Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm ra nhiều phương pháp tổng hợp doxophyllin phù hợp với điều kiện Việt Nam, nâng cao hiệu suất phản ứng, chủ động nguồn nguyên liệu thuốc trong nước, gi
Trang 1NGHIỆN CỨU QUY TRÌNH TỔNG HỢP DOXOPHYLLIN
LÀM THUỐC ĐIỀU TRỊ HEN SUỲẼN VÀ COPD
Trương Văn Đạt* (Thạc sĩ, Giảng viên Bộ môn Hóa Hữu Cơ, Đ ại học Y Dược Tp HCM),
Đậu Quỳnh Hương (Dược sĩ, Bộ môn Hóa Dược, Đại học YDược Tp HCM) Hướng dẫn: PGS TS Trần Thành Đạo (Phó Trưởng Bọ môn Hóa Dược, Trương Ban Quản /ý đảo tạo,
Khoa Dược - Đ ạĩh ọ c Y Dược Tp, HCM)
TÓM TẮT
Đặt vấn đề và mục tiêu nghiên cứu: Doxophyllin là 7-(1,3-ơioxoỉan-2-yímethyi) theophyllin thuộc nhóm dẫn chất xanthin được sư dụng làm thuốc giãn phe quản trong điều trị hen suyễn và COPD Doxophyllin có tốc dụng
tốt và ít tảc dụng phụ so với theophyllin Nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm ra nhiều phương pháp tổng hợp
doxophyllin phù hợp với điều kiện Việt Nam, nâng cao hiệu suất phản ứng, chủ động nguồn nguyên liệu thuốc trong nước, giảm giá thành sản phẫrri.
Đ ối tượng, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu: - Nguyên liệu: theophyllin, doxofyllin chuẩn (USP) và các
hóa chất khac.
- Phương pháp: Doxophyllin được tồng hợp bằng 03 quy trình khác nhau, m ỗi quy trình sẽ được tổi ưu hóa để
tìm ra cấc thong sổ phản ưng cho hiệu suẩt cao nhất Phương pháp 1 gồm 3 giai đoạn khởi đẩu từ theophyllin qua trung gian dyphỳllin, kế đến 7-acetaldehyd theophyllin và sau cùng doxophyllin Phương pháp 2 chỉ duy nhất
1 giai đoạn, theóphỵllin phản ứng với 2-bromomethyl-1,3-dioxolan tạo thành sấn phẩm mong muốn doxophyllin Phương pháp 3 gốm 3 ]bước đ ĩ từ theophyllin qua trúng gian 7-(2,2-diethoxyeihyl) theophyllin tiếp theo là 7- acetaldehyd theophyllin và sau cùng doxophylìin Doxophylìín được kiềm nghiệm bang TCCS và đành già độ ổn định ỉrong điều kiện khắc nghiệt, lão hóa cấp tốc và nghiên cứu độ ổn định dài hạn ở điều kiện bảo q u ả rĩ
Kết quả : Dọxophyllin được tổng họp từ m ỗi quy trình được xác định cẩu trúc và độ tinh khiết bằng các
phương pháp: SKLM, đo điểm chảy, DSC, IR, MS, NMR so sánh với doxophyllin chuẩn (USP) Sau khi tối ưu
‘hóa, hiệu suất toàn phần tương ứng cho tưng quy trình là: 62%; 90,44% và 81,85% Sản phẩm doxophyllin kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn cơ sở Doxophyllin đạt độ on định trong thời gian nghiên cứu.
Két luận: Đã tổng hợp thành công doxophyllin theo 03 quy trình với hiệu suất cao, đạt độ ồn định Các qui trình này có thể được nghiên cứu nâng cap cỡ lô lớn hơn để phát triển thành qui trinh công nghệ sản xuất cịoxophyllin tại Việt Nam.
Từ kh óa : Doxophyllin.
SUMMARY
SYN TH ESIS OF DO XO FYLLINE AS A NOVEL XANTHINE BRONCHODILATOR
Van-Dat Truong*, Quynh-Huong Dau, Thanh-DaoTran
Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City, VietNam
Background : Doxofylline (7-(1,3-dioxolan-2-ylmethyl) theophylline), a new m ethylxanthine derivative is wildly
used in the treatment o f asthma and COPD It show to have similar efficacy with significantly less side effects in adults This study is aimed to find more approach to produce doxofylline in Vietnam with high yield so that to contribute to reduce the cost price.
