Phát triển quy trình phân tích các hoạt chất cordycepin, adenosin và inosin trong thực phẩm chức năng đông trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---***--- VŨ MINH TUẤN PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT CORDYCEPIN, ADENOSINE VÀ INOSINE TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

VŨ MINH TUẤN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT

CORDYCEPIN, ADENOSINE VÀ INOSINE

TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-*** -

VŨ MINH TUẤN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CÁC HOẠT CHẤT

CORDYCEPIN, ADENOSINE VÀ INOSINE

TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS PHẠM HÙNG VIỆT PGS.TS DƯƠNG HỒNG ANH

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Phạm Hùng Việt và PGS.TS Dương Hồng Anh đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thanh Đàm cùng toàn thể các anh, chị, em trong nhóm điện di mao quản thuộc trung tâm CETASD – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giúp đỡ và hỗ trợ trong quá trình thực hiện nghiên cứu này Tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) đã tài trợ cho nghiên cứu này thông qua đề tài mã số 104.04-2016.50

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích nói riêng

và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong thời gian học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Hà Nội, tháng 11 năm 2020

Học viên

Vũ Minh Tuấn

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đông trùng hạ thảo 3

1.1.1 Nguồn gốc 3

1.1.2 Nghiên cứu và phát triển 3

1.1.3 Các thành phần hóa học của Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) .6

1.1.4 Giá trị dược liệu của đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) .8

1.2 Cordycepin, Adenosine, Inosine trong Đông trùng hạ thảo 9

1.2.1 Cordycepin 9

1.2.2 Adenosine 12

1.2.3 Inosine 14

1.3 Tổng quan các phương pháp phân tích adenosine, cordycepin và inosine ……… 15

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 15

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản 19

1.3.3 Nhận xét và đề xuất phương pháp thích hợp 20

1.4 Tổng quan về phương pháp điện di mao quản 21

1.4.1 Nguyên lý tách chất và cấu tạo cơ bản của thiết bị điện di mao quản .21

1.4.2 Nguyên tắc nhận biết các chất và cấu tạo cơ bản của detector độ dẫn không tiếp xúc 23

1.4.3 Các thông số đánh giá trong điện di mao quản 24

1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất 25

1.5 Cơ sở thiết kế thí nghiệm xác định các hợp chất adenosine, cordycepin và inosine bằng phương pháp CE-C 4 D 26

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 29

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 29

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 29

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 29

2.2 Hóa chất và thiết bị 30

2.2.1 Hóa chất 30

2.2.2 Hệ thiết bị điện di mao quản 31

2.2.3 Thiết bị và dụng cụ phụ trợ 33

2.2.4 Chuẩn bị mẫu 33

2.3 Phương pháp nghiên cứu 33

2.3.1 Khảo sát điều kiện phân tích adenosine và cordycepin trên kênh 1 .34

2.3.2 Khảo sát điều kiện phân tích inosine trên kênh 2 34

2.4 Xác định các thông số đánh giá phương pháp phân tích 34

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 35 2.4.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 35

2.4.3 Độ chính xác của phương pháp 35

2.5 Áp dụng phân tích mẫu thực 37

2.6 Xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3 Kết quả và thảo luận 39

3.1 Phát triển quy trình phân tích adenosine và cordycepin trên

kênh 1 ……… 39

3.1.1 Kết quả khảo sát các BGE 39

3.1.2 Kết quả khảo sát điện thế tách 42

3.2 Phát triển quy trình phân tích inosine trên kênh 2 43

3.2.1 Khảo sát thành phần của dung dịch điện ly nền 43

3.2.2 Khảo sát pH của dung dịch điện ly nền 45

3.2.3 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm điện ly 46

3.3 Đánh giá phương pháp 49

3.3.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49

3.3.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 50

3.3.3 Độ lặp lại và độ tái lặp 53

3.3.4 Độ đúng của phương pháp 53

3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực 55

Kết luận ……….58

Tài liệu tham khảo 59

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosine, cordycepin

và inosine……….16

Bảng 3.1 Điều kiện tối ưu quy trình phân tích 49

Bảng 3.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 50

Bảng 3.3 Thông số đánh giá đường chuẩn 51

Bảng 3.4 Độ lặp lại và độ tái lặp 53

Bảng 3.5 Kết quả phân tích đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích………54

Bảng 3.6 Kết quả phân tích mẫu thực 56

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200 m trên mực nước biển tại Tây Tạng 4

Hình 1.2 Quả thể nấm C militaris trên ký chủ nhộng 5

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống điện di mao quản 21 Hình 1.4 Mô hình của đo độ dẫn không tiếp xúc và mạch điện tương đương 24 Hình 2.1 Hệ thiết bị điện di mao quản hai kênh loại xách tay 31 Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo của bộ phận dẫn lưu lỏng 2 kênh……… 32 Hình 3.1 Điện di đồ thu được khi khảo sát các BGE với thành phần acid hữu

cơ khác nhau để tách adenosine và cordycepin 39 Hình 3.2 Điện di đồ thu được khi khảo sát các BGE với thành phần acid acetic

ở các nồng độ khác nhau 40 Hình 3.3 Biểu đồ minh họa sự thay đổi về diện tích pic của Cor (PA1) và Ade (PA2) cũng như độ phân giải giữa Cor và Ade (R) thu được khi khảo sát các BGE với thành phần acid acetic ở các nồng độ khác nhau 41 Hình 3.4 Điện di đồ thu được khi khảo sát BGE với thành phần acid acetic 0,25 M trên nền mẫu thực ……….42 Hình 3.5 Điện di đồ thu được khi khảo sát ảnh hưởng của điện thế tách đối với quá trình phân tích adenosine và cordycepin với BGE acid acetic 0.25 M (pH =2.54) 43 Hình 3.6 Điện di đồ lựa chọn thành phần BGE (tại pH 9,0; 50 mM Tris) phân tích inosine 44

Hình 3.7 Điện di đồ khảo sát các pH khác nhau của dung dịch 50 mM

Tris/For phân tích inosine (20 mg/L) 46

Hình 3.8 Điện di đồ khảo sát nồng độ BGE phân tích inosine 47

Hình 3.9 Điện di đồ khảo sát nồng độ Tris trong dung dịch BGE phân tích inosine trên nền mẫu thực……… 48

Hình 3.10 Biểu đồ đường chuẩn Adenosine 52

Hình 3.11 Biểu đồ đường chuẩn Cordycepin 52

Hình 3.12 Biểu đồ đường chuẩn Inosine 52

Hình 3.13 Điện di đồ đánh giá độ đúng của phương pháp 544

Hình 3.14 Điện di đồ phân tích inosine trong mẫu thực 57

Hình 3.15 Điện di đồ phân tích adenosine và cordycepin trong mẫu thực 57

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C4D Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CHES Acid N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic

