Cải biến di truyền chủng xạ khuẩn streptomyces natalensis VTCC a 3245 nhằm tăng khả năng sinh chất kháng sinh natamycin

natalensis cải biến cũng được sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh rifamycin và streptomycin, hai loại kháng sinh được biết đến có khá năng gây đột biến ở các gen liên quan đến quá

PHẢN I THÔiNG TIN CHUNG

tăng khả năng sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài

1 TS Nguyễn Kim Nữ Thảo Viện Vi sinh vật và

1.4 Đo'n vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nehệ Sinh học

1.5 Thòi gian thực hiện:

1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016

1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm

1.5.3 Thực hiện thực tế: từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016

1.6 N h ữ n g th a y đ ổ i so v ó i th u y ế t m in h b an đ ầ u (nếu có):

(Vệ mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ kiên của Cơ quan quản lý)

1.7 Tông kinh phí đưọc phê duyệt của đề tài: 150 triệu đồng

PHÀN II TỎNG QUAN KỂT QUẢ NGHIÊN c ử u

1 Đặi vấn đề

Striptomyces, chi lớn nhất của nhóm xạ khuẩn được biết đến với khả năng tổng họp một lượng

lớn cá; chât trao đôi thứ câp bao gôm các chât kháng vi sinh vật Trong số đó, natamycin, một họp chât thuộc nhóm polyene đã và đang thu hút được nhiều sự quan tâm Natamycin được sản xuất từ

quá tìn h lên men một sô chủng xạ khuân như Streptomyces nơtalensis, Streptomyces chattcnoogensịs và Strepiomyces gilvosporeus [8] Đặc điểm nồi bật của natamycin là chúng có khả năng tháng nâm mạnh, ức chê sinh trưởng của nâm men, nấm mốc và ngăn ngừa sự hình thành aílatoiin từ nâm sợi So với các chât kháng nấm khác thì natamycin có độc tính rất thấp với tế bào động /ật có vú nên chúng được ứng dụng nhiêu trong y học để điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm

trùng ịiảc mạc do Aspergillus và Fusarỉum gây ra [6] Thêm vào đó, natamycin còn được sử dụns rộng ríi trong công nghiệp thực phâm đê kéo dài thòi gian bảo quản của nhiều loại thực phẩm khác nhau ihư pho mát, xúc xích, hoa quả và đô uống Natamycin là một trong số rất ít các chất kháng nâm clrợc khuyên cáo sử dụng trong thực phâm bởi cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA ơ Việt Nam, natamycin năm trong danh mục phụ gia thực phâm được phép sử dụng trong sản Xiất, chế biến và kinh doanh thực phẩm theo thông tư số 27/2012/TT-BYT của Bộ Y Tế

I V natamycin có vai trò phổ biến như vậy nhưng hiện nay ờ Việt Nam toàn bộ lưọng natanvcin được sử dụng đêu phải nhập khẩu Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và

Công nghệ sinh học hiện đang bảo quản chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 có khả năng ánh nataniycin Chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 chính là chùng chuẩn được

Struyk và cộng sự phân lập từ mẫu đất ở Nam Phi [11] và đang được lưu giữ ở bảo tàng giống Nhật Bản với ký hiệu JCM 4693 Tuy nhiên để tạo được chủng sản xuất, các nghiên cứu cải biến di

truyén cần được thực hiện để tăng khả năng sinh natamycin Đối với chủng s natalensis, chưa có

một nghiên cứu nào ở Việt Nam thực hiện cải biến di truyền bằng cách tác động trực tiếp vào cụm gen sinh tông hợp natamycin Trong khi đó, trên thế giới, trình tự cụm gen mã hóa cho quá trình sinh tông họp natamycin đã được công bô; cụm gen này có kích thước khoảng 85 kb bao gôm 13 gen mã hóa cho polyketide synthase, 12 gen mã hóa cho protein biến đổi sau dịch mã, protein vận

chuyến và protein điều hòa, trong đó có p im M [1,2] Gen pim M có kích thước 579 bp, được tìm

thây như một gen mã hóa cho protein điêu hòa dương của quá trình sinh tổng hợp natamycin [1]

Khi xóa bỏ pimM, khả năng sinh natamycin biến mất Vì vậy, tác động vào gen p im M chính là một

chìa khóa quan trọng có khả năng cho phép tạo ra chủng sản xuất sinh natamycin với hiệu suất cao hơn

Trong nghiên cứu này, gen điều hòa dương p im M được tách dòng và chèn thêm một phiên bản vào hệ gen của chủng xạ khuẩn s natalensis, tạo nên chủng cải biến với hai phiên bản của gen điều hòa dương p im M và hiệu suất sinh tổng họp natamycin cao hơn chủng tự nhiên Đồng thời, điều kiện nuôi cấy và tách chiết, tinh sạch natamycin cũng được nghiên cứu Ngoài ra, chủng s natalensis cải biến cũng được sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh rifamycin và streptomycin,

hai loại kháng sinh được biết đến có khá năng gây đột biến ở các gen liên quan đến quá trình phiên

mã và dịch mã ở vi khuẩn nhằm mục đích chọn lọc được các chủng đột biến với hiệu suất sinh natamycin cao hơn chủng ban đầu [1 0].

2 M ục tiêu

Mục tiêu của đề tài là cải biến dược chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis có khả năng sinh

chât kháng nấm natamycin cao hơn chủng tự nhiên 2-4 lần, xây dụng được quy trình nuôi cấy tối ưu

cho chủng Streptomyces natalensis đã được cải biến và quy trình tách chiết, tinh sạch và phân tích

chât kháng nấm natamycin

Ngoài mục tiêu đã được đặt ra trong thuyết minh, chúng tôi còn thử nghiệm nâng cao khả năng

sinh natamycin của chủng xạ khuẩn s natalensis cải biến bàng cách chọn lọc các chủng đột biến

E coli E T 12567 [pUZ8002] là quà tặng của giáo sư Takuya Nihira (Đại học Osaka, Nhật Bản)

Tách chiết DNA tong so từ chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensỉs

Chúng xạ khuân Streptomyces natalensis được nuôi trên môi trường “seed medium” (g/1:

glucose- 20; malt extract- 6; peptone -6; NaCl-0,2 g/L và pH 7.0-7.2), lắc trong 3 ngày ở 30°c Ly tâm thu tế bào từ 3 mỉ dịch nuôi cấy Tế bào được nghiền nát bằng que nghiền tế bào và rửa lại với

1 ml nước khử trùng Thêm 0,2 ml đệm ly giải (100 mM Tris HC1, 100 mM N a2EDTA, 1,5 M NaCl, 1% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), pH 8,0), 50 Ịil lysozyme (30 mg/ml) và 50 jil SDS 20% Vortex trộn đều mẫu rồi ủ ở 6 5°c trong 2 giờ, sau 25 phút lắc mẫu một lần Ly tâm

mâu à 8000 g trong 10 phút, thu dịch trong sang ông eppendorí' mới.Thêm một thê tích C:I

(Chloroíorm: Isoamylalcohol 24:1) bằng thể tích mẫu trong ống Ly tâm 16000 g trong 5 phút Thu dịch nôi, thêm một lưọnơ isopropanol bằng thể tích dịch trong ổng ủ tại nhiệt độ -2 0° c trong 1 giờ, 1} tâm 16000 g trong 5 phút Bỏ dịch nổi, rửa cặn bằng 70% ethanol lạnh Ly tâm 16000 g trong 5 phút Bỏ dịch nổi, cô chân không cặn ở nhiệt độ phòng tới khô Thêm 50 |il nước để hòa DNA, giữ DNA ở -20°c

Phản ừng PCR khuếch đại gen điều hòa dương pim M

Gen điều hòa dương pim M được khuếch đại từ mẫu DNA tổng số bằng phản ứng PCR sử dụng

cặp mồi PMD (5'-TCCTGGATCCGCCCTGTGCCCGCTCACTTCACGAAG-TCG-3’ì PMR (5 -

Taq Colorless Master (Promega, Madision, WI USA), 0,5 |iỉ mồi xuôi PMD; 0,5 (.li mồi ngược PMR; 3,5 Ịil H20 ; 0,5 Ịil DNA Phản ứng khuếch đại gồm 30 chu kì, với 5 phút biến tính ở 95°c,

15 giây bắt cặp mồi ở 62°c, 1 phút 30 giây ở 7 2 °c để kéo dài mạch, bước cuối cùng là 72°c trong

7 phút và giữ lạnh ở 4 °c Sản phẩm PCR được điện di và kiểm tra trên gel agarose 1%

Tạo vector tái to hợp p S E T p im M

Gen p im M và plasmid pSET152 được căt bàng enzvme giới hạn BamHl Sau đó sản phâm căt

được nổi lại bằng ligation mix để tạo vector tái tổ họp pSETpimM Vector pSETpimM được khuếch

đại bằng cách biến nạp vào chủng E coli DH5a và chọn lọc bằng kháng sinh apramycin và sàng lọc

khuẩn lạc xanh/trắng sử dụng IPTG và X-gal Khuẩn lạc trắng lựa chọn để nuôi, tách và kiểm tra

plasmid pSETpimM bằne điện di với plasmid pSET152, giải trình tự gen p im M được chèn trong

plasmid pSET152

Biến nạp vector tái tồ hợp p SE T p im M vào chủng E coli ET12567 và tiếp hợp với chủng s natalensis

Vector pSETpimM được biến nạp vào chủng E coli ET12567 [pUZ8002] bằng phương pháp sốc

nhiệt ớ 4 2 °c trong 1 phút Bằng chọn lọc kháng sinh: apramycin, kanamycin và chloramphenicol;

và chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng, các khuẩn lạc trắng được lựa chọn và kiểm tra sự có mặt của

vector tái tổ hợp bàng cách PCR nhân gen pim M Chủng E coli E T 12567 chứa vector tái tổ họp được sử dụng để tiếp hợp với chùng s natalensis theo phương pháp của Enríquez và cs [5].