Materials and method: - Materials: theophylline, doxofyiline RS (USP) and other chemicals.
- Method: doxofylline are synthesized by 3 different procedures M ethod 1 consists o f 3 steps from
theophylline via intermediate dyphylline and 7-acetaldehyd theophylline to obtain the final product Method 2 has unique step, in which 2-bromomethyl-1,3-dioxolane is substituted on xanthine ring at position o f 7 to obtain the final product The last one includes 3 steps as the method 1 but via intermediate 7-(2,2-diethoxyethyl)theophylline instead o f dyphylline.
Results: Structure and purity o f doxofylline was identified by melting point, DSC and spectroscopic methods (IR, MS NMR) The total yield o f each corresponding procedure is: 62%, 90.44% and 81.85% The quality o f final product meet the specifications o f doxofylline issued in the home specifications.
Conclusion: Doxofylline was synthesized from 3 procedures with the yields rankings from respectively These
could be further studied in more big scale to develop a suitable procedure for producing doxofylline in Viet Nam.
K eywords: Doxofylline
ĐẶT VẮN Đ Ế V À MỤC TIÊU NGHIÊN c ứ u bẳí đầu có mặt trong nước ta trong vài năm gần đậy
[3,4,6,8,16] Với mục tiêu tìm ra nhiêu phương pháp Doxophyllin có tên khoa học là 7-(1,3-dioxolan-2-
ylmeỉhyl) theophỵilín thuộc nhộm đẫn chất xanthin sử
dụng đế giãn phế quản đièu tri hen suyên và bệnh tăc
nghen phối man tính (COPD) Doxophyllin ià dằn chấí liệu thuốc trong nước, giảm giá thành sản phầm, thế hệ mới có nhiều ưu điểm như ít tác động phụ so nghiên cửu này được thực hiện nhằm mục tiêu íối ưu với theophyilin, được sử dụng phổ biến ở châu Âu và hoa 03 quy trinh tổng hợp Doxophyilin từ theophyilin,
Trang 2xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đánh giá độ ổn 2.1 Xây dựng và tối ưu hóa quy trình tổng hợp:
định của doxophỵilin _ doxophyllin đữợc tổng hợp bằng 03 quy trinh khac
NGUYỀN LIỆỤ, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u nhau, xác định cấu true sản phẩm bằng các phừơng
1 N guyên liệu: Theophyíiin, doxotyllin chuẩn pháp phổ hghiệm; mỗi quy trinh sẽ được tối ưu hóa đe (USP) và các hóa chẩt khác tim ra các thông số phản ứng cho hiệu suat cao
i n
OH
+ H C H O + N a ! 0 3 + H 20
+ h 2 o
ĩ II } + N a l 0 4 -1 1 }
O ^ S i N
H<N H * -0 - 8O,H h ,c , nX ^ Ọ
T L /> + J J II ỳ
Phương pháp tối ưu hóa: tối ưu đa biến, một đáp ứng dưới sự hỗ írợ cùa phần mềm MODDLE 5.0.
Q uv trinh 2: quy írình 1 bước
0X VX > * » ^ v
Phương pháp tối ưu hóa: tối ưu đa biến, đa đáp ứng (íối ưu hóa thông minh) dưới sự hỗ trợ của phần mềm Design Expert 7.1.6 và BCPharsoft.
Quv trinh 3 : quy trình 3 bước
,0CH2CH3
H,cW l * Br v - OCHc 2CM r 3 0X HX Ì
O C H í C H 3
-A < r CH0
ỵ— C H O HO.
