Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời omeprazole, pantoprazole, rabeprazole và lansoprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – DAD)

Do đó, xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng một quy trình chung, nhanh chóng, chính xác, đơn giản và tiện lợi để xác định đồng thời 4 hoạt chất trên trong huyết tương n

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN LÊ VÂN HÀ

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

TPHCM – 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

NGUYỄN LÊ VÂN HÀ

Chuyên ngành: Quản lý và cung ứng thuốc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Hướng dẫn khoa học: DS Dương Đình Chung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Chữ ký SV

SV Nguyễn Lê Vân Hà

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến DS Dương Đình Chung, người thầy đã tận tình hướng dẫn cũng như truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp tôi bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và hoàn thành tốt khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị trong bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm cũng như các thầy cô trong khoa Dược – trường Đại học Nguyễn Tất Thành đã tận tình truyền dạy cho tôi những kiến thức quý báu và giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận tại trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ trường Đại học Nguyễn Tất Thành, những người đã trang bị cho tôi rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình học tập để tôi có được thành quả ngày hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs 2

1.1.1 Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton 2

1.1.2 Công thức hóa học và tính chất 3

1.1.3 Cơ chế tác dụng 4

1.1.4 Dược động học 4

1.1.5 Dược lực học 4

1.1.6 Tác dụng không mong muốn 4

1.1.7 Chỉ định 4

1.1.8 Chống chỉ định 5

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC 5

1.2.1 Trên thế giới 5

1.2.2 Trong nước 7

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 8

1.3.1 Cơ sở lý thuyết 8

1.3.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC 8

1.3.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký 9

1.3.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 11

1.3.5 Một số phương pháp tính toán kết quả định lượng bằng HPLC 13

1.4 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 14 1.4.1 Khái niệm 14

1.4.2 Các chỉ tiêu thẩm định 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Hóa chất, dung môi 18

2.1.3 Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu 18

2.1.4 Dụng cụ, máy móc, thiết bị 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.2.1 Các dung dịch thử nghiệm 19

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28

3.1.1 Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện 28

3.1.2 Kết quả khảo sát pha động 29

3.1.3 Lựa chọn nội chuẩn 34

3.2 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU 36

3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐÃ CHỌN 39

3.3.1 Tính tương thích hệ thống 39

3.3.2 Thẩm định tính đặc hiệu 42

3.3.3 Thẩm định độ tuyến tính 45

3.3.4 Giới hạn định lượng dưới 48

3.3.5 Thẩm định độ đúng, độ lặp lại 49

3.3.6 Hiệu suất chiết 54

3.3.7 Độ ổn định 54

3.4 BÀN LUẬN 62

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

4.1 KẾT LUẬN 67

4.2 KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AUC Area Under Curve Diện tích dưới đường cong

CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên

EMA European Medicine Agency Cơ quan quản lý thuốc Châu Âu

FDA Food and Drug Administration Cơ quan quản lý thực phẩm và

thuốc Hoa Kỳ HQC High Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ cao

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LLOQ Lower Limit Of Quantification Giới hạn định lượng dưới

LQC Lower Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

MQC Middle Quality Control Sample Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

PDA/

PPIs Proton Pump Inhibitors Ức chế bơm proton

USP The United States

UV-Vis Ultraviolet - Visible Tử ngoại - khả kiến

DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 20 Hình 3.1 Phổ UV của OPZ, LPZ, PPZ, PPZ 29 Hình 3.2 SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 30 Hình 3.3 SKĐ khảo sát pha động MeOH – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (75 : 25) 30 Hình 3.4 SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (40 : 60) 31 Hình 3.5 SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm phosphat 5 mM, pH 8 (25 : 75) 31 Hình 3.6 SKĐ khảo sát pha động ACN – đệm natri acetat 5 mM, pH 7,6 (25 : 75)

32

Hình 3.7 SKĐ khảo sát pha động ACN – nước 0,3 % TEA, pH 7,2 (55 : 45) 33 Hình 3.8 SKĐ khảo sát pha động MeOH – ACN – nước 0,3 % TEA, 33 Hình 3.9 SKĐ: a chất nội chuẩn domperidone và PPIs; b chất nội chuẩn

metronidazole và PPIs và c chất nội chuẩn indomethacin và PPIs 35

Hình 3.10 SKĐ: a huyết tương trắng; b Mẫu huyết tương xử lý bằng phương

pháp gây tủa protein với MeOH; c Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp gây tủa protein với MeOH thêm dung dịch kiềm hóa KOH, d Mẫu huyết tương xử lý bằng phương pháp chiết phân bố lỏng - lỏng và e Mẫu chuẩn, nội chuẩn pha trong

pha động (hệ pha động số 7) 38

Hình 3.11 SKĐ: a mẫu huyết tương trắng; b mẫu thử giả lập; c mẫu huyết tương

chứa mẫu thử thêm chuẩn; d mẫu pha động 43

Hình 3.12 Phổ hấp thu UV: a IS; b PPZ; c OPZ; d RPZ ; e LPZ; Độ tinh khiết

pic: f IS; g PPZ; h OPZ; i RPZ ; j LPZ 44

Hình 3.13 Đường biểu diễn tương quan giữa tỷ lệ diện tích S/IS và tỷ lệ nồng độ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Công thức hóa học và tính chất của các PPIs 3

Bảng 1.2 Tóm tắt các nghiên cứu định lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong dịch sinh học đã được công bố trên Thế giới 5

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.3 Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu 23