Lựa chọn điều kiện nuôi cấy và m ôi trường thích hợp

Để xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh natamycin, chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được nuôi cấy trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường

lỏng, tốc độ lắc 160 v/p, nhiệt độ 3 0°c trong 5 ngày với các điều kiện được khảo sát bao gồm:

- Môi trường nuôi cấy: thí nghiệm được tiến hành với 6 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau gồm MT1 (glucose - 20, cao bò- 8, cao nấm men- 2, asparagin - 0,5, KH2PO4- 0,05 g/L); MT2 (tinh bột- 10 glucose - 10, bột đậu tương- 10, pepton - 5, CaCƠ3~ 3 g/1); MT3 (tinh bột - 50, bột đậu tương - 30, cao nấm men - 8, KH2PO4- 0,05, CaCC>3- 2 g/1); MT4 (glucose - 10, peptone- 5, malt extraci - 3, cao nấm men - 3 g/1, 2 ml/1 MgCl2.6H20 2.5M); MT5 (glucose - 10, cao nấm men - 10 g/1); MT6 (glucose - 50, asparagines - 10, ZnS0 4.7H20 - 0,02; MgSƠ4.7H2 0 - 0,2; FeS0 4.71rỈ2 0 -0,02; C uSỏ4.7H20 - 0,02 g/1); MT7 (cao nấm men - 20, tinh bột - 10 g/1)

- pH của môi trường MT3: được điều chỉnh về các giá trị 5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 9 bằng NaOH và HC1

- Thê tích môi trường trong bình nuôi 250 ml: được thay đôi từ 25 ml đên 100 ml MT3

- Các nguồn cacbon khảo sát gồm: tinh bột, glucose, glycerol, malt extract, galactose, dextrin với nồng cộ 5% được thử nghiệm thông qua việc thay thế tinh bột trong môi trường MT3

- N ing độ tinh bột trons MT3: được thay đổi từ 10 đến 70 g/1

- N3ng độ K2HPO4 trong MT3 được thay đổi từ 0 đến 1 g/1

- Các nguồn nitơ: được khảo sát gồm NaNC>3, N H4C I, (N H4)2SƠ4, urea, cao nâm men, cao bò với

n ồ n g CỘ 8 g/1 đ ư ợ c th ử n g h iệ m th ô n g q u a v iệc th a y th ế cao n ấ m m e n tro n g m ô i trư ờ n g M T 3

- N ìng độ cao nấm men trong MT3 được thay đổi từ 2 đến 12 g/1

Lụa ctọn điều kiện tách chiết thích hợp

Để xác định được điều kiện tách chiết natamycin tối ưu, dịch nuôi cấy chủng xạ khuân

Síreptomyces nataìensis VTCC-A-3245 (M2) đã loại bỏ tế bào được trộn với dung môi Sau đó hỗn

hợp tách chiết được khuấy trộn liên tục bằns máy khuấy từ Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết được khảo sát bao gồm:

- Ảnh hưởng của loại dung môi: các dung môi tách chiết được khảo sát bao gồm butanol, hexan

và eth/1 acetate, tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v), hỗn hợp tách chiết được đảo trộn liên tục v ố tốc độ 500 v/p trong 1 giờ ở 30°c

- Ả ih hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấv : dung môi (v/v): tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi được thay đổi từ 1:0,5; 1:1; 1:2 và 1:3 (v/v) Hỗn họp tách chiết được khuấy trộn liên tục với tốc độ 500 v/p trong giờ ở 30°c

- Ả ih hưởng của thời gian tách chiết: thời gian tách chiết tăng dần từ 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2

giờ với tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v), tốc độ khuấy trộn là 500 v/p ỡ 30°c.

- Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn: tốc độ khuấy trộn được khảo sát bao gồm 300, 500, 600 và

800 v/p Hỗn hợp tách chiết có tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v) và được đảo trộn liên tục băng máy khuấy từ trong 1 giờ ở 30°c

Gây đột biến bằng kháng sinh

Các đột biến kháng rifamycin được thu nhận từ các khuẩn lạc sống sót trong 7 ngày sau khi trải giông cấp 1 trên đĩa thạch GYM chứa riíamycin với các nồng độ khác nhau Sau đó chủng đột biến kháng rifamycin tiềm năng nhất tiếp tục được gây đột biến theo quy trình tương tự với streptomycin

Xác định hoạt tính của natamycin

Hoạt tính của natamycin được xác định định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch [4]

với chủng kiểm định Saccharomyces cerevisiae V TC C -Y -62 Ket quả vòng hoạt tính được xác

địah sau 24 giờ ủ đĩa thạch ở 30 c

Tinh sạch natamycin bằng sắc kỷ lỏng cao áp (HPLC)

Natamvcin được tinh sạch bằng cột sắc ký Eclipse Plus (5 um, 4,6 x 250 mm) (Agilent, Mỹ) Phương pháp HPLC được cài đặt như sau: nồng độ acetonitrile 15% trong 7 phút, tăng đến 50% trong 8 phút, tăng tiếp đến 85% trong 5 phút, giữ ở 85% trong 5 phút và cuối cùng cân bằng lại cột băng 1 5% acetonitrile trong 3 phút; tốc độ dòng 0,5 ml/phút; thu tín hiệu trong dải bước song từ

190 - 600 nm Đỉnh natamycin được so sánh với phổ hấp thụ của chất chuẩn natamycin trong thư viện HPLC tại Đại học Osaka, Nhật Bản Natamycin tinh sạch được gửi đi phân tích khối phố LC-

MS tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN ’

4 T ông kết kết quả nghiên cứu

4.1 Cải biến di truyền, tạo chủng xạ khuẩn s natalensis có khả năng sinh chất kháng nam natamycin cao hơn chủng tự nhiên

Khuếch dại gen điểu hòa dương pim M từ DNA tong so chủng s natalensis

Trong cụm gen sinh tống hợp natamycin, gen p im M được chứng minh là gen điều hòa dương trong con đường tổng hợp natamycin pim M và promoter (~ lkb) được khuếch đại từ DNA tống số

Tạo vector tái tổ hợp pSETpim M

Plasmid pSET152 và pim M được cắt bằng B am ỉỉl và được nối lại bằng ligation mix đế tạo

DH5a nhàm khuếch đại vector pSETpimM Chủng E coli DH5a đã biến nạp được nuôi và tách

plasmi d pSETpimM để kiểm tra sự có mặt của vector tái tồ họp pSETpimM Bằng phương pháp điện di, vector pSETpimM có kích thước lớn hơn kích thước của vector pSET152 đúng như mong đợi (hình 2) Thêm vào đó, vector tái tổ họp pSETpimM được gửi đi giải trình tự để kiêm tra đoạn

chèn pim M Kết quả giái trình tự cho thấy đoạn gen pim M chèn trong vector có trình tự tương đồng 100% với gen pim M AM49372.1 trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tìm kiếm blast Vì vậy, kết quả gi ải trình tự chỉ ra rằng không có đột biến nào xuất hiện trong đoạn gen p im M được chèn ở

3) Như vậy, pSETpimM được biến nạp thành công vào chủng E coli ET12567 [pUZ8002].

Hình 4: Các thể tiếp họp xuất hiện trên đĩa

thạch YS

925 bp

Hình 3: Gel điện di sản phẩm pim M PCR từ

khuẩn lạc E coli E T 12567 được biến nạp

M: XMarker

1: Đối chứng dương (khuôn pSETpimM)

2: p im M PCR từ khuẩn lạc trắng 1

3: p im M PCR từ khuẩn lạc trắng 2

4: Đối chứng âm (khuôn pSET152)

Đe chuyển một bản copy của gen pim M vào bộ gen của chủng s natalensis, chúng E coli

E T 12567 [pUZ8002] chứa vector pSETpimM được tiếp họp với các bào từ của s natalensỉs Bằng

cách sử dụng 107 bào tử s natalensis cho mỗi thí nghiệm tiếp họp sẽ có khoảng 80 khuẩn lạc mọc

trên đĩa thạch MS sau 5 ngày ủ ở 3 0°c (hình 4)

S à n g lọc các chủng s natalensis có chứa gen p im M đã được tích hợp thêm vào hệ gen

60 khuẩn lạc trên dĩa MS agar được cấy vạch lại trên môi trường YS bổ sung thêm kháng sinh apramycin và nalidixic acid Một khuẩn lạc mọc trên đĩa YS có bổ sung kháng sinh được lựa chọn

đê nuôi cấy và tách DNA tổng số đề làm khuôn cho phản ứnơ PCR nhân gen apramycin Chủng này

được đánh số là VTCC-A-3245 (M2) Trên gel agaroase 1%, chỉ có duy nhất một băng 1 kb từ giếng mẫu sử d ụ n ơ khuôn DNA tổng số của chủng cải biến trùng với đối chứng dương sử dụng khuôn pSET152, không có băng nào từ mẫu đối chứng âm sử dụng DNA tổng số của chủng hoang dại xuất hiện (hình 5) Vì vậy, chùng cải biến đã được tiếp họp thành công vector tái tổ hợp và hệ

9 2 5 b p

Hình 5: Gel điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Apramycin từ chủng cải biến

1: Đối chứng âm (khuôn DNA tổng số của chủng s natalensis)

2: Chủng cải biến (khuôn DNA tổng số của chủng S.nataỉensis cải biến)

3: Đối chứng dương (khuôn vector pSET152)

M: X Marker.

Đảnh giá lượng natamycìn của chủng xạ khuẩn cải biến

Để kiểm tra khả năng sinh natamycin của chủng s natalensis đột biến so với chủng dại, dịch

nuôi cấy của hai chủng này được tách chiết với n-butanol và phân tích bằng HPLC Ket quả phân tích diện tích dưới đường cong của peak natamycin của hai mẫu dịch tách từ hai chủng cho thây chủng cải biến có lượng natamycin cao hơn gấp gần 3 lần so với chủng hoang dại (hình 6) Kêt quả cân lượng sinh khối khô của hai chủng cho thấy tốc độ sinh trường của hai chủng là như nhau

Hình 6: Kết quả HPLC của mẫu tách chiết natamycin từ chủng s natalensis hoang dại (A) và chủng

s natalensis cải biến (B) 4.2 Xây dự ng qui trình n u ô i cấy tối ưu cho chủng s nataỉensis đã được cải biến

A n h hưởng của loại m ôi trư ờng dinh dưỡng

Khả năng sinh natamycin của chủng cải biến Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được

khảo sát trên 7 loại môi trường khác nhau (kí hiệu MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7) Kết quả ở hình 7 cho thấy, môi trường tốt nhất cho khả năng sinh natamycin của chủng nghiên cứu là môi trường MT3, tiếp theo là MT2, MT5, MT4, MT1, MT7 Trong môi trường MT6, chủng này sinh trưởng kém và khône; sinh natamycin Như vậy môi trường MT3 (tinh bột - 50 bột đậu tương -

30, cao nấm men - 8, KH 2PO4- 0,05 CaCOi- 2 g/1) được lựa chọn là môi trưÒTig phù họp nhât cho

khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2).

\ V V - *A " 0 n \T>'5 v A t ^Hình 7: Ảnh hường của loại môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh natamycin của chủng

Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán

bàng T test Ợ p < 0,05).

