Phương pháp nghiên cứu: sử dụng các ìã thuật ADN tải tổ hợp như khuếch đại gen, tạo các đoạn ADN ỉinker, cắt - nối ADN tạo ra các vùng trình tự ADN mới, biến nạp vector vào trong tế bào
Trang 1HỆ VECTOR SEM LIKIFOREST VIRUS: NGHIÊN c ứ u PHÁT TRIỂN CÁC
VECTOR VÀ ỨNG DỤNG TRONG SINH - Y - D ư ợ c
Pham Thi Hồng Nhung* Đinh Đoàn Long*
*Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: cải biến vector SFV nhằm xây dựng hệ thống vecíor SFV biểu hiện protein người nhcmh và hiệu quả Phương pháp nghiên cứu: sử dụng các ìã thuật ADN tải tổ hợp như khuếch đại gen, tạo các đoạn ADN ỉinker, cắt - nối ADN tạo ra các vùng trình tự ADN mới, biến nạp vector vào trong tế bào E Coli khả biến, nhân dòng, sàng lọc và bảo quản các dòng vi khuẩn mang vector quan tâm Kết quả: các vector SFV được cải biến có thêm vùng trình tự giúp tăng cưởng dịch mã, mở rộng và đa dạng hỏa các vùng nhân dòng đa điểm, thêm các vùng gen mã cho FLAG-tag, HlS-tag và vị ừ-ỉ thrombỉn giúp tinh sạch và xác định protein tái tổ hợp dễ dàng hơn Két luận: hệ vector SFV cơ bản và các phiên bản cải hiển là những công cụ tiềm năng cho phép biểu hiện mạnh protein tải tổ hợp - một phần không thể thiếu của nghiên cửu sinh học phân tử, nghiên cứu thuốc, sản xuất vaccine và điểu trị bệnh bằng liệu pháp gen ngày nay.
Từ khóa: Vector Semliki Porest vừus, biểu hiện protein, ADN tái tổ hợp
SEMLIKIFOREST VIRUS VECTORS: V E C T O R DEVELOPMENT AND
APPLICATIONS IN BIOLOGY - MEDICBVE - PHARACY
SUMMARY
Objectives: improving SFV vector fo r deveỉoping fast and high-level expressỉon SFV vecíor system
o f human proteins Method: using DNA recombinant techniques such as gene amplìfication, creating the linker segment, cutting and linking the DNA, preparation and trans/ormatìon o f competent E.Coli, screening bacterial colonies andstoringsamples Resutts: modifledSFVvectors have the enhcmce sequence, expand and dtversỊỊỳ moleculco' cloning site, the sequences for puriýìcaíion and detection o f recombỉnant proteins (FLAG-tag, HlS-tag, thrombin site) Conclusion: SFV vector system yvith modựied version is the potential tool fo r recombinant protein expression which ừ an essential part o f molecular bỉology research, drug discoveìy, vaccine productỉons ơnd gene therapỉc nowadays.