GC-MS Sắc ký khí – detector khối phổ

IDL Giới hạn phát hiện của thiết bị

IQL Giới hạn định lượng của thiết bị

Leff Chiều dài hiệu dụng của mao quản

MDL Giới hạn phát hiện của phương pháp MQL Giới hạn định lượng của phương pháp MEKC Điện di mao quản điện động học Mixen MES Acid 2-(N-morpholino) ethanesulfonic MOPS Acid 3-(N-morpholino) propanesulfonic

UV – Vis Quang phổ hấp thụ phân tử

MỞ ĐẦU

Ngày nay, nhu cầu sử dụng các thảo dược có nguồn gốc từ thiên nhiên như: đông trùng hạ thảo, nấm linh chi, nhân sâm, sâm Ngọc Linh,… để phòng và trị bệnh đã trở nên phổ biến Trong đó, đông trùng hạ thảo (ĐTHT) là một loại dược liệu tự nhiên quý hiếm, được dùng như thuốc chữa bệnh và bồi bổ cơ thể Loại thảo dược này có sự hình thành đặc biệt, là sự kết hợp giữa nấm và ấu trùng Sử dụng đúng cách đông trùng hạ thảo sẽ mang lại nhiều công dụng tốt cho sức khỏe

như có thể nuôi dưỡng phổi, thận, có tác dụng điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa,

kháng u, chống viêm [45] Nhu cầu thị trường đối với đông trùng hạ thảo dùng làm thuốc, thực phẩm hoặc thuốc bổ là rất lớn, đặc biệt là ở Trung Quốc và Việt Nam Số lượng đông trùng hạ thảo ngoài thiên nhiên rất hạn chế do vòng đời phức tạp, ký sinh bắt buộc và môi trường sống nghiêm ngặt, thêm vào sự khai thác quá mức đã làm sụt giảm trầm trọng khiến dược liệu này đắt hơn vàng, thậm chí có giá lên tới 100000 USD/kg [29] Do giá cao và số lượng đông trùng hạ thảo mọc trong

tự nhiên gần như cạn kiệt, chúng ngày càng được nuôi cấy nhiều hơn Đồng thời, rất nhiều hàng giả, hàng kém chất lượng đã được đưa vào thị trường và rất khó nhận biết dựa trên hình thái của chúng Cho đến nay, các nucleoside ở dược liệu

tự nhiên đem lại nhiều tác dụng quý cho con người, được công nhận là các thành phần hoạt tính sinh học chính và được sử dụng làm chất đánh dấu hóa học chính

để kiểm tra chất lượng của đông trùng hạ thảo [26] Trong số các nucleoside này, cordycepin (Cor, 3’-deoxyAdenosine), adenosine (Ade) và inosine (Ino) là các thành phần quan trọng nhất, có thể được sử dụng làm chỉ số để đánh giá chất lượng, đảm bảo tính xác thực của ĐTHT cũng như thực phẩm chức năng có thành phần ĐTHT [5] Do đó, việc thiết lập một phương pháp kiểm soát chất lượng adenosine, cordycepin và inosine nhanh, nhạy và đáng tin cậy là rất quan trọng để phát triển

và sử dụng dược liệu đông trùng hạ thảo

Các phương pháp phân tích để xác định nucleoside trong đông trùng hạ thảo

và các sản phẩm từ đông trùng hạ thảo chủ yếu dựa trên sắc ký lỏng hiệu năng cao

cũng là phương pháp thường xuyên được sử dụng để kiểm soát chất lượng sản phẩm này tại Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Tuy nhiên, chi phí cao cho việc thiết lập công cụ, bảo trì và phân tích mẫu khiến việc sử dụng

nó để sàng lọc và phân tích nhanh các nucleoside trong kiểm soát chất lượng đông trùng hạ thảo không phù hợp với nhiều trung tâm phân tích địa phương với chuyên môn hạn chế và nguồn tài chính khiêm tốn Với khả năng phân tích nhanh, hiệu quả và sử dụng ít dung môi hóa chất, điện di mao quản (CE) có thể được coi là một giải pháp thích hợp thay thế cho HPLC Việc sử dụng các kỹ thuật CE để tách nucleoside trong đông trùng hạ thảo đã được thực hiện, sử dụng các thiết bị CE thương mại kết hợp với detector khối phổ (MS) hoặc tử ngoại (UV) [13, 26, 35, 52] Việc sử dụng kết hợp giữa thiết bị CE tự chế tạo loại xách tay và detector đo

độ dẫn không tiếp xúc (C4D) có thể là giải pháp hợp lý khi CE-C4D có yêu cầu chi phí đầu tư và vật tư tiêu hao không cao cũng như tương đối đơn giản trong vận hành Bởi vậy, với ý tưởng phát triển phương pháp điện di mao quản trong phân

tích các nucleoside trong đông trùng hạ thảo, đề tài luận văn “Phát triển quy trình phân tích các hoạt chất Cordycepin, Adenosine và Inosine trong thực phẩm chức năng Đông trùng hạ thảo bằng phương pháp điện di mao quản” đã được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đông trùng hạ thảo

1.1.1 Nguồn gốc

Đông trùng hạ thảo được hình thành khi ấu trùng các loài bướm thuộc chi

Thitarodes bị nấm thuộc chi Ophiocordyceps và/hoặc Cordyceps ký sinh [42] Thường gặp nhất là sâu non của loài Thitarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus Ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng có thể

bị Ophiocordyceps sinensis ký sinh Các loài nấm này phân bố rộng ở châu Á và

châu Úc với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á, đó là các vùng cao nguyên cao hơn mặt biển từ 4000 đến 5000m như: Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc, Vân Nam

Vào mùa đông, nấm bắt đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì ăn hết chất dinh dưỡng của chúng Những con sâu này có thể đã ăn phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể sâu Đến một giai đoạn nhất định thường là vào mùa hè ấm áp, nấm bắt đầu mọc ra khỏi sâu như một ngọn cỏ và vươn lên khỏi mặt đất phát triển thành dạng cây (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử Hiện nay nhiều loài nấm thuộc chi Ophiocordyceps và Cordyceps được nuôi trồng trên quy mô công nghiệp