Trang 3Phương pháp tối ưu hóa: kết hợp hai phương pháp
tổi ưu hỏa cua quy trình 1 và 2
2.2 Xây dựng quy trình và thực hiện kiểm
nghiệm thieo tiêu chuẩn c ơ s ở (TCCSJ: thực hiện
kiem nghiệm ỉheo T C C S với các chỉ tiêu như tính chất,
định tính (phồ IR, UV-Vis), ỉạp chất (phương pháp
HPLC), giới hạn kim loại nặng, tro sulfat, mất khổi
lượng do làm khô và định lượng (phương pháp HPLC)
với chuẩn ià doxophyilin (USP) Kết quả được thẩm
định íại Viện kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh
2.3 Đánh giá đọ ổn đĩnh của doxophyllin:
doxophyilin được đánh giá độ ồn định bang các
phườncỊ pháp như nghiên cứu sự phân hủy ơ điều
kiện khac nghiệt, nphỉen cứu độ ổn định bằng phương
pháp lão hỏa cap toe và nghiên cứu độ ổn định dài hạn
ơ điều kiện bảò quàn C ac chì tiêu đánh giá !à tính
chất, tạp chấí liên quan và hàm lượng.2,5,7,10,
KẾT QUẢ
1 Xác định cấu trúc sản phẩm
Sản phẩm được tổng hợp từ mỗi quy trỉnh được
xác định cấu trúc và độ tinh khiết, kết qua như sau:
Nhiêt đố nóng chầv: điểm chảy đo bằng phương
pháp mao quản (144 °C), đo theo phương pháp phô
quét nhiệí vi sai (sản phẩm doxophyiiin có độ tinh khiết
99,43% và nhiệỉ độ nong chảy 144,37 °C) phù hợp với
nhiệt độ nóng chảy của doxophyllin (144-146 °C).
Phế IR (KBr c n í!) : cho các dao động ứng với phổ
IR tham khảo của doxophyliin 2954,25 (oCh3-n);
2877,40 (UCH3-N); 1700,61 ( io o ) ; 1657,54 (Oc-c);
1546,82 (oc=n) 1232,76 (uc-o).
Phổ MS: m/z [M+Naf - 289,0929, phù hợp với
khối lượng phân íử dự kiến của dòxophyilìin là
266,0929
Phổ 1H-NMR (DMSO-đg 500 MHz, ô ppm): 3,20
(s, 3H, N-CH3); 3,41 (s, 3H, N-CH3); 3,79-3,87 (/77, 2H,
0 -C H 2-CH2-0 ); 4,41 (ơ, J = 4,0 Hz, 2H, N-CH2-CH);
5,19 (?, J = 4,0 Hz, 1H, N-CH2-CH); 7,99 (s, 1H, N=CH-
N)
Phổ 13C-NMR (DMSO-dg 125 MHz 5 ppm): 27,45
(N-CHs); 29,35 (N-CH3); 64,52 (0 -C H 2-C H 2-0); 47,58
(N-CHrCH); 100,60 (N-CH rCH ); 143,02 (N=CH-N);
106,15 (C-C-N); 147,98 (N-C-N); 154,43 (CH3-N-C-C);
150,89 (CH3-N -C-N -CH3)
So sánh số liệu pho với tài liệu tham khảo và phổ
doxophyilín chuẩn (USP) cho thấy sản phẩm đúng !à
doxophyjlin
2 Kết quả tối ưu hóa quy trình tổng hợp: thực
hiện tối ưu hóa ở quy mô 5 g và nâng cap len cỡ lô
100 g nguyên liệu theophyílin
Quv trình 1:
Bước 1: kết quả tối ưu của 15 thí nghiệm với 3 yếu
tố Xi.»3 và 1 đáp ứng y như sau
« Tỳ lệ mol theophyllin: NaOH = 1:1,454
• Nhiệt độ 89,19 °Ó
• Thời gian: 86,16 phút
• Hiệu suất trung bình: 78,67%
Bước 2: kết quả khảo sát Sơ bộ mà không cần tối
ưu, được các thông số tối ưu sau
• Tỷ iệ mol dyphyliin : N a i0 4 = 1 :1,2.
• Thời gian: 10 phút
• Nhiệt độ : 35 °c
• Hiệu suất truncj bình: 92,81%
Bước 3: kết quả toi ưu cùa 15 thí nghiệm với 3 yếu
tố x^ 3 và 1 đáp ưng y như sau
• Tỷ lệ mo! ethylen glycol theophylin-7- acetaldeỉíyd = 6,22 : 1
• Thời gian: 128 phút
» Nhiệt độ: 108 °Ò
• Hiệu suất trung bình: 84,92%
Hiệu suất toàn phần của quy trình 1 là 62%.