Keywords: Semliki Porest virus vector, protein expression, DNA recombinant
I ĐẶT VẨN ĐÈ
Ngày nay, biểu hiện protein tái tổ hợp là một phần quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử và phát triển tìiuốc Nhu cầu biểu hiện nhanh và ở mức độ cao các gen
Trang 2nhanh chóng tăng cao khi trình tự gen người được giải mã hoàn chỉnh Nhiều hệ tìiống vector virus và không phải virus đã và đang được phát triển cho mục đích này
Semiliki Porest Virus (viết tắt là SFV) là virus có hệ gen ARN (+) thuộc họ Togaviridae, chi Alpha vừus Để phát ưiển hệ vector tìr vừus này, hệ gen của vừus được chia ứiành 2 vector: vector nhân dòng và vector hỗ ừợ Vector nhân dòng (replicon vector) gồm tìình tự gen mã hóa phức hệ RNA replicase gồm 4 protein phi cấu trúc (kí hiệu là nsPl-4) và vị ừí nhân dòng chèn gen ngoại lai Vector hỗ trợ (helper vector) được xóa bỏ phần lớn vùng gen mã cho protein phi cấu trúc, chỉ giữ lại nguyên vẹn vùng gen mã hóa cho các protein cấu trúc vỏ ứiam gia vào đóng gói virus [1]
Vector SFV có nhiều ưu
Tạo miễn dịch với hạt
mọt trong nhưng hẹ tìiong bieu độ cao vằ đổng nhất \ accine tổ hợp mức độ cao
hiện protein ữên tế bào động vật “ thuôc ^ 1« trtc nhanh và hiệu quả nhất hiện nay uvH ị
i , Liệu pháp g e n ^ - B i ể u hiện gen
[4] Hạt virus SFV tông hợp điều trị uiig tliư ^ S F V ^ tạmthòi in\4vo nhanh, 24 giờ sau khi 2 vector ^
được đông biên nạp sẽ cho 10 - à gây biỗu Wện trong nLi cắy
10" hat virus trưởng thành/ml tát biểu hiện gen Aú cấp (tể bào thần
không cần tinh sạch hay cô đặc Dải vật chủ lây nhiễm của SFV rộng cho phép chọn lựa các dạng biến đổi sau dịch mã phù hợp [2] Vector SFV có khả năng tự sao chép ARN trong tế bào chất cao nhờ RNA replicase và mức độ biểu hiện protein lên đến 25% tổng số protein tế bào Nhiều protein khác nhau như protein nhân, protein tế bào chất, protein màng và protein tiết đã được biểu hiện tìiành công sử dụng hệ vector SFV [1] Hệ vector có tính an toàn cao nhờ các yếu tố: các vector đều có nguồn gốc tìì một dòng đã được làm suy yếu khả năng gây bệnh; hệ gen virus được tách và tái cấu trúc tìiành 2 vector riêng biệt nên virus mất khả năng tái sản xuất qua mỗi chu kì tế bào; 3 đột biến ở phức protein p62 (tiền thân của protein màng E3và E2) khiến vừus chỉ nhiễm sau khi hoạt hóa bằng a- chymoưypsin Hơn thế nữu, nếu chỉ biến nạp vector nhân dòng vào tế bào động vật tìù ARN của virus cũng có thể tự nhân lên số lượng lớn ữong tế bào chất và cho phép biểu hiện tạm tìiời gen ngoại lai ở mức độ cao
Trang 3Vector SFV có nhiều ứng dụng ữong các lĩnh vực khác nhau (Hình 1) Đã có nhiều báo cáo về ứng dvmg của vector SFV ữong nghiên cứu nghiên cứu sinh học phân tử và phát triển tìiuốc, sản xuất vaccine tái tổ hợp và liệu pháp gen, đặc biệt là trong điều trị ung thư [2][4] [6] Sử dụng liệu pháp gen dùng vector SFV đã được tiến hành trên các mô hình động vật đã và có thể áp dụng ữên trên người ừong tương lai không xa
Vector SFV hiện nay không được tìiương mại hóa Chúng tôi hiện có hệ vector SFV gồm 2 vector có dạng cADN là pSFV2 và pHelper2, đây là quà tặng của TS Rod Bremner (Bệnh viện Toronto Westem - Canada) Tuy có nhiều ưu điểm nhưng hệ vector SFV này vẫn còn vị trí nhân dòng đa điểm khá hạn chế và có ứiể ứỉêm các vùng gen giúp tăng cường dịch mã và sàng lọc tìiể tái tổ hợp dễ dàng hom Chửứi vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm cải biến hệ vector SFV cơ bản, tạo ra các phiên bản vector mới