để tinh chế các cơ chất có dược tính

1.1.2 Nghiên cứu và phát triển

Nấm dược liệu từ lâu đã là một phần quan trọng của văn hóa và nền văn

minh nhân loại, đăc biệt các loài trong giống Cordyceps được đánh giá cao do chứa

nhiều hợp chất dược liệu [31] Hiện nay, có khoảng 680 loài nấm thuộc chi

Cordyceps [16] Hai loài nấm đông trùng hạ thảo được sử dụng lâu đời trong y học

cổ truyền Trung Quốc là Cordyceps sinensis (tên khác: Ophiocordyceps sinensis)

và Cordyceps militaris, hiện nay đang được nghiên cứu rất nhiều về chiết xuất và

Nấm đông trùng hạ thảo Ophiocordyceps sinensis (hay còn gọi là Cordyceps sinensis) là một loại nấm dược liệu có phân bố rất hạn chế trong tự

nhiên, chủ yếu ở các vùng núi cao thuộc dãy núi Hymalaya có độ cao trên 4000 m

so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc) (Hình 1.1), một số vùng Nepan và Butan; chỉ được nuôi trồng trong điều kiện hoang dã, loài nấm này hiện tại vẫn chưa được nuôi trồng thành công trong môi trường nhân tạo, do đó sản lượng nấm thu được không đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường [27,40, 55]

Hình 1.1 Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200 m trên mực

nước biển tại Tây Tạng (Daniel Winkler, 2010) Loài đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (thường được gọi nấm cam sâu

bướm), chứa các hợp chất hóa học tương tự như của O sinensis, được tìm thấy ở

vùng núi thấp hơn, có độ cao 2000 – 3000 m, phân bố rộng (Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và các nước trong khu vực Đông Nam Á) [27, 43, 46], và có thể

dễ dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo [11] Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về quy trı̀nh nuôi trồng nấm C militarisis nhằm thay thế cho loài O Sinensis

và có nhiều nghiên cứu quan trọng về gen, nhu cầu dinh dưỡng, môi trường nuôi

cấy, các đặc tính sinh hóa và dược lý của nấm C militaris [57]

Có hơn 400 phân loài Cordyceps đã tìm thấy và mô tả, tuy nhiên chỉ có

khoảng 36 loài được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo để sản xuất quả thể [27,

43, 46] Trong số những loài này, chỉ có loài C militaris đã được trồng ở quy mô

lớn do nó có dược tính rất tốt và có thời gian sản xuất ngắn [27] Quả thể của nấm

Cordyceps militaris (Hình 1.2) dùng làm thực phẩm, dùng trong các món hầm,

súp, trà ở các nước Đông Nam Á như Hongkong, Đài Loan, Trung Quốc Liều dùng an toàn được khuyến nghị là ı́t hơn 2,5 g/kg thể trọng [8] Quả thể và sinh khối nấm cũng được sử dụng làm thuốc và bồi bổ sức khỏe [47] Các loại thuốc từ nấm này dùng duy trì chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hòa giấc ngủ, viêm phế quản mãn tính [10]

Hình 1.2 Quả thể nấm C militaris trên ký chủ nhộng

Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng

hạ thảo được bán trên thị trường Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân sâm, tam thất, tổ yến Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang, viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng) Có thể kể tên một vài chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau:

- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo

Tenken, bột Cordyceps extract…

- Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ

thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước cốt gà Đông trùng hạ thảo…

Ở Việt Nam, đã có nhiều công ty và đơn vi ̣ nghiên cứu sản xuất thành công

nấm Đông trùng ha ̣thảo (C militaris) Trong đó Công ty Cổ phần Dược thảo Thiên

Phúc được xem là công ty sản xuất đông trùng hạ thảo với qui mô lớn nhất với nhà xưởng đặt tại Hà Nội và Đà Lạt Hiện nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ đông trùng hạ thảo tại Việt Nam rất đa dạng như: dạng đông trùng hạ thảo sau thu hoạch chỉ được sấy khô, đông trùng hạ thảo dạng viên nén hoặc viên nhộng, đông trùng

hạ thảo kết hợp với linh chi, đông trùng hạ thảo dạng nước,…Tuy nhiên, đặc điểm chung là các sản phẩm đông trùng hạ thảo có giá thành tương đối cao

Do giá trị kinh tế cao và quý hiếm nên các sản phẩm hàng giả, hàng kém chất lượng về Đông trùng hạ thảo và thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo đã xuất hiện nhiều trên thị trường Việt Nam nói riêng và thị trường thế giới nói chung

1.1.3 Các thành phần hóa học của Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)

Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C militaris

cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các loại vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2 mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học và nhóm hợp chất quan trọng: cordycepin (1,52%), acid cordycepic (11,8%), polychaccarit (30%) [37]

Acid amin

Kết quả nghiên cứu của Hur (2008) cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32

mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) [18] Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả thể và sinh khối nấm cũng có sự chênh lêch, dao động từ 1,15 ̣

 15,06 mg/g và 0,36  2,99 mg/g Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả

thể bao gồm: lysin (15,06 mg/g), acid glutamic (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonin (5,99 mg/g), arginin (5,29 mg/g), và alanin (5,18 mg/g) Số liệu phân tích

của Chang và cộng sự (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid

aspartic (2,66 mg/g), valin (2,21 mg/g) và tyrosin (1,57 mg/g) [7]

Acid béo

Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70%

tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối Lượng acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5%

trong quả thể và 33,0% trong sinh khối

Các polisaccarit CPS-1 và CPS-2 được tách chiết từ nấm Cordyceps militaris

cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccarit, mannoza và glactoza Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loai polisaccarit này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do etanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều

dùng Yan et al., 2008 cho rằng tác dụng này có thể do chức năng chống oxy hóa

của các polisaccarit từ nấm [51]

1.1.4 Giá trị dược liệu của đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)

Nấm Cordyceps được gọi là “Đông trùng hạ thảo” đã được sử dụng như là

loại dược liệu dân gian truyền thống và là thành phần thực phẩm có tác dụng tăng cường hệ thống miễn dịch, phục hồi năng lượng tương tự nhân sâm của các quốc gia Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản và Trung Quốc Các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong đông trùng hạ thảo đã được nghiên cứu ly trích, đánh giá khả năng trong tri ̣liệu và đã được ứng dụng rộng rãi trong điều tri ̣bệnh và nâng cao sức khỏe cho con người với kết quả rất tốt Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của đông trùng hạ thảo

Hoạt tính kháng oxy hóa: Các nghiên cứu cho thấy chất CM-hs-CPS2 chứa

trong dịch chiết nấm Cordyceps militaris có tính kháng DPPH, hoạt tính khử và

tạo phức ở nồng độ (8mg/m) là 89%, 1,188 và 85% [12]

Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm

từ Cordyceps militaris số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động

và hình dạng bình thường tăng Hiệu quả này được duy trì thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dụng chế phẩm Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn [49]

Hạn chế virus cúm: Polisaccarit có tính acid (APS) tách chiết từ nấm

Cordyceps militaris nuôi trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong

điều trị cúm A Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào [54]

