Đặc điểm exosomes tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn và tế bào tua biệt hóa từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn

Nghiên cứu này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp ĐHQG “Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư của exosome tiết từ các tế bào tua máu dây rốn người nhằ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Hương Diễm

ĐẶC ĐIỂM EXOSOMES TIẾT TỪ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO TUA BIỆT HÓA TỪ TẾ

BÀO BẠCH CẦU MONO MÁU CUỐNG RỐN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Hoàng Hương Diễm

ĐẶC ĐIỂM EXOSOMES TIẾT TỪ TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ DÂY RỐN VÀ TẾ BÀO TUA BIỆT HÓA

TỪ TẾ BÀO BẠCH CẦU MONO MÁU CUỐNG RỐN

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8460201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Thân Thị Trang Uyên

PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội – 2020

Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới TS Thân Thị Trang Uyên, cán bộ hướng dẫn trực tiếp của tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu, người đã luôn tận tình hướng dẫn và giải đáp những thắc mắc, khó khăn đồng thời luôn động viên và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Việt Anh, ThS Chu Thị Thảo, ThS Nguyễn Đắc Tú, CN Đỗ Thị Hoài Thu, CN Phạm Thị Cường, và ThS Lê Thị Huyền cùng các cán bộ của Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec đã hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn cao học này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến ThS Bùi Thị Vân Khánh, người đã hướng dẫn

và chỉ bảo tôi những điều cơ bản nhất từ ngày đầu tiên tôi tham gia vào nhóm Ung thư thực nghiệm Cùng với đó tôi cũng xin cảm ơn tới các Thầy, Cô trong Bộ Môn Sinh học

Tế bào, các anh chị, và các em trong nhóm Ung thư thực nghiệm đã đồng hành và hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm việc

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, và bạn bè

đã luôn yêu thương, ủng hộ, và tạo cho tôi một chỗ dựa vững chắc để giúp tôi vượt qua mọi khó khăn, thử thách

Xin chân thành cảm ơn!

Nghiên cứu này được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp ĐHQG

“Nghiên cứu khả năng kích thích miễn dịch kháng ung thư của exosome tiết từ các

tế bào tua máu dây rốn người nhằm hướng tới ứng dụng trong chế tạo vắc xin chống ung thư”, mã số: QG 18.09

Hà Nội, tháng 11 năm 2020

Học viên cao học,

Hoàng Hương Diễm

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN……… 3

1.1 Thể tiết exosome……… 3

1.1.1 Giới thiệu chung về exosome và thể tiết ngoại bào……… 3

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu và cơ chế hình thành……… 3

1.1.3 Chức năng của exosome……… 9

1.2 Exosome từ tế bào tua máu cuống rốn người……… 11

1.2.1 Giới thiệu chung về tế bào tua……… 11

1.2.2 Tế bào tua biệt hóa và trưởng thành từ tế bào bạch cầu mono (moDC)……… 12

1.2.3 Máu cuống rốn – một nguồn cung cấp tế bào mono……… 12

1.2.4 Exosome từ tế bào tua……… 13

1.3 Exosome từ tế bào gốc trung mô……… 15

1.3.1 Giới thiệu chung về tế bào gốc trung mô……… 15

1.3.2 Dây rốn - Nguồn cung cấp tế bào gốc trung mô……… 16

1.3.3 Exosome từ tế bào gốc trung mô……… 17

CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu……… 20

2.1.1 Mẫu máu cuống rốn……… 20

2.1.2 Tế bào gốc trung mô dây rốn người……… 20

2.1.3 Tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549……… 21

2.2 Hóa chất và thiết bị……… 21

2.2.1 Hóa chất……… 21

2.2.2 Thiết bị……… 24

2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao……… 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 26

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy biệt hóa và trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người……… 26

2.3.2 Nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ dây rốn……… 30

2.3.3 Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy……… 30 2.3.4 Phương pháp phân lập exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào……… 33 2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái và kích thước của exosome……… 34 2.3.6 Phương pháp tách chiết protein toàn phần có trong exosome……… 35 2.3.7 Phương pháp xác định đặc điểm protein chỉ thị của exosome……… 38 2.3.8 Phương pháp loại bỏ kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp……… 39 2.3.9 Phương pháp xác định sự phân bố phổ protein tách chiết từ EX trên gel…… 39 2.3.10 Phương pháp phân tích thống kê……… 40

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ……… 41 3.1 Kết quả biệt hóa và trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch cầu mono máu

KIẾN NGHỊ……… 64

BÀI BÁO CÔNG BỐ……… 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 66

PHỤ LỤC……… 72

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: Quá trình hình thành EX……… 5 Hình 2: Thành phần protein của EX được phân loại theo chức năng……… 7 Hình 3: Mẫu máu cuống rốn được thu thập tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec,

Hình 4: Quy trình nuôi cấy biệt hóa và trưởng thành DC từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người……… 26 Hình 5: Máu cuống rốn sau khi ly tâm theo tỷ trọng……… 28 Hình 6: Quy trình phân lập EX từ môi trường nuôi cấy tế bào……… 34 Hình 7: Hình ảnh buồng đếm tế bào sau khi phân lập bằng phương pháp Ficoll…… 38 Hình 8: Quần thể tế bào đơn nhân phân lập từ máu cuống rốn……… 40 Hình 9: Tế bào mono bám dính trên bề mặt chai nuôi cấy sau 2 giờ nuôi cấy bám

