Phân lập tuyển chọn các chủng bacillus có khả năng sinh tổng hợp biofilm và nghiên cứu ứng dụng biofilm trong việc ức chế sự phát triển một số vi sinh vật gây hại

1 U' nhiên trong điều kiện tự nhiên tế bào vi sinh vật ít khi tồn tại đơn le mà lại thường liêr kết nhau và bám dính trên một bê mặt nhất định tạo thành một cấu trúc được gọi là m àig s

ĐẠI HỌC QUOC GIA HẢ NỘI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ThS Nguyễn Thị Giang, CN Đoàn Diệu Linh,

CN Trịnh Thị Hiền, CN N guyễn Thị Phương Liên

H à N ộ i - 2 0 1 3

D A N H S Á C H N H Ữ N G N G Ư Ờ I T H Ụ C H I Ệ N Đ È T À I

1 PGS.TS Nguyễn Quang Huy, Trường Dại học Khoa học T ự nhiên, ĐHỌGHN

2 PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, ĐHQGHN

3 TS Phạm Bao Yên,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đ H Ọ G H N

4 TS Phạm Bao Yên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đ H Q G H N

5 ThS Ngô Thị Kim Toán, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đ H Q G H N

6 T h s Nguyền Thị Giang, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đ H Q G H N

7 CN Đoàn Diệu Linh,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đ H Q G H N

8 CN Trịnh Thị Hiền, Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đ H Q G H N

9 CN Nguyền Thị Phương Liên, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đ HQGHN

ii

- , -J -

^ -B á o c á o t ò n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

( 0 q u a n chủ qu án : Đại học Ọuốc gia Hà Nội

( o q u a n chú trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHỌGHN

Chú trì đề tài: PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Các cán bộ th a m gia: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, TS Phạm Bảo Yên, ThS Ngô Thị

K in Toán, ThS, Trần Thúy Hằng, ThS Nguyễn Thị Giang, CN Nguyễn Thị Phương Liên, CN Trịnh Thị Hiền CN Đoàn Diệu Linh

Thoi gian th ực hiện: từ 8/2011- 5/2013.

K i r h p h í : 1 7 0 0 0 0 0 0 0 ( M ộ t t r ă m b ả y m ư ơ i t r i ệ u đ ò n g )

1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu:

M ụ : tiê u : P h â n lập, t u y ê n c h ọ n c á c c h ủ n g B a c i l l u s c ó h o ạ t tín h tạ o b i o f i l m , n g h i ê n c ứ u

ứnị dụng biofilm đê ức chế sự phát triển một số vi sinh vật gây hại.

NộidurìịỊ'. Phân lập tuyển chọn các chùng vi sinh vật từ các điều kiện môi trường, sinh thái khác nhau có hoạt tính tạo bioíĩlm

NgHên cứu các đặc điểm về sinh lý, sinh hóa khả năng phát triển tạo biofilm cùa một

sô (hung Bacillus có hoạt tính tạo biofilm mạnh đồng thời có hoạt tính ức chế sự phát triểa một số vi sinh vật gây bệnh.

Bưrc đầu xây dựng quy trình lên men quy mô phòng thí nghiệm với 1 chủng Bacillus

và rghiên cứu thừ nghiệm sản phâm.

2 Các k ế t q u ả đ ạ t đ ư ợ c :

K ế t q u á k h o a h ọ c

- Đà phân lập trên 90 chung vi sinh vật từ các nguồn đất, nước nông nghiệp cũng như

n ư c c thai c ó h o ạ t tính t ạ o b i o í ì l m

- Đi tuyên chọn, phân loại được 05 chung Bacillus có hoạt tính tạo biofilm đồng thời

có tie dụng ức chế sự sinh trương một số nhóm sinh vật gây hại.

iii

-

. -Ị -Báo cáo tông kêt đê tài Q G 11-16

4 Tỉguyen Ọuang Huy, Trinh Thi Hien, Ngo Thi Kim Toan, Pham Bao Yen, 2012 Biớìlm forming bacteria isolated from wastewater in Vietnam International synposium on Green technology and Sustainable development Ho Chi Minh city 29-

30/ 1/2012, pp : 13-19.

5 ĩíguyen Ọuang Huy, Nguyen Thi Phuong Lien, Tran Thuy Hang, Isolation and Characterization o f Biofilm- forming bacterial strains from contamination sites in Vienam 1st HUS- SOGANG Internationa] symposium on Advance research and

T r a m n g , H a n o i 15 F e b , 2 0 1 2

6 T'guyen Quang Huy, Đoàn Diệu Linh, Nguyễn Thị Giang, Ngô Thị Kim Toán,

2012 Đặc điêm sinh học của hai chung vi khuân tạo biofilm phân lập từ nước thai ri rác Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50(3D): 127-134.

i v

- 9 ^ - —

-B á o c á o t ô n g k ê t đ ẻ t à i Q G 1 1 - 1 6

Kết qua đào lạo :

Pào lạo được 03 thạc sĩ chuyên ngành sinh học thực nghiệm: Trần Thị Hằng, tốt

n g h ệp năm 201 1; Nguyền Thị Giang, tốt nghiệp năm 2012; Ngô Thị Kim Toán, tốt ngh ệp năm 2012.

~ Pào tạo được 03 cư nhân neành sinh học: Doàn Diệu Linh; Trịnh Thị Hiền và

N gtyền Thị Phương Liên, tốt nghiệp năm 2011 và 03 cư nhân ngành sinh học và công nghr sinh học sẽ tốt nghiệp 6/2013.

Thanh quyết toán để tài: Đã hoàn thành.

S U M M A R Y

P ro jec t: Isolation o f biofilm formation active B a c i l l u s strains and effects o f biofilm for pathogenic bacteria

C o d e : Q G 1 1-16

M anaging Institution: N a t i o n a l U n i v e r s i t y Hanoi

Implementing Institution: VNU, Hanoi University o f Science

Isolate bacteria strains which have biofilm forming activated from sites in Vietnam

Study on physiological and biochemistry characteristics o f Bacillus strains selected and characterization o f biofilm forming and antibacterial activities o f them.

Establish a standard operating procedure for fermentation one Bacillus strain and research on applying.

Selected and characterized 05 B a c i l l u s strains which have b i o f i l m forming activity and antibacterial

I stablished a standard operating procedure for fermentation one Bacillus strain

6 Nguyền Ọuang Huy, Đoàn Diệu Linh, Nguyền Thị Giang, Ngô Thị Kim Toán,

2012 Đặc điêm sinh học cùa hai chủng vi khuân tạo biofilm phân lập từ nước thải

ri rác T ạ p c h í K h o a h ọ c v à C ô n g n g h ệ 5 0 ( 3 D ) : 1 2 7 - 1 3 4

Resỉarch training:

Contribution in training bachelor’s degree: 3

Contribution in training m aster’s degree: 3

Bucgct: Payment in full

17/

- , - ——

— -B á o c á o t ỏ n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

B Ả N G KÍ H I Ệ U V I É T T Ấ T

PAGE Poly Acrylamide Gel Electrophorensis Điện di gel polyacrylamide

v i i i

- _ - - í - — —

— -B á o c á o tỏn g, k ê í đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

D a n h m ụ c c á c b ả n g

Trang Bang 1.1 Vai trò cua các hợp chảt plolymer ngoại bào có trong biofilm 5

Bang 1.2 Các yêu tô anh hương đến sự bám dính tế hào và hình thành biofilm 9

Bang 3.1 Anh hướng cua nhiệt độ đên khá năng tạo biofilm cua các chung 31

phân lập

Bang 3.2 Anh hương cua pH môi trường đến sự tạo thành bioíìlm cua các 32

chung vi sinh vặt phân lập

Báng 3.3 Anh hương cua các n g u ô n cacbon đên sự tạo thành m à n g biofilm 33 cua các chung vi sinh vật phân lập

Bảng 3.4 Anh hưởng cua các nguôn nitơ đên sự tạo thành màng biofilm của 35

các chung vi sinh vật phân lập

Bảng 3.5 Hoạt tính kháng khuân của các chủng vi khuân phân lập 45

Bang 3.6 Kha năng phối trộn tế bào B 1.10 với một số giá thể mang 47

ix

- - ; -——

-B á o c á o t ỏ n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

D a n h m ụ c c á c h ì n h

Trang

H ìr h 1 1 C â u trúc b i o f i l m c u a S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s trên b ẽ m ặ t 2