Kháng khuẩn, kháng nấm và kháng ung thư: protein CMP tách chiết từ Cordyceps militaris có kích thước 12kDa, pI 5,1 và có hoạt tính trong khoảng pH 7-9 Protein này ức chế nấm Fusariumoxysporum và gây độc đối với tế bào ung thư bàng quang [6] Hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium [53] Cordycepin ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua việc ức chế các phản ứng viêm phụ thuộc NF-

κB, do đó được hi vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch [36]

Tan huyết khối: Enzym tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris

có hoạt tính gắn fibrin và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin Enzym này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinaza và enzym chiết từ giun đất Khi enzym này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người [19]

Tính kháng viêm: Để xác định tác dụng kháng viêm của nấm, dịch chiết từ

quả thể nấm Cordyceps militaris (CMWE) đã được thử nghiệm về tác dụng kiểm

soát lipopolisaccarit (LPS) (chịu trách nhiệm kích thích việc sản xuất nitric oxit), việc giải phóng các yếu tố hoại tử khối u α (TNF-α) và interleukin-6 (IL-6) của tế bào RAW 264.7 Các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE làm giảm đáng kể LPS, TNF- α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dịch chiết Những kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến việc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào [50]

1.2 Cordycepin, Adenosine, Inosine trong Đông trùng hạ thảo

Các thành phần hoạt tính sinh học chính trong Đông trùng hạ thảo bao gồm các nucleoside, polysacarit và sterol Trong số này, các nucleoside như cordycepin, adenosine và inosine được công nhận là thành phần hoạt tính sinh học quan trọng

và được sử dụng làm chất đánh dấu hóa học để kiểm tra chất lượng, đảm bảo tính xác thực của đông trùng hạ thảo cũng như thực phẩm chức năng có thành phần đông trùng hạ thảo

1.2.1 Cordycepin

Cordycepin (hay 3'-deoxyAdenosine) là một dẫn xuất của nucleoside

adenosine, khác với chất sau là không có nhóm hydroxy ở vị trí 3 ' của gốc ribose

của nó Ban đầu nó được chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris , nhưng bây giờ có

thể được sản xuất tổng hợp Nó cũng được tìm thấy trong các loài Đông trùng hạ

thảo khác cũng như Ophiocordyceps sinensis

Cordycepin đã thể hiện độc tính tế bào chống lại một số dòng tế bào bạch cầu trong ống nghiệm Cordycepin tạo ra tác dụng chống trầm cảm nhanh chóng

và mạnh mẽ thông qua con đường truyền tín hiệu AMPA [28]

Về tác dụng trị liệu của cordycepin, một nghiên cứu về cordycepin trong Đông trùng Hạ thảo cho thấy hợp chất này có hai tác dụng trên tế bào:

(1) Ở liều thấp, cordycepin ức chế tăng trưởng không kiểm soát và phân hóa

tế bào

(2) Ở liều cao, cordycepin chặn đứng tế bào không cho dính chặt với nhau nên sẽ ức chế tăng trưởng

Cả hai tác dụng này có lẽ cùng dưới một cơ chế là cordycepin can thiệp vào

sự tổng hợp protein của tế bào Ở liều thấp, cordycepin can thiệp vào sản xuất ribonucleic acid messenger) và ở liều cao, cordycepin tác dụng trực tiếp lên sự sản xuất protein Chính vì vậy, các nhà khoa học cho rằng Đông trùng Hạ thảo có tác dụng mạnh trong việc chống ung thư Hợp chất cordycepin từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch [38] Các nghiên cứu của một số nhà khoa học khác cho rằng, cordycepin khi đi vào bên trong tế bào sẽ được chuyển hóa thành mono, di, hoặc tri-phosphate và có tác dụng ức chế các enzym tổng hợp purin Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng cho thấy cordycepin có tác dụng kích hoạt sự kết thúc quá trình tổng hợp DNA hoặc RNA bên trong tế bào [9]

Adenosine là một hợp chất hữu cơ xuất hiện rộng rãi trong tự nhiên dưới

dạng các dẫn xuất đa dạng Phân tử bao gồm một adenin gắn với một ribose thông qua liên kết β-N9 - glycosidic Adenosine là một trong bốn khối cấu tạo nucleoside của RNA, chất cần thiết cho mọi sự sống Adenosine đóng một vai trò quan trọng trong các quá trình sinh hóa ở sinh vật, là một nucleoside chính trong Đông trùng

hạ thảo và được công nhận là chất đánh dấu hóa học để kiểm tra chất lượng của

Đông trùng hạ thảo (Ophiocordyceps sinensis) và các sản phẩm thay thế của nó ở

Trung Quốc [33] Hoạt chất này được chứng minh với khả năng điều tiết các quá trình sinh lí trong cơ thể con người bao gồm: bảo vệ tim cùng các chức năng của tiểu cầu, giãn nở mạch máu

Các công trình nghiên cứu và các ứng dụng trong thực tế đã chỉ ra adenosine

có những tác dụng dưới đây:

Ổn định huyết áp, hỗ trợ điều trị và phòng tránh các bệnh tim mạch: adenosine có mặt ở mọi tế bào trong cơ thể con người đồng thời tham gia vào mọi hoạt động sống của chúng ta Hoạt chất này tham gia vào quá trình điều hòa nhịp tim, khắc phục hiện tượng loạn và chậm nhịp tim, cải thiện hệ tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, tăng lượng oxy trong máu Bên cạnh đó, adenosine còn được ghi nhận với khả năng ức chế hoạt động ngưng trệ tiểu cầu quá mức, đồng thời hạn chế tình trạng mắc và phòng chống các bệnh về mạch máu như: nhồi máu cơ tim, tắc mạch máu não, máu lưu thông kém…[32]

Duy trì quá trình tuần hoàn, tăng cường oxy trong máu: adenosine có trong đông trùng hạ thảo giúp gia tăng lượng oxy trong máu, hỗ trợ sự giãn nở của các mạch máu, cung cấp dưỡng khí cho sự tuần hoàn máu của cơ thể

Cải thiện sức khỏe: adenosine cùng các thành phần khác trong đông trùng hạ thảo có khả năng cung cấp năng lượng cùng các chất dinh dinh dưỡng cần thiết giúp duy trì các hoạt động sống của cơ thể đồng thời hồi phục sức khỏe cũng những người mới ốm dậy, cơ thể suy nhược

Cải thiện khả năng sinh lí: adenosine có tác dụng tích cực trong việc cải thiện tuần hoàn vi và lưu lượng máu cục bộ của thận, bên cạnh đó, hoạt chất này có thể điều tiết hàm lượng prostaglandin trong thận cùng các nội tiết tố, các tổ chức thần kinh của chức năng sinh dục

