Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp

Điều này đã góp phần làm tăng giá trị sản phẩm đầu ra, đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.Tuy nhiên, do thiếu sự quản lý, do người nông dân thường chỉ tập trung đầu tư

H À N Ộ I, 2009

B Á O C Á O T Ó M T Ắ T

Tên đề tài: Phân lập và tuyển chọn một số chùng vi sinh vật có khả năng xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp

Chủ t r ì : Thạc sỹ Nguyễn Kiều Băng Tâm

I Mục tiêu nghiên cứu

Chọn lựa được các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao nhàm xử lý phếphụ phẩm nông nghiệp, hạn chế ô nhiễm môi trường và cung cấp nguồn phân bón giàuhữu cơ cho cây trồng

II Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao

2 Xác định điều kiện sinh trưởng của các chủng đã lựa chọn

3 Phương pháp xử lý phế thải nông nghiệp bàng vi sinh vật và xác định một số tính

chất hoá sinh của đống ủ sau khi được xử lý bằng vi sinh vật

4 Đánh giá hiệu quả của sản phẩm sau khi ủ bằng phương pháp xác định hàm lượng

các chất dinh dưỡng trong cây

III Kết quả đạt được

+ Từ 14 chủng vi sinh vật đã tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính phân giải xenlulozơ cao và 2 chủng có hoạt tính phân giải tinh bột cao Các chủng này thuộc nhóm

ưa nhiệt và ưa pH từ 7-8 Các chủng này có thể sử dụng để xử lý rơm rạ làm phân bón Khi

truyền thống mà hàm lượng các chất dinh dưỡng lại cao hơn, từ đó nâng cao năng suất cây trồng lên khoảng 22,5% Bên cạnh đó sản phẩm lại không chứa vi sinh vật gây bệnh nên an toàn cho người sử dụng

IV Tình hình kinh phí: 20.000.000 đ

Đã chi theo dự toán và quyết toán với tài vụ, Trường ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội

2 Content

* Select the microorganism strains with highly biological activities to treat agricultural by-products

* Research growth conditions of selected strains of microorganisms

* Appreciate the effectiveness of product after treatment by microorganisms

+ Among 14 strains of microorganisms, 2 strains with the highest cellulose

been selected They belong to thermophil group of organisms and growth well on

pH of 7-8 These strains can be used to treat straw to make biofertilizer

The time o f composting breeding waste by microorganisms is 3-6 times shorter than the traditional method of composting whereas nutritious components of the organic product and the plant productivity are higher than those in the control sample Moreover, the plants do not contain toxic microorganisms and safe for consumers

MỤC LỤC

LỜ I M Ở Đ À U 1

C H Ư Ơ N G 1 T Ỏ N G Q U A N T À I L I Ệ U 3

1.1 Phế phụ phẩm trồng trọt và ảnh hưởng của nó đến môi trường 3

1.2 Phế thải chăn nuôi và ảnh hưởng của nó đến môi trường 4

1.3 Vai trò của vi sinh vật trong việc xử lý các phế thải hữu c ơ 6

1.3.1 Khả năng chuyển hoá các hợp chất cacbon của vi sinh vật 6

1.3.2 Khả năng chuyển hoá các họp chất nitơ của vi sinh vật 7

1.3.3 Khả năng phân giải lipid của vi sinh v ậ t 8

C H Ư Ơ N G II P H Ư Ơ N G P H Á P N G H IÊ N c ứ u 9

2.1 Nguyên liệ u 9

2.2 Phương pháp nghiên cứ u 9

2.2.1 Kiểm tra mật độ vi sinh vật theo phương pháp K ock 9

2.2.2 Phân lập các chủng vi sinh vật phân giải xenluloza 10

2.2.3 Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh b ộ t 11

2.2.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 11

2.2.5 Xác định điều kiện sinh trưởng và phát tr iể n 12

2.2.6 Phương pháp xử lý phế thải trồng trọt bằng v s v 13

2.2.7 Phương pháp xử lý phế thải chăn nuôi bằng vi sinh vật 14

2.2.8 Phương pháp xác định các tính chất hoá sinh trong đống ủ 14

2.2.9 Phương pháp bố trí thí nghiệm trồng c â y 15

2.2.10 Đánh giá nhanh độ chín và độ an toàn của phân ủ 16

2.2.11 Các phương pháp xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng trong cây cải ngọt 16

C H Ư Ơ N G 3 K Ế T Q U Ả V À T H Ả O L U Ậ N 17

3.1 Phân lập và tuyển chọn một số v s v có hoạt tính phân giải họp chất hydrat cacbon 17

3.2 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh v ậ t 20

3.3 Khả năng sử dụng các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong xử lý phế phụ phẩm trồng trọt trong nông n g h iệp 22

3.3.2 Một số đặc điểm của phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi ủ 24

3.4 Nghiên cứu khả năng sử dụng phế thải chăn nuôi sau khi được xử lý nhanh bằng chế phẩm v s v đối với cây trồ n g 24

3.4.3 Đánh giá độ chín của sản phẩm sau khi ủ 26

Kết l u ậ n 28

Tài liệu tham k h ả o 29

4

LỜI MỞ ĐÀU

Việt Nam là một quốc gia có trên 70% dân số sống bằng nghề nông nghiệp, với diện tích đất cây trồng có hạt trên 8355,3 nghìn ha, trong đó 7322,3 nghìn ha lúa, 1033 nghìn ha ngô còn lại là các loại cây có hạt khác [3,6], hàng năm sau khi thu hoạch đã để lại trên đồng ruộng một khối lượng lớn phế phụ phẩm nông nghiệp trồng trọt (rơm, rạ, thân, lá cây )