Hìrh 1.3 Câu trúc cellulose ơ vi khuân góp phần hình thành biofilm 6

Hìrh 1.6 Các giai đoạn chính của quá trình hình thành và phát triên biofilm 12

Hìrh 3.1 Hình thái khuân lạc một số nhóm vi sinh vật phân lập 26

Hìrh 3.2 Khả năng tạo thành m àng sinh vật của các chủng vi sinh vật phân 27

lập từ mẫu nước thải làng miến Lại Trạch

Hỉrh 3.3 Khả năng tạo màng sinh vật của các chung vi sinh vật phân lập từ 28

m ẫi nước thải nhà máy san xuất bia

Hìrh 3.4 Kha năng tạo thành màng sinh vật của các chung vi sinh vật phân 28

lập từ mẫu nước thải làng nghề bún Phú Đô

Hìrh 3.5 Kha năng tạo thành m àng sinh vật của các chủng vi sinh vật phàn 29

l ậ p từ m ẫ u n ư ớ c th à i b c b i o g a s

Hìrh 3.6 Khả năng tạo thành màng sinh vật của một số chung vi sinh vật 30

phái lập từ mầu đất nông nghiệp

Hìrh 3.7 C â u trúc dạng màng nôi biofilm của 5 chủng vi sinh vật 36 Hìrh 3.8 Cấu trúc màng sinh vật tạo thành trên bề mặt nhựa của 5 chung vi 37

sin) vật

Hìrh 3.9 Anh chụp cấu trúc màng sinh vật cua các chung phân lập 38

Hìrn 3.10 Hình thái khuân lạc và nhuộm Gram cùa các chung vi sinh vật 40

pìhái lập

H ìrn 3 1 1 VỊ trí p h â n loại c ủ a c á c c h u n g M 3 8 , M 4 9 v ớ i c á c loài c ỏ q u a n h ệ 4 2

h ọ l à n g d ự a v à o trình tự g e n 1 6 S r D N A

X B á o c á o t ô n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

Hình 3.12 Vị trí phân loại cua chủng U1.3 và U3.7 với các loài có quan hệ 43

họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rDNA

Hình 3.13 Vị trí phân loại cua chung B1.10 với các loài có quan hệ họ hàng 44

dựa vào trinh tự gen 16S rDNA

Hình 3.14 Kha năne sinh trương cua chùng B 1.10 trong thiết bị lên men 46

x i

-_ - -Ị - ——

-B á o c á o t ô n g k ê t đ ê tà i Q G 1 1 - 1 6

M Ở Đ Ầ U 1

C H Ư Ơ N G 1: T Ò N G Q U A N T À I L I Ệ U 2

1.1 K h á i n i ệ m v ề b i o f i l m 2

1.2 Các dạng tôn tại b io film 3

1 2 1 T r o n g m ô i t r ư ờ n g tự n h i ê n 3

] 2.2 Trong các hệ thông thièt bị nhãn tạ o 3

1.2.3 Trong cơ thể sinh vật s ố n g 3

1 3 T h à n h p h â n , c â u trúc c ủ a b i o f i l m 4

1 3 1 T h à n h p h ầ n c á c h ợ p c h ấ t p l o l y m e r n g o ạ i b à o 4

1 3 2 T h à n h p h à n tê b à o 7

1 3 3 C ả u tr úc b i o f i l m 8

1.4 Q u á tr inh h ìn h t h à n h b i o f i l m 9

1.4 ] Các điều kiện tác động đèn sự hình thành b i o f i l i n 9

1.4.2 Các giai đoạn chính trong quá trình hình thành biofilm 11

1.5 Vai trò cua việc hình thành biofilm với vi sinh v ậ t 13

1.5.1 Bao vệ tê bào khoi các điều kiện bàt lợi cua mỏi trường 13

1 5 2 T ậ n d ụ n g n g u ồ n d i n h d ư ỡ n g c ủ a m ò i t r ư ờ n g 1 4 1.5.3 Mối quan hệ hợp tác giữa các l o à i 14

1.6 Hướng nghiên cứu ve b io f ilm 15

1.6.1 Lợi ích cua việc hình thành b io f ilm 15

1.6.2 Mối liên quan giữa việc tạo biofilm và kha năng đối kháng 17

1.7 Sơ lược về nhóm vi khuân B a c illu s 18

1 7 1 Đ ặ c đ i ê m c h u n g c á c c h u n g t h u ộ c n h ó m B a c i l l u s 18

1.7.2 ứ n g dụng cua các chùng B a c illu s 18

C H Ư Ơ N G 2: N G U Y Ê N L I Ệ U V Ả P H Ư Ơ N G P H Á P N G H I Ê N c ứ u 20

2.1 Nguyên l i ệ u 20

2.2 Hóa chất, thiết b ị 20

2 2 1 M õ i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y 2 0 2 2 2 M á\ móc thiết b ị 21

M Ụ C L Ụ C

x i ị B á o c á o t ỏ n g k ế t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

2 3 P h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ử u 2 1

2 3 1 P h ư ơ n g p h á p p h à n lập v i k h u â n 21

2.3.2 Phương pháp đánh giá kha nâng hình thành b io film 22

2 3 3 Q u a n sá t c â u trú c b i o f i l m h ã n g c h ụ p a n h trê n k í n h h i ể n v i đ i ệ n từ q u é t 2 2 2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện hình thành b iofilm 23

2.3.5 Đánh giá khá năng đôi kháng với một sò chúng vi sinh vật gảy h ạ i 23

2.3.6 Phương pháp phân loại phân từ dựa trên gen 16S r D N A 24

2 3 7 Q u á trình lẻ n m e n 2 4 2.3.8 Phương pháp thống kê sinh h ọ c 24

C HƯƠNG 3: K É T Ọ U Ẩ VÀ T H Ả O L U Ậ N 25

■VI Phân lập vi sinh vật từ các điêu kiện môi trường khác nhau có hoạt tính tạo biotìlm 25

3.1.1 Phân lập các chung vi sinh v ậ t 25

3.1.2 Đánh giá kha năng phát triển và tạo màng sinh vật cùa các chung vi sinh vật phân lập 26

3.2 Nghiên cứu tối ưu hỏa các yêu tô anh hường đên việc tạo biotìlm cùa các chủng phân lập 31

3.2.1 Anh hương cùa nhiệt đ ộ 31

3.2.2 Anh hương của điều kiện pH môi trư ờng 31

3.2.3 Anh hương của các nguôn c a c b o n 32

3.2.4 Anh hưởng của các nguồn n it ơ 34

3.2.5 Anh hướng tác động cua giá t h è 35

3.3 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học và phân loại cua các chung phân lập 39

3.3.1 Đặc điếm hình thái cua các chung vi sinh vật phân l ậ p 39

3.3.2 Phân loại các chung vi sinh vật phân lập dựa trẻn trinh tự gen mã hóa 16S r D N A 41

3.4 Đánh giá kha năng kháng khuân và xây dựng quá trình lên m e n 45

K É r L U Ạ N 4 8 K I I N N G H Ị 48

T À L IỆ U T H A M K H Ả O 49

P H Ị L Ụ C 54

x i i i - , - - -——

-B á o c á o tỏm> k ê t d ê t à i O G 1 1 - 1 6

M Ở Đ À U

Vi sinh vật đã và đang là đối tượng chính trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác

nhcU từ lên m e n t r u y ề n t h ố n g đ ế n c ô n g n g h i ệ p , n ô n g n g h i ệ p v à k ỳ th u ậ t di t r u y ề n h iệ n

đại T ro n g hâu hêt các nghiên cứu ơ phòng thi nghiệm vi sinh vật thường chi được xem xét dưới góc độ là một tế bào đơn le tách ra khòi hệ thống sống cộng đồng tự nhiên

1 U' nhiên trong điều kiện tự nhiên tế bào vi sinh vật ít khi tồn tại đơn le mà lại thường liêr kết nhau và bám dính trên một bê mặt nhất định tạo thành một cấu trúc được gọi là

m àig sinh vật (biofilm).

Biofilm là một dạng sống tồn tại khá phô biến trong tự nhiên và khác biệt với dạrg tê bào sống tự do bởi mạng lưới các hợp chất ngoại bào bao quanh và những thay đôi b iệt hóa trơng tế bào đê phù hợp với dạng sống mới Hình thành biofilm đem lại nhiìu lợi ích cho ban thân vi sinh vật như giúp tế bào tồn tại và chống chịu được những điềi k iện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng của môi trường thông qua mối quan

ty ĩr o n g các mô hình nghiên cứu biofilmm chủng vi khuẩn Bacillus là một trong

n h ù ig chùng được nghiên cứu ứng dụng nhiều nhất do những ưu điểm như tạo bào tử, khcng gây độc, có hoạt tính mạnh Ở Việt Nam việc nghiên cứu về các chùng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm nói chung và biofilm tạo ra từ Bacillus còn thiếu cả về số lirợig và chât lượng, chưa có các nghiên cứu phân lập, tuyên chọn cũng như các yếu tố ảnh h ư ơ n g đêr) việc tạo biofilm của Bacillus Đê góp phần hiểu rõ hơn về mạng lưới

b i o í l m cũng như tìm ra hướng ứng dụng cùa bioíìlm từ các chung Bacillus trong điều

kiệi m ôi t r ư ờ n g Việt N am c h ú n g tô i tiế n hành đ ề tài “ P h â n l ậ p , t u y ể n c h ọ n c á c

c h in g B a c i l l u s có khả năng sinh tổng hợp biofilm và nghiên cứu ứng dụng biofilm

t r o i g việc ú c c h ế s ự p h á t t r i ể n m ộ t số vi s i n h v ậ t gâ y hại

- - - ^ -———

-1 B á o c á o t ô n g k ẻ t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

C H Ư Ơ N G 1: T Ò N G QU A N r À l L IỆ U

1.1 K hái niệm về biofilm

Hiện tượng quân thê vi sinh vật gắn kết với nhau trên bề mặt (biofilm ) đã được

quai sát từ rất lâu, ngay từ năm 1864 Anthony van Leewenhoek đã lưu ý đến sự bám

dim cua vi sinh vật trong mảng bám răng Trong thập niên 1960, 1970 đã có rất nhiều

nghẽn cứu về lớp màng vi sinh vật nhưng thuật ngừ “biofilm” chỉ được công nhận

chíih thức vào năm 1984 [45], Ngày nay hướng nghiên cứu về bioíìhn cũng như

nhíng ứng dụng của nó ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học đặc biệt

là t ong lĩnh vực công nghệ sinh học, công nghiệp xừ lý nước thai hay nghiên cứu bệnh

trirền nhiễm [57],

H ìn h 1.1 Cấu trúc biofilm của Staphylococcus aureus trên bề mặt [44]

Đã có rất nhiều khái niệm được đưa ra nhằm góp phần hiểu biết rò hơn về

bioilm Theo O ’Toole một biofilm có thê được xác định là một tập họp của vi sinh vật

gắn kết trên bề mặt [20] ví dụ như cấu trúc biofilm của Staphylococcus aureus

(h ìĩh l.l) Wikipedia đinh nghĩa “một bioíĩlm được coi là một cấu trúc tập hợp của vi

sinl vật được bao quanh bời mạng lưới ngoại bào do chính nó tạo ra và được gắn kết

trêr bề mặt trên bề mặt hữu sinh hoặc vô sinh [56],

Nhìn chung có thê thấy một biofilm trong tự nhiên là cấu trúc cua các loài vi

si nỉ vật gồm hai thành phần chính là:

- Thành phàn tê bào: gôm tập hợp các tế bào cua một hay nhiều loài vi sinh vật khá; nhau, bám dính trên bề mặt nhàt định (có thê là hữu sinh hay vô sinh).