Ổn định thần kinh: Hoạt chất này giúp ổn định tinh thần, giải tỏa căng thẳng, mệt mỏi, giảm bớt tình trạng đau đầu, chóng mặt, hỗ trợ hoạt động của hệ thần kinh Bên cạnh đó, adenosine giúp điều tiết quá trình sinh hóa của giấc ngủ, giúp chúng ta có giấc ngủ sâu, ổn định thông qua tác dụng ổn định và chống thiếu dưỡng khí Theo một số kết quả nghiên cứu trên thế giới, adenosine được ghi nhận với

tác dụng giảm kích thích thần kinh, hoạt chất này có nồng độ thấp bất thường trong những bệnh nhân bị động kinh đồng thời làm giảm các cơn co giật của căn bệnh này khi thí nghiệm trên chuột [39]

Hoạt chất adenosine trong đông trùng hạ thảo được ghi nhận với hàm lượng khá cao Bởi vậy, việc sử dụng đông trùng hạ thảo sẽ giúp cơ thể hấp thụ được các dưỡng chất đồng thời thu nhận được những giá trị tích cực của adenosine với sức khỏe con người

1.2.3 Inosine

Inosine là một nucleoside được hình thành khi hypoxanthine được gắn vào

vòng ribose (còn được gọi là ribofuranose) thông qua liên kết β-N9-glycosidic

Các nghiên cứu trên động vật cho thấy inosine có đặc tính bảo vệ thần kinh Nó đã được đề xuất cho chữa trị chấn thương tủy sống và sử dụng sau đột quỵ

Inosine, một sản phẩm chuyển hóa chính của adenosine, ban đầu không có tác dụng sinh học Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây chứng minh rằng Inosine có chức năng điều hòa miễn dịch mạnh và bảo vệ thần kinh Inosine làm suy giảm sản xuất các chất trung gian gây viêm bởi các đại thực bào, tế bào lympho và bạch cầu trung tính, và bảo vệ trong các mô hình động vật của nhiễm trùng huyết, thiếu máu cục bộ và tự miễn dịch Inosine bảo vệ các tế bào thần kinh đệm và các tế bào thần kinh trong trạng thiếu oxy, và kích thích sự tái phát triển sợi trục sau chấn thương Các hoạt tính sinh học của inosine có thể liên quan đến tác động của các thụ thể Adenosine, poly (ADP-ribose) polymeraza và mức năng lượng của tế bào [14]

1.3 Tổng quan các phương pháp phân tích adenosine, cordycepin và

inosine

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Sắc ký lỏng là phương pháp tách chất với quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích ở pha động (pha lỏng) được chuyển tới cột tách Khi tiến hành phân tích sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh, do cấu trúc phân tử và tính chất

lý hóa của các chất phân tích khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách

ra khỏi nhau tại cột

Bảng 1.1 Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosine, cordycepin

Hiệu suất thu hồi (%)

x 4,6

mm, 5 μm)

Nước (A) và methanol (B)

isocratic 15% B;

3,0–3,5 phút, gradient 15–23%

B; 3,5–8,5 phút, isocratic 23% B;

8,5–9,0 phút, gradient 23–35%

B; 9,0–15 phút, isocratic 35% B

Khối phổ (MS)

Ade:

0,01 Cor:

0,01 Ino:

0,01

Ade:

103,1 Cor:

90,4 Ino:

× 2,1

mm, 1,8 μm)

Acetonitrile (A)

và nước (B) 0–3 phút, gradient

Ade:

0,20 Cor:

0,04 Ino:

0,50

Ade:

108,7 Cor:

115,6 Ino:

Hỗn hợp của acetonitril (ACN)

và nước (5:95, v/v) có chứa 0,1

M Trietylamine Acetat (TEAA)

Huỳnh quang (HPLC-FD)

Ade:

0,026 Cor:

0,021

4

41

150 mm, 1,8 µm)

Dung dịch 0,1%

acid formic trong nước (A) và acetonitrile chứa 0,1% acid formic (B)

Ade:

0,97 Cor:

0,24 Ino:

0,88

Ade:

102,1 Cor:

103,2 Ino:

ry Shield

RP 18 / 4,6 ×

Ade: 0,3 Cor:

0,25

2

24

Năm 2017, trong nghiên cứu của tác giả Juan Zou và cộng sự, nhóm tác giả

đã tách và phân tích hàm lượng bảy nucleoside (cordycepin, adenosine, guanosine, uridine, inosine, thymidine và 2-deoxyAdenosine) và hai nuclebase (adenine và uracile) trong các sản phẩm đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi cấy bằng phương pháp HPLC pha đảo kết hợp với detector khối phổ (MS) Điều kiện phân tích: pha động bao gồm (A) nước siêu tinh khiết và (B) methanol, với tốc độ dòng 1ml/phút, cột pha đảo C18 (250 mm x 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm) Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp cho adenosine, cordycepin và inosine từ 0,01

và 0,05 µg/ml, với hiệu suất thu hồi lần lượt là 103,1%, 90,4% và 79,4% [60]

Năm 2015, Shi-Yu Zong và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao kết hợp với detector khối phổ nguồn ion hóa phun điện tử (UPLC-ESI-MS/MS) để xác định nhanh đồng thời 13 nucleoside và nuclebase

trong Đông trùng hạ thảo tự nhiên với chất nội chuẩn 2-chloroAdenosine Chế độ quét MS dao động từ m/z 50 đến m/z 500 Các thông số nguồn tối ưu hóa được thiết lập như sau: nhiệt độ khí sấy, 350 °C; dòng khí làm khô, 10,0 l / phút; áp suất khí phun sương, 35 psi; và điện áp, 4000 V Điều kiện phân tích tối ưu đã được thực hiện trên cột C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 μm), các thành phần pha động gồm (A) acetonitrile và (B) nước được siêu âm khử khí trước khi sử dụng Tốc độ dòng của pha động là 0,30 ml/phút, nhiệt độ cột được duy trì ở 25 ° C, nhiệt độ khay mẫu được giữ ở 4 ° C và thể tích tiêm được cố định ở 2,0 μL Giới hạn phát hiện

và định lượng của adenosine (Ade), cordycepin(Cor), inosine (Ino) lần lượt là 0,20; 0,04; 0,50 µg/ml và 0,50; 0,10; 2,5 µg/ml Hiệu suất thu hồi các chất phân tích được định lượng gồm Ade 108,7%, Cor 115,2% và Ino 116,7%, với RSD < 6,18% [59]