A n h h ư ở n g của thê tích m ôi trường trong bình nuôi v à p H m ôi trường

Với mục đích xác định ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan trong môi trường nuôi cây đến khả năng sinh natamycin của chủng nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành thay đổi thể tích môi trường trong bình nuôi từ 25, 50, 75, 100 ml/bình 250 ml Kết quả chỉ ra trên hình 8 cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin cao nhât khi thê tích môi trường là 50 mỉ Tăng hoặc giảm thê tích môi trườnơ đều làm giảm sự tổng hợp natamycin của chủng này

lên khả năng sinh natamycin của chủng s

natalensỉs cải biên

pH

Hình 9: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh natamycin của chủng s natalensis

cải biến

Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05)

Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) nghiên cứu được xác định trong dải pH từ 5 đến 9 (hình 9) Kết quả chỉ ra trên hình 2 cho thấy, chúng VTCC- A-3245 (M2) có khả năng sinh trường và sinh natamycin tốt trong dải pH rộng (từ pH 5 đến 9), trons đó khoảng tối ưu là từ pH 6 đến 8 Tại khoáng pH tối ưu này, kích thước vòng hoạt tính đạt

23 - 24 mm sau 5 ngày nuôi cấy

A nh hư ởng của nguồn cacboiĩ và nồng độ tinh bột

Anh hưởng của nguôn cacbon lên khả năng sinh natamycin của chủng s natalensis cải biên

dược chỉ ra trên hình 10 Chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tôt trên tât cả các nguôn cacbon được khảo sát trong đó galactose là nguồn cacbon tốt nhất với đường kính vòng hoạt tính đạt 26.5 ram sau 5 ngày nuôi cấy Tiếp theo là nguồn tinh bột, malt extract và dextrin có đường kính vòng hoạt tính đạt 23.5-24 ram sau 5 ngày nuôi cấy Mặc dù, galactose là nguồn cacbon tôi ưu cho

mặt giá thành và mức độ phong phú của nguồn nguyên liệu thi tinh bột được lựa chọn là nguồn cacbon phù họp nhất cho chủng này.

30

10 20 30 40 50 60 70Nong độ tinh bộr (g L)GV)'" t i » v' V ‘ -" (yữ

Hình 10: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả

năng sinh natamycin của chủng Streptomyces

natalensis VTCC-A-3245 (M2)

Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05)

Hình 11: Anh hưởng của nồng độ tinh bột lên khả năng sinh natamycin của chủng

Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2)

Kết quả ảnh hường của nồng độ tinh bột khác nhau lên khả năng sinh natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt nhất ờ nồng độ tinh bột 20 g/1 (hình 11) Ở nồng độ tinh bột 20 g/1, đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 29,5 mm sau 5 ngày nuôi cấy

A n h hư ở ng của nông độ phosphate

Ảnh hưởng của nồng độ phosphate lên khả năng sinh naíamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) được xác định bàng cách thay đổi nồng độ KH2PO4 trong môi trường nuôi cấy từ 0 đến 1,0 g/1 Kêt quả thu được chỉ ra trên hình 12 cho thấy chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt ở tất cả các nồng độ KH2PO4 khảo sát, trong đó đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 23 mm sau 5 ngày nuôi cấy ở nồng độ KH2PO4 0,05 g/1

Hình 12: Ảnh hường của phosphate lên khả năng sinh natamycin của chủng s natalensis VTCC-A-

3245 (M2) Sai khác thống kê giữa các sổ liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05).

A n h hưởng của nguồn nitơ và nong độ cao nấm men

Sự tống hợp natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) được khảo sát trên 7 nguồn nitơ hữu cơ

và vô cơ khác nhau như NaNƠ3- NH4CI, (NH^)2S0 4, urea, cao nấm men, cao bò Chủng VTCC-A-

3245 (M2) sinh natamycin cao nhất trong môi trường chứa nguồn nitơ là cao nấm men với đường kính vòng hoạt tính đạt 24,5 mm sau 5 ngày nuôi cấy Tiếp theo là (NH4)2SC>4 với đường kính vòng

hoạt tính đạt 21mm, NH4CI - 17 mm và NaNƠ3 - 16 mm sau 5 ngày nuôi cấy Trong môi trường chửa nguồn nitơ là cao bò và urea, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh trường tốt nhưng không sinh natamycin (hình 13).

*

N ỏ n g đ ộ c a o n â m m e n ( g / L )

Hình 13: Ánh hưởng của nguồn nitơ lên khả Hình 14: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men

năng sinh natamycin của chủng Streptomyces lên khả năng sinh natamycin của chủng

natalensis VTCC-A-3245 (M2) Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05)

Khả năng sinh natamycin của chủns VTCC-A-3245 (M2) được khảo sát ở các nồng độ cao nấm men thay đổi từ 2 đén 12 g/1 Kết quả trên hình 14 cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt ở tất cả các nồng độ cao nấm men thí nghiệm, trong đó dường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 26 mm sau 5 ngày nuôi cấy khi môi trường có nồng độ cao nấm men 6 g/1 Tuy nhiên, khi so sánh giữa nồng độ cao nấm men 2 g/1 và 6 g/1 thì kích thước vòng hoạt tính đo được khác nhau không nhiều (24 mm và 26 mm, tương ứng) nên khi nuôi cấy ờ quy mô lớn thì có thê xem xét

sử dụng nồng độ cao nấm men 2 g/1 để giảm chi phí.

Để thấy rõ hơn ảnh hưởng của thành phần môi trường lên khả năng sinh natamycin của chủng

Sừeptomycẻs nulalensis VTCC-A-3245 (M2), chúng tôi đã tiên hành so sánh sự tông hựp

natamycin của chủng này trong môi trường tối UXI và môi trường không tối ưu Ket quả trên hình 15 cho thây, đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất trong môi trưòng tối ưu và không tối ưu lần lượt

là 26 mm và 18 ram, tương ứng, sau 5 ngày nuôi cấy Như vậy có thể thấy rằng sau quá trình lựa chọn môi trường nuôi cấy thích họp thì đường kính vòng hoạt tính đã tăng lên khoảng 44% so với môi trường ban đầu

~ M ô i trư ờ n e tố i ưu —®— M ô i trư ờ n g ban đ âu

Hình 15: Khả năng sinh natamycin của chủng Strepíomyces natalem is VTCC-A-3245 (M2) trong

môi trường tối ưu và môi trưÒTìg ban đâu

4.3 Xây dựng quy trình tách chiết, tinh sạch natamycin sinh ra từ chủng s natalensis đã được

A n h hưởng của loại dung m ôi và tỷ lệ dịcli nuôi cấy : dưng môi

Đe xác định loại dung môi tối un cho quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ chủng s naíalensis cải biến, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 3 loại dung môi khác nhau bao gồm: hexan, ethyl acetate và hutanol Ket quả cho thấy, butanol là dung môi tốt nhất để tách chiết natamycin từ chủng này (hình 16)

Hình 16: Ảnh hưởng của loại dung môi lên

quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ

chủng s natalensis cải biến

Ảnh hường của tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi butanol (1:0,5; 1:1; 1:2 và 1:3 (v/v)) lên quá trình

tách chiết natamycin sinh ra từ chùng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được chỉ ra trên

hình 17 Kết quà cho thấy, tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi = 1 :1 (v/v) là tỷ lệ tối ưu nhất để tách chiết r.atamycin Tăng hoặc giảm thể tích butanol đều làm giảm hiệu quả tách chiết natamycin

Anh hưởng của thời gian tách chiết và tốc độ khuấy trộn

Chung tôi tiến hành khảo sát hiệu suất thu nhận natamycin từ dịch nuôi cấy chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) ở các thời gian tách chiết thay đổi từ 0,5 đến 2 giờ Kết quả chỉ ra

trên h nh 18 cho thấy, thời gian tách chiết natamycin tối ưu là 1 giờ Giảm thời gian tách chiêt xuông 0,5 giờ hoặc tăng lên 1,5 hoặc 2 giờ đều làm giảm khoảng 10 - 12% hiệu suất tách chiết natam/cin

Thời gian rách chiẻt (giờ)

H hh 18: Anh hưởng của thời gian tách

chiết lên hiệu suất thu nhận natamycin sinh

ra từ chủng s natalensis cải biến

Tôc độ khuây trộn (v/p)Hình 19: Ảnh hường của tốc độ khuấy trộn lên quá trình tách chiết natamycin sinh ra

từ chủng s nataỉensis cải biên Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0.05)

Am hưởng của tốc độ khuấv trộrt lên quá trình tách chiết natamvcin sinh ra từ chủng

khuấy trộn tối ưu nhất là 600 v/p ở các tốc độ khuấy trộn khác (300, 500 và 800 v/p), hiệu suất tách chiết natamycin giảm đi không đáng kê.

Tinh sạch natam ycin sinh ra từ chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2)

Natamycin trong dịch chiết butanol được tinh sạch bằng phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký Eclipse Plus C18, tốc độ dòng 0,5 ml/phút Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết butanol trước và

[-lình 20: Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết natamycin trước (A) và sau tinh sạch (B)

Kết quả phân tích HPLC cho thấy, natamycin sinh ra từ chủng Streptomyces natalensis VTCC-

A-3245 (M2) có phổ hấp thụ trùng với natamycin chuẩn với 4 đình hấp thụ cực đại ở các bước sóng

279, 290, 304 và 318 nm (hình 21) Tiến hành chạy HPLC nhiều lần và thu lại phân đoạn chứa duy nhất natamycin Phân đoạn natamycin thu nhận dược được làm khô bằng máy cô quay chân không

«ữ

<o-Norm

12001000

Bằng phương pháp phân tích khối phổ, trọng l ư ợ n g phân tử của chất kháng nấm sinh ra từ chủng VTCC-A-3245 (M2) được xác định là 666,3 (hình 22) Kết quả này là tương tự với sô liệu thu được của L i và cs, 2008 và Atta và cs, 2012 [9, 3]

Hình 22: Kết quả phân tích khối phổ của chất kháng nấm sinh ra từ chủng Streptomyces

natalensis VTCC-A-3245 (M2) 4.4 N âng cao khả năng sinh natamycin của chủng xạ khuẩn Streptomyces naíalensis VTCC-A-

3245 (M2) bằng cách chọn lọc các chủng đột biến kháng rifamycin và strepíomycin

Gây đột biến bằng kháng sinh ri/amycin

Bằng cách cấy trải chùng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) trên đĩa thạch GYM

chứa kháng sinh riíầmycin ở nông độ 1 và 2 |ug/ml, chúng tôi đã thu nhận được 35 chủng đột biên (ký hiệu lân lượt từ Rfl đên Rf35) là các khuân lạc sông sót trên đĩa thạch sau 7 ngày Kêt quả thử

hoạt tính kháng Saccharomyces cerevisiae của các chủng đột biến so với chủng ban đầu (ký hiệu -

DC) được trình bày trên hỉnh 23

Hình 23: Khả năng kháng Saccharomyces cerevisiae của chủng ban đầu và các chủng đột

biên kháng riíầmycin (a) các chủng đột biến từ Rfl đến R fl7 so với đối chứng, (b) các chủng đột biến từ Rfl 8 đến RÍ35 so với đối chứng

Có thể thấy rằng, trong số các chủng đột biến thu nhận được thì Rf6, R fl2, Rf20, Rf27, Rf32 và Rf35 là các chủng có kích thước vòng hoạt tính lớn nhất, dao động từ 13-14 mm, cao hơn khoảng 1,7 lần so với chủng ban đầu Một số chùng đột biến khác như RO , RÍÌ3, R f l8, RD4 có khả năng sinh natamycin ở mức trung bình với đường kính vòng hoạt tính tăng từ 1,2 đến 1,5 lân so với chủng ban đầu Đặc biệt, khả năng sinh natamycin bị biến mất ở hai chủng RfìO và RÍ24 Như vậy

với các mức độ khác nhau Trong đó, chủng không tổng họp natamycin chiếm 6%, chủng làm tăng cường sản sinh natamycin chiêm 60% và còn lại 34% là các chủng không có thay đôi vê khả năng sinh natamycin so với chủng ban đầu (hình 24).