2 - , - 7 - 5 - —B á o c á o t ò n g k ê í đ ẻ t à i QCỈ 1 1 - 1 6

-— - Mạng lưới các hợp chất ngoại bào (extracellular polymeric substances-EPS) bat quanh các tế bào, tạo ncn cấu trúc đặc trưng cho biofilm [26],

D ự a v à o n h ữ n g k h á i n i ệ m trên c ó th ê th ấ y b i o í ì l m k h ô n g p h ả i là m ộ t d ạ n g s ố n g

đặc biệt mà trên thực tê đây là một hình thức tồn tại phô biến cua nhiều nhóm vi sinh

vật trong môi trườniì tự nhiên.

1.2 C á c d ạ n g tồn tại biofilm

Trong tự nhiên dạng sông biofilm có thê bắt gặp và quan sát trong rất nhiều

đạrg môi trường khác nhau từ môi trường tự nhiên như trên bề mặt cua các viên đá

nar 1 dưới đáy sông suối, trên bề mặt nước của các hồ, ao tù đến các hệ thống nhàn tạo

nhi vòi hoa sen, ống dẫn nước.

1.21 T r o n g môi trư cm g t ự nhiên

Môi trường nước tự nhiên như trong các ao hồ, sông, suối là điều kiện thuận lợi

n h ấ c h o v i ệ c h ìn h thành v à p hát triển m ộ t m ạ n g lư ớ i b i o í ì l m B i o f i l m c ó th ê đ ư ợ c h ìn h

th à :h n g a y tr ên b ề m ặt n ư ớ c ( k h o ả n g t i ế p x ú c v ớ i k h ô n g k h í ) đ ê h ìn h thành n ê n d ạ n g

cau trúc biofilm nôi (floating biofilm), có thể quan sát dưới dạnẹ những cặn hay váng

cùa vi sinh vật trên mặt ao, hồ hay bể lọc nước [32],

Một dạng khác của biofilm trong tự nhiên được tìm thấy là khi các vi sinh vật

bán dính trên bề mặt vật liệu ran như các viên sỏi, đá trong nước tạo thành dạng

bio ilm bề mặt.

1.22 T ro n g các hệ thống thiết bị nhân tạo

Biofilm cũng tồn tại trên bề mặt các thiết bị nhân tạo được cấu tạo chủ yếu từ vật liệu vô sinh (nhựa, thủy tinh, thép ) như trên vò của tàu thuyền, bên trong lòng

các ông dẫn nước, ống dần dầu hay dẫn khí đốt, trên sàn các quầy hàng thực phâm.

Trong các thiêt bị, đô dùng gia đình cùng có sự xuất hiện của biofilm khi các vi

sin} vật bám dính trong hệ thông vòi hoa sen, bồn rua mặt, ống thoát n ư ớ c [53],

1.23 T r o n g c ơ t h ể s i n h v ậ t s ố n g

Ngay trong cơ thê sống như động vật hay người cũng xuất hiện biofilm chu yếu

đ ư c c h ìn h t h à n h là s à n p h â m c ủ a n h ữ n g l o à i vi s in h v ật g â y b ệ n h n h ư S t r e p t o c o c c u s

m um s, Staphylcoccus aureus. Biofilm có thê hình thành trên bê mặt lớp tế bào biêu

mô như biêu mô ong dẫn niệu, xoang mũi, xoang miệng hay trên răng tạo thành cấu

- , - ; -

; -B á o c á o t ô n g k ê t d è t à i Q G 1 1 - 1 6

trúc bioíìlm gọi là màng bám răng (hình 1.2) Thậm chí bề mặt cua những dụng cụ y tế đặt trong cơ thê như van tim, niệu quan nhân tạo cũng có thể xuất hiện biofilm [50J.

1.3.1 T hành phần các họp chất plolym er ngoại bào

Thành phần polym er ngoại bào (EPS) rất đa dạng tùy loài vi sinh vật, dạng biofilm và điều kiện hinh thành nhưng về cơ bân đều bao gồm các đường đa cacbon (poly saccharide) có khối lượng từ 40 đến 95%, protein có khối lượng từ lđến 60% là protenn axit nucleic chiếm từ lđến 10% và lipit chiếm từ lđến 40% trong biofilm [12], [ 4 7 1- Thành phân các họp chất này thay đôi theo không gian và thời gian tồn tại cua biofilm v ề cơ ban biofilm có độ dày càng cao và thời gian ton tại càng lâu thì có hàm

l ư ợ n g E P S c à n g n h i ề u M ậ t đ ộ tế b à o tậ p t r u n g c a o n h ấ t ớ l ớ p đ in h trên c ù n g c u a

biofil m và giam dân theo độ sâu nhưng thành phân EPS lại phong phủ hơn ơ vùng phía trong biofilm Thành phân EPS cũng khác biệt so ờ dạng vi khuàn sống tự do so với

4 B á o c á o t ô n g k ê t đ ê t à i Q G 1 ì - 1 6

dạrg sống trong các hệ thông nhân tạo [25] Vai trò cua những thành phân chính trong

mộ' biofilm được trình bày qua bang I

B a n g 1.1 V a i t r ò c u a c á c h ợ p c h ấ t p l o l y m e r n g o ạ i b à o c ó t r o n g b i o f i l m [ 1 4 ]

rác dụng cua

Polysaccharide là thành phần quan trọng đê tạo nên cấu trúc biofilm hoàn chỉnh

Các polysaccharide có thê rất đa dạng về cấu trúc, các đặc tính sinh lý, sinh hóa thông

qué dạng liên kết glycosidic giữa các phân tử (P-1,4, (3-1,3 hay a -],6 ) hay đưn vị

m o io m er cấu tạo nên Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một đơn

p h ái m onosacharide duy nhất như cellulose, dextran hay dị phàn tử cấu tạo bởi 2 đến 4

đ-ạrg đơn phân khác nhau như alginate, emulsan, gellan [9], Các monosaccharit phổ

b iếi trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, L-fucose, nhóm axit uronic

n h i axit D-glucuronic, axit D-galacturonic Thành phần các đường đơn có ảnh hường

đ er đặc tính củ a polysaccharit và qua đó ảnh hường đến đặc tính của cả biofilm [9],

Vai trò của mạng lưới polysaccharide ngoại bào thô hiện ở rất nhiều giai đoạn

khác nhau trong quá trinh hinh thành biofilm như hồ trợ việc gắn kết tế bào lên bề mặt,

đ à n bao môi tương tác giữa các tế bào với nhau, kiến tạo cấu trúc đặc trưng cho

b ioilm

Một sỏ loại polysaccharide đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành

b i o i l m ơ một số loài vi khuẩn là cellulose, PNA/PIA và VPS [44J.

- Cellulose : Cellulose là polysaccharide phô biên nhât trong tự nhiên và được tạo ra bời ca thực vật và vi khuân (Hình 1.3) Quá trình tạo cellulose cùa vi khuẩn và

v.ai trò cua cellulose trong việc hình thành biofilm được mô tà trong 1 số lượng lớn các

5

- , - -

-B á o c á o t ỏ n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

loài vi khuân như Sarcina ventriculi, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli ,

Salmonella spp và Pseudomonas fluorescence [25], [39].

Hình 1.3 Cấu trúc cellulose ờ vi khuân góp phần hình thành biofilm [25]

Các thí nghiệm cho thay các sợi cellulose có thê tương tác với lipolysaccharide (1 _PS) của các tê bào lân cận và chính tương tác này trong cầu nối với các yếu tố khác chịu trách nhiệm trong việc qui định độ bền cũng như tính toàn vẹn cùa một biofilm

- P N A G / P N A : V a i trò c ủa p o l y - N - a c e t y l g l u c o s a m i n e như là m ộ t th à n h phần ngoại bào cua biofilm được nghiên cứu rộng rãi ờ hai loài vi khuẩn Gram âm có quan

hệ gân gũi là Staphylococcus epidermidis tông hợp nên các polysacharit găn kêt nội bào (P1A) và Staphylococcus aureus tông họp nên poly-N-acetylglucosamine (PNAG) Những nghiên cứu gần đây cũng nhận thấy những polysaccharit tương tự PNAG/PIA cùng được tông hợp ờ các vi khuân Gram âm khác như Escherichia coli, Yersinia pestis và ActinoBacillus sp. PIA và PNAG đều là những homopolysaccharides dạng chuồi cấu thành bởi các D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết a-1,6 glucozit nhưng chúng khác nhau về chiều dài chuồi và sự thay đổi nhất định [31 ].