Năm 2019, Yasia Su và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang (HPLC-FD) để đồng thời định lượng cordycepin, adenosine và 2-deoxyAdenosine (dA) Các điều kiện phân tích được dùng là: Cột pha đảo ODS C18 (250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm), pha động gồm hỗn hợp của acetonitrile (ACN) và nước (5:95, v/v) có chứa 0,1 M Triethylamine Acetat (TEAA), tốc độ dòng 1 ml/phút, nhiệt độ cột 30 oC, thể tích bơm mẫu là 10 µl Các bước sóng kích thích và phát xạ huỳnh quang lần lượt là

275 và 411 nm Phương pháp có giới hạn phát hiện đối với Cor, dA và Ade lần lượt là 0,021 ng/ml, 0,024 ng/ml và 0,026 ng/ml [41]

Năm 2018, Robin Joshi và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng sử dụng kỹ thuật đo quang phổ khối lượng ion di động (UPLC-IMS) để xác định đồng thời tám nucleoside trong đông trùng hạ thảo tự nhiên Quy trình tách sắc ký lỏng sử dụng cột C18 RRHD (2,1 x 150 mm, 1,8 µm), pha động bao gồm A (dung dịch 0,1% acid formic trong nước) và B (acetonitrile chứa 0,1% acid formic) theo chương trình rửa giải gradient dung môi Tốc độ dòng chảy và thể tích bơm mẫu lần lượt là 180 µl/phút và 1 µl, nhiệt độ cột được duy trì ở mức

lần lượt là 0,97; 0,24; 0,88 ng/ml và 3,20; 0,79; 2,90 ng/ml, với hiệu suất thu hồi

từ 89,35 – 103,2 % [22]

Năm 2009, Lei Huang và cộng sự đã xác định hàm lượng của adenosine và cordycepin trong các sản phẩm đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối detector dãy diod quang (HPLC-DAD) Điều kiện phân tích: pha động methanol/nước tỉ lệ 92 : 8 (v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút, cột pha đảo Waters Symmetry Shield RP 18 / 4,6 × 150 mm, 5 µm; nhiệt độ cột 30oC Mẫu được chiết bằng dung dịch methanol/nước tỉ lệ 50:50 Giới hạn phát hiện của adenosine là 0,3 µg/ml và của cordycepin là 0,25 µg/ml [24]

1.3.2 Phương pháp điện di mao quản

Năm 2009, Feng-Qing Yang và các cộng sự đã phát triển quy trình phân tích đồng thời 12 nucleoside và nucleobase trong đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi cấy bằng phương pháp điện di mao quản kết nối với detector khối phổ (CE-MS),

sử dụng 5-chlorocytosine arabinoside làm chất nội chuẩn Điều kiện tối ưu hóa bao gồm: dung dịch điện ly nền trong CE là acid formic 100 mM chứa 10%(v/v) methanol Các thông số được tối ưu: 75%(v/v) methanol chứa 0,3% acid formic với tốc độ dòng chảy 3 µl/phút được sử dụng để bổ sung dung môi trước khi đến buồng phun điện tích; tốc độ dòng chảy và nhiệt độ khí sấy lần lượt là 6 l/phút và

350oC Phương pháp có giới hạn phát hiện và định lượng nhỏ hơn 12,66 và 38,94 µg/ml, độ chính xác tốt với hiệu suât thu hồi từ 92,7 – 103,4% [52]

Năm 2006, Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã phát triển quy trình phân tích hoạt chất cordycepin trong đông trùng hạ thảo bằng phương pháp diện di mao quản với detector UV ở bước sóng 254 nm Các điều kiện tối ưu của phương pháp bao gồm: dung dịch đệm điện ly nền natri borat 20 mM với 28,6% methanol ở pH 9,5, điện thế tách 20 kV, thời gian bơm mẫu 10 s và nhiệt độ 25oC Giới hạn phát hiện

và giới hạn định lượng của phương pháp 1 µg/ml và 4 µg/ml, hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thực khoảng 98% [35]

Năm 2004, Y X Gong và cộng sự đã xác định hàm lượng 6 nucleoside và nucleobase bằng phương pháp điện di mao quản vùng kết hợp detector dãy diot quang với bước sóng phát hiện là 254 nm sử dụng chất nội chuẩn là adenosine monophosphat Phương pháp sử dụng dung dịch đệm bao gồm acid boric 500 mM

và 12,2% axetonitril được điều chỉnh pH đến 8,6 bằng natri hydroxit, điện thế tách

20 kV Mẫu được chiết siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Hiệu suất thu hồi khoảng 97 % với độ chụm nhỏ hơn 0,62 và 0,81% [13]

1.3.3 Nhận xét và đề xuất phương pháp thích hợp

Các phương pháp phân tích để xác định nucleoside trong các sản phẩm đông trùng hạ thảo chủ yếu dựa vào sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cùng với các loại detector khác nhau HPLC thực sự là phương pháp được sử dụng thường xuyên cho các hoạt động kiểm soát chất lượng ở các viện kiểm nghiệm an toàn thực phẩm cũng như các nhóm nghiên cứu Phương pháp sắc ký lỏng có ưu điểm là khả năng tách chất tốt và có thể xác định đồng thời nhiều hợp chất, độ lặp lại và độ ổn định của thiết bị tốt Đặc biệt là khi ghép nối với các detector khác nhau mang lại những đặc tính ưu việt như giới hạn phát hiện rất tốt (100 ng/l đến vài µg/l) khi sử dụng các detector MS, khả năng xác định chính xác các hợp chất trong các nền mẫu phức tạp khi sử dụng detector MS Tuy nhiên, đây là các phương pháp với chi phí phân tích cao khi phải sử dụng pha động là dung môi với độ tinh khiết cao Phương pháp cần trình độ chuyên môn cao về thiết bị và thực hiện phân tích, khiến việc sử dụng HPLC để sàng lọc nhanh chất lượng sản phẩm đông trùng hạ thảo tại các cơ

sở địa phương trở nên chưa phù hợp

Mặt khác, việc sử dụng các thiết bị CE thương mại kết hợp với detector khối phổ hoặc UV đã được thực hiện Điện di mao quản (CE) có thể được coi là một giải pháp thay thế phân tách nhanh và hiệu quả với mức tiêu thụ mẫu, dung môi và thuốc thử thấp Tuy nhiên, việc sử dụng các thiết bị CE thương mại gặp phải những hạn chế tương tự như HPLC khi triển khai tại cơ sở Trong khoảng 10 năm gần đây có rất ít nghiên cứu về phân tích xác định các nucleoside bằng phương

pháp điện di mao quản và chưa có nghiên cứu nào sử dụng CE - C4D để phân tích

3 nucleoside gồm adenosine, cordycepin và inosine được thực hiện Vì vậy, ý tưởng phát triển phương pháp điện di mao quản trong phân tích các nucleoside, một quy trình phân tích adenosine, cordycepin và inosine bằng phương pháp điện