Theo phương thức sản xuất nông nghiệp truyền thống, lượng phế phụ phẩm nông nghiệp trồng trọt sau khi thu hoạch được chuyển về nhà và được sử dụng như một nguồn nguyên liệu chính để đun nấu trong các nông hộ Cùng với sự phát triển của xã hội và nhu cầu đời sống ngày một nâng cao, ngày nay hầu hết các hộ nông dân đã sử dụng các nguồn nguyên liệu như than, gas, điện cho việc nấu nướng nên phần lớn lượng phế phụ phẩm nông nghiệp sau khi thu hoạch được người nông dân đốt ngay trên đồng ruộng tạo ra những chất độc hại : CH4, C 02, bụi Việc đốt phế phụ phẩm nông nghiệp trên đồng ruộng đang dần hình thành một thói quen xấu, không những gây ảnh hưởng xấu tới môi trường sinh thái mà còn rất lãng phí nguồn nguyên liệu có nguồn gốc thực vật này

Qua nhiều nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam cho thấy, các loại phế thải giàu họp chất hydrat cacbon như rơm rạ, thân, lá ngô, đậu, lá mía, phế thải sản xuất

cà phê, mía đường thường được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất phân bón hữu cơ sinh học Thành phần của phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm phần lớn là xenlulozơ, hemixenlulozơ, tinh bột, lignin, ngoài ra chúng còn chứa một số các chất

có giá trị dinh dưỡng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng Tuy nhiên, trong thực tế phế thải này không thể sử dụng trực tiếp được mà cần phải được xử lý trước khi đưa vào sử dụng Sản phẩm của quá trình phân huỷ phế thải này có tác dụng cải tạo độ phì nhiêu cho đất (làm cho đất tơi xốp, cải thiện tính chất đất nhất là khả năng giữ nước ) Việc xử lý và tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp giàu hợp chất hydrat cacbon với mục đích phục vụ sản xuất nông nghiệp bàng công nghệ vi sinh đang là một trong những giải pháp hữu hiệu, là một hướng đi đúng đắn, đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và có triển vọng, vừa góp phần cải tạo độ phì nhiêu cho đất, góp phần vào bảo vệ môi trường phát triển bền vững

Trong thời kỳ đổi mới, ngành chăn nuôi Việt Nam cũng liên tục đạt tốc độ tăng trưởng cao, góp phần tích cực trong sự nghiệp ổn định và phát triển kinh tế, xã hội của đất nước, số lượng đàn gia súc, gia cầm không ngừng tăng qua mỗi năm,

1

chất lượng vật nuôi cũng được cải thiện Điều này đã góp phần làm tăng giá trị sản phẩm đầu ra, đáp ứng đủ nhu cầu tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.

Tuy nhiên, do thiếu sự quản lý, do người nông dân thường chỉ tập trung đầu

tư để nâng cao năng suất và chất lượng vật nuôi mà chưa chú trọng nhiều đến các vấn đề về môi trường, nên hàng năm một lượng lớn phế thải chăn nuôi không được

xử lý đó thải trực tiếp ra môi trường, gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí, ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường sinh thái và sức khoẻ con người

Từ lâu, người nông dân đó biết tận dụng và xử lý nguồn phế thải chăn nuôi làm phân bón cho cây trồng, làm thức ăn cho gia súc v.v Tuy nhiên, việc xử lý theo các biện pháp truyền thống thường mất nhiều thời gian, gây ô nhiễm không khí

mà hiệu quả về dinh dưỡng thu được của phân ủ không tối ưu

Hướng nghiên cứu sử dụng vi sinh vật như một tác nhân sinh học để xử lý nhanh nguồn phế thải chăn nuôi tại các hộ gia đình, các trang trại nhàm hạn chế ô nhiễm môi trường, tạo sản phẩm phân bón hữu cơ có chất lượng phục vụ cho sản xuất nông nghiệp đã và đang là một hướng đi tích cực, thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước

Với mục đích nghiên cứu xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm phế thải trồng trọt và chăn nuôi theo hướng thân thiện với môi trường, chúng tôi đã tiến

năng xử lý ph ế phụ phẩm nông nghiệp".

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phế phụ phẩm trồng trọt và ảnh hưởng của nó đến môi trường

Phế phụ phẩm trồng trọt gồm tàn dư thực vật trong trồng trọt và chế biến

rơmphụ phẩm trồng trọt chủ yếu gồm các nhóm : lignin, hemixenlulozơ và xenlulozơ;

đường và tinh bột; mỡ, dầu; protein

Khả năng phân giải sinh học sẽ tăng dần từ lignin, hemixenlulozơ, xenlulozơ,

tấn nông sản và thành phần hoá học của một số họp chất chính trong tự nhiên được

Bảng 1.1 Lượng phế phụ phẩm phát sinh để thu được 1 tấn nông sản

sau thu hoạch

Tên nông sản Loại phế phụ phẩm Khối lượng (kg)

Quá trình lưu giữ và tận dụng lại chất thải rắn nông nghiệp một cách không hợp lý cũng dẫn đến những ảnh hưởng xấu tới môi trường không khí Khí hậu nhiệt đới nóng ẩm và mưa nhiều ở nước ta là điều kiện thuận lợi cho các thành phần hữu

cơ phân huỷ, thúc đẩy nhanh quá trình lên men, thối rữa và tạo mùi khó chịu cho

thải hữu cơ nông nghiệp ngay trên đồng ruộng, trong các chuồng trại hoặc tại những

