Chiết xuất phân lập stipuleanosid r2 từ sâm vũ diệp panax bipinnatifidus seem làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu

Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hóa học, xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sâm vũ diệp làm cơ sở cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của stipuleanosid R2,

Trang 1

Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

BÙI THỊ THANH VÂN

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ

LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN

CHO DƯỢC LIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: Bùi Thị Thanh Vân

CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP STIPULEANOSID R2 TỪ

LÀM NGUYÊN LIỆU XÂY DỰNG CHẤT CHUẨN

CHO DƯỢC LIỆU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa : QH.2014.Y

Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội - 2019

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, bên cạnh tôi luôn có sự giúp đỡ vô cùng quý giá đến từ các thầy cô giáo của Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với bạn bè và gia đình thân yêu của tôi Thời điểm hoàn thành khóa luận cũng là lúc tôi dành những lời tri ân chân thành nhất đến những người đã chỉ dạy, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn của mình

– TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội - thầy đã dành

nhiều thời gian hướng dẫn, dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin cảm chị Đặng Thị Ngần – Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ dạy, đóng góp ý kiến để khóa luận của tôi được hoàn thiện

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Nguyễn Thị Thu Thủy và anh Nguyễn Hoàng Việt – Đại học Dược Hà Nội; cùng PGS.TS Dương Thị Ly Hương – Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội chủ nhiệm đề tài Tây Bắc đã giúp tôi có được kết quả để tiếp bước thực hiện nghiên cứu này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược, đặc biệt là bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Dược học khóa QH.2014.Y, đặc biệt là các bạn Hà, Hoa, Nhung, Thảo đã đồng hành cùng tôi suốt thời gian nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin dành lời tri ân sâu sắc nhất tới gia đình thân yêu của tôi,

đã nuôi nấng và tạo động lực để tôi có kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2019

Bùi Thị Thanh Vân

Trang 4

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2

1.1 CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Ứng dụng 2

1.1.3 Phân loại 3

1.1.4 Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu 4

1.1.5 Phương pháp thiết lập chất chuẩn 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP 6

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 6

1.1.2 Thành phần hóa học 7

1.1.3 Tác dụng dược lý 8

1.1.4 Công dụng 9

1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2 9

1.2.1 Công thức hóa học và đặc điểm 9

1.2.2 Tác dụng sinh học 10

1.2.3 Các nghiên cứu về stipuleanosid R2 10

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 11

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 11

2.1.2 Dung môi, hóa chất 11

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 12

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 12

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 13

2.3.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 14

Trang 5

2.3.3 Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng

HPLC 14

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 15

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16

3.1 Chiết xuất, phân lập và tinh chế Stipuleanosid R2 trong Sâm vũ diệp 16

3.1.1 Chiết xuất 16

3.1.2 Phân lập 17

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết của stipuleanosid R2 phân lập được bằng SKLM 18 3.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2 19

3.2.1 Đặc điểm cảm quan 19

3.2.2 Điểm chảy 19

3.2.3 Kết quả đo phổ 19

3.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được bằng HPLC 22 3.3.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 22

3.3.2 Nhận dạng pic trên sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được 23

3.3.3 Định lượng stipuleanosid R2 phân lập được 24

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29

4.1 Về chiết xuất, phân lập và tinh chế 29

4.2 Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng 30

4.3 Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được bằng HPLC30 4.3.1 Xây dựng phương pháp 30

4.3.2 Phân tích định tính và định lượng stipuleanosid R2 phân lập được 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 6

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

LOD Giới hạn phát hiện

LOQ Giới hạn định lượng

RDS Độ lệch chuẩn tương đối

SKĐ Sắc ký đồ

SKLM Sắc ký lớp mỏng

SVD Sâm vũ diệp

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Hàm lượng cắn các phân đoạn chiết xuất từ Sâm vũ diệp 17 Bảng 3.2 Kết quả đo điểm chảy của stipuleanosid R2 20 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H và 13C-NMR, DEPT của stipuleanosid R2 21

Bảng 3.5 Sự phù hợp hệ thống xác định độ tinh khiết 26 Bảng 3.6 Kết quả định lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn 28