di mao quản tự chế loại xách tay kết hợp với detector đo độ dẫn không tiếp xúc kiểu tụ điện (C4D) đã được phát triển với mục tiêu khai thác tiềm năng cao của CE như một giải pháp thay thế đơn giản trong sàng lọc có khả năng triển khai tại các

cơ sở

1.4 Tổng quan về phương pháp điện di mao quản

1.4.1 Nguyên lý tách chất và cấu tạo cơ bản của thiết bị điện di mao quản

Điện di mao quản là phương pháp tách chất dựa trên khả năng di chuyển khác nhau của các phần tử tích điện trong lòng một mao quản rất hẹp dưới tác dụng của điện trường nhờ dòng chuyển dời có hướng của các điện tích trong điện trường theo một chiều nhất định [48] Kết hợp giữa kỹ thuật tách chất bằng điện di mao quản với các detector khác nhau (theo nguyên tắc đo điện, đo quang hoặc khối phổ) sẽ là phương pháp phân tích công cụ hữu hiệu

Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống điện di mao quản

Hình 1.3 trình bày sơ đồ cấu tạo đơn giản nhất của một hệ thống điện di mao quản Những bộ phận cơ bản của một hệ thống điện di mao quản (CE) bao gồm: nguồn cấp thế cao áp và các điện cực để tạo điện trường làm động lực tách chất trong mao quản, bộ bơm mẫu hay hệ thống dẫn lưu lỏng để dẫn dung dịch và mẫu vào mao quản, detector (có thể sử dụng nhiều loại detector như detector quang, khối phổ, điện hóa) để xác định các chất đã được tách sau quá trình điện di, bộ ghi

Dòng điện di thẩm thấu (EOF)

Dòng điện di thẩm thấu trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên thành mao quản và chất điện li chứa trong nó Với mao quản silica, các nhóm silanol (Si-OH) trên bề mặt mao quản có khả năng bị deproton hóa chuyển thành SiO- khi tiếp xúc với dung dịch chất điện li, đặc biệt là trong môi trường kiềm Đây là điều kiện

để hình thành nên lớp điện kép, trong đó lớp di động nằm bên ngoài mang điện

dương Khi áp vào hai đầu mao quản một điện thế, lớp di động này di chuyển về

phía cực âm với một vận tốc nhất định, tạo thành dòng, gọi là dòng EOF

Độ lớn của dòng EOF tỉ lệ thuận với lực điện trường E do thế V đặt vào hai đầu mao quản, độ lớn của thế ξ, hằng số điện môi và tỉ lệ nghịch với độ nhớt của

pha động điện di theo biểu thức sau:

(2) Trong đó: ε: hằng số điện môi của dung dịch đệm

ξ: thế zeta của lớp điện tích kép Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF Do vậy để có được hiệu quả tách cao, cần tìm được dòng EOF có cường độ phù hợp với chất phân tích, có nghĩa là phải tối ưu hóa các điều kiện của quá trình điện di

1.4.2 Nguyên tắc nhận biết các chất và cấu tạo cơ bản của detector độ dẫn

không tiếp xúc

Trong nghiên cứu này sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc để nhận biết các chất dưới dạng ion Về nguyên tắc, các detector độ dẫn (loại tiếp xúc và không tiếp xúc) xác định được các chất dưới dạng ion dựa trên khả năng dẫn điện của các ion nghĩa là đo dòng điện giữa hai điện cực khi chúng được áp thế nhất định Theo định luật Ôm, khi áp một thế nhất định vào hai điện cực, trong dung dịch điện ly

sẽ sinh ra một trở kháng, nói cách khác dung dịch điện ly có một độ dẫn nhất định

Độ dẫn của dung dịch (L) phụ thuộc vào diện tích bề mặt điện cực (A), khoảng cách giữa chúng (l), nồng độ (C) của chất dẫn điện và độ linh động (λ) của chất dẫn điện trong trường điện từ theo phương trình sau:

Độ linh động của các ion là hàm của kích thước của ion đó (bán kính hydrat hóa của ion) và điện tích của ion đó Như vậy giá trị L phụ thuộc vào bản chất của ion cần phân tích và nồng độ của chúng

Detector độ dẫn không tiếp xúc (C4D) là detector độ dẫn mà trong suốt quá trình làm việc các điện cực không tiếp xúc với dung dịch đo Cell - detector này bao gồm hai điện cực hình ống được đặt vòng quanh mao quản, cách nhau một khoảng cách nhất định Khoảng cách giữa hai điện cực này quyết định thể tích dung dịch đo trong detector Khối dung dịch nằm giữa hai điện cực có vai trò như một điện trở Trên một điện cực người ta áp vào nó một dòng xoay chiều Dòng điện này đi qua thành mao quản, qua dung dịch chất điện ly nằm giữa hai điện cực

và đi đến điện cực thứ hai Sau đó tín hiệu được thu nhận, khuyếch đại và xử lý và cho ra tín hiệu chất phân tích.Sau đây là mô hình đo độ dẫn không tiếp xúc và mạch điện tương đương:

Hình 1.4 Mô hình của đo độ dẫn không tiếp xúc và mạch điện tương đương

A: Không có điện cực nối đất; B: Có điện cực nối đất ngăn cách giữa hai điện cực; a: sơ đồ khối; b: dạng mặt cắt; c: mạch điện tương đương

1.4.3 Các thông số đánh giá trong điện di mao quản

Diện tích pic và độ phân giải là hai yếu tố được xem xét để định lượng trong

CE

Diện tích pic tỉ lệ với nồng độ chất phân tích đi qua detector Dựa vào giá trị diện tích pic, ta có thể xác định được nồng độ của chất phân tích có trong mẫu (công thức 4)

Trong đó: S là diện tích pic thu được; k là hệ số;

C là nồng độ chất phân tích Trong khi đó, độ phân giải thể hiện khả năng phân tách của hai pic gần nhau Độ phân giải được xác định bằng công thức (5) sau đây [13]:

Trong đó: ti và tj là thời gian lưu của hai chất i và j (ti > tj)

wi và wj là độ rộng đáy của hai pic chất i và j Theo lí thuyết, hai pic được coi là tách hoàn toàn khỏi nhau (với độ tin cậy

95 %) khi độ phân giải R ≥ 1,5 Trong thực tế, đối với các phương pháp sắc ký nói chung và phương pháp điện di mao quản nói riêng, độ phân giải được đa số các nhà phân tích chấp nhận là R > 1,2

1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất

Dung dịch điện di nền

Dung dịch điện di nền (BGE) có vai trò quyết định trong quá trình tách chất Như đã thấy trong công thức (1), chất điện di nền ảnh hưởng tới tốc độ di chuyển của các ion, thông qua giá trị độ nhớt của dung dịch và khả năng solvat hóa (thể hiện qua bán kính hidrat r)