có tính khả dụng cao
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
1 V ật ỉiệu nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn E.colì DH5a dùng để biến nạp plasmỉd và nhân nhanh plasmid
(Inviữogen - Mỹ)
- Vector pSFV2 và vector pHelper2 có cấu trúc được mô tả trong hinh 2 và hình 3
^pnHBotMr SAgmirtc
c B u_6K E1 PA •K
pu
— — I 3i:SrOP ỊHomEĩlẼEKẼEdỉA Hình 2 Cấu M c pSFV2 H ình 3 c ấ u trủc pHelper2
- Các mồi PCR và các đoạn oligonucleotit tự ứũết kế và đặt tổng hợp từ hãng IDP (Mỹ)
có trình tự được trinh bày ữong bảng 1 và bảng 2
Bảng 1 Trình tự các mồi sử dụng ttong nghiên cứu
F-N TGACCTGTTATACACCTCTACG Nhân đoạn trình tự tăng cường dịch mã
năm trong vùng gen mã vỏ capsid ữên pHelper
vector cải biên sử dụng colony PCR
Trang 4Bảng 2 Trình tự các oligonucleotit sử dụng ữong nghiên cứu
O-Ml a g c g a g a t c t7 | H |h | | | P H Ỉ V H H H P H 1
HBCACCACCATCÀTCACeACCATCÀCCATC
ACAGC AGCGGCCTGG r 1CCGCGTGGGTCTGGA
TCCTA
Tạo linker chứa ưình tự của H H i
H HIS4aB vi trí Thrombm leoi là
GCATCCTAGGGCCCGGGCGC
Tạo ra ỉinker chứa vùng nhân dòng đa điểm cải tiến 0-M 7
2 Phương pháp nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành xây dựng 2 vector cải biến là pSMP 2.1 và pSMP 2.2 tìr vector pSFV2 Nghiên cứu gồm các ứú nghiệm được tiến tìiành ứieo sơ đồ ở hình 4
Hình 4 Sơ đồ nghiên cứu tạo vector cải tiến pSMP 2.1 và pSMP 2.2
III KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u
Kêt quả giải trình tự từ khuẩn lạc được biến nạp vector cải biến pSMP 2.1 và khuẩn lạc được biến nạp vector cải biến pSMP 2.2 qua sàng lọc nhanh bằng colony PCR được ứỉnh bày trong hình 5 đến hình 8
p r o r a o t a r
Hình 5 Cấu trúc vector pSMP cải biến
Trang 5ị \ T 0 | ; A T Ĩ A C A T O C C T A C O c a A C G Ĩ T T T A C O O C C O C C C O T O Q C G C C C Q C O C C C G O C O O C C C O T C C C T C G C C 0 T T C C A 0 0 C C \ C T C C 0 a T O O C T C C C
0 T C G T C C C C O A C T T C C A O O C C C A O C A O A T O C AO C A A c T C A T C A O C O C C Q T AA A T 0 c o c T G A C AA T G A O A C A O A A C O C A A T T G C T c C T o c Ĩ A O 0 c c T c c c
Hình 6 Trình tự đoạn gen mã vỏ capsid giúp tăng cường dịch mã được gắn vào pSMP
_ 120 ^ ^ _ 1 3 0 _ ^ Ỉ40 _ ^150 1 « _ 170 _ _ _ l * 0 _ 1 »
I T G A C T A C A A G G Ã C G A C G A T G A C A A G C A C C A C C A T c A T C A c C A c c A T C A C C A T C A C A G C A G C G G C C T G G T T C C G C G T G G G
W\
SVặầmkầlầếc
T C T G G A T C C G C T Á A G C G C G C T T C G A A T C G A T G C A T C C T A G G G C C C G G G T A A T T A A T T G A A T T A C A T C c c T A c G c A A A c G T '
Hỉnh 7 Ket qua gíầi tnnĩh đoĩạn cải tiến trong vector pSMP2!l
WỈM4
r T GA C Ĩ Ã c A G G A C GA c G A T GA CAA G C A C C V C C A T C A T C A C C A C C A T C A C C A T C A C Ả G C A G C G G C C I G G T T C C G C G T G G G T
Ẻ
ềhặk^hkĩầét
200 _ 210 _ _ _220 _ 2M _ _ _ 2 5 0 _ _ 260
E G A T c c G C T A A G C G C G C T T C G A A T C G A ĩ G C A T C C T A G G G C C C G Q G T \ A T T A A T T GA A T T A CA T c c c T A c G C A A
Hình 8 Kết quả giải trình đoạn cải tiến ữong vector pSMP 2.2
