Bài tiểu luận PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ REALTIME PCR

Bệnh giả dại hay còn gọi là bệnh Aujeszky (Aujeszky’s disease) do virus thuộc nhóm herpes gây ra, tấn công vào hệ thần kinh trung ương và các cơ quan khác như hệ hô hấp, sinh sản của heo. Heo là ký chủ tự nhiên chủ yếu nhưng virus cũng có thể lây nhiễm cho chó, mèo và trâu bò gây ra các triệu chứng thần kinh trầm trọng và chết. Virus bệnh giả dại có thể ẩn náu lặng lẽ lâu dài bên trong tế bào thần kinh của heo và từng lúc kích hoạt gây bệnh cho heo.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài tiểu luận

PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ

REAL-TIME PCR.

Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Ngọc Hải

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phương Thảo

Mã số sinh viên: 06126139

– 2.2 Nested PCR phát hiện DNA PrV

– 2.3 Real-time PCR định lượng DNA PrV

– 2.4 Kết quả

I Đặt vấn đề

• Bệnh Aujeszky ảnh hưởng trực tiếp đến thành tích

sinh sản và tăng trưởng của heo

• Một số trường hợp ELISA dễ bỏ sót và phân biệt

sai

• Cấy chuyển và tiêm truyền (explantation and

cocultivation) tốn nhiều thời gian và độ nhạy không cao

I Đặt vấn đề

• Nested PCR và real-time PCR đã xác định tần số

thực tế và số lượng của sự lây nhiễm PrV nâng

cao cả độ nhạy và độ chính xác (McFarlane và

ctv, 1986; Lokensgard và ctv, 1991)

 Áp dụng 2 kỹ thuật này trong việc phát hiện virus PrV tiềm ẩn trong heo ở Việt Nam

II Nội dung

Hình 2.1 Diagram showing the virion structure,

its different proteins (with the new nomenclature)

• Không thấy bệnh lây

trên người Hình 2.2 Structure of the DNA of the Aujeszky´s

virus.The genes of the proteins gE and gI are located in the Us fragment

www.sanidadanimal.info/ /images/9virus.gif

Hình 2.3 Dead pigs (and a cat), a result of

pseudorabies

www.thepigsite.com/pighealth/contents/aujesky

Hình 2.4 Lesions on nose of piglet

www.thepigsite.com/pighealth/contents/aujesky

2 Phát hiện và định lượng DNA của PrV

2.2 Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrV

• Thành phần phản ứng (25 µl):

– 10 µl (500 ng) của DNA bộ gene

– 2.5 µM của mỗi primer

– 1.5 mM MgCl 2

– 0.05 U Taq Polymerase (Promega, USA)

– 0.2 mM dNTP

– 1X buffer

system 9600 (Perkin-Elmer, USA)

2.2 Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrV

2.2 Phản ứng Nested PCR phát hiện DNA PrV

• Giai đoạn 2:

• Sử dụng 5 µl của sản phẩm PCR đầu tiên.

• Dưới những điều kiện giống nhau

Bảng 3 Trình tự của các cặp primer sử dụng trong nested PCR

• Những sản phẩm chuyên biệt của nested PCR

được kiểm tra qua kỹ thuật cắt phân đoạn đa

hình (RFLP)

• sản phẩm được cắt với enzyme giới hạn HaeIII

• Điện di trên gel 1.85% agarose

2.2 Phản ứng nested PCR phát hiện DNA PrV

2.3 Real-time PCR định lượng DNA PrV.

• Định lượng DNA PrV đặc hiệu cho gene gB và

gE

máy dò huỳnh quang Real-Time Fluorescence Detection (USA)

• Dữ liệu được phân tích bằng cách dùng phần

mềm Ver 2.03 Supports Optical Monitor™

Primer và mẫu dò

+ forward primer là 5’-ACGGCACGGGCGTGATC-3’,

+ reverse primer là 5’-ACTCGCGGTCCTCCAG CA-3’

(Balasch và ctv., 1998a)

+Mẫu dò TaqMan, 5’-CTCG-GCGACCTCATCGAGCCCTGCAC-3’