0 100 101-130 131-160 161-190Khả năng sinh natamycin của chủng đột biến kháng rifamycin so với chủng ban đầu í0/

Hình 24: Tần suất của các chủng đột biến kháng rifamycin có khả năng sinh natamycin với

các mức độ khác nhau

Gày đột biến bằng kháng sinh streptomycin

Rf35, chủng đột biên kháng ritầmycin tăng cường tông hợp natamycin tôt nhât được sử dụng làm chủng ban đầu để tiếp tục gây đột biến ngẫu nhiên bằng streptomycin Từ các đĩa thạch GYM chứa streplomyein ở các nông độ 1, 5 và 10 ng/mỉ, chúng tỏi đã thu nhận được 32 chủng đột biên, kí hiệu

từ Srl đến Sr32 Trong đó, 3 chủng Sr2, Sr30 và Sr31 là các chủng có khả năng sinh natamycin tôt nhất với đường kính vòng hoạt tính đạt 21 mm, cao hơn 1,3 lân so với chủng Rf35 ban đâu (hình 25) Tần suất của các chủng đột biến làm tăng cường tổng hợp natamycin được xác định là 34% (hình 26)

Hình 25: Khả năng kháne; Saccharomyces cerevisiae của chủng ban đâu và các chủng đột biên

kháng streptomycin (a) các chủng đột biến từ Srl đến S rló, (b) các chủng đột biên từ S rl7 đên

Sr32

40-20 -

0

-< 1 0 0 1 1 5 - 1 3 0

K hà n ăn g sinh nalamy cin c ủ a chùng đột biến

kh án g streptom ycin so với chủng ban đầu (% )Hình 26: Tần suất của các chủng đột biến kháng streptomycin có khả năng sinh natamycin

với các mức độ khác nhau Việc sử dụng các kháng sinh có đích là các gen mã hoá cho các ribosome protein hoặc các protein tham gia vào quá trình phiên mã ở vi khuân như streptomycin, gentamycin, rifampin đê gây đột biên là một phương pháp hiệu quả đê thu được các chủng có khả năng tăng cường tông họp chất trao đổi thứ cấp [10] Nghiên cứu của Hư và Ochi [7, 10] cho thấy, sự tổng hợp actinorhodin tăng 1 ,6 đến 3 lần ở các chủng Streptomyces coelicolor đột hiến kháng một trong ba loại kháng sinh streptomycin, riíampin hoặc gentamycin Sự tổ hợp của hai kháng sinh làm phát sinh các đột biên

có khả năng tông họp actinorhodin tăng thêm 1,7 đên 2,5 lân Tương tự khả năng tông hợp actinorhodin tiếp tục tăng lên 3.5 lần ở các chủng đột biến kháng đồns thời 3 loại kháng sinh Tác giả Wang và cs [13] cũng đã sàng lọc thành công các chủng đột biến có khả năng tăng cường tông hợp actinorhodin Chủng đột biến C7 kháng liên tiếp 7 kháng sinh có khả năng sinh actinorhodin

cao hơn 180 lần so với chủng dại Streptomyces coelicolor 1147 Phương pháp gây đột biến liên tiếp

bằng nhiều kháng sinh cũng được tác giả Tamehiro và cs [12] áp dụng đối với chủng sản xuât công

nghiệp Streptomyces albus SAM-X để tạo ra chủng đột biến có khả năng sinh salinomycin cao hơn 2.3 lần Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự tổng hợp natamycin của chủng Streptomyces natalensis

VTCC-A-3245 (M2) tảng lên cao nhất là 1,7 lần sau khi gây dột biến bằng rifamycin và tăng thêm1.3 lần khi tiếp tục đột biến bàng streptomycin Như vậy chủng đột biến kháng 2 loại kháng sinh có khả năng sinh natamycin cao hơn 2,2 lần so với chủng ban đầu VTCC-A-3245 (M2) Khi so sánh

với chủng dại Síreptomyces natalensis VTCC-A-3245, chủng đột biến cuối cùng có thế tổng hợp

natamycin cao hơn khoảng 6 lần (hình 27 và 28) Kết quả nghiên cứu của chúng tôi là một minh chứng cho tính khả thi của phương pháp gây đột biến liên tiếp bằng nhiều kháng sinh đối với chủng

Slreptomyces natalensis và việc kết họp giữa cải biến chùng bằng kỹ thuật di truyền hiện đại và đột

biến bằng hoá chất làm phát sinh các đột biến có khả năng tổng hợp natamycin lớn hơn

s natalensis hoang dại (A) và chủng s natalensis cải biến (B )

Hình 28: Kết quả thử hoạt tính của chủng dại (1) và chủng Sr30 (2)

5 Đárh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận

Trong nghiên cứu này, gen điều hòa dương p im M trong cụm Ren sinh tống hợp natamycin được khuếch đại từ DNA tổng số chủng xạ khuẩn s natalemis Vector tái tổ hợp pSETpimM được xây dựng và biến nạp thành công vào chủng E coli ET12567 Bằng cách tiếp họp chủng E coli

E T 12567 chứa vector tái tổ hợp pSETpimM với bào tử chủng xạ khuẩn s natalensis, một chủng s natalensỉs cải biến VTCC-A-3245 (M2) có chứa thêm một bản copy gen pim M vào hệ gen được

chọn lọc So sánh khả năng sinh natamycin giữa chủng tự nhiên và chủng cải biến để chọn lọc được

chùng s natalensis có khả năng sinh chất kháng nấm natamycin cao hơn chủng tự nhiên bằng

phưong pháp khuếch tán trên đĩa thạch và phân tích bằng HPLC Qua tính toán diện tích dưới đường cong của đỉnh chất natamycin cho thay chủng cải biến có lượng natamycin cao hơn chủng hoang dại 3 lần

Thảnh phần môi trường nuôi cấy tối ưu cho khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được xác định là tinh bột - 20 bột đậu tương - 30, cao nấm men - 6,

K H2PO4 - 0,05, CaCƠ3 - 2 g /Ị pH môi trường là 6-8 Khi nuôi cấy chủng này trong môi trường tối

ưu ở rhiệt độ 30 c , tốc độ lắc 160 rpm, thể tích môi trường trong bình nuôi là 50 ml/bình tam giác

250 rrl thì kích thước vòng hoạt tính đạt 26 mm sau 5 ngày nuôi cấy cao hơn 44% so với môi trường ban đầu

Ngoài ra, sử dụng phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên liên tiếp bàng hai kháng sinh giúp chọn lọc đu7c các chủng có khả năng tống họp natamycin cao hơn 2 ,2 lẩn so với chủng cải biến di truyền

Streptomyces natalensis VTCC.-A-3245 (M2) và cao hon khoảng 6 lần so với chủng dại Chủng xạ

khuân này hứ a hẹn nhiều tiềm năng ÚT12 dụng n h ư phát triển các chế phấm sinh học kháng nấm gây

bệnh cho cây trồng

6 Tóm tắ t kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)

Natamvcin, a polyene compound with broad-spectrum activity against yeasts and fungi, was íĩrstly

found in Streptomyces natalensis Because o f its low toxicity to mammalian cells, natamycin is

wiđely used in food industry and medicine to prevent fungal growth Although natamycin has been used worldwide, this antiíungal compound has not been produced in Vietnam One o f the reason is we

do not process any industrial-scale production strain In order to develop such production strain, strain improvement must be involved Thereíore, we carried out the study "Genetic engineering of

Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 to improve its production of natamycin” In this study, we introduced a copy of the gene pim M , a positive regulator gene in the natamycin biosynthetic pathway, into s natalensis chromosome, hence boosting the expression o f the structural genes, resulting in the increase o f natamycin production The result showed that the level of natamycin produced by the s natalensis mutant strain increased 3 fold compared to the s natalensis wild type strain Genetically engineered Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) showed the highest level o f natamycin in

250 ml shake ílask containing 50 ml o f medium composed o f 20 g/1 o f starch, 0.05 g/1 o f potassium dihydrogen phosphate, 2 g/1 o f yeast extract, 2 g/1 CaCƠ3 and 30 g/1 soybean meal Natamycin

produced by s natalensis VTCC-A-3245 (M2) was best extracted by butanol and puriíied by

Cadenza C18 column chromatography In addition to the genetically engineered strain, we also obtained rifamycin and streptomycin resistant mutants which can produce 2 2 times more

natamycin than the genetically engineered Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2).