Quv trinh 2: kết quả tối ưu cùa 20 thí nghiệm với 4 yếu tố Xi^4 và 2 đáp ứng y-i-^như sau
® Tỷ lệ mol của 2-bromomethyl-1l3-dioxoiane :
theophyiíin = 1,32 : 1
» Thời gian: 6 giờ
• Tỷ lệ mol Na2C 0 3 : theophyllìn = 0,658 :1
® Hiệu suấỉ của sản phẩm doxophyllin thô:
102,543%
® Độ tinh khiết của sản phẩm doxophyliin thô:
96,496%
Hiệu suất toàn phần của quy trình 2 /ả 90,44%.
Quv trinh 3:
Bước 1:
• Sử dụng kết quả tối ưu hóa ở bước 1 của quy
trình 2, tuy nhiên, phản ứng xảy ra nhanh hơn (4 giờ)
• Hiệu suất trung bình: 96,23%
Bước 2: phản ứng xảy ra gần như hoàn íoàn
• Tác nhân: HC110%
Nhiệt độ: 60 °c
® Thời gian: 1,5 giờ
Bước 3:
• Sử dụng kết quả tối ưu hóa ở bước 3 của quy
trinh 1
• Hiệu suất trung bình: 85,06%
Hiệu suất toàn phần của quy trình 3 là 81,85%.
Ket quả nâng cấp lến cỡ lô 100 g nguyên liệu theophyllin phù hợp với kết quả sau khi toi ưu hỏa
3 Kết quả xây dựng quy trình và thực hiện kiểm nghiệm theo tỉêu chuẩn cơ sở
Tính chất Dạng tính thế màu trâng, tan trong nước, ethanol, methanol, ethyl acetat, diclomethan và
cioroform.
Đúng
Định tính ~ Phổ hồng ngoại (!R): phổ IR của doxophyllin có các dao động đặc trưng theo cấu trúc
hóa học của đoxophyllin là 2877,40 và 2954,25 (UCH3-N); 1657,54 (uc=c); 1700,61 (uc=o);
1546,82 ( uc = n ); 1232,76 (óoo)
- Phổ íử ngoại khả kiến (UV-Vis): phổ UV-Vis của mẫu thử có đỉnh hấp thu cực đại ở
bước sóng 273 nm.
Đúng
Trang 4Tạp chất - Trên sắc ký đồ mẫu (b): Rs pic theophyllin và doxophyliin là 9,6.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử: không có pic có thời gian lưu tương ứng với pic theophyllin và
các pic khác pic chính doxophyilin.
Đạt
Giới hạn
kim ioạỉ nặng
Mât khối lượng
do làm khô
< 0,5 % Đạt (0,14%) Định lượng Hám lượng ơoxophyỉìĩn từ 98 đến 102 % tính trên chê Dhầm khan
: _UỈA ÍL.Ẳ ■ / 11 - V Đạt (100,7%)
nghiệm kèm theo)
4 Kết quả đánh giá độ ổn đình của doxophyllin
! _»1_ í £ _ 1_ i L A 2 í I ! í í f _ Ặ _ l ‘ M
Điêu kiện Thời gian iưu của cảc pic trên sằc ký
đồ
Hàm lượng doxophyllin còn iại (mq/ml)
% doxophyllin bị phân hủy
HCI 0,1 M 2,66
7,31
NaOH
0,1 M
1,37 1,48 3,39 7,28
H20 2 3% 1,56
7,30
0,430 14,0
65°c và
RH = 75%
r-N I I - ' " ' T - t i •
7,33
' V T ' "
Nghiên cứu độ ổn định bằng phương pháp lão hóa cếp tốc: két quả thực hiện trẽn 03 lô
Chỉ tiêu Lô Thời qian khảo sát (thánq)
Tính chất Lô 1 Đat Đat Đạt Đat Đat Đat Đaí
LÔ 2 Đạt Đạt Đạt Đat Đạt Đat Đaí
Lô 3 Đat Đat Đat Đat Đat Đat Đat Tạp chất liên quan Lô 1 Đat Đạt Đat Đạt Đat Đat Đat
Lô 2 Đạt Đat Đat Đat Đat Đat Đat
Lô 3 Đat Đat Đaí Đạt Đat Đat Đạt Hàm lương
(%)
Lô 1 100,62 100,61 100,56 99,96 100,23 100,45 100,34
Lô 2 100,79 100,91 99,56 99,82 100,37 100,63 99,89
Lô 3 100,67 100,14 100,79 100,77 99,71 99,66 99,93 kễt iuặri