- VPS: V i k h u â n V i b r i o c h o l e r a e t ạ o nên n h ư n g e x o p o l y s a c c h a r i d e g ọ i là VPS (Vibrio polysaccharide) Dạng polysaccharide này cấu tạo chủ yếu bời glucose và galactose và một lượng nhỏ N-acetylglusoamine và mannose c ấ u trúc này dẫn đến sự hình thành khuàn lạc nhăn nheo trên bê mặt thạch và đóng vai trò quan trọng trọng việc hình thanh biofilm trên bề mặt răn cũng như bề mặt long [51] Các tế bào V cholerae

trong biofilm cũng bộc lộ kha năng sống sót tốt hơn trong môi trường nước tây rưa và chịu đựng với áp suât thâm thấu, axit, sự oxi hỏa tốt hơn khi so sánh với dạng sổng tự

do nhờ mạng lưới VPS bao phù quanh tế bào.

[24],

6 B á o c á o t ỏ n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

1.3.1.2 P r o t e i n n g o ạ i b à o

Những phương pháp di truyền và chụp anh hiên vi cung cấp thông tin về việc protein đóng vai trò như là một yêu tô kêt nối tế bào - tê bào trong quá trình hình thành biofilm hơi các loài vi khuân Protein ngoại bào có khối lượng dao động từ 10 kDa đến

200 kDa với 40-60% thành phần là axit amin kị nước N hững thành phần protein chính trong mạng lưới ngoại bào được nối với nhau bơi các ion hóa trị 2 là C a2+ và M g2+ và một lượng nho carbohydrat và axit nucleic [25],

Một protein ngoại bào được nghiên cứu phô biến là protein TasA ơ Bacillus subtilis là thành phân chính trong mạng lưới ngoại bào bao quanh tế bào B subtilis

trong suốt quá trình hình thành biofilm Chức năng chính xác cùa protein TasA trong mạng lưới ngoại bào vẫn chưa được sáng tò nhưng các kết quả nghiên cứu đã được ghi nhận là có tác dụng kháng khuân [43],

1.3.2 T h à n h p h ầ n tế bào

H ìn h 1.4 Thành phần tế bào sắp xếp trong một biofilm

Bioíĩlm có thể được hình thành bời tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài

thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuân lạc Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ờ giai đoạn đầu bơi nó qui định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật, đam nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yêu tô phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hồ trợ cho việc bám dính cúa các tê bào khác lên bê mật giá thê (Hình 1.4).

7

- 5 - 7 -* -—

—— -B á o c á o t ô n g k ẻ t đ ê t à i ọ c 1 1 - 1 6

Kính hiên vi quét tiêu điểm được sứ dụng hiệu quả trong việc quan sát cấu trúc không gian 3 chiều cùa biofilm ờ các chung vi sinh vật khác nhau và cho phép quan sát trực tiếp bioíìlm mà không cân phai phá vỡ cấu trúc quần thê

Vê cơ ban một m ạng lưới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0,2 đến ] um ơ một vài loài vi khuân độ dày cùa lớp EPS mong hơn, không vượt quá 10 đến 30nm [12], Ọuan sát dưới kính hiên vi quét cho thay biofilm không phai là một chất vô định hình, hay một khôi đặc sệt các polysaccharides và vi khuân như những nhận định trước đây.

1 3 3 C ấ u t r ú c b i o f i l m

H ìn h 1.5 Cấu trúc hiển vi của một biofilm

A Cấu trúc không gian của một bioíìlm với mạng lưới ngoại bào bao quanh,

B Anh hiên vi quét cho thấy cấu trúc không đồng đều bên trong bioíìlm và cấu trúc

những kênh dẫn truyền nước [ 14]

Cấu trúc biofilm bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật

tự dam bao sự trao đôi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào Mạng lưới các chất ngoại bào có vai trò qui định sự sắp xêp tế bào đồng thời tạo nên những kênh dần truvên nước bên trong biofilm đam báo cho việc khuếch tán, phàn phối chất dinh dưỡng đên khap các tê bào trong bioíìlm cũng như mang đi những chất thai không cần thiết (Hình 1.5) [28],

Các bioíĩlm được hình thành từ một loài vi sinh vật khác với bioíìlm được hình thành từ nhiẻu loài Trong trường hợp biofilm được hinh thành theo nhiều loài thường

8 B á o c á o t ò n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

đ ư c c c ấ u trúc t h e o k i ê u g ồ m n h i ề u lớ p t r o n g đ ó v i k h u â n h i ế u khí b ê n trcn v à n h i ề u lớp

vi ỉ huân kị khí bên dưới Kiêu cấu tạo này có cấu trúc đặc trưng do các luồng nước chay qua khuây động nên các vi khuân kị khí và hiếu khí có thê song song tồn tại khắp các hốc nho có trong bioflm.

1.4 Quá trình hình thành biofilm

1.4 1 C ác điều kiện tác động đến sự hình thành biofilm

Biofilm có the được hình thành trên các bề mặt bao gồm mô sống, các thiết bị, dựrg cụ y khoa, các hệ thông ống nước có cấu tạo từ những vật liệu khác nhau Tuv nhiìn trong điêu kiện tự nhiên đê chuyên từ dạng sống dạng tự do trong môi trường sang dạng câu trúc trong biofilm đòi hỏi một loạt những điều kiện nhất định Ba yếu tố chính qui định việc hình thành biofilm bao gồm

- T í n h c h ấ t b ề m ặ t g i á t h ể

- Đ i ề u k i ệ n m ô i t r ư ờ n g

- Đ ặ c tín h c ú a c h u n g vi sinh v ậ t [ 14 ]

F ả n g 1 2 C á c y ế u tô ả n h h ư ờ n g đ ế n s ự b á m d ín h tế b à o v à h ìn h th à n h b i o f i l m [ 14 ]

Eặc tính bề mặt giá thể Điều kiện môi trường Đặc tính tế bào

Tốc độ dòng chảy Tính kị nước bề mặt tế bào

Sự có mặt các nhân tố Khà năng tiết các chất ngoại

1.41.1 T í n h c h ấ t bề m ặ t giá t h ể

Đây là yếu tố quyết định đến việc hấp thụ chất hữu cơ và bám dính của tế bào bởi vậy mồi loài vi khuân chi hình thành biofilm được trên một loại số bề mặt giá thê với tính chất nhất định.

Diện tích bề mặt là một trong nhùng yếu tố chinh anh hương đến sự phát triển bioìlm Theo nguyên tẳc diện tích bê mặt càng lớn càng làm tăng kha náng tiếp xúc với tê bào, qua đỏ tạo điều kiện cho việc bám dính lên bề mặt giá thê Các hệ thống ong đầr khác với hâu hết các môi trường tự nhiên (ao hồ, sông) thường có một diện tích bề

m ặ khá lớn tạo điều kiện cho việc tiêp xúc giữa tế bào vi khuân và bề mặt.

9

- JJ - ; -í -

——— -B á o c á o t ô n g k ê t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

Sự phát triển cua các tế bào bên trong biofilm đã được chứng minh là có sự tàng lên khi tăng mức độ thô ráp cua bề mặt [ 14], Diều này được giai thích là do lực cắt giữa bề mặt và tê bào được giảm đi và diện tích tiếp xúc được tăng lên so với bề mặt nhẵn.

Các tính chât câu tạo của bề mặt vật liệu cùng anh hương mạnh đến tốc độ và mức độ găn kết tế bào lên bề mặt Hầu hết các nghiên cứu nhận thấy rằng các vi sinh vật găn kết với một bê mặt kị nước, không phân cực như Teflon và nhựa nhanh hơn là

so với một sô vật liệu khác như thủy tinh hay kim loại [26].

1.4.1.2 D i ề u k i ệ n m ô i t r i r ò n g

Các đặc trưng hóa lý của môi trường nước nlnr pH, mức độ dinh dường, nồng

độ các ion, nhiệt độ có thê đóng vai trò quan trọng troni: mức độ gan kết vi sinh vật lẽn

Những vi sinh vật có lông roi, lông nhung sẽ giúp cho việc di chuyên trong môi trường nước tốt hơn nên có hiệu qua tạo biofilm cao hơn Thí nghiệm so sánh giữa hai chung Pseudomonas fluorescens cho thấy chung di động có kha năng hình thành biofilm nhanh hơn so với chung không di động [13] Đối với loài có lông roi, lông nhung cúng sẽ có ưu thế trong việc di chuyên đên m ột bề mặt giá thê xác định nơi có

1 0

- - 3 -7 - í

-Báo cáo tông kêt đê tài QG 11-16

điều kiện thuận lợi cho việc hình thành biofilm đồng thời giúp cho việc bám dinh ban đâu cua tẽ bào với bê mặt.

'Tuy nhiên một số loài không có phân phụ trợ tế bào nhưng vẫn có kha năng hinh thành biofilm mạnh dựa vào kha năng tự tông hợp sằn các chất ngoại bào như lipopolysaceharide, glycoprotein tạo thành cấu trúc vo (capsule), màng nhày (slime) hay lớp cơ chất bao quanh tế bào [1] Đặc tính này tạo tính tự kết dính kết dinh cho tế bào và chù yêu có ơ những loài vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus mutans, Streptococcus salivanus, Xanthomonas spp, Bacillus anthracis [10].