Natamycin, một hợp chất dạng polyene có khả năng kháng nấm sợi và nấm men, được tìm thấy

lần đầu tiên từ loài Streptomyces natalensỉs Bời vì natamycin ít gây hại cho tế bào động vật nên

natamycin được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm và y học Mặc dù natamycin đang được

sử dụng phổ biến trên thế giới, hợp chất này chưa được sản xuất ở Việt Nam Một trong các lý do là bời vì Việt Nam chưa sở hữu chủng sản xuất ở quy mô công nghiệp Đe tạo được một chủng sản xuât như vậy, các bước cải biến di truyền cần được thực hiện Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Cải

biên di truyền chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 nhăm tăng khả năng sinh hoạt chât natamycin” Trong nghiên cứu này, một bản của gen điêu hòa dương pim M của con đường sinh tông hợp natamycin được chèn thêm vào hệ gen của chủng s natalensis nhằm tăng quá trình phiên mã của

các gen cấu trúc, dẫn đến tăng lượng hoạt chất natamycin sản sinh Ket quả cho thấy chủng xạ khuấn

cải biến thu được có lượng natamycin cao hơn 3 lần so với chủng dại Chủng cải biên di truyên s natalensis VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin cao nhất khi nuôi cấy trong bình 250 ml chứa 50 ml

môi trường gồm (g/l): tinh bột - 20, KH2PO4- 0,05, cao nấm men - 2, CaCƠ3 - 2 và bột đậu tương -

30 Natamycin sinh ra từ chủng cải biến được tách chiết tốt nhất bàng dung môi butanol và được

tinh sạch bằng cột sắc ký Cadenza C18 Ngoài chủng xạ khuấn cải biến di truyền Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2), chúng tôi còn thu nhận được các chủng đột biến kháng rifamycin và

streptomycin có thể sinh natamycin cao hơn 2 ,2 lần so vói chúng cải biến di truyên

T ài liệu tham khảo

] Antón TSỊ Santos-Aberturas J, Mendes M, Guerra s, Martin J, Aparicio J (2007) PimM, a PAS

domain positive regulator of pimaricin biosynthesis in Streptomyces natalensis, Microbiology 153,

3174-3183

2 Aparicio JF, Fouces R Mendes MV, Olivera N, M arti'n JF (2000) A complex multienzyme system encoded by fíve polyketide synthase genes is involved in the biosynthesis of the 26- membered polyene macrolide pimaricin in Streptomyces natalensis Chem Biol 7 895-905

3 Atta HM, Selim ShM, Zayed MS (2012) Natamycin antibiotic produced by Streptomyces sp.:

Fermentation, puriĩication and hiological activities J Am Sci 8(2): 469-475

4 Egorov NS (1985) In: Antibiotic, a Scientiiìc Approach (N s EGOROV Editor), English Edition MIR Publisher, Moscow

5 Enriquez LL, Mendes MV, Anton N, Tunca s , Guerra SM, Martin JF, Aparicio JF (2006) An

efíicient gene transíer system íor the pimaricin producer Streptomyces natalensis FEMS Microbiol

Lett 257: 312-318

6 Farid MA El-Enshasv HA, El-Diwany Al, El-Sayed ESA (2000) Optimization o f the cultivation

7 Hu H, Ochi K (2001) Novel approach for improving the pro-ductivity of antibiotic- producingstrains by inducing combinedresistant mutations Appl Environ Microbiol 67: 1885-1892.

8 Li M, Chen s, Li J, Ji z (2014) Propanol ađdition improves natamycin biosynthesis of

Streptomyces natalensis Appl Biochem Biotechnol 172(7): 3424-3432.

9 Lu CG, Liu c w , Qiu JY, Wang HM, Liu T and Liu DW (2008) Identiíìcation of an antifungal metabolite produced by a potential biocontrol Actinomyces strain A01 Braz J Microbiol 39(4): 701-707

10 Ochi K (2007) From microbial diíĩerentiation to ribosome engineering Biosci Biotechnol Biochem 71(6): 1373-1386

11 Struyk AP, Hoette I, Drost G, Waisvisz JM, Van Eek T, Hoogerheide JC (1958) Pimaricin, a new antifungal antibiotic Antibiot Annu 5, 878-885

12 Tamehiro N, Hosaka T, Xu J, Hu H, Otake N and Ochi K (2003) Imiovation approach for

improvement o f an antibiotic overproducing industrial strain o f Streptomyces albus Appl Emviron

Microbiol 69(11): 6421-6417

13 Wang G, Hosaka T, Ochi K (2008) Dramatic activation oíantibiotic production 'mStreptomyces coelicoỉorby cumulativedrua resistance mutations Appl Environ Microbiol 74: 2834-2840.

PHẦN III SẢN PH ẨM , CÔNG BỐ VÀ KÉT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI

3.1 Kết quả nghiên cứu

Có khả năng sinh chất kháns nấm natamycin cao hơn chúng tự nhiên 3 lẩn

2 Chủng Streptomyces

natalensis cải biến chứa đột

biến kháng rifamycin và

streptomycin

Không đãne ký Có khả năng sinh chất kháng

nấm natamycin cao hơn chủng tự nhiên 6 lần

3 Qui trình nuôi cấy tối ưu cho

khả năng sinh natamycin của

chảng Streptomyces

natalensis cải biến.

Xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu như thành phần môi trường, thể tích, thời gian, nhiệt độ để hàm

lượng n atam y cin là cao nhất

Qui trình nuôi cấy tối ưu cho khả năng sinh natamycin của

chủng Streptomyces natalensis cải biến.

4 Qui trình tách chiết, tinh sạch

nataỉensis cải biên.

Qui trình tách chiết, tinh sạch

và phân tích chất kháng nấm natamycin

3.2 Hình thức, cấp độ công bố kết quả

Tình trạng

(Đã in/ chấp nhận in/ đã nộp đơn/ đã được chấp nhận đơn hợp lệ/ đã được cấp giây xác nhận SHTT/ xác nhận sử dụng sản phâm)

Ghi địa chỉ

sự tài trọ' của ĐHQG HN đúng quv định

Đánh giá chung

(Đạt không đạt)

1

i Công trình công bô trên tạp chí khoa học quôc tê theo hệ thông ISI/Scopus

ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI_

i TRUNG TAM ĨHÔNG TIN THƯ VIỆN

17

5 Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành

quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

5.1 Genetic engineering of

Streplomyces natalensis VTCC-A-

3245 to improve its natamycin

production

5.2 Anh hưởng của điêu kiện nuôi cây

và thành phần môi trường lên khả

năng sinh natamycin của chủng xạ

khuẩn cải biến di truyền

Streptomyces natalensis VTCC-A-

3245 (M2)

5.3 Nâng cao khả năng sinh natamycin

của chủng xạ khuẩn Streptomyces

PHẦN IV T Ỏ N G HỢP KÉT QUẢ CÁC SẢN PHẨM K tì& C N VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐÊ TÀI

đăng ký

Sô lượng đã hoàn th àn h

1 Bài báo công bố trên tạp chí khoa học quốc tê theo hệ thông

iSI/Scopus

2 Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký họp đông xuât

bản

3 Đăng ký sở hữu trí tuệ

4 Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus

5 Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN,

tạp chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa

học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế

6 Báo cáo khoa học kiên nghị, tư vân chính sách theo đặt

hàng của đơn vị sử dụng

7 Kêt quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định

chính sách hoặc cơ sở úng dụng KH&CN

8 Đào tao/hô trơ đào tao NCS

PHẦN V T ÌN H HÌNH s ứ DỤNG KINH PHÍ

Kinh phí được duyệt

(triệu đồng)

Kinh phí thực hiện

(triệu đông)

Ghi chú

A Chi p h í trực tiêp

PHẨN V K IÉN N G H Ị (về phát triển các kết quả nghiên cứu của đề tài; về quàn lý, tô chức thực hiện ở các cấp)

PHẦN VI PH Ụ LỤ C (minh chímg các sản phẩm nêu ở Phần III)

X Á C N H Ậ N Q U Y É T T O Á N K IN H PHÍ Đ Ẻ T À I 2014-2016

(T4/2014 đến T3/2016)

Thu thập tư liệu (m ua, thuê)

Dịch tài liệu tham khảo (số trang X đơn giá)

3 Điều tra, khảo sát, thí nghiệm, thu thập sô

liệu, nghiên cứu

Chi phí tàu xe, công tác phí

Chi phí thuê m ướn

4 Chi phí cho đào tạo: Chi phí thuê m ướn NCS,

học v iên cao học

5 Thuê, mua sắm trang thiết bị, nguyên vật liệu 40.000.000 17.000.000

Thuê tran g th iêt bị

M ua tran g thiêt bị

M ua nguyên vật liệu, cây, con

H à Nội, ngàyi'Z tháng í năm 20 ịio

Ke toán trưởng C hủ trì đê tài

í ÍUI

y

knn Wứ' 'êáLv

" ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI VIỆN VI SINH VẬT VÀ CỒNG NGHỆ SINH HỌC

THUYẾT MINH ĐỀ CƯƠNG ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Cải hiến di truyền chủng xạ khuẩn Strepíomyces naialensỉs VTCC-A3245 nhằm tăng khả năng sinh chât

khảng sinh naiamycin để ứng dụng trong

bảo quản thực phẩm

Chủ trì đề tài: TS Nguyễn Kim Nữ Thảo

Hà Nội, 2014

TH U Y ẾT MINH ĐÈ CƯƠNG ĐÊ TÀI NGHIÊN c ứ u

Cải biến di truyền chùng xạ khuẩn Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 nhầm tăng khả năng

sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Tiếng A nh

Genetically engineering Streptomyces natalensỉs VTCC-A-3245 to improve natamycin production

for applications in food preservation

2 - M ã số (được cấp khi Hỗ sơ irúng tuyển)

3 - M ục tiêu và sản ph ẩm d ự kiến của đề tài

3.1 M ục tiêu ( Bám sát và cụ thể hóa định hướng mục tiêu theo đặt hàng - nếu có )

- Tạo được chửng xạ khuẩn Streptomyces natalensis cải biến di truyền có khà năng sinh chất kháng

nâm natam ycin cao hơn chủng tự nhiên VTCC-A-3245

- Xây dựng được qui trình nuôi cấy, tách chiết và tinh sạch natamycin từ chửng s natalensis đã

được cải biến

3.2 S ả n p h ẩm (Ghi tóm_íất±ên các sản phẩm nêu ở mục 12 và III - 21,22,23,24,25,26)

- Chủng s nataỉensis cải biến di truyền có khả năng sinh natamycin cao hon chủng tự nhiên 2-4

lần

- Qui trình nuôi cấy tối ưu, qui trình tách chiết, tinh sạch và phân tích chất kháng nấm natamycin từ

chủng s nataỉensis đã được cải biến.