-T À , ,
Lõ 1 Đat Đat Đat Đat Đạt Đat Đat
Lô 2 Đai Đat Đạt Đat Đat Đat Đạt
LÔ 3 Đaí Đat Đat Đat Đat Đat Đat
thấy hàm lirợng của 3 lô trong íhời gian 6 tháng khác nhau không ý nghĩa (x2 = 0,010 < x20,05 = 12,592 và p = 0,586 >= 0,05) Vậy, doxophyliin ổn định trong thời gian 6 tháng ờ điều kiện 40 ± 2 °c và độ ẩm tương đổi 75 ± 5%
Nghiên cửu độ ổn định dải hạn ở điều kiện bảo quản: két quả thực hiện trẽn 03 lố
Chỉíiêu Lô Thời gian khảo sát (thổnq)
Tính chấí Lô 1 Đat Đạí Đat
Lô 2 Đạt Đat Đat
Lô 3 Đat Đạí Đat Tạp chét Hên quan Lô 1 Đat Đạt Đat
Lô 2 Đat Đạt Đaí
Lô 3 Đạt Đat Đạt Hàm lương
(%)
Lô 1 100,67 99,87 99,63
Kêí luân Lô 1 Đat Đat Đat
Lô 2 Đạt Đạt Đat
Lô 3 Đạí Đạt Đạt
Trang 5Tiến hành phân tích phương sai hai yếu tố có lặp hàm lượng doxophyllin của 3 lô trong thời gian 0 3 và 6 tháng cho thấy hàm ỉượng của 3 lô trong thời gian 6 tháng khác nhau không ý nghĩa (v2 = 0,002 < x20 05 = 5,991 và p = 0,306 >= 0,05) Vậy, doxophyliin đạt độ ổn định trong thời gian khảo sát Can tiếp tục theo dõi đề xác đinh tuồi íhọ của doxophyllin ở điều kiện bảo quản thực
BÀN LUẬN
So sánh 03 quy trình như sau
Nội dunq Quv trình 1 Quv trình 2 Quy trình 3
Hiệu suất toàn phằn 62% 90,44% 81,85%
Độ tinh khiêt > 99% > 99% > 99%
Thời gian phản ứng
toàn phần
3 bước, tòng thời gian phản ứng khoẳnq 3,7 qiơ
1 bước, íông thời gian phản ứng
khoảng 6 qiờ
3 bước, tông thời gian phản ứng khoảnq 676 qiờ
Phương pháp tối ưu
hóa
Phương pháp co điến (đa yếu
tố, 1 đáp ứng), với sự trợ giúp của phan mem MODDLE 5.0
Phương pháp thông minh (đa yếu tố, đa đáp ứng)7với sự trợ giúp của phần mem Design Expert 7.1.6 và BCPharsofi
Kêt hợp cả hai phương pháp tối
ưu hóa
Khác ~ Giá thành nguyên liệu rẻ
- Sản phẩm trung gian dyphyliin có trong chuyên luận USP35, có tác dụnj3 giãn phế quản, tiêu chuẩn dê kiểm soát
- Gỉá thành nguyên iiệu 2- _ bromomethy!-1,3-dioxoian đắt (100g = 344 SGD)
- Giá thành nguyên liệu bromoacetaldehyd dỉethyl acetal (2,2-dietoxyethyl bromid) rẻ hơn (ioog = 54 SGD), có thê tổng hợp từ vinvl acetat
Xéỉ về tính khả thi ở quy mô công nghiệp, quy trình 3 có thể sử dụng để nâng cấp lên những cỡ iô cao hơn Tuy nhiên, íùy từng điều kiện và mục đích mà co thể chọn quy trinh cho phù hợp
K Ế T LUẬN V À KIẾN NGHỊ
Như vậy, nghiên cứu đã tổng hợp íhành công
doxophyllin tuy cỏ hiệu suất khác nhau nhưng mỗi quy
trình đều có ưu điểm và nhược điểm Sản phẩm đúng
cấu trúc so vởj doxophyílin chuẩn, có độ tỉnh khiết cao
và đạt tiêu chuẩn cơ sở Doxophyllin được tổng hợp
với hiệu suất cao hơn các patent đã công bố trước đây
và hoàn toàn có ìhể triển khai trong điều kiện tại Việỉ
Nam với quy mô iớn Ngoài ra, công írlnh đã áp dụng
phương pháp tốí ưu hóa thông minh trong quy hoạch