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 6 Hình 1.2 Các hợp chất tách được từ rễ cây sâm vũ diệp 8 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 9

Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào

Cai

11

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất stipuleanosid R2 18

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập stipuleanosid R2 từ phân đoạn n-butanol 19 Hình 3.3 Sắc ký đồ của stipuleanosid R2 phân lập được sau khi phun TT H2SO4

Trang 9

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đất nước Việt Nam ta luôn tự hào được thiên nhiên ưu đãi, tạo hóa ban cho

chúng ta một nguồn dược liệu “giàu có” so với các nước trong khu vực và trên thế

giới Thống kê của Viện Dược liệu cho thấy, cả nước đã ghi nhận 5.117 loài thực vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng có công dụng làm thuốc, trong đó

có nhiều loài dược liệu quý hiếm, đặc hữu như: sâm vũ diệp, sâm ngọc linh, ba kích, ngân đằng, thông đỏ…

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem., họ Nhân sâm – Araliaceae) là một

trong những dược liệu quý, phân bố ở Trung Quốc và dãy núi Hoàng Liên Sơn, Tây Bắc nước ta Về mặt y học, sâm vũ diệp được sử dụng làm thuốc bổ và là thành phần trong một số bài thuốc truyền thống của các dân tộc vùng núi Tây Bắc có tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, bổ dưỡng, tăng trí nhớ Theo như các tài liệu

đã được công bố về sâm vũ diệp cho thấy các saponin là thành phần hoạt chất chính mang lại tác dụng dược lý và giá trị sử dụng của dược liệu quý này trong y học, đặc biệt nói đến là stipuleanosid R2 – một saponin quan trọng có trong sâm vũ diệp

Để nâng cao chất lượng nghiên cứu về stipuleanosid R2 nói riêng và các hợp chất nói chung, việc kiểm tra, kiểm soát chất lượng dược liệu là vô cùng quan trọng Song thực tế nước ta còn gặp khó khăn trong việc phân tích, kiểm nghiệm do thiếu các chất chuẩn cần thiết Phần lớn chất chuẩn đang sử dụng phải nhập từ nước ngoài với giá cao và thời gian đặt hàng kéo dài Nhằm khắc phục nhược điểm này, cùng với mục tiêu phát triển tiềm năng của vị dược liệu quý sâm vũ diệp, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chiết xuất, phân lập stipuleanosid R2 từ Sâm Vũ Diệp

(Panax bipinnatifidus Seem.) làm nguyên liệu xây dựng chất chuẩn cho dược liệu”

Mục tiêu đề tài:

- Chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 có độ tinh khiết trên 95%

từ dược liệu sâm vũ diệp

- Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ

- Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 phân lập được

Kết quả của đề tài sẽ góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu thành phần hóa học, xây dựng tiêu chuẩn dược liệu sâm vũ diệp làm cơ sở cho các nghiên cứu hoạt tính sinh học của stipuleanosid R2, nền tảng cho việc phát triển sâm vũ diệp trong điều trị

Trang 10

2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 CHẤT CHUẨN, CHẤT ĐỐI CHIẾU

1.1.1 Khái niệm

Chất chuẩn (standard subtances) hay chất chuẩn đối chiếu (reference standards) là chất cần thiết để đánh giá các nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm… theo các quy trình đã xác định nhằm đảm bảo kết quả phân tích đạt độ chính xác, đáng tin cậy [28]

Chất chuẩn đối chiếu là một phần quan trọng của đo lường và thiết lập tính khả thi trong so sánh (comparability) và có thể truy nguyên được (traceability)[6]

Theo dược điển Việt Nam V: Chất đối chiếu là chất đồng nhất đã được xác định là đúng để dùng trong các phép thử đã được quy định về hóa học, vật lý và sinh học Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của chất thử Chất đối chiếu phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [3]