1.4.2 C ác giai doạn chính trong quá trình hình thành bioíìlm

S ự h ìn h th à n h b i o f i l m là q u á trình p h á t tr iể n m à tr o n g đ ó v i k h u â n trai q ua

n h ữ n g th a y đ ô i t r o n g c á c h th ứ c tô n tại đ ê c h u y ê n từ d ạ n g s ố n g đ ơ n b à o , r i ê n g rẽ s a n g

dạng tập hợp nhiều tế bào, cố định một chỗ và có sự sinh trương cũng như biệt hóa tế

b à o k h á c v ớ i d ạ n g s ố n g trôi n ô i K e t q uả n g h i ê n c ứ u s ự h ìn h th à n h b i o f i l m ở n h i ề u lo ài

Giai đ o a n 1: c ắ n kết b an đ ầu lên bề m ă t• •

Các bề mặt trong môi trường thùy sinh thường đạt được điều kiện cho sự hấp thụ của các chất vô cơ và hữu cơ Dưới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn có thê di chuyên hướng đến bề mặt bởi chuyến động Brownian hay hóa ứng động và hình thành mối tương tác tạm thời với bề mặt thông qua các lực tương tác yếu như lực Van der Waals, lực hút tình điện, liên kết hydro Bước găn kết ban đầu có vai trò quyết định trong việc hình thành biofilm [6].

- --

-^ -B á o c ả o t ỏ n g k é t đ ê t à i Q G 1 1 - 1 6

quần thê và được điều khiển bời hệ thống phân tử tín hiệu cảm ứng.

G ia i đoạn 3: H ình thành mạng lưới ngoại bào

G i a i đ o ạ n 4: H ì n h t h à n h m ộ t b i o f i l m h o à n chinh

Các tê báo tiếp tục phân chia và hoàn thiện mạng lưới đê tạo một biofilm có cấu trúc hoàn chinh Các biofilm phát triên khá chậm thường cần vài ngày đẽ đạt được cấu trúc hoàn chinh Một biofilm trương thành được coi như một tô chức tiên tiến luôn có

sư hích nghi liên tục với môi trường bao quanh, điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trường bất lợi vi khuân có thể tách rời khoi biofilm đê tìm một môi trường phì hợp hơn.

G iai đoạn 5: Ọ u á trình tách ròi

Sự phân huy các polymer ngoại bào có thê diền ra trong điều kiện thiếu hụt dinh dưcng hay oxi bên trontỉ một biofilm Tín hiệu cảm biến định mức (quorum sensing) ha> do tác động cua các yếu lý hóa đều ảnh hương đến quá trình tách rời biofilm [33],

Qm trình này liên quan đen sự tăng cường biêu hiện của các gen mã hóa cho enzyme phâi hùy carbonhydrate tạo nên các lực liên kết yếu hơn trong biofilm, dẫn đến sự phâi tách các tế bào riêng rẽ đồng thời các hệ thống gen mã hóa cho protein lông roi đưcc tãng cường biêu hiện đê chuân bị cho lôi sống tự do trôi nôi của tế bào.

1.5 V a i trò của việc hình thành biofilm vói vi sinh vật

Biofilm được hình thành và xem như là một hình thức tồn tại phô biến của nhiều loài vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên bởi nó đem lại những lợi ích nhất định cho sự tôn tại và phát triển của chính bản thân vi sinh vật.

1.5.1 Bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện bất lọi của môi trường

Các tế bào phai trài qua một số các thay đổi về hình thái, đặc tính sinh lý khi chu/ên sang dạng biofilm và một trong những thay đôi quan trọng là việc hình thành mạrg lưới các chất ngoại bào bao quanh M ạng lưới này giúp giữ lại chất hữu cơ không hòa tan từ môi trường nước xung quanh tạo điều kiện cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triêi và m ờ rộng biofilm Đồng thời nó cũng có vai trò trong việc kiến tạo cấu trúc không gian 3 chiều đặc trung cho biofilm bằng cách tạo nên một mức độ ổn định, một

sự cân băng nội môi cho các vi sinh vật sinh sống trong bioíìlm [47].

Bên cạnh đó một vai trò quan trọng cua mạng lưới ngoại bào là đem lại tiềm

n ăn ' chông lại các tác nhân kháng khuân cho các tế bào sinh sông trong bioíìlm [2]] Đặ( tính này phụ thuộc lớn vào tính chất cua ca mạng lưới biofilm và tác nhân kháng khuìn và thường thê hiện rõ với các chất kháng sinh thuộc nhỏm ưa nước và tích điện đưcng như các aminoglycosie [18] Vi khuân sống trong một bioíìlm có thè có kha

13

- , - -

5 -R á o c á o t ỏ n g k ê t đ è t à i Q G 1 1 - 1 6

nàng kháng đối với các tác nhân gây hại (chất kháng sinh, chất hoạt động bề mặt ) cao gâp 1000 lần so với tế bào sống trôi nôi.

Mạng lưới các hợp chất ngoại bào cũng được ghi nhận có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của kim loại nặng, các ion và chất độc, giúp tế hào tránh khoi rất nhiêu yêu tô stress từ môi trường như tia tư ngoại, pH, sốc thâm thấu và sự khô hạn [18] Ọuá trình hâp thụ các nguyên tố kim loại nặng được biết đến do tác dụng của các nhóm mang điện tích âm trong mạng lưới chất ngoại bào như nhóm phosphate, lưu

h u ỳ n h [ 4 6 ]

1.5.2 Tận dụng nguồn dinh dưõng cùa môi trưòng

Những kènh vận chuyên nước năm xen kẽ trong cấu trúc biofihn giữa các vùng bao quanh vi khuân lạc được ví như là một hệ thống tuần hoàn nguyên thủy Chúng hoạt động hiệu qua trong quá trình trao đôi chất với môi trường xung quanh, do đó làm tàng hiệu qua trong việc sư dụng nguồn dinh dưỡng cũng như loại bò các sàn phẩm chuyên hóa có khả năng gây độc hại [11], Nhờ vậy quá trình chuyến hóa trong bioíìlm cùng mang những đặc trưng khác so với dạng sống tự do.

Mặt khác bioíìlm được hình thành giúp vi sinh vật tận dụng được nguồn chất hữu cơ bám dính trên bề mặt giá thể.

1.5.3 M ố i quan hệ họp tác giữa các loài

Bôn cạnh đó một biofilm có thê được hình thành do sự hợp tác cùng chung sống cùa nhiều loài vi sinh vật để tạo một cộng đồng có cấu trúc không gian phức tạp Các loài vi sinh vật cùng tồn tại trong biofilm thích nghi với những điều kiện về dinh dưỡng, nồng độ khác nhau tạo nên những “vi ồ sinh thái” trong biofilm Chăng hạn như những vi sinh vật nam phía ngoài biofilm thích nghi với điều kiện hiếu khí cao trong khi những loài năm phía trung tâm biofilm có xu hướng chịu được nồng độ oxi thấp (vi hiếu khí).

Kha năng thích nghi với nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các loài vi sinh vật tận dụng được nguồn dinh dưỡng từ môi trường đồng thời hồ trợ lẫn nhau theo hướng cùng cỏ lợi trong quá trình chuyên hóa vật chất [26].

Môi quan hộ hợp tác giữa các loài trong biofilm cùng có anh hương lớn đến chu trình tuân hoàn cùa các nguyên tố trong tự nhiên Hầu hết các quá trình trong tự nhiên đòi hoi sự phoi hợp cua nhiêu nhóm vi khuân có cơ chế trao đôi chất khác nhau đê

1 4

- n - 7 -í - —

-Báo cáo tông kêt đê tài Q G ì 1-16

c ù rg phân giai m ột hợp chất hữu cơ và việc các vi sinh vật thuộc nhiều nhóm khác nhau cùng cư trú tron g biofilm góp phản thúc đày các quá trình nàv diễn ra nhanh hơn.

1.6 Huóng nghiên cứu về biofilm

Biofilm tác đ ộ n g đên rât nhiêu lĩnh vực trong cuộc sống hàng ngày do đó các nghiên cứu về b io film có ý nghĩa thực tiền quan trong và ngày càng thu hút sự quan

tâ n cua nhiều nhà k h o a học.

ỉ 6 I Lợi ích cùa việc hình thành biofilm

ư n g d ụ n g t r o n g v i ệ c x ứ l ý n ư ớ c th a i

Một trong n h ừ n g ứng dụng to lớn của biofilm liên quan đến những vẫn đề làm

s ạ c i nguồn nướ c thải, nguôn nước ngầm Ư n g dụng này bắt nguồn từ thực tế là bán

th â i vi sinh vật có k h a năng phân huy các chất hữu cơ trong môi trư ờng tự nhiên thành

c ác chất vô cơ đơn giản Từ đó đã có nhiều p h ư ơ n g pháp xư lý nước thải bao gồm nhũng giai đoạn x ử lý m à trong đó nước thai được lọc qua các biofilm nhằm m ục đích tácầ và đồng hóa các h ợ p chất hữu cơ có hại M ột lượng sinh khối lcrn các vi sinh vật tro rg m ạng lưới b io íìlm làm tăng sự hựp tác trong quá trình trao đổi chất, giúp cho quá trình loại bo các ch ât gây ô nhiễm trong nước diễn ra hiệu qu à hơn so với dạn g sống tự d' 0 Ọuá trình p h ân h ù y các chất cũng to ra hiệu qua hơn khi th ườ n g sản ph â m của clhuig này lại là cơ c h ất cho một chùng khác trong m ạng lưới biofilm [5].