BGE thường được sử dụng là các dung dịch đệm trong môi trường nước Thành phần của hệ đệm bao gồm một hợp phần mang tính acid, hợp phần còn lại mang tính bazơ Các yếu tố cần quan tâm khi lựa chọn dung dịch điện di nền phù hợp bao gồm thành phần, nồng độ các hợp phần và pH dung dịch

Điện thế tách

i j ij

2(t - t )

R =

w + w

Điện trường được tạo ra khi áp vào hai đầu mao quản một hiệu điện thế lớn,

cỡ kV, theo công thức E = V/L Đây là động lực cho quá trình di chuyển của các ion, ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng tách chất và tín hiệu thu được Khi hiệu điện thế nhỏ, chân pic dãn và diện tích pic lớn hơn, tuy nhiên thời gian phân tích dài hơn Trong khi đó, hiệu điện thế lớn có thời gian phân tích ngắn nhưng diện tích pic thu hẹp lại, đồng thời còn gây ra hiệu ứng nhiệt Do đó, giá trị độ lớn của hiệu điện thế đặt vào là yếu tố quan trọng cần quan tâm

Lượng mẫu đi vào mao quản

Lượng mẫu đi vào mao quản ảnh hưởng lớn tới diện tích và khả năng phân tách các pic Lượng mẫu ít dẫn tới diện tích pic giảm, làm giảm khả năng phát hiện chất, trong khi lượng mẫu lớn, diện tích pic tăng, làm giảm độ phân giải Đối với một hệ điện di mao quản đơn giản, vận hành bằng tay, sử dụng phương pháp bơm mẫu xi phông thì lượng mẫu đi vào mao quản phụ thuộc chủ yếu vào thời gian bơm mẫu Mặc dù vậy, với phân tích đơn đối tượng, thời gian bơm mẫu thường được giữ cố định

Ngoài ra, còn một số yếu tố khác trên hệ CE ảnh hưởng tới quá trình tách chất như chiều dài và đường kính trong của mao quản Tuy nhiên, thông thường, các yếu tố này được giữ cố định trên mỗi hệ thiết bị

1.5 Cơ sở thiết kế thí nghiệm xác định các hợp chất adenosine, cordycepin

và inosine bằng phương pháp CE-C 4 D

Nguyên tắc đầu tiên trong phân tích bằng CE-C4D là lựa chọn các BGE thích hợp nhằm chuyển các chất phân tích về dưới dạng ion mang điện để có thể thực hiện quá trình điện di và phát hiện bằng C4D Việc lựa chọn, đặc biệt là pH của BGE, phụ thuộc vào đặc tính axit – bazo của các chất phân tích Adenosine và cordycepin có cấu trúc phân tử tương tự nhau (hình trên), vì vậy tính chất axit – bazo của chúng khá giống nhau với các giá trị pKa là 3,6 và 12,4 [15, 23] Giá trị

pKa = 3,6 tương ứng với sự phân li H+ của dạng axit liên hợp do nguyên tử N(1)

bị proton hóa (NH+), trong khi pKa = 12,4 tương ứng với sự phân li của nhóm -OH

ở C(2’) trong gốc đường ribose Các trung tâm axit – bazo khác (các nguyên tử N

và nhóm -OH còn lại) rất yếu, với pKa < 0 hoặc pKa > 14, không có ý nghĩa trong phân tích CE và không được xem xét Các dạng tồn tại và quá trình phân li của hai chất này như sau:

Trong khi đó, inosine có các pKa là 1,2; 8,9 và 12,5 [61] tương ứng với sự phân li của NH+, nhóm -OH (do sự enol hóa) ở C(6) trong vòng hypoxanthine và nhóm -OH ở C(2’) trong gốc đường ribose, như các quá trình phân li dưới đây:

Như vậy, các dạng tồn tại chính của các chất phân tích phụ thuộc vào pH của môi trường, cụ thể như sau:

Adenosine Cordycepin Inosine

1,2 – 3,6 Cation Cation Trung tính

3,6 – 8,9 Trung tính Trung tính Trung tính

8,9 – 12,4 Trung tính Trung tính Anion

Như vậy, để có thể phân tích đồng thời cả 3 chất adenosine, cordycepin và inosine trên cùng một kênh (cùng một mao quản), cần lựa chọn các BGE có pH < 1,2 hoặc pH > 12,4 Đây là những điều kiện khắc nghiệt trong CE do rất khó lựa chọn được các hệ đệm có pH như vậy, đồng thời pH quá thấp và quá cao cũng không thực sự phù hợp để phát hiện chất bằng detector C4D do độ dẫn nền khi đó quá lớn Vì vậy, trong nghiên cứu này, adenosine và cordycepin sẽ được phân tích trên cùng một kênh điện di dưới dạng cation với BGE có pH < 3,6 và inosine được phân tích trên một kênh điện di khác dưới dạng anion với BGE có pH ~ 8,9 là những điều kiện thích hợp thuận tiện hơn với CE-C4D Do vậy, quy trình thực nghiệm và kết quả khảo sát quy trình phân tích đồng thời ba hoạt chất adenosine, cordycepin và inosine được trình bày trong chương 2 và chương 3 dưới đây

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đồng thời adenosine, cordycepin và inosine trong thực phẩm chức năng sử dụng hệ thiết bị điện di mao quản hai kênh loại xách tay kết hợp detector đo độ dẫn không tiếp xúc

Áp dụng quy trình để phân tích hàm lượng 3 nucleoside nói trên trong một

số mẫu thực phẩm chức năng có thành phần đông trùng hạ thảo được thu thập trên thị trường

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Tổng quan tài liệu về các phương pháp xác định các hoạt chất adenosine, cordycepin và inosine

Nghiên cứu, khảo sát và tối ưu các điều kiện phân tích adenosine, cordycepin

và inosine trên hệ thiết bị CE-C4D, bao gồm:

 Kênh 1: Phân tích adenosine và cordycepin

- Khảo sát dung dịch điện ly nền

- Khảo sát điện thế tách

 Kênh 2: Phân tích inosine

- Khảo sát dung dịch điện ly nền: loại đệm, pH và nồng độ đệm Thẩm định, đánh giá phương pháp quy trình phân tích adenosine, cordycepin và inosine trên hệ thiết bị CE-C4D qua các thông số: giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, đường chuẩn, độ chính xác (bao gồm độ chụm và độ đúng)

Áp dụng quy trình đã phát triển vào thực tế trong phân tích hàm lượng adenosine, cordycepin và inosine trong 8 mẫu sản phẩm đông trùng hạ thảo trên