Theo định nghĩa FDA: “Chất chuẩn đối chiếu (reference standards) là một lô hay mẻ của hợp chất làm thuốc được điều chế đặc biệt bằng cách tổng hợp độc lập hoặc bằng cách tinh chế bổ sung của nguyên liệu điều chế và được chứng minh bằng một loạt các thử nghiệm phân tích sâu rộng để xác định nó là nguyên liệu xác thực có độ tinh khiết tối đa, có thể đạt được một cách hợp lý Nó thường được dùng cho việc phân giải cấu trúc và chất làm chuẩn cho các chất chuẩn làm việc (working standards) [19]

1.1.2 Ứng dụng

Chất đối chiếu được dùng trong các phép thử sau:

- Định tính bằng phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại

- Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang

- Các phép thử định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

- Các phép chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng

- Các phép thử sinh học

- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng [3]

Ngoài ra chất đối chiếu còn dùng để:

- Thẩm định một phương pháp mới

- Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác

Trang 11

- Chất chuẩn sơ cấp (primary standards): là các hợp chất với những chất lượng

và độ tinh khiết được thiết lập độc lập, được chấp nhận mà không cần tham khảo các tiêu chuẩn khác

- Chất chuẩn thứ cấp (secondary standards): là các hợp chất mà chất lượng và

độ tinh khiết được thiết lập dựa trên sự so sánh với chất chuẩn phân tích

So sánh 2 loại chất chuẩn:

Bảng 1 So sánh 2 loại chất chuẩn [18]

Chất chuẩn sơ cấp Chất chuẩn thứ cấp

Tên gọi khác Chất chuẩn gốc Chất chuẩn phòng thí nghiệm,

+ Quá trình phát triển thuốc + Nghiên cứu và phát triển (R&D) + Chuẩn hóa dụng cụ, phương pháp và vật liệu

+ Chuẩn hóa chất chuẩn thứ cấp

Trang 12

4

Giá cả Rất cao Thấp hơn

1.1.4 Sự cần thiết của việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu

Hiện nay, trên thế giới đã có một số chất chuẩn là những hợp chất đặc trưng của dược liệu được sản xuất đạt mức độ tinh khiết nhất định Trong số đó, chỉ có một số ít chất chuẩn được tiếp cận mua được, nhưng thường có giá rất đắt Hoạt động nghiên cứu thiết lập và sản xuất các chất chuẩn giúp cho công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc được dễ dàng và thuận tiện

Nguồn chất chuẩn ở Việt Nam hiện nay đã có hơn 500 chất chuẩn bao gồm chất chuẩn Quốc tế, chuẩn khu vực, chuẩn Dược điển Việt Nam, chuẩn phòng thí nghiệm, chuẩn chính Tuy nhiên chủ yếu trong đó là chất chuẩn hóa học, rất ít chất chuẩn có nguồn gốc từ dược liệu Sự thiếu hụt này đã và đang gây nhiều khó khăn cho ngành Dược như:

- Không kiểm tra, giám sát Dược liệu và các dạng bào chế có nguồn gốc từ dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ và toàn diện

- Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ dược liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về hàm lượng dược chất Do đó khó có thể bào chế các thuốc có chất lượng cao phục vụ nhu cầu phòng bệnh và chữa bệnh

Do vậy nghiên cứu thiết lập chất chuẩn các hợp chất chiết xuất Dược liệu là nhiệm vụ khoa học công nghệ cấp thiết, đòi hỏi nhu cầu thực tiễn khách quan

1.1.5 Phương pháp thiết lập chất chuẩn

1.1.5.1 Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn sơ cấp

Quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp bao gồm các bước như sau [34]:

- Đánh giá nhu cầu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (CCĐC)

- Lựa chọn nguồn nguyên liệu dùng để thiết lập CCĐC từ nhà cung cấp

- Đánh giá chất chuẩn đối chiếu:

+ CCĐC dùng cho phép thử định tính: Thông thường chỉ cần kết quả đánh giá

từ một phòng thí nghiệm đủ tiêu chuẩn

+ CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết: Yêu cầu mô tả đặc tính rộng hơn so

với phép thử định tính, đặc biệt khi sử dụng trong các phép thử giới hạn Nếu sử dụng kĩ thuật SKLM, thường đề nghị độ tinh khiết tối thiểu (≥ 90%), nhưng yêu cầu