Trong công nghiệp lên men

Trong các b ồ n lên men ở qui mô công nghiệp bioíìlm là hình thức hiệu quả đế

g lữ lại sinh khối vi sinh vật

Bình th ư ờ n g các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng được giữ lại trong các bồn

lè n men sau m ồi m ẻ x ử lý Khi đó đê tiếp tục m ột qui trình mới lại phải bô sung thêm

m ộ lượng sinh khối nhất định và đựi thời gian đê vi sinh vật có thế sinh trường, phát

tr iêi tới một n ồn g độ nhất định mới Ọui trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu v;àc cũng như mất thời gian vận hành.

N gược lại khi đã được bám giữ trên bề m ặt giá thê bằng m ạng lưới biofilm sinh kihci vi sinh vật có thê được giữ lại m ột cách có hiệu qua sau mỗi me xử lý N h ữ n g giá

t h ể có sẵn m ạn g lưới biofilm có thê được tái sử dụn g ở nh ữ ng lần xứ lý tiếp theo mà klhcng phai bô sung thêm vi sinh vật cũng n h ư đợi thời gian phát triến.

15

- , - ; -ĩ -—

-Báo cáo tỏng kêt dê tài QG 11-lổ

H ư ớ n g n g h iê n c ừ u s ư d ụ n iỊ VI s in h v ậ t c ỏ k h a n ă n g h ìn h th à n h b io f ilm t r o n g đ â u

tn ir h p h ò n g t r ừ b ệ n h g ả y h ạ i ở c à y tr ỏ n g

H ư ớ n g n g h i ê n c ứ u n à y bắt n g u ồ n từ h iệ n t r ạ n g n g à n h n ô n g n g h i ệ p h iệ n n a y

Bệr.h g â y hại ơ cây trông đ a n e là một vấn nạn lớn gảy anh h ươ ng không nho đến năng suấ: cây trong, san lượng vụ mùa Rất nhiều ph ư ơ n g pháp đã được sư dụng nh ằ m ngăn ngùa, g iảm nhẹ hoặc kiêm soát bệnh gây hại cây trồng T rong số đó những biện pháp sinh học như sư dụng các vi sinh vật được đặc biệt chú ý.

Các nghiên cứu đã chi ra rằng vi sinh vật có thể hoạt đ ộng như một tác nhân đối

khán g v ớ i n h i ề u m ầ m b ệ n h k h á c n h a u ơ t h ự c v ậ t b a o g ồ m c á c lo ạ i s â u b ọ v à c á c m ầ m bệnh vi s in h v ậ t n h ư n ấ m , x ạ k h u â n , vi k h u â n Rất n h i ề u lo à i v i s in h v ậ t đ ã đ ư ợ c p h â n

lập từ nhiêu nguôn khác nhau có vai trò đối kháng với tác nhân gây bệnh như các vi

khuân th u ộ c c h i B a c i l lu s , P a n t u e a , P s e u d o m o n a s v à S t r e p t o m y c e s v à nấm th u ộ c chi

Ampelomvces , Coniothyrium , Paecilommyces và Trichoderm a N hiều loài có hiệu quả đối kháng cao đã được đ ư a vào qui trinh san xuất, tạo thành các chế phâm th ư ơ n g mại hóa sử dụng trên qui m ô lớn, được phép lưu hành, trong đó các chế phẩm có sử dụng Triehoderma đượ c sư d ụ n g ở nhiều quốc gia (M ỹ, Đ ức, Ản Độ, V iệt Nam, .)[40, 41],

Đ â u tranh s in h h ọ c là k ế t q u ả cù a rất n h i ề u d ạ n g t ư ơ n g tác g i ữ a c á c n h ó m s in h

vật C ơ chế cua sự tươ ng tác này đã được k iềm ng h iệ m trong rất nhiều nghiên cứu C ơ chế đối kháng phô biến th ư ờ n g được biết đến đó là ức chế thông qua chất kháng sinh Hầu hết các vi sinh vật có thể tạo và tiết m ột hay nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuân Trong vài trư ờng hợp chất kháng sinh từ vi sinh vật được nhận thấy là có tác dụng ức chế m ầ m bệnh gây hại ờ cây trồng T rên thế giới đã có rất nhiều chất kháng

sirứ đ ư ợ c n g h i ê n c ứ u c ó tá c d ụ n g ứ c c h ế v i s i n h v ậ t g â y h ạ i V í d ụ n h ư c h ủ n g B a c i l lu s

c e r e u s U W 8 5 đ ư ợ c b i ế t đ ế n là c ó k hả n ă n g t ồ n g h ợ p c á c k h á n g sin h h i ế m n h ư

z w rte rm y c in và kanosam ine Khả năng tổng hợp chất kháng sinh giúp làm tăng tính

c ạ m tranh, đa dạng hóa sự ức chế giữa các n h ó m vi sinh vật.

Đâu tranh sinh học cũng có thê dựa trên tính cạnh tranh giữa các n hó m vi sinh vật có thê là cạnh tranh về nhu cầu với m ột n guyên tố vi lượng như sắt hay cạnh tranh

v e rơi định cư trên m ột v ùn g xác định cua cây trồng.

T rong hầu hêt các nghiên cứu nhằm nhóm vi sinh vật có kha năng đối kháng,

c h ố ig lại tác nhàn gây bệnh thường được phản lập từ nguỏn đất trông hơi trên thực tế

có một lượng lớn các vi sinh vật sinh sống trong môi trư ờng đất và không gây hại cho

16

- z J - 5 - ———

-Báo cáo tông kêt dê tài QG 11-16

cay trồng C h ú n g cỏ thê tồn tại tự do trong đất hay hình thành mối liên kết với thực vật theo rất nhiều cách khác nhau như bám dinh ơ phía trong hay ngoài m ô thực vật ờ dạng

té bào đơn lé hay thành từ n g cụm trong các nốt rễ cây Mối quan hộ này phần lớn m ang lại lợi ích cho cá hai bên: thực vật là nguồn cung câp chât dinh dưỡng và sự định cư lâu dai cho các q uần thê vi sinh vật Ngược lại khi hình thành mối tư ơ n e tác thì các loài vi sinh vật cũng có thê làm thay đỏi môi trường sống xung quanh thực vật theo hướ ng có lọi cho sự phát triên cua chính thực vật đó [7],

1.6.2 Mối liên quan giữa việc tạo bioíìlm và khả năng đối kháng

Vi sinh vật trong đất có thê hình thành mối tươ ng tác với thực vật thông qua việc tạo nên m ột biofilm bao phu rất nhiều vùntỉ như lá, thân, hạt giống nhưng phô biến nhất vẫn là xung quanh vùn g rề cây B ioíìlm hình thành trên bề mặt rễ cây tạo ra hiệu quả định cư lâu dài cho chính loài vi khuân đó đồn g thời hoạt độn g như một bể thu dinh dưỡng, qu a đó làm g iảm sự tiết các chất dinh d ư ờ ng từ rễ cây để cung cấp cho sự phát triên hay định cư của tác nhân gây bệnh [7],

M ặc dù nh ữ ng nghiên cứu về biotilm đă đ ượ c quan tâm từ rất lâu như n g nghiên cứu về việc hình thành bio film trên bề mặt rễ cây, vai trò cũng như ứng dụng của quá trình này còn hạn chế và chi mới được lưu ý troniỉ vài nám gần đây [23], [49],

N h ữ n g nghiên cứu đã chi ra rằng đặc tính tạo nên một m ạng lưới biofilm có vai trò đáng kê tron g việc đ ấu tranh giữa các n hóm vi sinh vật trong đất có thể được giai thích bởi một sổ cơ chế sau;

B iofilm giúp vi sinh vật trên đất b ám dính trên bề mật rễ cây hiệu quả h(m đ ồ n g thời tạo nên m ộ t lớp m àn g bao phủ xung quanh rễ cây, ngăn chặn sự xâm nhập của các tác nhân vi sinh vật gây hại vào các phần bên trong câv.

N h ờ m ạ n g lưới các hợp chất ngoại bào của biofilm các tế bào của các chủng có khả n ăn g chốn g lại các chất kháng sinh được tiết từ các chủng nấm, xạ khuẩn gây bệnh.

M ột số họp chất liên quan đến quá trình hình thành biofilm là chất hoạt động bẽ mặt n h ư utirin hay surfactin có vai trò hoạt độ n g như m ột chất kháng khuân ức chế sự sinh trương cùa các nh óm vi sinh vật khác.