Bảng 3.1 Kết quả phân tích ANOVA các phương pháp xử lý mẫu 39

Bảng 3.2 Bảng kết quả phân tích tính tương thích hệ thống 41

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của PPZ 45

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của OPZ 46

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của RPZ 47

Bảng 3.6 Kết quả thẩm định độ tuyến tính của LPZ 48

Bảng 3.7 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày (3 ngày) 49

Bảng 3.8 Kết quả thẩm định độ chính xác (độ lặp lại) trong ngày và khác ngày 50

Bảng 3.9 Số liệu của Summary Statistics (Độ đúng) 51

Bảng 3.10 Kết quả hiệu suất chiết của PPZ và OPZ 52

Bảng 3.11 Kết quả hiệu suất chiết của RPZ và LPZ 53

Bảng 3.12 Kết quả thẩm định độ ổn định dung dịch chuẩn gốc PPIs và IS 55

Bảng 3.13 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của PPZ trong huyết tương 57

Bảng 3.14 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của OPZ trong huyết tương 58

Bảng 3.15 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của RPZ trong huyết tương 59

Bảng 3.16 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của LPZ trong huyết tương 60

Bảng 3.17 Kết quả phân tích thống kê nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương 61

TÓM TẮT Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2013 – 2018

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI OMEPRAZOLE,

PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE VÀ LANSOPRAZOLE TRONG HUYẾT TƯƠNG

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC – DAD)

Nguyễn Lê Vân Hà Hướng dẫn khoa học: DS Dương Đình Chung

Mở đầu

Nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) bao gồm Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ),

Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ), được dùng để điều trị bệnh trào ngược dạ dày - thực quản,

loét dạ dày tá tràng, Tuy nhiên việc định lượng riêng lẻ từng hoạt chất trong nhóm thuốc này phải qua

nhiều quy trình khác nhau gây phức tạp và tốn kém Do đó, mục tiêu của đề tài là xây dựng và thẩm

định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng phương pháp

HPLC theo hướng dẫn của FDA Đồng thời ứng dụng quy trình này để phát triển vào nghiên cứu dược

động học lâm sàng đối với nhóm thuốc PPIs

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là các thuốc OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương

Phương pháp nghiên cứu: xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và

RPZ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – DAD)

Kết quả

Điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời bốn PPIs trong huyết tương bằng phương pháp

HPLC là: Cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), đầu dò DAD với bước sóng phát hiện

285 nm, pha động là hỗn hợp nước 0,3 % TEA (pH = 7,2 được điều chỉnh bằng acid acetic) – ACN –

MeOH (53 : 15 : 32, tt/tt/tt), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl, nhiệt độ cột là 45ºC

Quy trình đã được thẩm định đạt các chỉ tiêu: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính

xác, giới hạn định lượng dưới, tính tuyến tính, độ ổn định theo hướng dẫn của FDA

Kết luận

Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang Quy trình đã được thẩm định, đáp

ứng đầy đủ yêu cầu của một quy trình định lượng thuốc trong dịch sinh học theo hướng dẫn của FDA

Từ khóa: HPLC, Omeprazole, Pantoprazole, Rapeprazole, Lansoprazole, định lượng, thẩm định

ABSTRACT Final assay for the degree of BS Pharm - Academic year: 2013 -2018

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY METHOD (HPLC – DAD) FOR THE SIMULTANEOUS

DETERMINATION OF OMEPRAZOLE, PANTOPRAZOLE, RABEPRAZOLE AND

LANSOPRAZOLE IN HUMAN PLASMA

Nguyen Le Van Ha Supervisor: B.S Duong Dinh Chung Introduction

Proton pump inhibitors (PPIs), viz Lansoprazole (LPZ), Omeprazole (OPZ), Pantoprazole (PPZ) and Rabeprazole (RPZ), are used for treating gastro-oesophagal reflux disease, duodenal gastric ulcers, However, the quantitation of these compounds is often complex and difficult as each component requires each analytical procedure Therefore, the aim of this study is to develop and validate a simple and rapid reverse-phase HPLC method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma according to the FDA guidelines The developed method is applied to

a pharmacokinetic study for PPIs

Materials and methods

Materials: OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma

Methods: Developing and validating the method for simultaneous quantitation of OPZ, LPZ, PPZ and RPZ in human plasma by high performance liquid chromatography (HPLC - DAD)

Results

The separation of the four components was performed on XDB Zobrax C18 column (150 x 4.6 mm, 5 µm), using the mixture of 0.3% triethylamine (pH 7.2 adjusted with acetic acid) – acetonitrile – methanol (53 : 15 : 32, v/v/v) as a mobile phase An isocratic elution was made at 45ºC, flow rate of 1.0 ml/min with 20 μL injection volume The UV detection was performed at 285 nm

Validation results showed that the method is suitable for the HPLC system and the procedure obtained the specificity, accuracy, precision, lower limit of quantitation, linearity, and stability according to the FDA guidelines

ĐẶT VẤN ĐỀ

Loét dạ dày - tá tràng là bệnh đứng đầu về mức độ phổ biến trong số các bệnh

lý đường tiêu hóa Ước tính khoảng 10 % dân số thế giới mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân biệt giới tính và mỗi năm tăng thêm khoảng 0,2 % dân số mắc bệnh Trước thực trạng đó, nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm kháng acid, kháng histamin H2 hay ức chế bơm proton…được sử dụng trong điều trị Trong đó, nhóm thuốc ức chế bơm proton (PPIs) thường được kê đơn nhiều vì

ưu điểm cho tác dụng nhanh, hiệu quả làm lành vết loét có thể đạt đến 95% sau tám tuần điều trị; thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự bài tiết pepsin, yếu tố nội tại và sự co bóp dạ dày [5]

Omeprazole (OPZ), Lansoprazole (LPZ), Pantoprazole (PPZ) và Rabeprazole (RPZ) là các đại diện quan trọng và được kê đơn phổ biến nhất của nhóm ức chế bơm proton Để có được sự điều chỉnh liều sử dụng hợp lý cho từng đối tượng bệnh nhân thì việc kiểm soát nồng độ các hoạt chất này trong huyết tương là rất cần thiết,

từ đó, làm định hướng giúp bác sĩ thực hiện kê đơn thuốc an toàn và hiệu quả Tuy nhiên, cho đến nay, nước ta vẫn chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định lượng đồng thời các hoạt chất này trong huyết tương Do