độ tinh khiết cao hơn (≥ 95%) đối với kỹ thuật HPLC hoặc GC Thông thường chỉ cần một phòng thí nghiệm tham gia đánh giá CCĐC dùng cho phép thử độ tinh khiết Nếu CCĐC được phân lập hoặc điều chế lần đầu tiên thì cần tiến hành một số phép thử hóa lý như phổ NMR, phổ MS và phân tích nguyên tố để mô tả đặc tính

Trang 13

5

+ Các CCĐC dùng cho phép định lượng: Phạm vi các phép thử rất rộng, sử

dụng nhiều kỹ thuật đã được thiết lập và thẩm định, bao gồm các phương pháp đã được sử dụng để đánh giá tiêu chuẩn chất lượng trong dược điển Khi định lượng các CCĐC bằng các phương pháp không đặc hiệu, như đo quang phổ UV hay so màu, cần phải xác định hàm lượng nước và lượng dung môi tồn dư Khi định lượng bằng các phương pháp đặc hiệu, cần phải xác định hàm lượng tạp chất Trong trường hợp này, khuyến khích sử dụng thêm các phương pháp tuyệt đối để định lượng chất chính

+ Các CCĐC dùng để hiệu chuẩn thiết bị: Yêu cầu phạm vi các test đánh giá

như đối với định lượng

- Phân tích định tính, định lượng để đánh giá chất chuẩn sơ cấp

- Xác định giá trị ấn định

- Xác định thông tin cần cung cấp kèm theo chất chuẩn sơ cấp

- Đóng gói, bảo quản, nghiên cứu độ ổn định

1.1.5.2 Thiết lập, bảo quản và phân phối chất chuẩn thứ cấp

Trên cơ sở tham khảo quy trình thiết lập chất chuẩn sơ cấp, các hội đồng dược điển quốc gia hay khu vực hoặc các phòng thí nghiệm được ủy quyền của cơ quan quản lý dược quốc gia xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn thứ cấp hay chất chuẩn làm việc của cơ sở đó Việc thiết lập chất chuẩn làm việc dựa trên chất chuẩn sơ cấp thường được tiến hành do nhu cầu thực tế, khi nguồn chất chuẩn sơ cấp không đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng trong công tác nghiên cứu và đảm bảo chất lượng thuốc

Việc phân loại chất chuẩn làm việc mang ý nghĩa tương đối Một chất chuẩn làm việc của khu vực hay quốc gia có thể được coi là chất chuẩn sơ cấp để thiết lập chất chuẩn phòng thí nghiệm hoặc các nhà sản xuất dược phẩm Trong trường hợp này, các chất chuẩn khu vực hay quốc gia được gọi là chuẩn liên kết

Theo quy định của ASEAN, chương trình đánh giá lại chất chuẩn đối chiếu ASEAN (ACRS) được thiết kế để phát hiện các dấu hiệu sớm của quá trình phân hủy bằng các kỹ thuật phân tích phù hợp Các kỹ thuật này phải đáp ứng được các yêu cầu: sử dụng lượng mẫu ít, tiến hành nhanh, độ nhạy cao Tần suất và cỡ mẫu dùng cho đánh giá lại phụ thuộc một số yếu tố như độ ổn định của CCĐC, đồ bao gói, nút đóng của đồ bao gói, điều kiện bảo quản, độ ẩm, tính chất vật lý và mục đích sử dụng của CCĐC Đối với ACRS tần suất đánh giá lại được quy định như sau: 3 năm đối với CCĐC dùng cho phép thử hóa học, 2 năm đối với CCĐC dùng

Trang 14

- Xác định độ tinh khiết bằng đo nhiệt vi sai, nếu thích hợp

1.2 TỔNG QUAN VỀ SÂM VŨ DIỆP

Lá kép chân vịt, gồm 2 - 3 chiếc mọc vòng Lá chét gồm 5 - 7 (ít khi 3) lá thuôn, dài 2,5 - 14 cm, rộng 1,5 - 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy không đều, mép có răng cưa, có lông

Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn; cuống cụm hoa 5 – 10 cm; cụm hoa có từ 20 – 90 hoa; cuống hoa mảnh dài 1 – 1,5 cm Hoa màu trắng đục, mọc thành tán đơn ở ngọn thân, 5 cánh hoa, bầu 2 - 3 ô [2] Quả hình cầu đến hình cầu dẹt; đường kính 0,6 – 1,2 cm; khi chín màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa 1 – 2 hạt Hạt hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [2,11]

Hình 1.1 Hình ảnh sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

Trang 15

7

SVD là loài sâm mọc tự nhiên và được phát hiện tương đối sớm ở nước ta Trên thế giới, SVD được tìm thấy ở Trung Quốc, Ấn Độ và Nepan (vùng cận Hymalaya), tại Việt Nam dược liệu này phân bố ở dãy núi Hoàng Liên Sơn: huyện

Sa Pa, Bát Xát - Lào Cai và huyện Than Uyên - Lai Châu Tây Bắc [2,11-12] ở độ cao 1900-2400 m, trong rừng ẩm

1.1.2 Thành phần hóa học

Saponin là thành phần chính của lá và rễ cây SVD, trong đó bao gồm saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng với một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn [8,13] Saponin bao gồm: ginsenoside, notoginsenoside và chikusetsusaponin là các hợp chất có hoạt tính chính trong nhóm dược liệu này [35]

Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc đã công bố phân lập được 13 saponin khung dammaran từ lá của dược liệu này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trưng như ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [31]

Năm 2002, nghiên cứu của Trần Công Luận cho thấy kết quả định tính sơ bộ trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin [12]

Năm 2003, đã xác định thành phần saponin ở thân rễ SVD chủ yếu là saponin triterpen thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro Ngoài ra còn có các saponin triterpen nhóm dammaran như Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2 [11]

Năm 2018, nhóm nghiên cứu của Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được hai saponin từ rễ của SVD: stipuleanosid R2 và aralosid A methyl este [30]

Như vậy, tổng cộng có 28 hợp chất saponin đã được xác định từ các phần của cây SVD

Trang 16

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt

tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư [21]

Năm 2017, nghiên cứu về SVD có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in

vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân

đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5-1-2-5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [10]

Me Methyl Ara(f) α- L-arabinofuranosyl Ara(p) α-L-arabinopyranosyl Glc β-D-glucopyranosyl Xyl β-O-xylopyranosyl

Trang 17

9

Ngoài ra, các nhà nghiên cứu khám phá ra SVD nhờ các thành phần ginsenoside Rh1, Rh2, Rg1, Rg2 và chikusetsusaponin L5 có khả năng ức chế hoạt động enzyme tyrosinase trên 50% [35] – một enzyme có tác dụng tổng hợp melanin tạo sắc tố da, nếu thừa enzyme này sẽ làm da đen, sạm và nám

1.2 TỔNG QUAN VỀ STIPULEANOSID R2

Stipuleanosid R2 là một hợp chất saponin quan trọng chiếm tỷ lệ lớn nhất trong SVD tính đến thời điểm nghiên cứu hiện nay, thành phần mang hoạt tính, đang tiếp tục được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học, hợp chất này được phân lập trong một số dược liệu như: sâm vũ diệp, tam thất hoang, Aralia taibaiensis [29], Aralia elata [27]

1.2.1 Công thức hóa học và đặc điểm

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2 [37]

Trang 18

10

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:

heptamethyl-8a-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxycarbonyl-1,2,3,4a,5,6,7,8,9,10,12,12a,14,14a-tetradecahydropicen-3-yl]oxy]-3-[(2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-5-hydroxy-4-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxane-2-carboxylic acid [33]

(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[[(3S,4aR,6aR,6bS,8aS,12aS,14aR,14bR)-4,4,6a,6b,11,11,14b-Công thức phân tử: C53H84O23 [37]

Phân tử lượng: 1089,232 g/mol [38]

Tính chất lý hóa: Chất bột màu trắng, độ tan: 0,57 g/l [38], điểm nóng chảy 210 -

2150C [22]