+forward primer, 5’-TCGTGATGACGTGCG-TCGTCG-3’,

reverse primer, 5’-CGCGGAACCA-GTCGTCGAAGC-3’,

(McCaw và ctv., 1997)

Mẫu dò TaqMan là 3’

5’-CTACGAGGGGCCG-ACGCGAGCCTGGA-* Hỗn hợp phản ứng (25 µl):

• 5 µl (500 ng) của DNA bộ gene

• 12,5 µl của hỗn hợp pha sẵn TaqMan PCR 2X

• 2,5 µl của 900 nM dung dịch của mỗi primer

• 2,5 µl của 250 nM mẫu dò đã đánh dấu huỳnh

2.4 Kết quả

2.4.1 Nested PCR trong phát hiện PrV

• Nested PCR đã phát hiện được DNA của PrV

• Nhiều sản phẩm nested PCR cắt thì phù hợp với nhiều kết

quả mong đợi

• Sản phẩm khuếch đại của gene đích qua nested PCR cũng

được phát hiện sau tạo dòng.

Hình 2.5 Sản phẩm khuếch đại của nested PCR được tạo ra từ ba gene (gB,

• Nested PCR đã xác định cho các gene gB, gE, và gG

của PrV

2.4.2 Real-time PCR định lượng DNA của PrV

• Số lượng DNA PrV tiềm ẩn chọn lọc từ những mô thần

kinh đã được đánh giá qua kỹ thuật real-time PCR

• Với gene gB và gE của PrV tạo ra số lượng bản copy

của DNA PrV tiềm ẩn trong khoảng 10 0.1 và 10 7.2

(1-1.58×107) copy qua 1 µg của DNA bộ gene.

Hình 2.6 Sự định lượng DNA PrV tiềm ẩn trong mô

• Real-time PCR từ gene gE PrV cho màu thuốc nhuộm

huỳnh quang trên các cấp độ ngưỡng

• Tần số thực tế cao ở những gene gB (100% cho BS,

92% cho OB, và 85% cho TG).

• Một số lượng nhỏ những mẫu OB (67%) và TG

(74%) của gene gE được kiểm tra dương tính trong

real-time PCR.

Đa số heo lớn lên ở những nông trại Hàn Quốc thì lây

2.4.2 Real-time PCR định lượng DNA của PrV

III Kết luận

• Trong nghiên cứu này, tần số thực tế và số lượng về sự lây nhiễm

của virus PrV tiềm ẩn ở mô thần kinh của heo đã được xác định qua nested PCR và Real time PCR

• Nested PCR biểu hiện kết quả dương tính ở tất cả mẫu BS, còn

gene gE hoặc gene gG cho băng dương tính ở lượng nhỏ những

mô thần kinh

• Real-time PCR cho gene gE PrV đưa ra tín hiệu huỳnh quang ở

cấp độ trên ngưỡng, bằng cách đó chỉ ra một tần số thực tế đã

được quan sát ở nested PCR

• Real-time PCR chứng tỏ rằng những cấp độ của sự lây nhiễm tiềm

ẩn PrV biến đổi đáng kể từ một con thú đến những con tiếp theo

Tài liệu tham khảo

loạn sinh sản và hô hấp (PRRSV) trên heo Luận văn tốt nghiệp.

Chae, Jeong Gon Cho and Hee Jong Song.2005 Molecular Survey of Latent Pseudorabies Virus

Infection in Nervous Tissues of Slaughtered Pigs by Nested and Real-time PCR Laboratory of

Microbiology, College of Veterinary Medicine and Bio-Safety Research Institute, Chonbuk National University, Jeonju 561-756, Republic of Korea.

Diseaenter, USDA, Agricultural Research Service, PO Box 70, AmeA 50010.

amplification of latent Aujeszky's disease virus in dexamethasone treated pigs Virology

Section, Central Animal Health Laboratory, MAF Quality Management, Upper Hutt, New Zealand.

CẢM ƠN SỰ THEO DÕI CỦA

THẦY VÀ CÁC BẠN