Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lăn IIHà Nội - 2015 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA PHỤ GIA TH ựC PHẨM: AMARANTH, TARTRAZINE VÀ MONOSODIUM GLUTAMATE TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEK293 Pham
Trang 1Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lăn II
Hà Nội - 2015
ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA PHỤ GIA TH ựC PHẨM: AMARANTH, TARTRAZINE
VÀ MONOSODIUM GLUTAMATE TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEK293
Pham T hiH òe \ Hoàng Thị Mỹ Hạnh \ Bùi Thị Vân Khánh ỉ
Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Lai Thành ỉ
' Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
TÓM TẮT
Phụ gia thực phẩm là nhóm chất thông dụng và ngày càng được sử dụng phổ biến, dễ
dàng tiếp xúc với con người Mô hình in vìíro sử dụng dòng tế bào để xác định độc tính các
hóa chất là mô hình hiệu quả và đang được áp dụng rộng rãi Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá độc tính của 3 chất phụ gia đang được cho phép sử dụng là amaranth (E123), tartrazine (E102) và monosodium glutamate (E621) lên dòng tế bào thận phôi người HEK293, đồng thời tiến hành so sánh độc tính của các chất này với íormaldehyde (E240) - chất bảo quản đã bị cấm sử dụng Chúng tôi đã xây dựng được đường cong đáp ứng liều và xác định được giá trị IC50 của E123, E102, E621, E240 lần lượt là 0,38 mg/ml; 3,58 mg/ml; 0,78 mg/ml; 0,63.10'^ mg/ml Các giá trị IC50 cho thấy các chất phụ gia tuy ít độc hơn nhiều
so với formaldehyde nhưng vẫn có ảnh hưởng nhất định đến tế bào HEK293 trong đó độc tính của E 123 là cao nhất
Từ khóa; phụ gia thực phẩm, độc tính, HEK293, tế bào.
EVALUATION OF TOXICITY OF FOOD ADDITIVES: AMARANTH,
TARTRAZINE, MONOSODIUM GLUTAMATE ON HEK293 CELL LINE SUMMARY
Food additives are widely used in day life and easily penetrate into body In this study,
we applied the cell-based toxicity test, the common essay used in in vitro toxicology, to
evaluate the toxicity o f three food additives that consist o f amaranth (E123), tartrazine (E102), monosodium glutamate (E621), on human embryonic kidney cell line - HEK293 and compare
preservative IC50 values o f E123, E102, E62I, E240 are 0.38, 3.58, 0.78, 0.63x10'^ mg/ml, respectively Although there are significant gaps between the toxicity o f formaldehyde and three tested substances that clearly showed in the IC50 values; these food additives, however, still have some certain iníluences on HEK293 cell line and E123 is the strongest one
Trang 2Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi ư ẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015
Keyword: food additives, toxicity, HEK293, cells
1 ĐẶT VÁN ĐÈ
Cùng vód sự phát triển của công nghiệp hóa chất và công nghiệp thực phẩm là sự gia tăng nhanh chóng về số lượng cũng như chủng loại của các chất phụ gia thực phẩm, ủ y ban phụ gia thực phẩm JECFA (Joint PAOAVHO Expert Committee on Food Additives) ước tính
có hơn 1500 loại phụ gia thực phẩm Bên cạnh nhíĩng lợi ích, phụ gia thực phẩm cũng tiềm ẩn những nguy cơ gây hại cho sức khỏe con người Sử dụng quá liều sẽ gây ngộ độc cấp tính hoặc ngộ độc mãn tính nếu sử dụng với một lượng nhỏ thưòmg xuyên liên tục và lâu dài Một
số phụ gia thực phẩm sẽ tích lũy trong cơ thể gây tổn thương vĩnh viễn Cũng như có nguy cơ hình thành khối u, ung thư, đột biến gen, gây quái thai [5, 6]
Một trong những mô hình được sử dụng rộng rãi để đánh giá độc tính của các chất là
mô hình thử độc in vitro Mô hình này phù hợp cho các thí nghiệm kiểm tra trên số lượng lớn