Nếu như trước đây các phụ phẩm nông nghiệp được nhà nông tận dụng chủ yếu để làm nhiên liệu đốt cho nấu ăn, thì hiện nay cuộc sống ngày một được nâng cao hơn, chỉ có một phần phế phụ phẩm nông nghiệp được tái sử dụng như: trồng nấm, làm ván ép, một phần làm nhiên liệu đốt còn lại được đem đốt trực tiếp ngay tại đồng ruộng, khi đốt như vậy thì thường phát thải ra các chất gây ô nhiễm môi trường như: CH4, C 0 2 [1] Mặt khác, sau vụ mùa thì những đống rơm, rạ được đốt nhiều đã gây ra khói bụi gây ảnh hưởng đến môi trường: khói phủ trên diện rộng tại Hà Nội đêm 16/10/2005, khiến nhiều nơi ở Hà Nội trong tình trạng mù mịt Đây không phải lần đầu tiên hiện tượng khói mỏng bao trùm Hà Nội Năm 2004, vào đợt cuối tháng

nguyên nhân do người dân ở các vùng lân cận Hà Nội đốt rơm rạ sau thu hoạch cộng với lượng khói bụi đọng lâu trong khí quyển (Theo Ciren Bộ tài nguyên vàmôi trường Trung tâm thông tin)

1.2 Phế thải chăn nuôi và ảnh hưởng của nó đến môi trường

Một trong những khó khăn, thách thức đối với ngành chăn nuôi hiện nay là giải quyết các vấn đề liên quan đến phế thải chăn nuôi Khi chăn nuôi ở quy mô nhỏ

lẻ phân tán, các loại phế thải chăn nuôi thường được tận dụng cho trồng trọt, những

4

tác động tiêu cực của chúng đối với môi trường là không đáng kể Tuy nhiên, khi ngành chăn nuôi phát triển theo hướng trang trại hoặc các làng nghề chăn nuôi mang tính hàng hóa, vấn đề kiểm soát lượng phế thải trong chăn nuôi trở thành bài toán khó đối với các nhà quản lý hiện nay [15] Hiện nay, phần lớn lượng chất thải chăn nuôi sẽ xả thẳng ra ngoài tự nhiên hoặc sử dụng không qua xử lý.

Theo Bộ NN&PTNT, mỗi năm chăn nuôi thải ra trên 73 triệu tấn chất thải rắn (phân khô, thức ăn thừa) và 25-30 triệu khối chất thải lỏng (phân lỏng, nước tiểu

và nước rửa chuồng trại) Trong đó, khoảng 50% lượng chất thải rắn (36,5 triệu tấn), 80% chất thải lỏng (20 - 24 triệu m3) xả thẳng ra tự nhiên, hoặc được sử dụng trực tiếp [15] Bảng 1.3 cho thấy lượng chất thải hàng ngày của các loài gia súc, gia cầm

Bảng 1.3 Lượng chất thải hàng ngày của các loài vật nuôi [5]

Sơ đồ 1: Mối quan hệ giữa chăn nuôi và các yếu tố

ô nhiễm môi trường từ chăn nuôi

5

Lượng phê thải không lô hàng ngày vật nuôi thải ra môi trường tôn đọng lại gây ảnh hưởng xấu tới nguồn nước, không khí, đất, các sản phẩm từ vật nuôi Lượng phế thải này sẽ gây ô nhiễm đất, nước, không khí bởi chúng chứa nhiều các nguyên tố như nitơ, photpho, kẽm, đồng, chì, asen, niken , tạo ra các khí độc và đặc biệt là các loại mầm bệnh, ký sinh trùng và vi sinh vật gây hại Đó có thể là các loại giun sán (giun đũa, giun tóc, giun móc, giun kim, sán dây, sán lá ), các

bệnh tả, kiết lỵ cho gia súc Một nghiên cứu mới đây cho thấy, nếu sử dụng chất

Vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải chăn nuôi đã xuất hiện ở nhiều nơi, đặc biệt là các vùng gần các trang trại chăn nuôi gia súc, gia cầm lớn, các xã có khu chăn nuôi tập trung trong khu dân cư gây bức xúc cho người dân sống xung quanh, đặc biệt là ô nhiễm vi sinh vật, ô nhiễm nước và ô nhiễm không khí

Theo một kết quả nghiên cứu tại xã Hồng Hà (Hà Tây), do các khu chăn nuôi đều nằm tập trung trong khu dân cư nên đã xảy ra ô nhiễm môi trường nước và không khí nghiêm trọng, ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ người dân địa phương Kết quả phân tích chất lượng nước thải, nước mặt quanh khu vực xã Hồng Hà cho

cao hơn 5-13 lần, tổng N, p cao hơn 9-23 lân [16]

1.3 Vai trò của vi sinh vật trong việc xử lý các phế thải hữu cơ

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, thực vật và động vật thường thải ra môi trường xung quanh một lượng lớn các chât hữu cơ trong đat Mạt khac, khi chúng chết đi chúng cũng để lại một lượng lớn chất hữu cơ khó phân giải cho đất, gây ô nhiễm môi trường xung quanh Dưới tác dụng cua cac chung VI sinh vạt, cac chất hữu cơ chưa được phân giải bằng hệ enzym tiêu hoá của động vật, hay các chât hữu cơ có trong xác động thực vật sẽ tiếp tục được hệ enzym thuỷ phân của vi sinh vật có sẵn trong môi trường và của chủng vi sinh vật tuyên chọn đưa vào phân giải,chuyển hoá thành các họp chât vô cơ đơn gian [13]

1 3 1 Khả năng chuyển hoá các hợp chất cacbon của vi sinh vật

Các hợp chất cacbon hữu cơ có nhiều trong cơ thê động vật, thực vật, VI sinh

6

vật như xenlulozơ, tinh bột, ligin Khi động thực vật chết đi, xác của chúne sẽ để lại một lượng chất hữu cơ khổng lồ trong đất Nhờ hoạt động của các nhóm vi sinh vật dị dưỡng cacbon, các chất hữu cơ này dần dần bị phân huỷ tạo thành các hợp chất đơn giản hơn, mà sản phẩm phân giải cuối cùng là C 0 2 Khi môi trường bị ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa cacbon như xenlulozơ, tinh bột, các loại đường đơn , người ta thường sử dụng các nhóm vi sinh vật có khả năng phân eiải xenlulozơ, tinh bột để xử lý chất thải hữu cơ này [13].