đó, xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng một quy trình chung, nhanh chóng, chính xác, đơn giản và tiện lợi để xác định đồng thời 4 hoạt chất trên trong huyết tương nhằm phục vụ công tác điều trị cũng như đánh giá sinh khả dụng

(SKD) và tương đương sinh học (TĐSH), chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Xây

dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời Omeprazole, Lansoprazole, Pantoprazole và Rabeprazole trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC - DAD)” Đề tài được thực hiện với mục tiêu:

1 Nghiên cứu điều kiện sắc ký định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương

2 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu

3 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng và đề ra quy trình phân tích thường quy để định lượng đồng thời OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong huyết tương theo hướng dẫn FDA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÓM PPIs

1.1.1 Lịch sử phát minh nhóm thuốc ức chế bơm proton

Thuốc PPI đầu tiên ra đời vào năm 1989 là OPZ, tiếp theo đó là sự ra đời của các thuốc LPZ, PPZ và RPZ, esomeprazole và mới đây nhất là dexlansoprazole Các thuốc ức chế bơm proton gồm OPZ, esomeprazole, LPZ, PPZ và RPZ Chúng ức chế bài tiết acid dịch vị do ức chế hệ thống enzym H+/K+ – ATPase (“bơm proton”) của tế bào thành dạ dày Các thuốc ức chế bơm proton điều trị có hiệu quả trong loét dạ dày và tá tràng, phối hợp với kháng sinh để tiệt trừ

Helicobacter pylori

Trong bệnh trào ngược dạ dày – thực quản, chỉ dùng thuốc nhóm này khi có triệu chứng nặng (lúc đầu ngắn ngày) và khi có các biến chứng như hẹp, loét, chảy máu đã được xác định bằng nội soi (phải điều trị duy trì đủ liều bằng một thuốc của nhóm này)

Các thuốc ức chế bơm proton cũng được dùng để phòng ngừa và điều trị các trường hợp loét do dùng NSAID ở những người phải tiếp tục dùng NSAID sau khi vết loét đã liền, thông thường không nên giảm liều thuốc ức chế bơm proton vì tình trạng loét không triệu chứng có thể xảy ra Thuốc ức chế bơm proton có hiệu quả trong điều trị hội chứng Zollinger – Ellison (kể cả các trường hợp kháng với các điều trị khác) [6]

imethoxypyridin-2-yl) methylsulfinyl]-1H- benzimidazole

6-(Difluoromethoxy)-2-[[(3,4- methylpyridin-2-yl]methyl- sulfinyl]-1H-benzimidazole

2-[[4-(3-methoxypropoxy)-3-CTCT

Tính

chất

Bột trắng hoặc gần như trắng

Tan trong dicloromethan và

dung dịch kiềm loãng, hơi tan

Bột kết tinh màu trắng hay gần như trắng Khó tan trong nước và ethanol (96%), thực tế không tan trong hexan Rất dễ bị phân hủy trong môi trường acid, thường thấy ở dạng muối natri ngậm 1,5 phân tử nước [4], [11], [14], [21]

Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng trắng Khó tan trong nước và ethanol, thực tế không tan trong hexan Rất dễ bị phân hủy trong môi trường acid, thường thấy ở dạng muối natri [21]

1.1.3 Cơ chế tác dụng

Các thuốc thuộc nhóm ức chế bơm proton là dẫn xuất benzimidazole, chúng

có cùng cơ chế là ức chế bơm H+/ K+ ATPase (còn gọi là bơm proton) Sau khi vào trong cơ thể, ở pH ≤ 5, thuốc được proton hóa thành 2 dạng: acid sulphenic và sulphenamic Hai chất này gắn thuận nghịch với nhóm sulfhydryl của bơm H+/ K+

ATPase ở tế bào thành dạ dày nên ức chế bài tiết acid do bất kỳ nguyên nhân nào [3], [6]

1.1.4 Dược động học

Khi dùng đường uống, các PPIs hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa nhưng thay đổi tùy thuộc theo liều dùng và pH dạ dày Sinh khả dụng theo đường uống có thể đạt đến 70 % nếu dùng lặp lại Các thuốc gắn mạnh vào protein huyết tương (> 95

%) Nhóm thuốc PPIs chuyển hóa chủ yếu qua gan, chất chuyển hóa được đào thải chủ yếu qua nước tiểu (80 %), phần còn lại qua mật vào phân Thời gian bán thải khoảng 30 – 90 phút [3], [6]

1.1.6 Tác dụng không mong muốn

Thuốc có thể gây các rối loạn tiêu hóa như buồn nôn, táo bón hay tiêu chảy, các rối loạn thần kinh trung ương như chóng mặt, nhức đầu, ngủ gà (ít gặp) Ngoài

ra, do thuốc gây ức chế tiết acid sẽ khiến pH dạ dày tăng lên, làm cho một số vi khuẩn phát triển gây ung thư (hiếm) PPIs ức chế cytochrome P450 nên có thể ảnh hưởng đến tác dụng của các thuốc khác khi dùng đồng thời [2], [6]

1.1.8 Chống chỉ định

Quá mẫn với bất kỳ thành phần nào của thuốc [6]

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG OPZ, LPZ, PPZ VÀ RPZ TRONG DỊCH SINH HỌC

Tốc độ dòng (ml/phút)