IV BÀN LUẬN
Vector cải tiến có vùng nhân dòng đa điểm với 10 vị ứí nhận biết của enzyme cắt Các vị trí nhân dòng đa điểm mới đảm bảo không có ừong trình tự gốc của vector và được chọn mã cho những enzyme cắt tạo được đầu tương ứúch với nhiều enzyme cắt khác Cải biến này giúp việc cắt và chèn gen ngoại lai vào vector nhân đòng có nhiều lựa chọn, hiệu quả tạo ADN tái tổ hợp tăng cao
Vector pSMP 2.2 được thiết kế khác pSMP 2.1 là có tìiêm 5 nucleotit ứước vùng nhân dòng đa điểm làm khung đọc mở của gen ngoại lai sẽ lệch đi khi được cài vào 2 vector cải biến Điểm khác biệt này cho chúng ta có dạng vector biểu hiện tái tổ hợp để lựa chọn vector biểu hiện được protein mong muốn
Hai đoạn ưình tự mã cho 2 đoạn peptit rất ngán (còn gọi là đuôi ái lực) FLAG-tag
và HlS-tag sẽ liên hợp với protein tái tổ hợp giúp tinh sạch và ứiu hồi protein tái tổ hợp
Trang 6Hai đuôi ái lực này có đặc điểm chung là: không gây đáp ứng miễn dịch; được tinh sạch đom giản và chính xác bằng một bước sử dụng cột lọc có chất gắn thích hợp; có ảnh hưởng tối thiểu lên cấu ứúc và hoạt động sinh học của protein tái tổ hợp mà nó gắn vào Hai đuôi
ái lực frên có ứiể loại bỏ dễ dàng và đặc hiệu để sản xuất các protein dạng nguyên gốc khi cắt bỏ chúng tại vị ứí thrombin
Nhiều nghiên cứu cho ứiấy khi thêm vùng tăng cường dịch mã nằm ờ gen mã hóa
vỏ capsid vào các vector biểu hiện, không những không làm giảm tốc độ phiên mã mARN
mà còn tăng cường khả năng dịch mã lên 10 đến 100 lần Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy ứên SFV có 102 nucleotit đầu tiên mã hóa cho protein vỏ capsid cũng có khả năng tăng cường dịch mã cho những gen xuôi chiều và cùng nằm ứong khung đọc mở với đoạn trình tự này [3] Thêm đoạn trình tự mã hóa cho vỏ capsid SFV vào trước vị ừí nhân dòng có thể biểu hiện protein hàm lượng cao như một protein liên hợp với protein vỏ capsid
Mặc dù có nhiều dạng protein có thể được biểu hiện nhờ sử dụng vector SFV nhưng bước đầu ứng dụng hệ vector SFV, chúng tôi định hướng sử dụng hệ vector này nhằm biểu hiện các tíiụ ứiể kết cặp G protein (GPCR) GPCR là đích tác động chính của hom 50% các loại dược phẩm đang được sử dụng ữong điều trị Hom 100 GPCR tái tổ hợp
đâ được biểu hiện hiệu quả ữong tế bào động vật sử dụng vector SFV, chúng đầy đủ hoạt tính như dạng kiểu dại với lượng lớn và không bị lẫn các dạng phụ như GPCR tự nhiên [5] GPCR có thể được sử dụng để kiểm tra ái lực tương tác và sự tác động tới tế bào của các hợp chất có hoạt tính sinh học có khả năng phát triển ứiành thuốc mới, qua đó phục vụ các nghiên cứu dược lý học, sàng lọc và phát triển dược phẩm ở cấp độ phân tò và tế bào
Nghiên cứu các dòng tể bào nhiễm SFV chỉ ra: vùng gen mã hóa cho protein phi cấu trúc của SFV cần cho sự cảm ứng chết tìieo chưcmg trình (apoptosis) Cảm ứng chết theo chương trình bởi SFV không phụ ứiuộc p53, do đó không gây ứiương tổn cho ADN tế bào Theo nghiên cứu của Angel A và cộng sự năm 2005, tiêm ARN SFV-LacZ cũng kéo dài sự sống của chuột BALB/c bị ung thư Chuyển gen interlenkin-12 (IL12) chuột nhờ vector SFV cho thấy có thể gây suy thoái và ức chế khối u B16 ứiông qua việc ức chế hình thành mạch máu quanh khối u ứong nghiên cứu của Asselin-Paturel và cộng sự năm 1999 Không có dấu hiệu bị đầu độc ở chuột đã xử lý SPV-IL12 và hiệu quả chống khối u có tìiể được tăng cường bằng việc cách tiêm nhắc lại hạt SFV tái tổ hợp Vector SFV có mức độ biểu hiện cao và có khả năng gây dừng quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ cũng như