- Khả năng phân giải xenỉuỉozơ: Xenlulozơ là loại hợp chất khá bền vững, không tan trong nước (chỉ phồng lên do hấp thụ nước, không được tiêu hoá bởi hệ enzym của con người và một số loài động vật) Vì vậy, ngoài phế thải thực vật, xenlulozơ còn tồn tại rất nhiều trong phế thải chăn nuôi, nhất là trong thành phần chất độn của phế thải [13]

Trong thiên nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ xenlulozơ nhờ có hệ enzym xenlulozơ ngoại bào Trong đó vi nấm là nhóm có khả

còn có các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và niêm vi khuẩn cũng có khả năng phân huỷ

- Khả năng phân giải tinh bột: Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, gồm 2 thành phần là amilo và amilopectin Trong đất có nhiều loại vi sinh vật có

Pseudomonas [7, 13]

1,3,2 Khả năng chuyển hoá các hợp chất nitơ của vi sinh vật

Trong thiên nhiên tồn tại nhiều dạng hợp chất nitơ hữu cơ như protein, axit amin axit nucleic, urê Các hcrp chất này đi vào đất từ nguồn xác động, thực vật, các loại phân chuồng, phân xanh, rác sinh hoạt Thực vật không thề đồng hoá được dạng nitơ hữu cơ phức tạp trên mà chỉ có thê sư dụng được sau qua trinh phan giâi

n i t ơ h ữ u c ơ b ở i h ê c n z y m CỦ3 VI s i n h v ạ t - CỊUCI tỉ lỉĩh ũ ỉ ĩ ì o n h o ơ [ 1 3 ]

Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng amôn hoá protein Ví

Streptomyces rimosus, Streptomyces gnseus ', vi nâm có Aspergillus oryzae,

Aspergillus flavus, Aspergillus mger [13]

Khả năng chuyển hoá các hợp chất nitơ hữu cơ của vi sinh vật không chỉ làm giảm ô nhiễm môi trường mà còn có thê tận dụng quá trình này vào sản xuat Cac nhà khoa học đã vận dụng quá trình này vào các quá trình chê biên và bảo quản

7

nông sản quí như: trứng, thịt, sữa, thịt hộp, cá hộp hay trong chế biến thức ăn cho người và gia súc; chế biến phân hữu cơ chứa nitơ.

1.3.3 Khả năng phân giải lipid của vi sinh vật

Lipid (chât béo) là nhóm hợp chât hữu cơ tự nhiên, rất phổ biến trong tế bào thực vật và động vật Nó là este của axit béo và rượu đơn, đa chức Lipid (chất béo)

là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên, rất phổ biến trong tế bào thực vật và độns vật

Nó là este của axit béo và rượu đơn, đa chức Dựa vào thành phần cấu tạo, có thể coi lipid gồm hai nhóm:

- Lipid đơn giản: là este của rượu và axit béo, gồm một số nhóm nhỏ sau: triaxyl glixerin (glyxerit), sáp(Cerid), sterit

- Lipid phức tạp: trong phân tử của chúng ngoài axit béo và rượu còn có các thành phần khác như axit phosphoric, bazơ nitơ, đường Nhóm này bao gồm: Glixerophospholipit, Glixeroglucolipit, Sphingophospholipit, Shingoglucolipit

v ề tính chất: Lipid không tan vào nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ như ete, benzen, toluen Lipid là dung môi hoà tan các loại vitamin như: vitamin A,

D, E, K, F [7].

Trong tự nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải lipid như

Pseudomonas, Achromobacte, Actinomyces,

Với khả năng phân giải các hợp chất như trên, các nhà khoa học đó sử dụng các loại vi sinh vật có sẵn trong môi trường; làm tăng hoạt tính của các chủng vi sinh vật để xử lý các loại phế thải trong trồng trọt và chăn nuôi

8

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 N guyên liệu

Rơm rạ: Được lấy mẫu tại ruộng lúa sau thu hoạch tại Hà Tây

Phân ỉợn: được lây mâu từ khu chăn nuôi của người dân xã Đông Ngạc huyện Từ Liêm, Hà Nội

Chê phâm vi sinh vật: Do phòng Vi sinh vật — Viện Thổ nhường Nông hoá sản xuât Chê phâm vi sinh vật được tạo thành từ tổ hợp các vi khuẩn, nấm men, xạ

Bảng 2.1 Thành phần chế phẩm vi sinh vật

STT Các nhóm vi sinh vât

•

Chỉ tiêu chất lượng (Mật độ - CFƯ/g)

Rau cải ngọt: Giông cải ngọt Tosankan (Brassica integrifolia)

Cây cải ngọt Tosankan là thực vật có hai lá mầm, có chu kỳ sinh trưởng ngắn (khoảng 40 ngày) Cây có giá trị về mặt dinh dưỡng cao Cây cải ngọt phát triển tốt trong điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa của Việt Nam và có thể trồng

2.2 P h ư ơn g pháp nghiên cứu

2.2.1 Kiểm tra mật độ vi sinh vật theo phương pháp Kock

(1) Kiểm tra mật độ vi sinh vật tổng số: trên môi trường thạch thịt

(2) Kiểm tra mật độ nấm men: trên môi trường Hansen

(3) Kiêm tra ĩìĩật độ xợ khuân', tren moi trương Gâuse

(4 ) Kiểm trơ mật độ E.colv. trên moi trương Mac Conkey

(5) Kiểm tra mật độ Salmonella: trên môi trường ss.