Thể tích bơm mẫu (µl) H.A Dugger và

Octylamine

C18, 150 mm x 4,6 mm; 5 µm

285 nm với LPZ

và 305nm với OPZ

và RPZ

Zonisamide

Triethylamin (TEA) 0,1 % (pH

= 6,0 được điều chỉnh bằng acid ortho phosphoric) – ACN

và RPZ

Định lượng OPZ

và LPZ thì PPZ được sử dụng làm chất chuẩn nội Định lượng PPZ và RPZ thì LPZ được dùng

Đệm phosphate 10 mM – ACN (53 : 47), đã điều chỉnh

pH đến 7,3 bằng TEA

C18, 150 mm x 4,6 mm; 5 µm

290 nm đối với PPZ và

285 nm với LPZ

làm chất chuẩn nội R.F Hussein và

cộng sự (2016)

[16]

Đệm Na2HPO4 0,05 M –ACN (60 : 40), đã điều chỉnh pH đến 7,0 bằng acid phosphoric

1.3 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.3.1 Cơ sở lý thuyết

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng ở áp suất cao Pha tĩnh có thể là chất rắn được bao trên bề mặt một chất mang rắn, hoặc là chất mang rắn đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, phân tán, trao đổi ion hay tương tác hóa học trên bề mặt [8], [5]

1.3.2 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC

1.3.2.1 Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất (thường là từ 0 - 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định, phù hợp với quá trình sắc ký [8], [5]

1.3.2.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ Dung môi cần được lọc loại các hạt (thường dùng màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm) và đuổi khí hòa tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí) [8], [5]

1.3.2.3 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng hệ thống tiêm mẫu tự động Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (tiêm tay) hay microsyringe tiêm trong hệ thống tiêm mẫu tự động [8], [5]

1.3.2.4 Cột sắc ký

Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở cột xảy

ra quá trình phân tách các chất Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao tới vài trăm bar

Cột có nhiều cỡ khác nhau, tùy theo mức độ và mục đích của quá trình sắc ký Nhìn chung, các cột phân tích thường có chiều dài từ 10 – 25 cm, đường kính 2 – 5

mm [8], [5]

1.3.2.5 Bộ phận phát hiện

Là bộ phận phát hiện chất phân tích Tùy theo bản chất của các chất cần phân tích mà sử dụng đầu dò thích hợp, hiện nay có các loại đầu dò sau: Đầu dò hấp thụ

UV – Vis, đầu dò phổ phát xạ nguyên tử, đầu dò huỳnh quang [8], [5]

1.3.3 Một số thông số cơ bản của quá trình sắc ký

1.3.3.1 Thời gian lưu t R và thể tích lưu V R

Thời gian lưu (tR): Là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới bộ phận phát hiện và cho pic trên sắc ký đồ tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic Xác định thời gian lưu để định tính các chất trên sắc ký đồ, với một chất nhất định tR là một hằng số khi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Trong một phép phân tích còn có thời gian lưu hiệu chỉnh hay thời gian lưu thực (tR’), được tính bằng công thức sau:

𝑡R’ = 𝑡R − 𝑡MVới tM là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha tĩnh

Nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn nếu tR quá lớn thì pic bị giãn, thời gian phân tích kéo dài

Thể tích lưu (VR): Là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới bộ phận phát hiện và cho pic trên sắc ký đồ

VR = tR × Fc Với Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian

Trên thực tế, thể tích lưu là lượng tổng cộng pha động tính từ lúc tiêm mẫu đến khi tín hiệu sắc ký đầu tiên ra khỏi hệ thống [8], [5]

Hệ số phân bố K phụ thuộc vào: Bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh và nhiệt độ cột Trị số K càng lớn thì sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm [8], [5]

𝑡𝑅 − 𝑡0

𝑡0

Hệ số dung lượng k’ phụ thuộc vào bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt

độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho 1 ≤ k’ ≤ 8 [8], [5]

𝑡(R)A − 𝑡M

𝑡(R)B− 𝑡MQuy ước: Chất B là chất bị lưu giữ mạnh hơn chất A nên α > 1 Để tách riêng hai chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [8], [5]

1.3.3.5 Hệ số đối xứng của pic F

𝐹 = 𝑊2𝑎Trong đó: W: Chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic; a: Khoảng cách

từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [8], [5]

1.3.3.6 Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N

Hiệu lực cột được đo bằng thông số: Số đĩa lý thuyết N của cột:

⁄

)

2

Trong đó: W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic; W: Chiều

1.3.3.7 Độ phân giải R s của cột

Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)

Rs = 2 [𝑡(R)A− 𝑡(R)B]

𝑊𝐴+ 𝑊𝐵 hoặc

1,18 [𝑡(R)A− 𝑡(R)B]

𝑊1 2

⁄ 𝐴 + 𝑊1

2

⁄ 𝐵

Trong đó:

t(R)A, t(R)B: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B)

WA, WB: Độ rộng pic đo ở các đáy pic

W1/2: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Yêu cầu: Rs > 1, giá trị tối ưu để định lượng Rs > 1,5 [8], [5]

1.3.4 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

1.3.4.1 Lựa chọn pha tĩnh

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất Tùy vào độ phân cực của pha tĩnh và pha động, sắc ký được chia thành 2 loại:

 Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực, chất phân tích thường là các chất phân cực hoặc là các chất có thể phân cực

 Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh ít phân cực, pha động phân cực, chất phân tích thường là các chất có thể phân cực hoặc ít phân cực

Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền silica (SiO2), nền oxyd nhôm (Al2O3), nền hợp chất cao phân tử (cellulose) hay trên mạch carbon Trong sắc ký hấp phụ pha đảo, pha tĩnh trên nền silica có nhiều ưu việt nên được sử dụng nhiều nhất

Có thể phân loại chất nhồi cột theo gốc siloxan:

 R là các nhóm phân cực (ưa nước): Nhóm –OH hoặc các alkylamin –CH2

-NH2, alkyl nitril –CH2–CN, sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực [29]

 R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm –OH bề mặt silica trung tính bằng các gốc alkyl (-R) của mạch carbon (C2, C8, C18) hay các gốc carbon vòng phenyl Do các nhóm –OH thân nước được thay thế bằng các gốc –R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân cực Silica

đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký tạo cặp ion [8]

Tuy vậy do hiệu ứng lập thể nên những nhóm –OH tự do chưa được thay thế trong cấu trúc của pha tĩnh có thể gây ảnh hưởng xấu đến quá trình sắc ký tùy theo môi trường pH phân tích Trong môi trường acid mạnh, pH < 2 thì có sự phân ly các nhóm ether ra khỏi nền Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không thể tương tác với cột Trong môi trường base (pH > 7), các nhóm –OH trong cột sẽ tương tác với chất tan có tính base Tương tác này khác với kiểu tương tác của chất tan với nhóm –SiC18, dẫn đến hiện tượng cùng một chất nhưng sẽ có những đỉnh ra khác nhau hay hiện tượng kéo đuôi làm cho việc phân tích diện tích hay chiều cao pic có độ chính xác không cao Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các hợp chất như trimethylclorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexametyldisizan (ít sử dụng hơn) để tương tác với nhóm –OH này Ngoài ra, trong một số trường hợp còn ghép lên dây C18 một số nhóm phân cực để tăng thêm độ phân cực của dây C18 làm cột có khả năng tách chọn lọc hơn đối với những hợp chất phân cực mạnh [8], [29]

1.3.4.2 Lựa chọn pha động

Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký và là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất phân tích của một hỗn hợp Trong sắc ký pha đảo, pha động là dung môi phân cực như: Nước, MeOH, ACN,… hoặc hỗn hợp của chúng Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc ký như:

Độ chọn lọc α, thời gian lưu tR, độ phân giải Rs,…nên việc phân tích, lựa chọn pha động thích hợp rất quan trọng Yêu cầu của một pha động [29]:

 Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian

 Hòa tan được chất cần phân tích

 Có độ tinh khiết cao

 Nhanh đạt trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký

 Có tính kinh tế và không gây ô nhiễm môi trường

 Bản chất của dung môi để pha pha động

1.3.5 Một số phương pháp tính toán kết quả định lượng bằng HPLC

Tất cả các phương pháp tính toán kết quả định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích của nó

Có 4 phương pháp tính toán kết quả định lượng thường được sử dụng trong sắc ký: chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêm chuẩn và chuẩn hóa diện tích Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong dịch sinh học Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những quy trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp [8], [5]

Phương pháp chuẩn nội:

 Nguyên tắc: Thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội - IS) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

 Yêu cầu với chất chuẩn nội:

 Trong cùng điều kiện sắc ký, IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

 Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử

 Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử

 Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

 Có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

1.4 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG DỊCH SINH HỌC 1.4.1 Khái niệm

Thẩm định một phương pháp phân tích sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích thực tế, nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát

Phân tích dược chất trong dịch sinh học là cơ sở để đánh giá SKD và TĐSH trực tiếp và chính xác nhất Mẫu sinh học thường có chứa nhiều tạp là các chất nội sinh (các muối vô cơ, lipid, protein và chất chuyển hóa) và sự khác nhau giữa các cá thể, lượng mẫu ít, nồng độ chất phân tích thường rất thấp Do vậy, phương pháp phân tích sinh học phải được thẩm định trước khi áp dụng vào phân tích mẫu để đảm bảo độ tin cậy [9], [13], [17], [26]

 Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách được hoàn toàn khỏi pic tạp và đáp ứng các yêu cầu: Hệ số kéo đuôi (AS) ≤ 2,0; độ phân giải (RS) giữa pic của chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn

 Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng

 Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng

1.4.2.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương nhỏ nhất) Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu dịch sinh học Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích Không nên xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của khoảng tuyến tính Đường chuẩn sẽ không bao giờ có điểm “0” [13], [26]

Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b với

hệ số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số r2 ≥ 0,99 và phải đáp ứng các điều kiện sau [13], [26]:

 Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải đạt từ 85 – 115 %, trừ tại điểm LLOQ được chấp nhận 80 – 120 %

 Có ít nhất 75 % số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó LLOQ và nồng độ cao nhất phải đạt tiêu chuẩn

 Có hệ số tương quan r ≥ 0,99

1.4.2.3 Giới hạn định lượng dưới

Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) là nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được Do đó giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy, độ đúng và độ chính xác của phương pháp LLOQ được chấp nhận với điều kiện đáp ứng của chất phân tích tại nồng độ này so với đáp ứng

của mẫu trắng ít nhất bằng 5 lần (tỷ số S/N ≥ 5), và có thể xác định với độ chính xác trong khoảng ± 20 % và độ đúng từ 80 – 120 % [13], [26]

1.4.2.4 Độ đúng và độ chính xác

Độ đúng và độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra, 1 nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của phương pháp định lượng, 1 nồng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ ở gần điểm giữa Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu độc lập

Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất Độ chính xác có thể được biểu thị bằng hệ số biến thiên (CV) hoặc

độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong ngày và giữa các ngày Nói chung, CV ≤ 15

%, riêng nồng độ gần với LLOQ thì CV ≤ 20 %

Độ đúng của phương pháp phân tích được biểu thị là khả năng tiến tới gần nồng độ thực nhất của chất phân tích trong mẫu sinh học Điều đó có thể được biểu thị bằng khả năng tìm lại tương đối, và phải nằm trong khoảng 85 – 115 %, nhưng

có thể chấp nhận 80 - 120 % đối với điểm gần LLOQ [13], [26]