Trang 7kích hoạt chết theo chương trình của tế bào chủ có thể được nhắm đến sử dụng ữong liệu pháp gen để điều trị ung thư
Vector SFV có thể dùng để nghiên cứu để biểu hiện protein kháng nguyên tìr nguồn gen của vi sinh vật gây bệnh, loại trừ được khả năng có mặt của đối tượng này trong cơ thể
và kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với các loại kháng nguyên ngoại lai Sự sao chép ARN của vector SFV diễn ra ở tế bào chất, không có nguy cơ dung hợp gen của virus vào nhiễm sắc ứiể tế bào chủ Nhiểu nghiên cứu cho tíiấy, nhiều người và động vật không có miễn dịch tiền nhiễm chống lại vector SFV Khả năng gây chết ứieo chưomg ưình do nhiễm virus giúp hệ gen của virus không tồn tại dai dẳng ữong các mô và giải phóng các protein kháng nguyên mã hóa tìr gen ngoại lai Một lợi ứiế nữalà SFV có phạm vi vật chủ rộng, xâm nhiễm nhiều loại tế bào Khỉ Pigtail được tiêm chủng với hạt SFV tái tổ hợp biểu hiện
gpl60 của virut suy giảm miễn dịch ở khỉ (srv) có đáp ứng miễn dịch bảo vệ khỏi căn
bệnh này (Mossman s.p và cs, 1996) Vector SFV (dạng ARN hoặc ADN) và hạt SFV tái
tổ hợp được ứng dụng để tạo ra các kháng nguyên đơn dòng chống lại các protein prion
Krasemann s và cs, 1999) Các vector SFV được coi là một công cụ vector dẫn truyền gen
lý tưởng ứng dụng ữong sản xuất vaccine cho người và động vật
V KẾT LUẬN
Từ kết quả giải trình tự cho ứiấy chúng tôi đã tạo tìiành công hai vector cải biến pSMP 2.1 và pSMP 2.2 Hệ vector cải biến được cài thêm vùng tăng cường dịch mã, các đuôi tag hỗ trợ quá trình tinh sạch thu hồi protein tái tổ hợp, vị trí nhân dòng đa điểm được
mở rộng thuận tiện cho việc chèn gen ngoại lai Cùng với vector pSFV2 và pHelper, hệ vector cải biến pSMP sẽ là công cụ sinh học có nhiều tiềm năng ứng dụng trong các nghiên cứu sinh - y - dược
LỜI CẢM ƠN
Chúng tôi xin cảm om TS Rod Bremner (Bệnh viện Toronto Westem - Canada) vì
đã tặng hai vector pSFV2 và pHelper2
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 LiỊjestrổm, p and Garoff, H (1991) A new generation o f animal cell expression vectors based on the Semliki Porest virus replicon B/o/Tec/ino/ogv 9: 1356-1361
2 Lundstì-om, K (1999) Alphavirus vectors as tools in neurobiology and gene tìierapy
Receptor & Signal Transd Res 19: 673-686.
3 Limdsứom K (2003), “Semliki Porest virus vectors for rapid and high-level
expression o f integral membrane proteins”, Bỉochỉm Biophys Acta., 1610, pp 90-96.
Trang 84 Lundstrom, K and Chiu, M.L (2006), G Proteữi - Coupled receptors in Drug Discovery, Taylor & Prancis Group
5 Sjoberg M., Suomalainen M, and Garoíf H (1994)), “A signiíicantly improved Semliki Porest vừus expression system based on ữanslation enhancer segments from
tìie viral capsid gene”, Biotechnoỉogy, 12, pp 1127-1131.
6 Zhou X., Berglund p., Rhodes G., Parker S.E., londal M., and LiỊjesừốm p (1994),
“Selí-replicating Semliki Porest vừus RNA as a recombinant vaccine”, Vaccine, 12,
pp 1510-1513