9

(6) Kiểm tra mật độ nấm mốc: trên môi trường Czapeck

Số lượng khuẩn lạc được tính bằng công

• n l : số lượng đĩa petri được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất

• d: hệ số pha loãng tương ứng với hệ số pha loãng thứ nhất

2.2.2 Phần lập cảc chủng vi sinh vật phân giải xenluloza

Để phân lập các vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza Đề tài tiến hành phân lập trên môi trường Hutchinson và Clayton Phương pháp tiến hành như sau:

- Chuẩn bị các môi trường Hutchinson và Clayton

- Khử trùng môi trường rồi phân phối ra các hộp petri (Khi môi trường nguội còn 40 - 50°C), mỗi hộp khoảng 20 -30 ml môi trường

- Cân 10 g mẫu phế phụ phẩm nông nghiệp cho vào bình tam giác dung tích 250ml chứa sẵn 90ml nước sinh lý đã khử trùng, lắc trên máy lác 30 phút, được dịch pha loãng 10 Sau đó, dùng nước cất vô trùng pha loãng để đạt được độ pha loãng 10*2, 10'3 Hút chính xác 0,05ml dịch pha loãng bằng pipet nhỏ (pipetman 200ml) vào các đĩa peptri chứa môi trường Hutchinson và Clayton đã khử trùng và dàn đều dịch trên bề mặt môi trường bằng que trang vô trùng, những thao tác này được làm trong tủ ấm trên n^ọn lửa đèn cồn Dùng kẹp kim loại vô trùng gáp khoanh giấy lọc tròn (có diện tích bằng diện tích bề mặt thạch) đã hấp khử trùng và đặt lên bề mặt thạch và dùng que trang thuỷ tinh vô trùng làm cho giấy dính sát vào

bề mặt thạch Bao gói và nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 30°c trong 1- 2 tuần (chú ý

để ở nơi có độ ẩm không khí cao để đề phòng giấy lọc bị khô) Sau thời gian nói trên lấy ra kiểm tra các vi sinh vật phát triển trên bề mặt giấy lọc

10

Vi sinh vật phân giải xenlulozơ khi phát triển trên giấy lọc thường còn lẫn với một số vi sinh vật khác Muốn thuần khiết ta phải cấy chuyển sang môi trường dịch thể có trộn các mẩu giấy lọc vụn Các môi trường được sử dụng trong quá trình này là: Môi trường Gauze, môi trường Hans và môi trường Czapeck Sau khi làm thuần xong bảo quản các chủng phân lập được trong ống thạch nghiêng chứa môi trường phù hợp với từng loại.

2.2.3 Phăn lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột

Đe phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột đề tài sử dụng các môi trường vẫn dùng để phân lập vi khuẩn có bào tử, nấm mốc, nấm men Phương pháp tiến hành như sau:

- Chuẩn bị môi trường Thạch - tinh bột (1000ml)

- Khử trùng môi trường rồi phân phối ra các hộp Petri (Khi môi trường nguội còn 40 - 50°C), mỗi hộp khoảng 20 -30 ml môi trường

- Cấy dịch pha loãng mẫu nghiên cứu (cấy khoảng 0,05ml) lên bề mặt thạch, dùng que gạt thuỷ tinh gạt đều Nuôi cấy ở nhiệt độ 28- 30°c trong khoảng 7- 10 ngày Sau thời gian nói trên lấy ra kiểm tra khuẩn lạc các vi sinh vật phát triển trên môi trường

- Thu thập các khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấy chuyển sang môi trường đặc hiệu

để làm thuần Sau khi làm thuần xong bảo quản các chủng phân lập được trong ống thạch nghiêng chứa môi trường phù hợp với từng loại

2.2.4 Phương pit áp đảnh giá hoạt tỉnh sinh học

2.2.4.1 Đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật phân giải

11

Cách tiến hành: Dùng môi trường thạch - cơ chất: môi trường CMC gồm: lơ CMC (xenluloza tự nhiên), 15g thạch, 1000ml nước cất.

Phân phối đều vào bình tam giác có dung tích 250ml khử trùng ở latm trong

30 phút, đợi nguội đến 40° c thì đổ môi trường ra đĩa peptri (thường đổ khoảng từ 7-9 đĩa, mỗi đĩa dày khoảng l,5cm) Sau chờ thạch đông lại, dùng dụng cụ đục một

đục đối xứng Tiếp theo nhỏ 0,1 ml dịch enzym/l lỗ Sau khi thạch khô (khoảng 15 phút), thì để các đĩa đó vào tủ lạnh sau 5-6 giờ thì lấy ra để vào tủ ấm ở 30°c (không lật ngược đĩa) để enzym tác dụng với cơ chất CMC Sau 24 giờ sau thì

Sau đó, gạt bỏ hết dịch lugol, đo vòng thuỷ phân màu vàng trên nền đỏ tím

Hoạt tính CMC- aza được hiển thị bằng hiệu số giữa đường kính vòng phân giải (D) và đường kính lỗ khoan (d), (D- d) đơn vị đo là cm