thực nghiệm để tối ưu hóa quy trinh tổng hợp Kết quả
đánh giá độ ổn định cho thấy doxophyllin đạt độ ổn
định trong íhời gian khảo sát Trong thơi gian tới, cần
nâng cấp cỡ lô quy trinh tổng hợp doxophyllin ở quy
mô 500 g nguyên líẹu theophyílin và các cỡ iô cao hơn
để đánh gia được hiệu quả của từng quy trình, đồng
thời tiến hành tiếp tục 5 đánh giá độ ổn định ơ điều
kiện bảo quản íhực, nghiên cứu độc íính cấp, độc tính
bán trường diễn của doxophyllin, từ đó, tiến hành bào
chế thành các dạng thuốc phù hợp (viên nén, thuốc
tiêm, siro, )
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Ị Asian YC (2006), “Application of Box - Behnken
design and response surface methodology for
modeling of some Turkish coas”, Elsivier Inc., 86,
pp.91-2 Akhilesh Gupta e t al (2011), "An Analytical
Approach of Doxofylline: A Review", Asian J Pharm
Ana., 1(4), pp 67-70.
3 David B Ishay (1956), 7-(2:3-dihydroxypropyl)
Theophyline, J Chem S o c 3975
4 Furukawa CT, Shapiro GG, Pierson WE,
Bierman c w (1983), “Dyphylline versus theophylline: a
double-biind comparative evaluation”, Journal o f
clinical pharmacology, 23, pp.414-422.
5 ÍCH (2003), “Q1A(R2) stability Testing of New
Drug Substances and Products”, pp 1-22
6 Jean Bousquet and Nikolai Khaltaev (2007),
Global surveillance, prevention and control o f Chronic Respiratory Diseases: a comprehensive approach,
WHO, pp 15-21
7 Jens T Carstensen (2005), Drug stability
principles and practices, Wilmington, North Carolina,
pp 329-384
' 8 Jhuma Sankar, Rakesh Lodha, s K Kabra (2008), "Doxofyiiine: The Next Generation
Methylxanthine", Indian Journal o f Pediatrics, 75(3), 59
9 Kim H Esbensen (2004), Multivariate Data
Analysis - In Practice 5th Edition: An Introduction to
Multivariate Data Analysis and Experimental Design,
CAMO Software Inc., pp 20-147.
10 Namdeo G Shinde e t al (2013),
“Pharmaceutical Forced Degradation Studies with
Regulatory Consideration” , Asian J Pharm Ana., 3(4),
pp 178-188
11 Patent CN1106404 A (1995), “Synthetic
process of, new drug dosotheophyiline”
12 Patent CN 102936248 A (2012), “Method for preparing doxofyiiine”
13 Patent CN 1041728 c (1999), “Synthesis of doxofyliine”
14 Ranjit Singh et ai (2012), “Current trends in forced degradation study for pharmaceutical product
development”, J Pharm Educ Res., 3(1), pp 54-63
15 Stat-Ease, Inc., Design expert 7.1.6.
16 Shukla D, Chakraborty s , Singh s , Mishra B
(2009), "Doxofylline: a promising methylxanthine
derivative for the treatment of asthma and Chronic Obstructive Pulmonary disease”, Opin Pharmacothe.r,
10(14), pp.2343-2399
17 The United States Pharmacopoeial Convention (2012), USP35, pp 14 1,14 5 , 15 1, 317, 2999