các hóa chất trong thời gian ngắn Do đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu dựa trên mô hình này nhằm đánh giá độc tính của 3 chất phụ gia thực phẩm amaranth (E123), tartrazine (E102), monosodium glutamate (E621) trên dòng tế bào thận phôi người (Human embryonic kidney 293-HEK293); đồng thời so sánh độc tính của nhóm 3 chất này với formaldehyde (E240) - chất bảo quản đã bị cấm sử dụng
2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Dòng tế bào thận phôi người HEK293
HEK293 được sử dụng như một mô hình nghiên cứu hiệu quả về sinh học tế bào nói
chung cũng như thử độc in vitro nói riêng [1, 7] Bởi vì, đây là dòng tế bào người đã được
thương mại hóa với những ưu điểm: có thời gian tăng sinh ngắn, tốc độ tăng sinh nhanh và dễ nuôi cấy Bên cạnh đó, HEK293 còn được dùng trong sản xuất các vector virus, vắc - xin và protein tái tổ hợp [3]
Tế bào HEK293 được cung cấp bởi Nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm - Bộ môn Sinh học Tế bào - Khoa Sinh học - Trưòng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia
Hà Nội
2.1.2 Các chất phụ gia thực phẩm: Amaranth (£123), Tartrazine (E102), Monosodium Glutamate (E621)
E123, E102, E621 là nhóm các chất phụ gia đang được sử dụng phổ biến trong đó E 123
và E 102 là chất tạo màu, E621 là chất điều vị
Trang 3Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015
Pormaldehyde (E240) - chất bảo quản đã bị cấm sử dụng được dùng làm chất so sánh độc tính với nhóm chất trên
Các hóa chất thử nghiệm được cung cấp bởi hãng Sigma
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nuôi cấy tế bào HEK293
Tế bào HEK293 được nuôi frong môi trường Opti-MEM® (Gibco) có bổ sung 5% (v/v) FBS (Gibco), lOOU/ml Penicillin (Gibco), lOO^g/ml Streptomycin (Gibco) ở điều kiện độ ẩm
90%, 5% C 0 2 ,3 T C Hình thái tế bào được kiểm tra bằng kính hiển vi soi ngược.
2.2.2 Phutrag pháp đánh giá độc tính
Tế bào được phơi nhiễm với các hóa chất thử nghiệm có dải nồng độ như bảng 1 Mỗi nồng độ được lặp lại ba lần, trong đó formaldehyde được sử dụng làm chất so sánh Sau 48 giờ phơi nhiễm, đáp ứng của tế bào với chất thử được đánh giá thông qua phương pháp ATP Bioluminescence Phương pháp này dựa ữên phản ứng biến đổi luciferin thành oxyluciferin xúc tác bời enzyme luciferase với sự có mặt của ion và ATP cho ra tín hiệu huỳnh quang [4] Cường độ của tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với số tế bào có khả năng thực hiện chức năng [2] Mật độ quang học của dung dịch ừong giếng được đo bàng thiết bị đo tín hiệu huỳnh quang đa năng ở bước sóng 500 nm
Bảng 2.1 Dải nồng độ các hóa chất thử nghiệm Tên hóa
chất
Đơn
vị
Dải nồng độ
2.2.3 Phân tích thống kê
Dữ liệu được phân tích và xử lý bằng phần mềm GraphPad Prism 5, từ đó tính được giá trị nồng độ hóa chất gây ức chế 50% tổng số tế bào (IC50)
3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Sau 48 giờ phơi nhiễm với hóa chất, hình thái tế bào HEK293 được kiểm tra bằng kính hiển vi soi ngược Các chất thừ làm tế bào co lại, thay đổi hình dạng đặc trưng, làm giảm khả năng bám dính và dẫn đến suy giảm khả năng sống của tể bào (Hình 3.1)
Trang 4Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội-2015
Te bào HEK bình thường có hình dạng đặc trưng là hình thoi dài và dẹt Hình thái này vẫn được bảo toàn khi phơi nhiễm tế bào với các hóa chất ờ nồng độ thấp như E123 0,05 mg/ml; E102 Img/ml; E621 0,1 mg/ml xế bào bắt đầu mất hình dạng đặc trưng, có hiện tượng bị co lại và hiện tượng này gia tăng khi nồng độ của các hóa chất tăng dần Thậm chí, khi tế bào bị phơi nhiễm với hóa chất ở các nồng độ cao (E123 20mg/ml, E102 75 mg/ml, E621 15 mg/ral) còn quan sát được các mành xác tế bào trong các giếng
Hình 3.1 Hình thái tế bào sau 48 giờ phơi nhiễm với E621
Hình thái tế bào cỏ sự thay đổi rõ ràng theo chiều tăng của các nồng độ (mg/ml): 0 (A), 0,1 (B) 0,25 (C) 0,5 (D), 1 (E), 2,5 (F) ,5(G), 7,5(H) 15(1).