- Sản phẩm khoa học: 02 bài báo trên tạp chí chuyên ngành trong nước

- Sản phẩm đào tạo: 01 thạc sỹ, 01 cử nhân

4 - T h ò i gian th ự c hiện: 24 tháng

(Từ tháng 4 /2014 đến tháng 3 /2016)

5 - T h ô n g tin về tác giả th u y ết m inh đề cưoug

H ọ và tên: N guyễn Kim N ữ Thảo

Ngày, tháng, năm sinh: 24/12/1983 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sỹ

Chức danh khoa học: Không Chức vụ: Trưởng phòng

Điện thoại: 04-7547407

Tổ chức : Viện Vi sinh vật và Cồng nghệ Sinh học

Nhà riêng: s ố 9/ngõ 162 Chùa Láng, Hà Nội Mobile: 0948806096

Fax: 04-7547407 E-mail: thaonkn@gmail.com

Tên tổ chức đang công tác: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học

Địa chi tổ chức: E2; 144 Xuân Thủy- c ầ u Giấy- Hà Nội

Tóm tắ t h o ạ t động nghiên cửu của tác giả th u y ết m inh đề cương

(Các chưomg trình, đề tài nghiên cứu khoa học đã tham gia, các công trình đã công bổ Hên quan tới phương hướng của đề tài)

T h ò i gian T ên đề tài/công trìn h T ư cách th am gia Câp quản lý / noi công tác2013-2014 Tinh sạch và phân tích các

chât có hoạt tính kháng

Xanothomonas oryzae pv

oryzae từ xạ khuẩn để sử

dụng trong phòng trừ sinh học bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam

Chủ nhiệm Quỹ khoa học quốc tế IFS

Tóm t ă t h o ạt động đào tạo sau đại học của tác giả thuyết m inh đề cương tro n g 5 năm trở lai

T h ờ i gian H ọ, tên NCS/học viên

CH

T ư cách tham gia(HD chính/phụ)

G hi chú(đã bảo vệ/đang thực hiện)

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học

Đ iện thoại: 04-37547407 Fax: 04-37547407

E-mail: imbt@ vnu.edu.vn

Website: http://www.imbt.vnu.edu.vn

Địa chỉ: E2, 144 Xuân Thủy- c ầ u Giấy- Hà Nội

Tên tổ ch-ức chủ quản đề tài: Đại học Quốc gia Hà Nội

(Ghi những người có đóng góp khoa học và thực hiện những nội dung chính thuộc tô chưc chu tri

tổ chức p hố i hợp tham gia thực hiện đề tài, không quá 10 người kê cả chủ nhiệm ãê tai)

H ọ v à tên, học

h à m học vị

Tổ chức công tác

T ư cách tham gia (chủ nhiệm

đề tà i/ủ y viên)

Nội dung công việc th am gia

T h ò i gian làm việc cho đề tài (Số tháng quy đổi2)

1 TS N guyễn Kim

N ữ Thảo

Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học

Chủ nhiệm đề tài

Chủ nhiệm đề tài, thiết kế và tham gia thực hiện các thi nghiệm, viết thuyết minh, báo cáo khoa học cho đề tài

12

2 TS N guyễn Quỳnh

Uyển

Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học

Thành viên Tham gia thiết

kế các thí nghiệm

n

3 CN N guyễn Thị

V ân

Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học

Thành viên Tham gia thực

hiện thi nghiệm tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng s.

4 CN Phạm Thi Thu Viện Vi sinh Thành viên Tham gia thưc

10

tích và kiểm trahoạt tính củanatamycin

II M Ụ C TIÊU, N Ộ I DUNG VÀ S Ả N P H Ẩ M D Ụ K ỈỂ N

0 M ục tiêu

Bám sát và cụ thể hóa định hướng mục tiêu theo đặt hàng - nếu cổ)

Cải biến được chủng xạ khuẩn Strepỉomyces nataỉensis có khả năng sinh chất kháng nẩm

Latamycin cao hơn chủng tự nhiên 2 -4 lần

Xây dựng được qui trình nuôi cấy tối ưu cho chủng Streptomyces natalensis đã được cải biến

Xây dựng được qui trình tách chiêt, tinh sạch và phân tích chất kháng nấm natamycin

1- Nội d u n g N C K H

Vêu rõ nội dung khoa học, công nghệ cần giải quyết, các hoạt động chỉnh để thực.hiện các nội ung tạo ra được sản phâm; ý nghĩa, hiệu quả cùa việc nghiên cứu, phướng án giải quyết, chỉ rõ

ỌI dung mới, tỉnh kê thừa p h át triên, các nội dung cỏ tính rủi ro và giải pháp khẳc phục, ghi rõ

Úc chuyên đê cần thực hiện trong từng nội dung).

ôi d u n g 1: Cải biến di truyền, tạo chủng xạ khuẩn s nataỉensis có khả năng sinh chất kháng nấm

atamycin cao hơn chủng tự nhiên

- Hoạt động 1: Tách dòng gen điều hòa dương pìm M từ hệ gen của chủng xạ khuẩn s

natalensis VTCC-A-3245 đang được bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật vào vector pSET152 có nguồn gốc từ thực khuẩn thể (Ị)C31 và biến nạp vào E coỉi DH5a.

- Hoạt động 2: Biến nạp vector tái tổ hợp pSET152 chứa gen p im M vào chủng E coỉi

E T 12567 và tiêp hợp với chủng s natalensis Sàng lọc các chủng s nataỉensỉs có chứa gen

p im M đã được tích hợp vào hệ gen của chủng s nataỉensis.

- Hoạt động 3: So sánh khả năng sinh natamycin giữa chủng tự nhiên và các chủng cải biến

đè chọn lọc được chủng s nataỉensis có khả năng sinh chất kháng nấm natamycin cao hơn

chủng tự nhiên

ội d u n g 2: Xây dựng qui trình nuôi cấy tối ưu cho chủng s natalensis đã được cải biến.

- Hoat động 1: Chọn lọc môi trường nuôi cấy phù họp nhất với chửng s nataỉensis đã được

cải biến

- H oạt động 2: Xác định thê tích, thòi gian, nhiệt độ nuôi cây phù hợp nhât với chủng s nataỉensìs đã được cải biến.

Nội dung 3: Xây dựng qui trình tách chiết, tinh sạch và phân tích chất kháng nấm natamycin sinh

ra từ chủng s natalensis đã được cải biến.

- H oạt động 1: Tối ưu hóa qui trình tách chiết natamycin từ chủng s natalensis đã đươc

Chừng Sireptomyces natalensis cải biến có khả năng sinh chất kháng nấm natamycin

cao hơn chủng tự nhiên 2-4 lần

- Đ iều kiện nuôi cấy tối ưu cho khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces

natalensis cải biến.

_Qui trình tách chiết, tinh sạch và phân tích chất kháng nấm natamycin

13 - Tông q u a n tìn h hình nghiên cửu trong và ngoài nước và đề x u ấ t nghiên cứu của đề tài

Nâm là nguyên nhân gây rất nhiều bệnh nghiêm trọng trển con người, cây ừồng và vật

1U01 Nam có thê p h á hủy mùa màng hay làm hỏng thức ăũ ừong quá trình bảo quàn, gây tổn thất

ớn vê mặt kinh tê đặc biệt là ở các nước nhiệt đới Các chất được tổng hợp hóa học có khả năng cháng nâm ở m ột mức độ nhất định Tuy nhiên, các chất này có rất nhiều nhược điểm như thiếu

inh đặc hiệu và có thê tích tụ lại ừong môi trường, một số chất còn gây hại cho cả con người Ụ) 2ấc chât nàỵ cũng dẫn đến ô nhiễm môi trường và sự phát triển của cac nấm kháng thuốc Chính vì 'ậy, các chât kháng nâm có nguồn gốc tò vi sinh vật luôn được quan tâm M ột ừong các nhóm vi

linh vật được nghiên cứu để tìm chất kháng nấm nhiều nhất chính là xạ khuẩn (2) Các hoạt chất Lhang nâra từ xạ khuân đã được tìm thây và có nhiêu ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp như

ycloheximide (từ s grìseus), blastcidin-S (từ s griseochromogenes), kasugamycine (tù s

m ugaensis), Rhizovit (từ s rimosns), Mycostop (từ s griseoviridis), Actinovate (từ s lydicus), 'logall (từ Agrobacterìum radiobacter) hay trong công nghiệp thực phẩm như natamycin (từ s '.ataỉensis).

N atam ycin hay còn gọi là Pimaricin là một chất polyene kháng nấm rất quan trọng công

Lghiệp thực phâm Natamycin được tìm ra đầu tiên từ chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis

'hân lập được trong đât ở Nam Phi (5) Natamycin được coi là một loại chất kháng nấm rất manh,

0 khả năng kháng cả nâm m en và nấm sợi cũng như ngăn ngừa sự hình thành aílatoxin, độc tố

inh ra từ nârrt sợi (4) Natamycin không gây hại cho tế bào người và động vật nhiều như các chất

háng nam khác Thêm vào đó, natamycin rất khó hòa tan nên được sử dụng dễ dàng trên bề mặt lực phâm Chính vì vậy, ừên thê giới, natamycin đã được sử dụng rât nhiêu ừong ngành công ghiệp thực phâm với vai trò là chât bảo quản tự nhiên cho pho mát, xức xích, hoa quả vả đồ uống

Natamycm là một trong sô rất ít các chất kháng nấm được khuyến cáo sử dụng trong thưc phẩm bời

cơ quan quản lý thuôc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) Trong nam 2009, cơ quan an toan thực pham

sử dụng natam>'cin để xử lý bề mặt cho các loại pho mát và xúc xích Ở lệt Nam, natamycin năm trong danh mục phụ gia thực phẩm được phép sử dụng trong san xuất chê biên và kinh doanh thực phẩm theo thông tư số 27/2012/TT-BỸT của Bộ Y Te

Tuy natamycin có vai trò phổ biến như vậy nhưng hiện nay ở Việt Nam, toàn bô lương natarnycin được sử dụng đều phải nhập khẩu Bảo tàng giong chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinhvat

va Công nghệ sinh học hiện đang bảo quản chủng Streptomyces natalensis VTCC- Â-3245 co kha năng sinh natamycin Chủng Streptomyces nataỉensis VTCC- A-3245 chinh là chủng chuẩn đươc

Struyk va cộng sự phân lập từ mâu đât ờ Nam Phi (5) và đang được lưu giữ ở bảo tàng giống Nhat Bản với^ký hiệu JCM 4693; Tuy nhiên để tạo được chủng sản xuất, cac nghiên cứu cai bien di truyên cân được thực hiện để tăng khả năng sinh natamycin Cải biến chủng giống sử dụnơ cac ki thuạt di truyên và sinh học phân tử là một hướng đi rất quan trọng ừên thế giới để làm tang khả năng sinh các chât trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học để tạo ra được những chủng sản xuat tot

có thê đưa vào ứng dụng thực tiễn Có rất nhiều phương pháp cải biến di truyền đã được phai triển

VI dụ như cải biên ribosom, tàng số gen điều hòa dương, giảm số gen điều hoa âm, chuyển toàn bo cụm gen m ã hóa vào chủng sản xuất, tăng số lượng phiên bản gen cấu trúc (5) Các nghiên cưu nay

cũng đa thu được nhiêu kết quả khả quan như cải biến ribosome ừên chung s antìbioticus giup ượng Actmomycin tăng 5.25 lân, tác động vào các gen cấu trúc của chủng s claviãỉgenis giúp lượng Cephamycm c tàng 2-4 lân hay tác động vào các gen điều hòa dương ở chủng s peucethis khiên lượng Doxorubicin tăng 4 lần (6-9).