1.4.2.5 Tỷ lệ thu hồi

Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo quy trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không được xử lý qua chiết tách được pha trong dung môi phù hợp (thường sử dụng dung môi pha động) Tỷ lệ thu hồi là hiệu suất chiết của phương pháp phân tích trong một giới hạn nhất định Để khảo sát

tỷ lệ thu hồi của phương pháp nên tiến hành tại 3 nồng độ thấp, trung bình và cao của đường chuẩn, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần Tỷ lệ thu hồi không nên vượt quá 110 % và không nên quá thấp; giá trị CV < 15 % đối vớ mỗi nồng độ và tỷ lệ thu hồi trung bình tại mỗi nồng độ không khác nhau quá ± 15 % [13], [26]

1.4.2.6 Độ ổn định

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc

xử lý, phân tích và bảo quản mẫu Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời

nên tiến hành tại 2 nồng độ thấp và cao của đường chuẩn, mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 3 lần Do đó, trong thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định

Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm [13], [26]:

a Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông

b Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi

đã xử lý (chiết tách)

c Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian dự định

d Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong hệ thống bơm mẫu tự động)

e Độ ổn định của mẫu thử được đánh giá trên các mẫu tự tạo, bảo quản ở điều kiện lạnh (thường ở -2 °C đến -8 °C)

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các hoạt chất OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong huyết tương

2.1.2 Hóa chất, dung môi

Dung môi: acetonitril, methanol, nước (Merck, Đức) đạt chuẩn cho sắc ký lỏng Hóa chất: kali dihydrophosphat, kali hydroxyd, triethylamin, natri acetat, acid acetic (Merck, Đức) đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

2.1.3 Chất đối chiếu, vật liệu nghiên cứu

Các chất đối chiếu được cung cấp bởi Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Thành Phố

Hồ Chí Minh, huyết tương người cung cấp bởi Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh (số kiểm soát: 1620 16L19) được trình bày ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

Chuẩn

Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM

PPZ Natri QT219 030715 94,21 % RPZ Natri QT226 010813 96,29 %

Chuẩn nội Indomethacin

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Đầu dò dãy diod quang (1260 diod) Agilent, Mỹ

Cột sắc ký XDB Zobrax

Cân phân tích 0,01 mg, max 120 g Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Màng lọc PTFE 0,22 µm; 0,45 µm Sartorius, Đức

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các dung dịch thử nghiệm

2.2.1.1 Dung dịch chuẩn gốc

Dung dịch nội chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 5 mg chất chuẩn nội

Indomethacin (IDM) cho vào bình định mức 10 ml, thêm khoảng 5 ml methanol (MeOH), siêu âm 5 phút Thêm MeOH đến vạch, lắc đều Dung dịch thu được có nồng độ IDM khoảng 500 µg/ml Từ dung dịch này pha loãng đến nồng độ phù hợp khi thực hiện khảo sát

Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn PPIs cho vào

bình định mức 10 ml, thêm khoảng 5 ml MeOH, siêu âm 5 phút Thêm MeOH đến vạch, lắc đều (bình 1) Dung dịch thu được có nồng độ hỗn hợp OPZ, LPZ, PPZ và RPZ khoảng 1000 µg/ml

2.2.1.2 Dung dịch chuẩn làm việc

Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với MeOH để được 2 dung dịch chuẩn làm việc (SW) có nồng độ hỗn hợp các PPIs trong SW1 là 144 g/ml và SW2 là 18

g/ml

2.2.1.3 Mẫu đối chiếu

Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 trong

400 l huyết tương để thu được các mẫu đối chiếu có nồng độ hỗn hợp các PPIs là

2000 ng/ml và IS là 8000 ng/ml sau khi xử lý mẫu

2.2.1.4 Mẫu kiểm tra

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc khác (chuẩn gốc thứ 2), pha loãng đến nồng độ phù hợp Thêm lượng nhất định dung dịch này vào 400 l huyết tương để thu được các mẫu nồng độ thấp (LQC), nồng độ trung bình (MQC) và nồng độ cao (HQC) có nồng độ sau khi xử lý mẫu tương ứng là 1000 ng/ml, 3000 ng/ml và 5000 ng/ml

2.2.1.5 Mẫu thử giả lập

Lấy 400 µl huyết tương trắng cho vào ống ly tâm Thêm 50 µl dung dịch SW hỗn hợp PPIs (hoặc QC), vortex trong 30 giây Thêm 50 µl dung dịch chất nội chuẩn, vortex trong 1 phút thu được mẫu giả lập

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Qui trình nghiên cứu được thực hiện qua các giai đoạn như Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.2.2.1 Xây dựng điều kiện sắc ký

Nghiên cứu xây dựng điều kiện sắc ký được thực hiện trên máy HPLC Agilent

Xây dựng điều kiện sắc ký

Phương pháp xử lý mẫu

Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

Xử lý kết quả và viết báo cáo

các chất nghiên cứu, sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo, đề tài thực hiện khảo sát các điều kiện sắc ký trên cột sắc ký C18 150 x 4,6 mm; 5 µm với cột bảo vệ cùng loại:

Bước sóng phát hiện: Áp dụng bước sóng được khảo sát từ các dung dịch

chuẩn OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH được các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có nồng độ khoảng 5 µg/ml Tiến hành quét phổ hấp thu UV trên máy quang phổ UV 1800 (Shimadzu) của 4 dung dịch, chọn bước sóng phát hiện phù hợp

Pha động: Thăm dò một số pha động, sử dụng hỗn hợp pha động là MeOH,

ACN, phối hợp với dung dịch có pH thay đổi (dung dịch đệm hoặc dung dịch kiềm)

ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân đối của pic đạt yêu cầu

Tốc độ dòng, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu: được khảo sát đồng thời Chọn