Q á c L A I ỉ ĩ í S S d 0

17

- _ - - ^ - — -—

-B á o c á o t ỏ n g k ê t đ ẽ tà i Q G ỉ 1 - 1 6

1.7 So luọc về nhóm vi khuân Bacillus

1.7 1 Dặc điếm chung các chúng thuộc nhóm Bacillus

Các ch u n g Bacillus g ồ m các vi khuản thuộc nhóm khuân nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím G ra m dương, kích thước 0.41-0.58 Ịim X 1,5-3 |iin, đứng đơn le hay tạo thành chuồi ngắn Bacillus có kha năng di đ ộn g (có từ 8 - 12 tiên m ao) và có kha năng sinh nội bào tư có hình bầu dục nhò hơn tế bào vi khuân và nam giữa tế bào (hình 1.7) [59

Hình 1.7 C hủn g vi khuẩn B subtilis [60]

1.7.2 ủng dụng của các chủng Bacillus

T r o n g m ô i t r ư ờ n g d in h d ư ỡ n g h ạ n c h ế c á c c h ù n g t h u ộ c c h i B a c illu s c ó k h ả n ă n g

tổ>n£ hựp m ột so enzy m như proíease, am ylases, cenlulase, lipases, Ị3-galactosidase,

n a t u k i n a s e , và kh áng sinh [59] Các hãng sản x u ất đã dựa vào khả năng tông hợp các

e n z / m e c ủ a B s u b t i l i s đ ể s ả n x u ấ t c á c e n z y m n à y trên q u y m ô c ô n g n g h i ệ p C á c

e n z /m e đượ c ứ n g dụng đê sàn xuất một số phụ gia trong chất tẩy rửa và các sản phẩm

k h á : [60] Đ en nay, tất cà các protease b ô sung vào chất tẩy d ùng trên thị trường đều là

s e r h e p r o t e a s e , đ ư ợ c d ù n g từ c á c c h ủ n g B a c i l lu s D ự a v à o k h ả n ă n g tiết k h á n g s i n h m à

c ả c c h u n g B a c i l l u s đ ã đ ư ợ c s ứ d ụ n g đ ê sả n x u ấ t t h u ố c k h á n g s in h trên q u y m ô c ô n g

n g h i ệ p C á c c h ấ t n à y đ ư ợ c s ử d ụ n g n h ư t h u ố c k h á n g k h u â n v à k h á n g n ấ m [ 3 7 ] , D o k h a

n ă n ỉ hình thành m à n g sin h h ọ c n h iều ch u n g B a c i l l u s c ò n đ ư ợ c ứ n g d ụ n g rộn g rãi tron g

vi ệc chông ô n h iễ m và xư lý bằng biện pháp sinh học trong ngành chế biến thực phâm

V i ihuân này cũng giúp làm giam ăn mòn kim loại ở trong các đ ư ờ n g ống dần [41],

N h i ê u c h ù n g B a c i l lu s đ ư ợ c ứ n g d ụ n g tr o n g n ô n g n g h i ệ p vi c h ủ n g th a m g i a t íc h

c ụ c v à o c h u trình c a c b o n v à n itơ , p h à n h u y v ậ t c h ấ t h ữ u c ơ n h ờ v à o k h a n ă n g s in h

nhiêu loại e n z y m e ngoại bào [59], N hiều c h u n g Bacillus có kha năng hình thành các

m à n g s i n h h ọ c (b io film ) g i ú p h ồ trợ c h o h ệ t h ố n g th â n rề c ạ n h tranh v ớ i n ấ m g â y b ệ n h

v a c á c l o ạ i vi k h u â n c ó h ạ i c h o c â y t r ồ n g [ 3 2 ] , N g ư ờ i ta d ù n g B s u b t i l i s nhir tác nhản

k i ê m s o á t s i n h h ọ c p h ò n g trừ v i s i n h v ậ t n h ư n ấ m R h i z o c t o n i a s o l a n i , F u s a r iu m s p ,

Pvỉicularia otyzae [41], M ột sô chu ng Bacillus thunngiensis có kha năng sán xuất độc

tô đòi với côn trùng nên đ ư ợ c sư dụn g như thuốc diệt ấu trùng c h o n g lại nhiều loại sâu

b ư ớ m đ ê b ả o v ệ m ù a m à n g [5 0 ] th a y th ê c h o c á c lo ạ i th u ố c trừ sâu tô n g h ợ p [4 8 ],

N g oài ra, m ột số c h u n g thuộc chi Bacillus có khả n ăng sinh khán g sinh hạn chế

vi khuân có hại trong đ ư ờ n g ruột và trong môi trư ờ ng , g iú p vật nuôi chuyên hoá hiệu

Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập, tuyến chọn các

chủng Bacillus có khả năng sinh tông họp biofilm và nghiên cứu ứng dụng trong

việc ức chế sự phát triến một số vi sinh vật gây hại” v ớ i m ụ c t i ê u b ô s u n g t h ê m cơ

s ớ d ừ l i ệ u v ề k h a n ă n g h ìn h th à n h m ạ n g lư ớ i b i o f i l m từ c á c c h ủ n g v i k h u â n B a c i l lu s

đượ c p h â n lập tại V iệt n a m và ímg dụng các c h ủ n g vi khuẩn này tron g việc phòng trừ

vi sinh vật gây hại đặc biệt gây hại trong n ô n g nghiệp.

C H Ư Ơ N G 2 : N G U Y Ê N L I Ệ U V À P H Ư Ơ N G P H Á P N G H I Ê N c ử u

2 1 N g u y ê n li ệ u

Các m ẫu thu thập bao gồm: Các m ẫu đất, nước, hùn thu thập từ các m ẫu đất

nò n g nghiệp trồng các loại cây hoa màu khác nhau (cài ngọt, hẹ, đ ậ u ) ơ ngoại thành khu vực trung tâm H à N ội; các m ầu nước, bùn ô nhiễm được lấy các làng nghe tại Hà

N ội và H ưng Yên; các m ẫu thu thập từ cống thai cua nhà m áy bia Hà Nội; các mẫu

nư ớ c thai từ bê B iogas tại xã Vĩnh Yên, Vĩnh Lộc, T hanh Hóa Các mẫu sau khi thu

th ậ p được vận chuyên và phân tích trong v òng 24 giờ.

Các vi sinh vật kiêm định: E.coli , Samonella sp , P h y t o p h t h o r a sp. đ ượ c cung càp từ Viện Vi sin h vật và công nghệ sinh học, Đ H Ọ G H N ; chung Ralstonia

s o l a n a c a e r u m từ V i ệ n T h ô n h ư ờ n g N ô n g h ó a

2.2 Hóa chất, thiết bi

2.2.1 Môi trưòng nuôi cấy

Môi trường LB (L uria - Bertani broth hay Luria broth):

Cao nấm m en 5g

Môi trư ờng LB là môi trường th ư ờ ng đượ c sử dụn g trong việc nuôi c ấy các

c h ủ n g vi khuẩn hiếu khí Môi trường có đầy đủ các chất dinh d ư ỡ n g nguồn cacbon,

ni tơ c h o v i sin h vật sin h trư ờ ng và phát triển.

Môi trư ờng k h o á n g cơ bản

Môi trường k h o á n g (:ơ sơ:

C ác môi trư ờ n g đều đưực khư trìing ờ nhiệt độ 121°c trong thời gian 120 phút

Các hóa chất khác sử d ụn g trong nghiên cứu, đánh giá kha năng tạo m àng sinh vật như

c á c lo ạ i đ ư ờ n g F r u c t o s e ( S i g i n a - M ỹ ) ; A r a b i n o s e ( M e r k - Đ ứ c ) , M a n n o s e ( M e r k -

Đức), N aC l (C ông ty cô phần Hóa chất Đ ức G ia n g ) đều đạt độ tinh sạch cho mục

đích nghiên cứu.

2.2.2 Máy móc thiết bị

Đ e tài có sử d ụ n g các trang thiết bị của P hòng Thí nghiệm Trọng điếm C ông

nghệ Enzym và Protein, P h ò n g thí nghiệm Bộ môn Sinh lv thực vật và Hóa sinh, Khoa

sinh học, T rư ừ n g Đại học K hoa học Tự nhiên.

2.3 Phưong pháp nghiên cứu

2.3.1 Phưong pháp phân lập vi khuẩn

Phân lập từ môi trường đất và nước

Đ ê p h â n lậ p v i k h u â n từ c á c m ẫ u đ ấ t, n ư ớ c ở c á c đ ịa đ i ê m k h á c n h a u s ư d ụ n g

phư ơ ng pháp pha loãng m ẫu trong nước vô trùng, c ấ y gạt dịch pha loãng ơ các nồng

đ ộ 1 0 '1, 1 0 ^ v à 1 0 '5 tr ên đ ĩa petri c h ứ a m ô i t r ư ờ n g k h o á n g c ơ s ở h o ặ c L B N u ô i c ấ y ờ

3 7 ° c t r o n g v ò n g 2 4 g i ờ

F’hân lập vi khuẩn từ rễ cây

N h a m mục đích phân lập các chung vi khuân sống bám trên rễ cây p h ư ơ n g pháp

phân lập theo R.Fall [17] đượ c tiến hành:

- M ầu rễ cây ở phân đinh sau khi được rửa sạch băng nước cất khư trùng, và sonicate trong 1 phút đ ư ợ c đặt lên bề mặt thạch cua đĩa petri có chứa môi trư ờng LB đã

- M ầ u n ư ớ c rử a từ rễ c â y đ ư ợ c h ò a l o à n g ơ c á c n ồ n g đ ộ 1 0 ' 1, 1 0 '3 v à ] 0 ' 5 c ấ y

g ạ t trên đ ìa petri đ c n k hi k h ô m ặ t th ạ ch

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng hình thành bioíìlm

N g u y ê n tẳc: tro n g điều kiện dinh d ư ỡ n g thích h ợp và môi trư ờng nuôi cấy tĩnh

thê các chun g vi sinh vật hình thành b io film trên bề m ặt giá thẻ Phát hiện, quan sát

trù ng và u trong điều k iện tĩnh ở 3 7 ° c

Sau 24 giờ các dịch nuôi cấy được loại bỏ khòi các ố n g effendorf Đ ánh giá mật

đ ộ tê bào sôn g trôi nôi trong m ôi trư ờ n g b ằ n g p h ư ơ n g p h á p đo O D 6 2 0n m dịch nuôi

c a y v i k h u â n

Q uan sát khả n ăn g hình thành b iofilm : M ồi ố n g e f f e n d o r f đ ượ c rử a sạch 2 lần

b ằ n g nước cất k hừ trùng Bô su n g vào m ồi ố n g e f f e n d o r f 1 ml d u n g dịch tím violet 1%

v à giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Loại bò d u n g dịch n h u ộ m và quan sát sự bắt

m à u của các tế bào b ám trên trên thành ố n g với tím kết tinh.