„ A ơ Việt Nam, phương pháp cải biến chủng giống trước đây chỉ tập trung vào phương pháp gây đột biên ngâụ nhiên bằng hóa học íia cực tím, tia gamma Các phương pháp này được đanh gia

a ong hiẹu qua và tôn rât nhiêu công sức Đôi với chủng s natàlensìs, chưa có một nghiên cứu

nao ờ Việt Nam thực hiện cải biển cH truyện bằng cách tác động trực tiếp vào cụm gen sinh tổnơ hơp natamycin Trong khi đó, trên thế giới, trình tự cụm gen mã hóa cho quá trình sinh tổng hợp natamycin đã được công bố, cụm gen này có kích thước khoảng 85 kb bao gồm 13 gen mã hóa cho polyketiđe synthase, 12 gen mã hóa cho protein biến đổi sau dịch mã, protein vận chuyển và

protein điều hòa, trong đỏ có pim M (10,11) (Hình 1).

Hình 1 Cụm gen sinh tổng hợp natamycũi trong đỏ p im M n ằ m ở phía bên trái của cụm gen (11) Gỹ n p im M có kích thước 579 bp, được tìm thấy như một gen m ã hỏa cho protein điều hòa

dương của quá trình sinh tổng hợp natamỵcin ự ỉ, 12) Gen p im M mã hóa cho protein chứa 192 axit

amin với trình tự tương đồng cao với trình tự của các protein điều hòa các cụm gen sinh tong hợp cac polyene khác ở vi khuân như AmphRTV, NysRTV, FscRÍ và PteF- các protein điều hòa phiên

mã của các cụm gen sinh tổng họrp amphotericin, nystatin, candicidin và íllipin (11) Khi xoa bo vimM, khà nàng sinh natamycm biến mất do mức độ phiên mã thấp của 7 gen: pimS2 pimS3 oimS4, pimA, piml, p i m j và pim K (Hình 2).

Time (min)

Hình 2 K hả năng sinh natamycin biến mất khi xóa bỏ gen p im M trên s ncitalensìs (11)

Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ tách dòng gen điều hòa dương pimM , chèn lêm m ột phiên bàn gen pim M vào hệ gen của chủng xạ khuẩn s nataỉensis để tăng cường quá

ìn h sinh tông hơp natamycin, tạo nên chủng cải-biến vói hai phiên bản của gen điều hòa dươnơ

im M v ầ hiệu suất sinh tổng họp natamycin cao hom chủng tự nhiên Đây sẽ là nghiên cứu mở đầu

ho hướng nghiên cứu cải biên di truyền ở Việt Nam để tạo ra các chủng sản xuất có khả năng sinh hât trao đôi thứ câp có hoạt tính sinh học cao có thể được ứng dụng vào thực tiễn

14 - Liệt k ê d an h mục các công trìn h nghiên cứu, tài liệu có liên quan đến đề tà i đã trích dẫnkhi đánh g iá tổng quan

(1) Oskay, M (2009) Antiíungal and antibacterial compounds from Streptomyces strains Aỷrỉcan Journal o f Biotechnoỉogy 8, 3007-3017.

(2) Berdy, J (2005) Bioactive microbial metabolites, Journal o f Antìbiotic Ợokyo) 58, 1-26.

(3) Struyk, A.P., Hoette, I., Drost, G., Waisvisz, J.M., Van Eek, T., Hoogerheide, J.c , (1958)

Pimaricin, a nev/ antifungal antibiotic Antibiot Annu 5, 878-885.

(4) Hay, R (2003) Antiíungal drags used for systemic mycoses, Dermatologic Clinics 21, 577-

587.

(5) Olano, c , Lombó, F., Méndez, c , Salas, J (2008) Improving production o f bioactive

secondary metabolites in actinomycetes by metabolic engineering, Metaboỉic Enợỉneerino 10

(6) Hosoya, Y., Okamoto, s., Muramatsu, H., Ochi, K., (1998) Acquisition of certain streptomycin-

resistant (sừ) mutations enhances antibiotic production in bacteria Antìmicrob Agents Chemother 42, 2041-2047.

[T) MaỊmberg, L.H., Hu, w s , Sherman, D.H., (1993) Precursor flux control through targeted

chi‘omosomal insertion of the lysine epsilon-aminotransíerase (lat) gene in cephamycin c

biosyníhesis J Bacteriol 175, 6916-6924.

'8) MaỊmberg, L.H., Hu, w s ; Shennan, D.H., (1995) Effects o f enhanced lysine

epsilonaminotransferase activiíy on cephamycin biosynthesis in Streptomyces clavuligerus Appl Microbiol Bỉotechnoỉ 44, 198-205.

;9) Parạiụli, N., Viet, H.T., Ishida, K., Tong, H.T., Lee, H.C., Liou, K., Sohng, J.K„ (2005)

Identiíĩcation and characterization of the afsR homologue regulatory gene ữ o m Streptomyces peucetius ATCC 27952 Res Microbiol 156, 707-712.

10) Aparicio, J.F., Fouces, R., Mendes, M.V., Olivera, N., M artin , J.F., (2000) A complex multienzyme system encoded by five polyketide synthase genes is involved in the biosynứiesis

o f the 2ố-membered polyene macrolide pimaricm in Streptomyces natalensis Chem Bioỉ 7

895-905

11) ^ À ntón N., Santos-Aberturas, J., Mendes, M., Gueưa, s., Martm J., Aparicio, J (2007)

PimM, a PAS domain positive regulator of pimaricin biosynứiesis in Streptomyces nataỉensis, Microbioỉogy 153, 3174-3183.

12) Jang, B-Y., Hwang Y-I., Choi, S-U., (2011) Eữects o f p im M and pim R on the increase o f natam ycin producíion in Streptomyces nataỉensis, Journal o f the Korecin Society fo r Ảppỉied Biological Chemỉstry 1, 141-144.

15 - Cách tiêp cận, phư ơ n g pháp nghiên cứu, kỹ th ũ ậ t sử d ụ n g ~

f ! ? f ả c h *ìếp c,ận vấn ủề nghiên cứu‘ th iế tk ế ns hìên cứu’ Phươnê pháp nghiên cứu kỹ thuạt sẽ sư dụng găn với từnệ nội dung chính của đề tài; so sánh với các phương pháp giai quyêt tương tự khác và phân tích để làm rõ được tỉnh mới, tính độc đảo, tỉnh sảng tạo cua đề tài)

>11 - _ , í 9 — U UICMU uaug iu uiuại UI ixuyen ae lam tầngkha năng sản xuât natamycin, một chất kháng nấm được sử dụng rọng rãi trong công nghiẹp thực

a r x v a u A1V 5caa ũ Ỵiaiaiensis tự nỉiièĩi Dế thực hiên cônơ viêc lay, trước tiên, gen p im M sẽ được nhân lên bằng phương pháp PCR từ ADN nhiễm sắc thể cua : ung s natalensis VTCC-A-3245 Sau đó, gen p ìm M sẽ được tái tổ họp vào vector pSETÌ52 co ẽôc từ thực khuẩn thể OC31 và biến nạp vào chủng E coỉi DH5a Vector tai tổ hợp

)ori 1152-pim M sau khi được tinh sạch sẽ được biến nạp vào chủng E coli ET12576 đã chưa /ector pUZ8002 Cuôi cùng vector tái tổ hơp pSET152-pim M sẽ được chuyển vao chung s ĩatalensỉs băne rihươns nhán tiến Virm vrvi rVmnrr V nnii c T n ĩ 7 í : T ' 1,1.: AL ' \

úm M sẽ được chèn vào hệ gen của chủng s nataỉensỉs ở vị tn attB Các chung s nataỉensis chưa lai phiên bản gen p ỉm M sẽ được sàng lọc nhờ vào hoạt tính kháng apramycin mã hóa bởi gen co

rên vector pS E T l 52

va ,aP a e unn sạcn natamycm Cụ thê là dịch nuôi cây sẽ được phân lóp bằngutanol đ ê th u dịch chiêt thô Sau đó, dịch chiết thô sẽ được qua cột silica gel để thu phân đoan cohưa natamycin Phân đoạn này sẽ tiếp tục được tinh sạch bang cột sắc ky C18 để thu natamycm

I

Streptomyces natalensls JCM4633

PCR nhãngen Sán phấm PCR cùa gen pimM

I Tái tó hợp Vector pSET152 chứa gen pimM

I Biến nạp

E.coìi DH5a chứa vector pS£T152

chứa gen pimM

\ Nhằn lên và

ị tách plasmid Vector p.SET152 chửa gsn pimM

ị Biến nạp

E.coli ÊT12576 [pUZ8002] chứa

vector pSETiS2 chứa gen pimM

Ì Tiếp hợp vả sàng lọc

Streptomyces natalensis JCM4S93 chứa

thèm m ột phiên bàn gen pimM

Chủng s nátaiensis cài biến có khả

năng sinh natamycin cao hơn chủng gốc

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

Nuôi cấy lắc trẽn quy

ị mô bính tam giác Dịch nuôi cấy chứa natamycin Tách bằng dung môi hữu cơ (n-bưtanol) Dịch chiết thô

Tinh sạch bằng sắc ký cột

và sắc ký lỏng cao áp Natamycin tính sạch

p im M có khả

năng sinh chất kháng nấm natamycin cao hem chủng tự nhiên 2-4 lần

N ộ i dung 1: Tách

dòng gen điều hòa

dương p im M từ hệ

gen của chủng xạ khuẩn s natalensỉs

VTCC-A-3245 vào vecíor pSET152 có nguồn gốc từ thực khuẩn thể 4>C31 và

biến nạp vào E coỉi

DH5a

Nguyễn Kim Nữ Thảo

6/2014

4/2014 N ộ i dung 2: Biến

nạp vector tái tổ hợp pSET152 chứa gen

p im M vào chủng E

coỉi ET12567 và tiếp hợp với chủng s

natcilensis Sàng lọc các chủng s

nataỉensis có chứa gen pimMẩầ được

tích họp vào hệ gen của chùng s

natalensis.

Nguyễn Kim Nữ Thảo

9/2014

7/2014 N ộ i dung 3: So

sánh khả nàng sinh natamycin giữa chủng tự nhiên và các chủng cải biến để chọn lọc được chủng

s nataỉensis có khả

năng sình chất kháng nấm natamycin cao hơn chủng tự nhiên

Nguyễn Kim Nữ Thảo

10/2014-1/2015

2 T ối vu Điều kiện tối ưu - N ộ i dung 1: Chọn 10 CN.

2/2015-h ó a đêu đê sản lượng lọc môi trường nuôi Nguyên 4/2015

k iện 1UÔĨ kháng nấm cây phù hợp nhât với Thi Vân

cây cho natamycin sinh chủng s natalensis

chủĩiỉ s. từ chủng s. đã được cải biên

nataỉensis

cải biến

natalensis cải

biến là lớn nhất định thể tích, thời - N ộ i dung 2\ Xác

gian, nhiệt độ nuôi cấy phù hợp nhất với

chùng s natalensis

đã được cải biến

Nguyễn Thị Vân

7/2015

và phân tích chất kháng nấm natamycin tò

chủng s

nataỉensỉs đã

được cải biến

- N ộ i dung 1: Tối ưu

hóa qui trĩnh tách chiết natamycin từ

chùng s nataỉensỉs

đã được cải biến

Nguyễn Kim N ữ Thảo, CN

Phạm Thị Thu Hướng

11/2015

8/2015 N ộ i dung 2: Tối ưu

hóa qui trình tinh sạch natamycin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Nguyễn Kim Nữ Thào, CN

Phạm Thị Thu Hướns

12/2015-2/2016

V iết báo

cáo

Báo cáo tổng kết

Tổng kết và báo cáo kết quả

Nguyễn Kim Nữ Thảo

TS

Nguyễn Quỳnh Uyển

3/2016

Ghi những cá nhân cỏ tên tại Mục 10 và nghiên cứu sinh, học viển cao học tham gia

I I I H ÌN H THỬC S Ả N P H Ẩ M KH O A H Ọ C CỦA Đ È TÀI.