2.2.4.2 Đánh giá hoạt tỉnh phân giải tinh bột

Xác định hoạt tính phân giải tinh bột bàng phương pháp khuyếch tán trên

Phương pháp tiến hành cụ thê như sau:

+ Chuẩn bị môi trường phù hợp cho mỗi chủng vi sinh vật+ Điều chỉnh môi trường về các nồng độ pH ở các mức khác nhau: 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 bằng dung dịch đệm Mc Ilvaine

12

+ Khử trùng môi trường rồi cấy dịch pha loãng vi sinh vật ở nồng độ thích

tien hanh kiem tra mật độ vi sinh vật phát triển trên môi trường

2.2.5.2 Anh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy.

Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng và phát triển của

vi sinh vật băng phương pháp nuôi cấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau

Phương pháp tiến hành cụ thể như sau:

+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp, khử trùng môi trường và phân phối ra các hộp petri

thể thích hợp đã chuẩn bị sẫn trong các ống nghiệm, cấy dịch pha loãng vi sinh vật

ở nồng độ thích hợp Tiến hành nuôi tại các nhiệt độ khác nhau (25°c, 30°c, 35°c, 40°c, 45°c, 50°c, 55°C) Sau đó kiểm tra số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường sau 2-4 ngày

2.2.53 Anh hưởng thời gian nuôi cấy.

Để xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, đề tài tiến hành xác định mật

độ tế bào vi sinh vật ở các thời điểm khác nhau

Phương pháp tiến hành như sau:

+ Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp cho từng chủng vi sinh vật, khử trùng môi trường

+ Cấy dịch pha loãng vi sinh vật vào môi trường dịch thể Nuôi cấy lắc (150 vòng/phút) trong điều kiện nhiệt độ thích hợp cho từng chủng vi sinh vật

+ Tiến hành xác định mật độ tế bào ở các thời điểm khác nhau: 0 giờ, 12giờ,

24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ và 96 giờ

2.2.6 Phương pháp xử lý phế thải trồng trọt bằng v s v

điều chỉnh độ ẩm, pH và kích thước hợp lý cho quá trình ủ

- Thực hiện thí nghiệm theo 2 công thức ủ: Mỗi công thức ủ có khối lượng50kg

13

+ Công thức 2 (TN): Rơm rạ +• 1% sinh khối dịch thể vi sinh vật• •

- Phôi trộn các nguyên liệu, đảo đều và điều chỉnh độ ẩm cho khối ủ sao cho

độ ẩm nguyên liệu đạt 50-60%, sau đó đánh đống

- Trong quá trình ủ tiến hành kiểm tra theo dõi nhiệt độ đống ủ Kiểm tra và điêu chỉnh độ ẩm thường xuyên để độ ẩm khối ủ được ổn định

- Cảm quan: màu sắc, độ mịn của nguyên liệu,

- Độ giảm trọng lượng cơ chất trong đống ủ

2.2.7, Phương pháp xử lý phế thải chăn nuôi bằng vi sinh vật

Phương pháp xử lý phế thải chăn nuôi bằng vi sinh vật (phương pháp ủ phân) được tiến hành theo quy trình xử lý phế thải chăn nuôi [7]

★ Nguyên liệu trước khi đưa và ủ được điều chỉnh độ ẩm, pH và kích thước hợp lý cho quá trình ủ

- Độ ẩm được điều chỉnh bằng cách phơi khô tự nhiên hoặc trộn với các chất độn khác như rơm rạ, cây xanh, thân cây hay than bùn theo tỷ lệ phù hợp

- Điều chỉnh pH bàng cách rắc vôi bột trên đống ủ

★ Đống ủ có khối lượng 50kg với thành phần chính là phân lợn, than bùn được phối trộn với nhau và được bổ sung chế phẩm vi sinh vật, chất dinh dưỡng theo quy trình xử lý phế thải chăn nuôi

★ Trong quá trình ủ tiến hành kiểm tra, theo dõi nhiệt độ đống ủ, sự biến động của quần thể vi sinh vật trong đống ủ

- Kiểm tra và điều chỉnh độ ẩm đống ủ thường xuyên để độ ẩm được ổn định

- Tiến hành quan sát về màu sắc, độ mịn của nguyên liệu, độ giảm trọng; lượng cơ chất của đống ủ

2.2.8 Phương pháp xác định các tính chất ho ả sinh trong đống ủ

1 Xác định độ ẩm [4], [9]

2 Xác định pH theo phương pháp cực chọn lọc hidro (máy đo pH meter)

3 Xác định hàm lượng chất hữu cơ theo phương pháp Walkey-Black [4], [9]

4 Xác định hàm lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldhal [4], [9]

14

6 Xác định hàm lượng K20 dễ tiêu theo phương pháp quang kế ngọn lửa [4], [9]

2.2.9 Phương pháp bố trí thí nghiệm trồng cây

Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, ba lần lặp lại

- Nguyên liệu:

+ Đất thí nghiệm là đất phù sa ven sông Hồng không được bồi đắp hàng

được đánh tơi, nhặt bỏ xác hữu cơ, mầm cỏ Phơi đất ngoài trời nắng từ 1-2 ngày để tiêu diệt mầm cỏ dại và vi sinh vật gây bệnh

+ Cây trồng: Giống cải ngọt Tosakan

- Diện tích ỏ thỉ nghiệm: mỗi ô có diện tích là 2500 cm2 (50cm x50cm) Chiều cao ô: 25 cm Khối lượng đất trong mỗi ô: 20kg

+ Thí nghiệm với 4 công thức:

Công thức 0(ĐC)\ Đối chứng, không bón phân hữu cơ + NPK

Công thức 1(CT1): Bón phế thải chăn nuôi đó qua xử lý (SPĐXL) + NPK

Công thức 2(CT2)\ Bón phân chuồng tươi +NPK

Công thức 3(CT3): Bón phân hữu cơ c ầ u Diễn + NPK

+ Cách thức bón phân: Các loại phân bón được bón lót vào trong đất Trong đó: SPĐXL được bón với khối lượng 0,4kg/ô; phân hữu cơ c ầ u Diễn: 50g/ô; phân chuồng: 0,4kg/ô Riêng ở công thức phân chuồng, phân chuồng được tưới bổ sung sau 5 ngày và 20 ngày cấy

(kg/ha)

+ Các biện pháp kỹ thuật như làm đất, chăm sóc, tưới nước được thực hiện như trong điều kiện sản xuất thông thường theo qui trỡnh chăm sóc cây cải được hướng dẫn bởi Trần Thế Tục, Nguyễn Ngọc Kính và theo Quy phạm về khảo nghiệm hiệu quả các loại phân bón trên cây trồng (10TCN 216-2003) [10]

+ Tỉ lệ nảy mầm: bàng số hạt nảy mầm trên tổng số hạt+ Đo chiều cao cây: từ gốc rễ đến đầu lá cao nhất

15

+ Khối lượng tươi trung bình của mỗi cây (mỗi công thức thí nghiệm nhổ 10 cây để cân).

+ Khối lượng khô trung bình của mỗi cây+ Số lá và diện tích lá

2.2.10 Đánh giá nhanh độ chín và độ an toàn của phẫn ủ

- Phương pháp plant test

Chuẩn bị khay có kích thước 38x28x6 cm và đổ đầy phân ủ Cân lOg hạt cải, rắc đều lên bề mặt khay Sau khi gieo xong, phủ một lớp nilon lên bề mặt khay cho tới khi cây nảy mầm Thường xuyên theo dõi quá trình phát triển của cây và độ ẩm của phân ủ Sau 5 ngày gieo, tiến hành thu hoạch và cân trọng lượng tươi của cây cải ở mỗi khay Mức độ chín của đống ủ được đánh giá qua tỉ lệ nẩy mầm và trọng lượng tươi của cải trên mỗi khay Trọng lượng cải trên mỗi khay từ 60-100g sẽ cho biết đống ủ đó chín Neu trọng lượng của cải thu được nhỏ hơn 60g chứng tỏ phân ủ chưa chín

Sử dụng nhiệt kế có mức đo nhiệt độ từ 0°c đến 100°c, cắm sâu 50cm đến 60cm vào trong đơn vị bao gói có khối lượng khồng nhỏ hơn 10 kg Sau 15 phút, đọc nhiệt độ lần thứ nhất Đo, ghi chép và theo dõi sự thay đổi về nhiệt độ trong thời gian 3 ngày liên tiếp, mỗi ngày đo một lần (đo vào lúc 9 giờ)

Phân hữu cơ vi sinh vật bảo đảm độ hoai mục khi nhiệt độ của đơn vị bao gói phân bón không thay đổi trong suốt thời gian theo dõi

2.2.11 Các phương pháp xác định hàm lượng các chất dinh dưỡng trong cày cải ngọt

1 Xác định hàm lượng N 0 3* theo phương pháp so màu (do Grandvan-Lianz giới thiệu) [4]

2 Xác định hàm lượng vitamin c [4]

3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Kjehldan 1883 [4]

4 Cân khối lượng rau, số lá, chiều cao cây, diện tích lá

16

CHƯƠNG 3 KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

■

3.1 Phân lập và tuyên chọn một số v sv có hoạt tính phân giải hợp chất hydrat cacbon

3.1,1 Phân lập và tuyển chọn một số v s v c ó hoạt tính phân giải xenluloza

Từ các mẫu rơm rạ, đề tài đã tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng mọc trên giấy lọc trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau Kết quả

Bảng 3.1 Ket quả phân ỉập các chủng vi sinh vật

Nhiệt độ phân lập

r

SÔ lượng chủng vi sinh vật

Mầu rơm ra•

15 ngày

Mầu rơm ra•

sau thu hoạch

30 ngày

Mầu rơm ra#

Bảng 3.2 Hoạt tính phân giải xenluloza của các chủng vi sinh vật

STT Kí hiêu •

Mật độ tế bào (CFƯ/ml)

Đường kính vòng

phân gỉảỉ (D-d) cm

Kết quả đánh giá cho thấy: bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch đĩa, đề

cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.2 Phân lập và tuyển chọn một số v s v c ó hoạt tính phân giải tinh bộí

Từ các mẫu rơm rạ, đề tài đã tiến hành phân lập các chủng vi sinh vật phân giải tinh bột trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau Kết quả phân lập được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật

Nhiêt đô phân

Tuyển chọn

Với mục đích tuyển chọn những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột cao, đề tài tiếp tục đánh giá hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật đã phân lập được theo phương pháp khuếch tán trên thạch đĩa Các chủng vi sinh vật tuyển chọn được nhân sinh khối trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28-30°C và được lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút) Hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao được thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Hoạt tính phân giải tinh bột của các chủng vi sinh vật

STT Kí hỉêu •

Mật độ tế bào (CFƯ/ml)

Đường kính vòng

phân giải (D-d) cm

Kết quả đánh giá cho thấy: bằng phương pháp khuy ếch tán trên thạch đĩa đề

cho các nghiên cứu tiếp theo

3.1.3 Một số đặc điểm sinh học của các chủng đã lựa chọn

19

Để đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật tuyển

chọn, đê tài đã tiên hành quan sát quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng khi được nuôi cây trên môi trường thạch và môi trường dịch thể tương ứng