Đ ánh giá m ật độ tế bào tron g biofilm: Sau khi rử a sạch 2 lần bàng n ư ớ c cất khừ

trù n g các tinh thể tím b ám trên thành e ffe n o d rf đ ư ơ c hò a tan tro ng lm l etanol 70° M ật

đ ộ tế bào trong b iofilm đượ c x ác định b àng cách đo đ ọ hấp thụ O D 570nm.

2.3.3 Quan sát cấu trúc biofilm bằng chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét

C h uân bị m ẫu b iofilm nôi: bô sung dịch nuôi cấy lắc vi k h u ân vào bình tam giác

c h ứ a 2 0 m l môi trư ờ n g LB N u ô i c ấ y tĩnh 24 g iờ ờ 3 7 ° c

G an mẫu b io íìlm lên lam en để cổ địn h mẫu.

M ạ p h u m ẫ u h à n g v à n g trên m á y J F C - 1 2 0 0 t r o n g 5 p h ú t ở 3 0 m A

Soi và chụp ảnh trên kính hiên vi quét điện tư J S M - 5 4 2 1 L V (N h ậ t Ban) tại

p h ò n g chụp hiên vi điện tử quét, T ru ng T â m K h o a H ọ c Vật Liệu, T rư ờ n g Đ H K H T N

-5 5 - — ——

-Báo cáo tông kèt đê tài QG 11-16

Mỗi c h u ng vi khuân đều hình thành bioíìlm tốt nhât ở những điều kiện thích hợp

vè nhiệt độ, p ll nồ n g độ m uối N aC l khỏ ng thích hợp sẽ tác động dên vi sinh vật và có thê anh hưcmg đến sự sinh trư ơ n g và phát triến cùa vi sinh vật

2.3.4.1 Ảnh huỏng của nhiệt độ

Đ ánh giá kha n ăn g hình thành biofilm cua các chung vi khuân trong môi trường

k h o a n g d in h d ư ỡ n g th ấ p c ó h ô s u n e 1% g l u c o s e l à m n g u ồ n c a c b o n , n u ô i c ấ y ơ c á c

n h iệ t độ: từ 2 5 đ ê n 6 0 ° c S a u 1 n g à y n u ô i c ấ y , t i ế n h à n h q u a n sát, đ á n h g i á k h a n ă n g

tạo biotìlm cùa ch ú n g vi k hu â n nghiên cứu.

2.3.4.2 Ảnh hưỏng của nồng độ glucose

T ư tm g tự như trên kha n ă n g hình thành biofilm của các chun g vi khuân được thực hiện trong môi trư ờ n g k h o á n g dinh dườ ng thấp có bô sung các nồng độ glucose khác nhau từ 0,1 đến 5%.

2.3.4.3 Khả năng sử dụng một số loại đưòng

Đè đánh giá kha n ăng sinh trư ơng và tạo biofilm cua chun g vi khuân trong môi trư ờng có sư dụng m ột số loại đ ư ờ n g khác nhau làm nguồn cacbon N uôi cấy tạo biofilm bởi chun g vi k huân tro n g môi trư ờng kho án g dinh d ư ỡ n g có hô sung 1 % các loại đườ ng khác nhau.

2.3.4.4 Điều kiện dinh dưỡng của môi trường

Đánh giá kha n ăng hinh thành biofilm trong hai loại môi trư ờng với thành phần,

h à m lượng dinh d ư ỡ n g khác n h a u là môi trư ờ n g khoáng dinh dưỡ ng thấp và môi trư ờng LB.

2.3.5 Đánh giá khả năng đối kháng vói một số chủng vi sinh vật gây hại

P hư ơn g pháp nhỏ dịch: d ù n g kh o a n nút chai đục các lồ trên môi trư ờng đã cấy

vi sinh vật kiêm định, nhỏ 30 ^1 dịch nuôi cấy vi khuân Đặt nuôi cấy trong tu ấm

C h ấm đầu tăm bông lên môi trư ờng đà cấy vi sinh vật kiểm đinh Cuối cùng nuôi cấy trong tu ấm 3 7 ° c

S ư d ụ n g c á c m ô i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y k h á c n hau : L B , k h o á n g d in h d ư ỡ n g thấp,

CV.apeck đê đánh giá điều kiện kháng khuân mạnh nhất.

2.3.6 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA

Phương pháp này d ựa trên phương pháp S anger có cai tiến: Dựa vào sự tông

Kết quà được xử lý trên phần m ềm PC /G ene, G endoc, BioEdit và được so sánh với trình tự đã được công bố trên ngân hàng dừ liệu gen quốc tế bàng ch ương trình

B L A ST (Basic Local A ig n m e n t Search Tool) qua dữ liệu của D D G J E M B L đê tìm xem m ức độ tươ ng đồ n g của các chùng nghiên cứu.

Ket quà đọc trình tự 16S rD N A của các c h ù ng vi sinh vật có khả năng tạo m àng sinh vật m ạnh được thực hiện với sự giúp đ ỡ cùa V iện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh

h ọ c - Đ ạ i h ọ c Q u ố c g i a H à N ộ i

2.3.7 Quá trình lên men

C huẩn bị 40m l dịch cấy lắc chùng vi khuân lắc qua 1 đêm

C huẩn bị 3L môi trư ờ n g nuôi cấy

400m l N aO H IM , 4 00 m l H 2 S 0 4 IM dù n g đế điều chỉnh pH

Bô sung 3L môi trư ờ n g vào nồi lên m en rồi k h ử trùng nồi lên men

C h ạ y n ồ i lên m e n đ ê t h ứ p H v ớ i c á c đ i ê u k iệ n : n h i ệ t đ ộ v à p H tố i ưu c u a c h u n g

n g h i ê n c ứ u ; T ố c đ ộ k h u ấ y 3 0 0 v ò n g / phút.

Thu dịch và đưa vào các giá thể chất m ang (đã khư trùng).

2.3.8 Phương pháp thống kê sinh học

Các kết qua thu được được xư lv bang thông kê sinh học thông qua các phần

CHƯƠNG 3: KÉT ỌUA VẢ THAO LUẠN 3.1 Phân lập các chúng vi sinh vật từ các điều kiện sinh thái môi trưòng khác nhau có hoạt tính tạo bioíĩlm

3.1.1 Phân lập các chung vi sinh vật

Từ m ẫ u nước, đất tại các khu vực khu vực Lại Trạch, H ưng Yên chúng tôi phân lập được 23 chu n g vi sinh vật, số lượng các chung lần lượt thu được từ phần nước thài tâng m ặt là 6 chủng, phần giữa cách tầng mặt 30 cm là 11 chun g và phần m ặt đáy là 6 chung Từ m ẫ u nước thai làng bún Phú Đ ô chúng tôi phân lập được 27 chùng vi sinh vật với sô lượ ng chung hiện diện ờ tầng m ặ t là 5 chủng, khu vực nước phần giữa cách mặt nước 15 cm là 12 ch u n g và phần m ặt đáy là 10 chủng Phân lập mẫu nước thài nhà

m áy sản xuât bia thu đ ư ợ c 25 chùng vi khuân, trong đó lượng ch ung từ khu vực nước thai tâng đáy là 1 ].

T ừ m ẫ u nước ứ các bê biogas c h ú n g tôi phân lập được 11 chủng vi khuẩn với các hình d ạn g khuẩn lạc khác nhau.

T ừ 3 ngu ồn mẫu chính là nguồn đất nguồn rễ cây và nguồn nước chúng tôi thu đirợc một số lượng lớn kh uân lạc với hình dạng, kích thước đa dạng (hình 3.1) Tiếp tục sàng lọc chú n g tôi lựa chọn 13 chu ng vi khuẩn được phân lập tuyên chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

Kêt q u ả thu được cho phép chúng tôi nhận định: phần lớn các chùng vi sinh vật phân lập đ ư ợ c từ các m ẫ u nước thải tập trun g ờ khu vực nước phần giữa và phần mặt đáy Các đ ịa điếm lấy m ẫu lại chù yếu là nh ữ ng khu vực nước thài chứa h àm lượng

c acbon cao Đ iều này phù hợp với giài thích về khả năng bám dính của các ch ủng vi sinh vật ờ các phần nước này Đ ây là p hần nước thải ít có sự biến đ ộn g và xáo trộn về

d òng chay, là m ột điều kiện thuận lợi ch o các vi khuẩn gắn kết với nhau và với các bề mặt D ồng thời phần n ướ c này cũng là nơi cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng giúp các tế bào tăng trư ơ n g và phát triển tốt, hứa hẹn thu nhận được nhiều chùng có khả năng hình thành biofilm tốt, phù hợp với mục đích nghiên cứu.

Đôi với mầu đât n ô n g nghiệp kêt qua phân lập ban đầu cho thấy số lượng vi sinh vật phát triên trôn môi trư ờng thạch sau m ột ngày nuôi cấy với số lượng nhiều ơ mẫu đât và mẫu rễ cây, trong khi đó mẫu nước lại có rất ít khuân lạc phát triển.

2 5

— - 3 -/ -ĩ - —

-Báo cáo tỏng kêt đẽ tài ỌG 11-16