20 C âu trú c d ự kiếo báo cáo kết quả của đề tài

- Tổng quan tài liệu

- Phương pháp nghiên cứu

- Kết quà và thảo luận

Chuyên đê 1: Cải biên di truyền, tạo chủng Streptomyces natalensìs chứa hai phiên bản của

gen điêu hòa dương pimM, có khả năng siah natamycin cao hơn chủng tự nhiên

Chuyên đê 2: Qui trình nuôi cấy tối ưu cho chủng s nataỉensis đã được cải biến đề hàm

lượng natamycin sinh ra là cao nhất

Chuyên đê 3: Qui ừình tách chiết, tinh sạch natamycin sinh ra bởi chủng s nataỉensỉs đã

được cải biển

-T à i liệu tham khảo

Zl Bài báo, báo cáo, sách chuyên khảo:

Sô bài báo đăng tạp chí quốc gia: 2

50 bài báo đăng tạp chí quốc tế:

50 báo cáo khoa học, hội nghị khoa học trong nước:

50 báo cáo khoa học, hội nghị khoa học quốc tế:

3ách chuyên khảo và cẩc sản phẩm khác dự kiến công bố:

natalensis cải biến di

truyền có khả năng sinh

Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, NXB Đại học Quốc gia

cải biến

- Xác định được qui trình tách chiết, tinh sạch natamycin

Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, NXB Đại học Quốc gia

Hà Nội

Tác giả

Ỉ2 Phưcrag p h á p ; Tiêu chuẩn; -Quy phạm ; P h ần mềm máy tín h ; B ản vẽ thiết kế; Q uy trình

:ông nghệ; S ơ đo, b ản đồ; số liệu, C ơ sử d ữ liệu; Báo cáo p h ân tích; T ài liệu d ự báo (phương ìháp, quy trĩnh, mô hình, ); Đê án, qui hoạch; Luận chứng kinh tế-kỹ thuật và các sản phẩm khác.

( dự k iế n )

Yêu câu khoa học G hi chú

Chủng s natalensis được cải

biến di truyền có khả năng sinh

natamycin cao hơn chủng tự

natam ycin của chủng s

natcilensis cải biến.

Xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu như thành phần môi trường, thể tích, thời gian, nhiệt độ để hàm lượng natamycin là cao nhất

1 qui trình

Qui trình tách chiết, tinh sạch và

phân tích natamycin

Xác định được phương pháp tách chiết, tinh sạch

natamycin từ chủng s

natalensỉs cải biến.

1 qui trình

3 Sản p h ẩm công nghê

vlâu (model, maket); Sàn phẩm (là hàng hoá, có thể được tiêu thụ trên thị trường); V ật liệu; Thiết

ị, máy móc; Dây chuyền công nghệ và các loại khác;

ph ẩm tạo raTrong nước Thế giới

4 Sản p h âm d ự kiến đăng ký bảo hộ quyền sở h ữ u công nghiệp, giải pháp hữu ích, b ằn g sáng

5 Sản p h ẩ m đào tạo

ITT C ấp đào tạo Số lưọng Nhiệm vụ được giao G hi chú

liên quan đên đê tài (Dự kiến kinh p h í)

Đ.vị: Tr đông

- Tiến sỹ

1 - Thạc sỹ 01 - Cải biến di truyền

- Sàng lọc chủng cải biến

- Xác định qui ừình tinh sạch, tách chiết natamycin

kiện nuôi cấy

- Xác định qui trình tinh sạch, tách chiết natamycin

26 Các sản p h â m khác ( Ghi rõ : Hợp đồng, chỉnh sách )

IV K H Ả N Ẩ N G ỨNG D Ụ NG VÀ TÁC Đ Ộ NG CỦA K Ế T QUẢ N G H IÊ N c ử u

2 7 - Khả năng ứng dụng kết quả nghiên cửu

27.1 Khả năng ứng dụng ừ ong lĩnh vực đào tạo, nghiên cứu khoa học & công nghệ, chỉnh sách

- Nâng cao kiến thức và kỹ năng cho cán bộ sinh viên

- Đào tạo 0 1 thạc sĩ và 01 cử nhân

27.2 K hả năng ứng dụng trong thực tiễn (phát triển kinh tế -XH, sản xuất hàng hóa ).

- Chủng s nataỉensìs cải biến di truyền có khả năng dùng cho sản xuất chế phẩm diệt nấm phuc

vụ trong nền công nghiệp thực phẩm

27.3 Khả năng liên doanh liên kết với các doanh nghiệp trong quá trình nghiên cứu

Ỉ8 - P h ạ m vi và đ ịa chỉ (dự kiến) ứng dụng các kết q u ả của đề tài

19 - Tác đ ộ n g v à lợi ích m ang lại của kết quả nghiên cứu

29.1 Đôi với lĩnh vực KH&CN có liên quan

(Nêu những dự kiến đóng góp vào các lĩnh vực khoa học và công nghệ ở trong nước và quốc tế ĩóng góp mới, m ở ra hướng nghiên cứu mới thông qua các công trĩnh công bo ở trong và ngoai iước).

Tạo được chừng s natalensis có khả năng siah chất kháng nấm natamycin cao hơn chủng tự

nhiên Từ đó có thê ứng dụng sản xuất chất kháng nấm sử dụng trong nền công nghiêp thưc phẩm

- Tạo tiên đề cho các nghiên cứu cải biến chủng giống bằng kĩ thuật di truyền và sinh học phân tử đê tạo chủng vi sinh vật sản xuất có khả năng sản sinh chất có hoạt tính sinh học cào hơn chùng hoang dại

9.2 Đối với kinh tế - x ã hội và bảo vệ môi trường

Veu những tác động dự kiên của kêt quả nghiên cứu đổi với xã hội: đỏng góp cho việc xây dựng

hu trương, chỉnh sách, pháp luật hoặc cổ tác động làm chuyển biển nhận thức của x ã hội sự phát 'lên kinh tê x ã hội và bảo vệ môi trường).

- N atam ycin là chất có khả năng kháng nấm không gây hại cho con người Vì vậy, việc cải

biên di truyền tạo chủng s.' nataỉensis sỉah natamycin với hàm lượng cao sẽ là tiến đề cho

việc phát triên sản xuất chất kháng nấm tại Việt Nam, tiến tói giảm chi phí nhập khẩu

natamycin

9.3 Đổi với tổ chức chủ trì và các cơ sở ứng dụng kết quả nghiền cứu

Dôi với các đơn vị tô chức thuộc ĐHQG chủ ý tới: nâng cao trình độ, năng lực cán bộ khoa học,

in bộ giảng dạy, cán bộ quản lý; tăng cường thiết bị)

- Giúp cán bộ nghiên cứu có cái nhìn mới, tiếp cận với những phương pháp hiện đại ừong cải

en di truyền chủng giống

1.4 Kinh p h í và các nguồn lực khác mà đề tài có thể đem lại.

JThu thập tư liệu (mua, thuê)

Dịch tài liệu tham khảo (số ừang X đơn giá)

3 ±)ieu tra , khảo sát, th í nghiệm, thu th ậ p số liệu,

nghiên cứu

Chi phí tàu xe, công tác phí

Chi phí thuê mướn

4 Chi phí cho đào tạo

(C h ip h í thuê mướn NCS, học viên cao học Phù hợp

với mục 25)

5 Thuê, mua sắm trang thiết bị, nguyên vật liệu 40

17Thuê trang thiết bị

M ua trang thiểt bị

Mua nguyên vật liệu, cây, con

6 Hội thảo khoa học, viết báo cáo tổng kết, nghiệm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ N ộ ĩ

Đ ại học Q uốc gia;

C ăn c ứ H ư ớ n g d ln quán lý hoạt động K hoa h ọ c v à C ông n g h ệ ò Đ ại học

Q uốc g ia H à N ộ i (Đ H Q G H N ) đ u ợ c b an hành theo Q uyết đ ịn h số 1895/Q Đ -K H C N

C ăn cứ Q uyết định số 1122/Q Đ -Đ H Q G H N ngày 07/4/2014 của G iám đôc

Đ H Q G H N về việc phê duyệt darủi m ục đề tài cấp Đ H Q G H N n ăm 2014;

X-ét đề nghị của Trường Ban Khoa học Cong nghe,

QUYỂT ĐỊNH:

Đ iề u 1 P h ê duyệt đề tài nghiên cứu k h o a học cấp Đ H Q G H N n ăm 2014, mã

số Q G 14 62 “C ải biển d i tru yền ch ủ n g x ạ khuẩn S tre p to m y c e s n a ta len sis VTCC-

A 3 2 4 5 nhằm tă n g khả n ă n g sin h chất kh á n g sinh n a ta m y c in đ ể ứng' d ụ n g trong bảo q u ả n th ự c p h ẩ m ” (th u y ết m in h đề cương đề tà i k è m theo) B ô nhiệm TS

N g u y ễn K im N ữ Thảo, V iệ n V i sinh v ậ t v à C ông n g h ệ S in h học, Đ H Q G H N lamchủ nh iệm đề tài

Đ iề u 2 T h ờ i g ian th ự c h iệ n đề tài Q G 14.62 là 2 4 th á n g k ê từ ngày ký

q u y ết đ ịn h T ổ n g kinh p h í th ự c h iệ n đề tài là 150 triệ u đ ồ n g cM ộ t trăm năm m ươi triệu đồng), k in h p h í cap n ăm 2 0 1 4 là 75 triệu đòng, k in h p h í cấp n ă m 2015 là 75

triệ u đ ồ n g lấy từ n g u ồ n k in h p h í khoa học công n g h ệ củ a Đ H Q G H N

Đ iều 3 C hánh V ăn phòng, Trưởng B an K hoa học C ông nghệ, V iện trưởng

V iện V i sinh v ật v à C ông n g k Sinh học v à TS N guyễn K im N ữ T M o có trách nhiệm