1.2.2 Tác dụng sinh học

Theo kết quả của một số nghiên cứu in vitro trên thế giới, các nhà khoa học

đã chứng minh rằng stipuleanosid R2 có tác dụng gây độc tế bào ung thư [27]; ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư bạch cầu đặc biệt là đối với dòng tế bào K562 và U937 [22]; có tác dụng chống oxy hóa [32]; hạ đường huyết, điều hòa miễn dịch và

hạ lipid máu [31]

1.2.3 Các nghiên cứu về stipuleanosid R2

Hiện nay trên thế giới và trong nước vẫn chưa có nhiều các nghiên cứu công

bố về hợp chất stipuleanosid R2 trong dược liệu Các nghiên cứu đang dừng lại ở việc phân lập hợp chất này trong các dược liệu và xây dựng được phương pháp định lượng hợp chất stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD [9] Chính vì vậy để nâng cao chất lượng nghiên cứu cần phải có những tiêu chuẩn cho chất chuẩn stipuleanosid R2…

Trang 19

11

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được trồng và thu hái ở Sa Pa,

Lào Cai là dược liệu được nghiên cứu trong đề tài này

Mô tả đối tượng nghiên cứu: thân rễ SVD có nhiều đốt và những vết sẹo, cong ngoằn ngoèo, dài 7-12 cm, đường kính 1,2-1,8 cm Thể chất cứng chắc, giòn,

dễ bẻ, mặt bẻ lởm chởm, màu vàng nâu nhạt Mùi thơm nhẹ, vị đắng, hơi ngọt

Xử lí mẫu: thân rễ SVD rửa sạch, để khô, thái lát mỏng, sấy khô ở 500C đến hàm ẩm đạt dưới 10%, bảo quản trong túi nilong kín, để nơi khô ráo, thoáng mát để

sử dụng trong nghiên cứu

Hình 2.1 Mẫu sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sa Pa, Lào

Cai

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng (chiết xuất dược liệu, sắc

Trang 20

12

khiết 98%, mã sản phẩm 155-01701)

- Dung môi chạy sắc ký HPLC (Methanol, acetonitril) của Merck, Đức

- Hạt nhồi dùng cho sắc ký cột loại:

+ Pha thường silica gel 60 (230-400 mesh, Nacalai Tesque, Nhật Bản)

+ Pha đảo YMC ODS-A (50 μm, YMC Co Ltd., Nhật Bản)

- Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ đáp ứng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP tại Khoa Y Dược, ĐH Quốc gia Hà Nội:

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1260 Infinity (Agilent

Technologies, Mỹ) với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động

- Tủ sấy Memmert (Memmert – Đức), tủ hút

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR (sai số 0,0001g, Precisa - Thụy Sĩ)

- Cân xác định hàm ẩm Prescisa HA 60

- Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic - Hàn Quốc)

- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Thụy Sĩ)

- Máy đo điểm nóng chảy BUCHI 535

- Bếp điện, bếp đun cách thủy

- Cột sắc ký các loại kích cỡ

- Màng lọc 0,45 µm

- Dụng cụ thủy tinh: bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, bình định mức, bình cầu dung tích 50 - 2000 mL, ống nghiệm, pipet chính xác

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 từ dược liệu sâm vũ diệp

- Bước đầu xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng stipuleanosid R2: nhiệt độ nóng chảy, dữ liệu phổ

- Phân tích định tính, định lượng stipuleanosid R2 tinh chế được

Trang 21

13

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế, xác định cấu trúc hóa học của stipuleanosid R2

2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất các hợp chất saponin từ dược liệu

Các nghiên cứu về thành phần hoạt chất trong sâm vũ diệp đều cho thấy sâm

vũ diệp có chứa thành phần chính là saponin, tham khảo các tài liệu về chiết xuất saponin và sapogenin trong dược liệu [13-14] để tìm ra phương pháp chiết xuất phù hợp nhất với mẫu nghiên cứu là thân rễ SVD

- Phương pháp chiết mẫu: chiết siêu âm với dung môi ethanol 70%

- Phương pháp chiết phân đoạn: chiết lỏng-lỏng

Quy trình chiết xuất:

1 Thân rễ SVD sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết siêu âm bằng dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ 400C, chiết 3 lần

2 Thu dịch chiết, sau đó lọc dịch chiết qua giấy lọc, gom lại, cất quay loại dung môi dưới áp suất giảm, đun cách thủy thu được cao tổng ethanol

3 Cao ethanol thu được cho phân tán trong nước rồi lắc lần lượt với các

dung môi có độ phân cực tăng dần ether, ethyl acetat và n-butanol lặp lại 3 lần theo

tỷ lệ 1:1

4 Các phân đoạn thu được cho cất quay chân không dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi, đun cách thủy thu được 3 cắn tương ứng với từng phân đoạn

2.3.1.2 Phương pháp phân lập và tinh chế stipuleanosid R2 trong cao rễ SVD

Lựa chọn phân đoạn n-butanol để tiến hành phân lập, sử dụng phương pháp:

sắc ký cột pha thường và sắc ký cột pha đảo Theo dõi quá trình phân lập chất bằng sắc ký lớp mỏng

- Sắc ký cột (SKC): được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường silica gel 60 (0,04 - 0,063 nm, Nacalai Tesque, Inc., Nhật) và pha đảo YMC ODS-A (50µm, YMC Co Ltd, Nhật) Theo dõi quá trình phân lập bằng SKLM

- Sắc ký lớp mỏng (SKLM): được thực hiện trên bản mỏng Silicagel 60 F254 (Merk) và Silicagel RP-18 F254S (Merk) đã hoạt hóa ở 1050C trong 1 giờ Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ

từ đến khi hiện màu

Tinh chế chất phân lập bằng phương pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi thích hợp

Trang 22

14

2.3.1.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập được

Sử dụng các phương pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) kết hợp so sánh dữ liệu phổ thu được với các dữ liệu phổ đã công bố trong các tài liệu tham khảo để biện giải cấu trúc chất phân lập được

2.3.2 Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất

Dữ liệu chuẩn dùng để nhận dạng chất nhằm cung cấp thông tin cho thiết lập hồ sơ nhận dạng chuẩn Việc nhận dạng chất dựa vào:

- So sánh phổ của chất phân tích với phổ chất chuẩn trong cùng điều kiện

- So sánh thông tin phổ, dữ liệu hóa lý, hằng số vật lý của chất phân tích với tài liệu khoa học hoặc thông tin đã công bố Tập hợp các dữ liệu chuẩn đó có thể khẳng định được hợp chất là đúng đối tượng nghiên cứu

Các phương pháp được sử dụng để xây dựng bộ dữ liệu gồm có: đo điểm chảy; đo phổ tử ngoại khả kiến (trong dung môi MeOH), đo phổ hồng ngoại (trong KBr); đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (H1 NMR, C13 NMR, DEPT) và 2 chiều (COSY, HMBC, HSQC), đo phổ khối lượng (MS) [3]

2.3.3 Phương pháp định tính, định lượng stipuleanosid R2 trong SVD bằng

HPLC

Phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng hệ thống Agilent 1260 Series Infinity của Agilent Technologies, Hoa Kỳ với detector DAD và bộ phận bơm mẫu tự động

 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Tham khảo một số tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm, tiến hành khảo sát về bước sóng, thành phần pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, thể tích bơm mẫu và lựa chọn điều kiện sắc ký để đảm bảo điều kiện phân tích định tính, định lượng thành phần stipuleanosid R2 trong thân rễ SVD

 Nhận dạng các pic trên sắc ký đồ của chất stipuleanosid R2 phân lập được từ

thân rễ SVD

Tiến hành sắc ký HPLC mẫu chất phân lập và mẫu cao BuOH theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn Nhận dạng pic trên SKĐ của chất phân lập được dựa vào thời gian lưu tương ứng trên SKĐ mẫu thử và xác định hàm lượng hợp chất stipuleanosid R2 của dược liệu dựa vào tương quan diện tích pic trên SKĐ

Định dạng
Số trang	45
Dung lượng	1,69 MB