(—> Tế bào bị co lại Mảnh xác tế bào)
Để đánh giá sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào, chúng tôi sử dụng phương pháp ATP Bioluminescence Giá trị mật độ quang học thu được ờ bước sóng 500 mu được xử lý bằng phần mềm GraphPad Prism 5 Từ đó, chúng tôi xây dựng được đường cong đáp ứng liều
Trang 5Hội nghị Khoa học công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội-2015
của tế bào HEK293 sau 48 giờ phơi nhiễm (Hình 3.2) và tính toán được chỉ số IC50 của tìmg loại hoá chất (Bảng 3.1)
m
Hình 2 Đường cong đáp ứng liều của tế bào với từng hóa chất sau 48 phơi nhiễnt
Đồ thị đường cong đáp ứng liều biểu diễn mối tương quan giữa phần trăm tăng sinh của tế bào so với đối chứng (A%) và nồng độ của hóa chất thử Kết quả cho thấy sức sóng hay khả năng tăng sinh của tế bào HEK293 giảm dần khi nồng độ của hóa chất tăng dần
Từ những kết quả trên phương trình đường cong đáp ứng liều, chúng tôi xác định được giá trị IC50 là giá trị mà tại đó nồng độ hóa chất gây ức chế 50% tổng số tế bào Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1
Bảng 3.1 Giá trị IC50 của các hóa chất thử nghiệm trên dòng tế bào HEK293
Trang 6Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015
So sánh các giá trị IC50 tính toán được nhận thấy giá trị IC50 của E123 thấp nhất nên đây là chất có độc tính cao nhất trong nhóm 3 chất phụ gia thực phẩm Tuy nhiên, giá trị IC50 của E240 lại thấp hơn hàng nghìn lần chứng tỏ độc tính của E240 cao gấp hàng nghìn lần so vớiE123,E102 và E621
4 KÉT LUẬN
Bằng việc sử dụng mô hình in vitro trên đối tượng cụ thể là dòng tế bào HEK293
chúng tôi đã đánh giá được độc tính của nhóm các chất phụ gia thực phẩm E123, E102 và E621 Những chất này tuy ít độc hơn E240 nhimg cũng gây những ảnh hưởng nhất định lên tế bào trong đó E 123 là mạnh nhất Kết quả của nghiên cứu này đã bước đầu chứng minh được những nguy cơ tiềm ẩn của các chất phụ gia đối với sức khỏe con người
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được thực hiện bằng kinh phí tìr ĐHQGHN trong đề tài mã số QG13.11 Xin chân thành cảm cm nhóm nghiên cứu Ung thư thực nghiệm - Bộ môn Sinh học
Tế bào - Khoa Sinh học, trường ĐH KHTN, ĐHQGHN và Phòng thí ngiệm ừọng điểm Enzyme - Protein, ĐH KHTN, ĐHQGHN đã hỗ trợ trong quá trình thực hiện nghiên cứu này
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Lưu Hàn Ly, Đỗ Thị Vui, Nguyễn Lai Thành (2014), “Đánh giá độc tính của một số dung
môi và phụ gia thực phẩm trên dòng tế bào HEK293”, Tạp Chí Khoa học, ĐHQGHN.
2 Crouch, s., Kozlowski R., Slater K., and Pletcher J (1993), “The use of ATP bioluminescence as a measure o f cell proliferation and cytotoxicity”, dournal o f
immmological methods, 160 (1), pp 81-88.
3 Cui, D., Tian F., Ozkan C.S., Wang M., and Gao H (2005), “Effect o f single wall carbon
nanotubes on human HEK293 cells”, Toxicology letters, 155 (1), pp 73-85.
4 Hannah, R., Beck M., Moravec R., and Riss T (2001), “CellTiter-Glo™ Luminescent cell
viability assay: a sensitive and rapid method for determining cell viability”, Promega Cell Notes, 2, pp 11-13.
5 Tilson, H.A., laspers R., Komet L., and Van Ree J (1998), Introduction to neurobehavioral toxỉcology: Food and environment, CRC Press.
6 Tuormaa, T.E (1994), “The adverse effects o f food additives on health: a review o f the
literature with a special emphasis on childhood hyperactivity”, Journal o f Orthomolecular Medicine, 9, pp 225-225.
Trang 7Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015
7 Wirkner, K., Schweigel J., et al (2004), “Adenine nucleotides inhibit recombinant N-type calcium channels via G protein-coupled mechanisms in HEK 293 cells; involvement o f the
P2Y13 receptor-type”, British jo u m a l ofpharmacology, 141 (1), pp 141-151.