điều kiện sắc ký sao cho pic PPIs và IDM tách hoàn toàn nhau và tách khỏi các pic tạp và đạt độ tinh khiết cần thiết cho định lượng và các thông số sắc ký đạt yêu cầu Lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho [26]:

 Hệ số phân giải giữa các chất không nhỏ hơn 1,5

 Số đĩa lý thuyết của các pic không nhỏ hơn 3000

 Hệ số bất đối xứng của các pic từ 0,9 đến 1,5

 Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 20 phút

 RSD % của thời gian lưu của các pic với 6 lần tiêm lặp lại không lớn hơn 2,0

%

 RSD% của tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn/nội chuẩn của 6 lần tiêm lặp lại ở nồng độ định lượng không lớn hơn 2,0 %

2.2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu

Tiến hành khảo sát các phương pháp chiết tách sau đây:

Phương pháp gây tủa protein bằng dung môi hữu cơ: Từ mẫu thử giả lập,

thêm tiếp 50 µl dung dịch KOH 0,25 M và 1,2 ml dung dịch MeOH hoặc ACN, vortex trong 5 phút Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút Lấy dịch nổi, lọc qua màng PTFE 0,22 µm Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký Tiến hành song song với mẫu được chiết không kiềm hóa

Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng: Từ mẫu thử giả lập, thêm tiếp 4,5

ml hỗn hợp dung môi diethyl ether - triethylamin (99 : 1), vortex trong 5 phút Đem

ly tâm 4500 vòng/phút trong 10 phút Lấy 3 ml dịch nổi, bốc hơi ở 40 C bằng máy

ủ nhiệt khô, cắn thu được đem hòa tan vào 1 ml dung dịch pha động, lọc qua màng PTFE 0,45 µm Dịch lọc thu được dùng để tiêm sắc ký

2.2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích đã chọn

Quy trình phân tích được thẩm định theo hướng dẫn của FDA [26] về các chỉ tiêu tính đặc hiệu (chọn lọc), đường chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu suất chiết và độ ổn định mẫu

a Kiểm tra tính tương thích hệ thống

Tiến hành tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện

Yêu cầu: RSD % của: (i) thời gian lưu hoặc thời gian di chuyển ≤ 2 %, (ii) tỷ số diện

tích pic (RS/IS) của chất cần định lượng ≤ 2 % Hệ số T từ 0,8 ≤ T ≤ 1,5 và độ phân giải giữa các pic cần định lượng Rs ≥ 1,5 [26]

b Tính đặc hiệu

Tiến hành sắc ký mẫu pha động, mẫu đối chiếu trong pha động, mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa thử và mẫu huyết tương chứa thử thêm chất đối chiếu được xử lý theo quy trình tối ưu được chọn từ kết quả khảo sát các phương pháp xử lý mẫu Ghi lại các sắc ký đồ và đánh giá độ tinh khiết tín hiệu sắc ký bằng đầu dò dãy diod quang

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau [26]:

 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu pha động không có các tín hiệu tại thời gian lưu của các pic cần định lượng trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu

 Sắc ký đồ của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương ứng với sắc ký đồ hoặc điện di đồ của mẫu đối chiếu

 Độ tinh khiết pic của các pic cần định lượng trong mẫu thử phải đạt theo cách xác định độ tinh khiết pic tính từ phần mềm của hệ thống

 Khi thêm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic (S/IS) của chất cần định lượng Hoặc sự tăng chiều cao pic sau khi thêm chất đối chiếu

c Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính

Đường chuẩn bao gồm 1 mẫu huyết tương trắng và 5 mẫu huyết tương có pha

SW và IS Thực hiện tính toán lượng thể tích cần thiết của dung dịch SW1 và SW2 thêm 400 l huyết tương để thu được các mẫu của đường chuẩn có nồng độ từ 500 – 1000 – 2000 – 4000 – 8000 ng/ml sau khi sử lý mẫu

Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn trong huyết tương được trình bày ở Bảng 2.3

Bảng 2.3 Cách chuẩn bị mẫu đối chiếu

Định lượng 2 lần cho mỗi mẫu, tính giá trị trung bình, dựa vào đường chuẩn tính lại độ đúng tại mỗi điểm nồng độ Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau: Hệ số tương quan tuyến tính r phải lớn hơn 0,995; ít nhất 75 % số điểm của đường chuẩn bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20% [9], [13], [26]

d Giới hạn định lượng dưới

Nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (LLOQ) có thể định lượng được với độ đúng và độ chính xác chấp nhận được Do đó, giá trị LLOQ thể hiện độ nhạy của phương pháp Trong nghiên cứu, giá trị LLOQ được xác định dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng với độ đốc đường tuyến tính

Công thức tính toán như sau:

a

SD

Trong đó: SD là độ lệch chuẩn đường tuyến tính

a là hệ số gốc đường tuyến tính (y = a.x + b) LLOQ được chấp nhận nếu thỏa mãn điều kiện sau:

 Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80 – 120 % so với nồng độ thực

 Độ chính xác RSD ≤ 20 % [9], [13], [26]

e Độ đúng và độ lặp lại

Tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu LQC 1000 ng/ml, MQC 3000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml Xác định hàm lượng OPZ, LPZ, PPZ và RPZ có trong mẫu bằng đường chuẩn phân tích trong cùng điều kiện Với mỗi nồng độ tiến hành lặp lại trên 6 mẫu (độ đúng và độ lặp lại trong ngày) và trong 3 ngày liên tiếp (độ đúng và độ lặp lại giữa các ngày)

 Độ đúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm được và nồng độ thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng từ 85 – 115 %, có thể chấp nhận 80 – 120 % đối với những điểm gần giới hạn định lượng dưới

 Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng RSD %, giá trị này không được vượt quá 15 %, riêng nồng độ gần với giới hạn định lượng dưới thì không được vượt quá 20 % [9], [13], [26]

f Hiệu suất chiết

Hiệu suất chiết hay còn gọi là tỷ lệ thu hồi được thẩm định bằng cách tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC 1000 ng/ml và HQC 5000 ng/ml trong dịch sinh học, mỗi lô mẫu gồm 6 mẫu độc lập Xử lý mẫu theo quy trình nghiên

cứu, phân tích, ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic Song song tiến hành với các lô mẫu

QC trong pha động có nồng độ tương ứng

Xác định tỷ lệ thu hồi của các PPIs và IS bằng cách so sánh kết quả đáp ứng của các PPIs và IS trong các mẫu QC pha huyết tương (có qua chiết tách) với đáp ứng của các PPIs và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách)

Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn các điều kiện sau:

 Hiệu suất chiết các nồng độ khác nhau không được quá ± 15 %

 Giá trị RSD % các đáp ứng của PPIs và IS trong các mẫu huyết tương ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [9], [13], [26]

g Độ ổn định

Độ ổn định của thuốc trong huyết tương/ dịch sinh học nói chung phụ thuộc vào điều kiện bảo quản và định lượng, tính chất hóa học của thuốc, nền mẫu và đồ chứa Trong nghiên cứu, thực hiện khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, độ

ổn định ngắn hạn, độ ổn định dài hạn và độ ổn định sau 3 chu kỳ đông – ra đông

Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc: Phân tích và so sánh nồng độ của dung

dịch chuẩn gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 °C trong 3 ngày với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng Dung dịch chuẩn gốc được coi là ổn định nếu độ lệch giữa nồng độ trung bình của dung dịch sau bảo quản so với nồng độ trung bình của dung dịch mới pha ≤ 2 % Giá trị RSD giữa các kết quả định lượng tại từng thời điểm phải ≤ 2 % [26]

Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian ngắn: Phân tích mẫu huyết

tương ở 2 lô mẫu nồng độ LQC và HQC được pha chế và lưu trữ tại nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, so sánh với nồng độ mẫu được xử lý ngay sau khi chuẩn bị Nồng độ các PPIs trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định ở nhiệt độ phòng phải sai khác với nồng độ mẫu xử lý ngay không quá 15 % và giá trị RSD% giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26]

Độ ổn định của mẫu huyết tương thời gian dài: Bảo quản mẫu huyết

tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ -35 ± 5 C, phân tích mẫu tại thời điểm

ban đầu và sau từng khoảng thời gian bảo quản sau 15 ngày và sau 30 ngày So sánh nồng độ của mẫu huyết tương sau khi bảo quản với nồng độ của mẫu tại thời điểm ban đầu Nồng độ các PPIs trong mẫu sau khi bảo quản một thời gian nhất định phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26]

Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông: Khảo sát độ

ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông thực hiện trên 2 lô mẫu nồng độ LQC và HQC Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -35 ± 5 °C và để rã đông ở nhiệt độ phòng Sau khi tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24 giờ Lặp lại chu kì đông - rã đông 2 lần nữa Sau 3 chu kỳ đông – rã đông, tiến hành xử lý mẫu, phân tích xác định nồng độ các PPIs có trong mẫu So sánh với nồng độ các PPIs có trong các lô mẫu tiến hành phân tích ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu)

Nồng độ các PPIs trong mẫu sau 3 chu kỳ đông – rã đông phải sai khác với nồng độ ban đầu không quá 15 % và giá trị RSD % giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải ≤ 15 % [26]

2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel 16 Một số công thức tính toán sử dụng trong xử lý thống kê kết quả

𝑖=1

𝑛 − 1 tương ứng với hàm STDEV.S trong Microsoft Excel

 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD %):

𝑅𝑆𝐷 (%) = 𝑆𝐷

𝑥̅ × 100

 Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ chất phân tích: y = ax + b Thực hiện phân tích trắc nghiệm Fischer để kiểm chứng độ tương thích của phương trình hồi quy và thực hiện phân tích trắc nghiệm Student để đánh giá các hệ số a, b có ý nghĩa

về mặt thống kê

 Các kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

Dựa vào tính chất hóa lý của các PPIs, qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn kỹ thuật sắc ký pha đảo, đầu dò dãy diod quang để thực hiện khảo sát với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: Cột sắc ký XDB Zobrax C18 (150 x 4,6 mm, 5 µm), Agilent (Mỹ); Cột bảo vệ tương ứng C18(4 x 4,6 mm, 5 µm); Agilent (Mỹ); Thể tích tiêm mẫu 20 µl; Tốc độ dòng 1,0 ml/phút và bước sóng ghi nhận tín hiệu từ

190 – 400 nm Tiến hành thăm dò các hỗn hợp ACN/ MeOH, nước ở các pH và tỷ

lệ khác nhau làm dung môi Chọn điều kiện sắc ký sao cho pic PPIs tách khỏi nhau

và tách khỏi các pic tạp chất Tín hiệu pic sắc ký cân đối, đạt độ tinh khiết và đồng thời có thời gian phù hợp cho một trình phân tích

3.1.1 Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện

Tiến hành quét phổ hấp thu trên máy UV 1800 (Shimadzu) trong khoảng bước sóng từ 190 - 400 nm của các dung dịch OPZ, LPZ, PPZ và RPZ trong MeOH ở nồng độ mỗi chất khoảng 5 µg/ml thu được trên phổ đồ Hình 3.1, OPZ có cực đại ở bước sóng 301 nm, LPZ có cực đại ở 283,5 nm, PPZ có cực đại ở 289 nm và RPZ

có cực đại ở 283,5 nm Bước sóng 285 nm được lựa chọn để ghi nhận tín hiệu với

cả bốn PPIs cho các nghiên cứu tiếp theo

Spectrum_Omeprazol_20180513_110258 - Raw Data