4 ngay nuoi cay khuan lạc co đường kính 1,2-2 mm Khi nuôi cấy lắc cho dịch sinh khoi sanh, đục, nhicu bọt, khi nuoi cây tĩnh thì tạo váng trên bê mặt dịch thể

+ Chủng Ui: khuẩn lạc có màu tráng sáng, không trong suốt, bề mặt nhăn

lạc co đương kính từ 1,5-2,3 mm Khi nuôi cây trên máy lắc trong môi trường dịch the tạo thành các hạt nhỏ, dịch môi trường trong theo thời gian nuôi cấy, khi nuôi cấy tĩnh thì tạo váng trên bề mặt môi trường dịch thể

trường dịch thể cho dịch đục và mùi chua, khi nuôi cấy tĩnh thì tạo váng trên bề mặt môi trường

nuôi cấy khuẩn lạc có đường kính từ 1,3-2,2 mm Khi nuôi cấy lắc trên môi trường dịch thể tạo dịch đục, nhiều bọt khí Khi nuôi cấy tĩnh thì tạo váng trên môi trường dịch thể

3.2 Điều kiện sinh trưởng và phát triển của các chủng vi sinh vật

3.2.1 Anh hưởng của nhiệt độ

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật được thể hiện trong bảng 3.5

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng và phát triển của

40 2,38.10s 5,43.108 3,06.105 2,48.103

và chủng ƯỊ thuộc nhóm vi sinh vật ưa nhiệt

3.2,2 Ảnh hưởng của pH

pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và phát triển của v s v

Kết quả bảng 3.6 cho thấy, các chủng vi sinh vật có khả tồn tại trong dải pH

triển thích hợp trong môi trường pH = 7,0 Trong khi đo chung U] co kha nang sinh trưởng và phát triêĩì tôt trong điêu kiện pH kiêm, trong đieu kicn pH — 8,0 chung UI

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Để đánh giá khả năng phát triển của các chủng vi sinh, đề tài tiến hành kiểm

tra mât đô vi sinh vật ở các thời điểm khác nhau Kết quả được thể hiện trong bảng

21

Bảng 3.7 Anh hưởng của thòi gian nuôi cây

3.3 Khả năng sử dụng các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong xử lý phế phụ phẩm trồng trọt trong nông nghiệp

3.3.1 Biến động về nhiệt độ trong quả trình ủ

Nhờ các hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật mà các hợp chất hữu cơ có cấu

toàn và các chất đơn giản hơn trong điều kiện yếm khí không hoàn toàn, các chất

nhả ra một lượng nhiệt đáng kể làm cho nhiệt độ khối ủ tăng lên, quá trình diễn ra càng mạnh thì nhiệt độ đống ủ càng cao và ngược lại Kết quả theo dõi nhiệt độ

Bảng 3.8 Biến động nhiệt độ trong quá trình ủ

Thòi gian (Ngày)

giải các hợp chất hữu cơ diễn ra mạnh ngay từ những ngày đâu Khi quá trình phan giải các hợp chất hữu cơ kết thúc, nhiệt độ của đống ủ cũng giảm xuông thâp tươngđương nhiệt độ môi trường.

23

3.3,2 Một sô đặc điêm của phê phụ phàm nông ngỉtiêp sau khi ủ

Sau khi nhiệt độ trong đông ủ giảm hẳn đề tài đã tiến hành lấy mẫu và đánhgiá một sô chỉ tiêu vê cảm quan và lý, hoá học của nguyên liệu, kết quả được trình bày trong bảng 3.9, 3.10

Bảng 3.9 Thành phần hoá học của nguyên liệu (%)

Chỉ tiêu 0 giờ Sau 22 ngày (ĐC) Sau 22 ngày (TN)

Màu ngả xang màu xám nâu

Mềm, hơi mủn, ẩm Màu ngả sang màu nâu đen, mùi mùn

Kết quả bảng 3.9 và 3.10 cho thấy, sau 22 ngày dưới tác dụng của vi sinh vật

nghiệm có sử dụng vi sinh vật nguyên liệu rơm rạ đã mủn hẳn Kết quả này chứng

tỏ vi sinh vật có khả năng sử dụng nguyên liệu rơm rạ như một nguồn dinh dưỡngcacbon

3.4 Nghiên cứu khả năng sử dụng phế thải chăn nuôi sau khi đưọc xử

lý nhanh bằng chế phẩm v s v đôi với cây trông

Phế thải chăn nuôi lợn có chứa nguồn dinh dưỡng tương đối cao, là nguồn nguyên liệu lý tưởng cho các quá trình lên men vi sinh vật Sản phẩm sau xử lý thường đem lại hiệu quả dinh dưỡng cao cho cây trồng, giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường Dưới đây sẽ là một số kết quả đánh giá khả năng sử dụng phế thải chăn nuôi sau khi được xử lý bàng chế phẩm vi sinh vật đối với cây trồng

3.4.1 Một số tính chất của pit ế thải chăn nuôi lợn

24

Bảng 3.11 Hàm Iưọmg một số chất dinh dưỡng trong phế thải chăn nuôi lợn

bo sung them mọt sô chât dinh dưỡng (N, p, K) đê tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trong giai đoạn đầu

3,4,2 Sự biên động quần thể vi sinh vật trong quả trình ủ

Bảng 3.12 Biến động về quần thể vi sinh vật có trong quá trình ủ

ưa ấm, tạo đà cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ưa nhiệt Sau 3 ngày, nhiệt độ của đống ủ đạt 60°c, mật độ vi khuẩn tổng số, xạ khuẩn và nấm men đạt

25