi đào được thu hái, sau đó rửa sạch để ráo nước rồi tiến hành xay nhỏ để lấy phần bã, tách chiết polyphenol bằng các loại dung môi: methanol, ethanol, nước Cân 4g bã ổi đào cho vào bình tam giác, bịt kín miệng bình và để vào thiết bị rung lắc để tiến hành trích ly Tiến hành tách chiết bằng phương pháp trích ly trong vòng

chiết trong, dịch chiết có màu hồng phớt nhẹ

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết

Để nghiên cứu ảnh hưởng của loại dung môi chiết, sử dụng 3 loại dung môi

Để đánh giá ảnh hưởng của loại dung môi chiết tới khả năng trích ly bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:

Cân 4g (Bã ổi đào)

Trích ly ở các loại dung môi

Thời gian chiết: 30 phút

Nhiệt độ tách chiết: 400C

Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu: 1/10 (w/v)

Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol

Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn loại dung môi tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 1 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu nồng độ dung môi phù hợp:

Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol

Được bố trí gồm 4 công thức, lặp lại 3 lần

Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các nồng độ dung môi

20% 40% 60% 80%

Dịch chiết

Phân tích Chiết ở cùng các điều kiện:

Dung môi sử dụng là dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1

Thời gian chiết: 30 phút

Tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu :1/10 (w/v)

Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm lượng polyphenol

Dựa vào kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn nồng độ dung môi chiết tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 2 được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu phù hợp:

Để đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:

Cân 4g (bã ổi đào) Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu

1/5 1/10 1/15 1/20

Dịch chiết

Phân tích Chiết ở cùng điều kiện:

Loại dung môi và nồng độ dung môi tốt nhất được tìm thấy ở thí nghiệm 1,2

Thời gian tách chiết 30 phút

Kết thúc quá trình chiết, xác định được hàm polyphenol

Dựa vào kết quả phân tích, lựa chọn được tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu tách chiết tốt nhất Kết quả của thí nghiệm 3 được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết

Để đánh giá ảnh hưởng của thời gian tới khả năng chiết, bố trí thí nghiệm theo công thức thí nghiệm sau:

Cân 4g (bã ổi đào)

Trích ly ở các khoảng thời gian

25phút 30phút 35 phút 40 phút

Dịch chiết Phân tích