Hình 14: Hình thái EX được phân tích bằng TEM……… 47 Hình 15: Sự phân bố phổ protein trên gel SDS-PAGE tách chiết từ EX có nguồn gốc từ mDC và UCMSC……… 49 Hình 16: Sự biểu hiện các protein chỉ thị đặc trưng của EX được kiểm tra bằng phương pháp miễn dịch màng lai……… 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Một số thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp EX……… 17

Bảng 2: Các hóa chất được sử dụng……… 28

Bảng 3: Các thiết bị được sử dụng……… 31

Bảng 4: Dụng cụ và vật tư tiêu hao……… 32

Bảng 5: Kháng thể sử dụng trong phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy của tế bào MNC và tế bào mDC……… 38

Bảng 6: Kháng thể sử dụng trong phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy của tế bào MSC……… 39

Bảng 7: Pha loãng nồng độ protein chuẩn……… 43

Bảng 8: Chuẩn bị protein chuẩn……… 44

Bảng 9: Kết quả phân lập tế bào MNC từ máu toàn phần……… 49

Bảng 10: : Số lượng tế bào MNC bám dính sau khi thay môi trường……… 50

Bảng 11: Tỷ lệ tế bào bạch cầu mono qua quá trình phân lập vào ngày 0 dựa trên phân tích bằng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy……… 51

Bảng 12: Số lượng DC thu được……… 53

Bảng 13: Kết quả định lượng protein tổng số thu được từ EX có nguồn gốc từ mDC 60 Bảng 14: Kết quả định lượng protein tổng số thu được từ EX có nguồn gốc từ UCMSC……… 60

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AB Apoptotic body Thể tế bào chết theo

chương trình BCA Bicinchoninic acid Axit bicinchoninic

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

Dex Exosome – derived from dendritic cells Thể tiết exosome tiết ra

bởi tế bào tua DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium

EV Extracellular vesicles Thể tiết ngoại bào

FBS Fetal bovine serum Huyết thanh thai bò

FDA Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm

và Dược phẩm Hoa Kỳ

GM-CSF Granulocyte/macrophage colony

stimulating factor

Yếu tố kích thích tạo cụm dòng hạt-mono

GMP Good Manufacturing Practices Các tiêu chuẩn thực hành

lâm sàng tốt HRP Horseradish peroxidase

iDC Immature dendritic cell Tế bào tua chưa trưởng

thành

ISCT International Society for Cellular

Therapy

Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào

mDC Mature dendrictic cell Tế bào tua trưởng thành

Mex Exosome – derived from mesenchymal

MVB Multivesiclevesicle body Thể đa bào

NCT National Clinical Trial Thử nghiệm lâm sàng

quốc gia

NK cell Natural killer cell Tế bào tiêu diệt tự nhiên

PBS Phosphate-buffered saline

PDGF Platelet-derived growth factor Nhân tố tăng trưởng từ

tiểu cầu PVDF Polyvinylidene florua

TEM Transmission electron microscopy Kính hiển vi điện tử

truyền qua

TNF - α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u

alpha

UCMSC Mesenchymal stem cell derived from

umbilical cord

Tế bào gốc trung mô từ dây rốn

1

MỞ ĐẦU

Thể tiết exosome hay còn gọi là thể tiết ngoại bào exosome là các túi nhỏ được đóng kín bởi cấu trúc màng lipid kép Chúng đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi thông tin giữa các tế bào do có mang các hoạt chất phân tử sinh học có nguồn gốc từ tế bào tiết và truyền thông tin này sang tế bào đích Tuy nhiên, những đặc điểm sinh học phân tử này là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc và tình trạng sinh lý học của các tế bào tiết

Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng thể tiết exosome được tiết ra từ nhiều loại tế bào khác nhau, trong đó phải kể đến cả tế bào miễn dịch và tế bào gốc trung mô Một trong những loại tế bào miễn dịch đóng góp vai trò quan trọng trong liệu pháp miễn dịch kháng ung thư đó là tế bào tua (Dendritic cells – DC) Gần đây các nhà khoa học đã nghiên cứu và nhận thấy rằng exosome từ tế bào tua (Dexosomes – Dex) có khả năng thay thế chính tế bào tua trong việc trình diện kháng nguyên để kích thích hệ miễn dịch tiêu diệt tế bào ung thư, và gây đáp ứng chống hình thành khối u Ngày càng nhiều các nghiên cứu chứng minh được rằng hiệu quả trị liệu của tế bào gốc trung mô chủ yếu thông qua các chất tiết hơn là cơ chế biệt hóa trực tiếp của chúng, đặc biệt là sự đóng gói của thể tiết ngoại bào hay exosome Những nghiên cứu trên các mô hình bệnh khác nhau cho thấy các exosome tiết từ tế bào gốc trung mô (Mexosomes – Mex) đặc biệt có lợi trong việc tăng cường khả năng hồi phục của cơ thể như cải thiện tình trạng xơ gan bảo

vệ thận và liền vết thương trên da Ngoài ra, exosome còn có ưu điểm hơn so với chính

tế bào mẹ khi sử dụng liệu pháp tế bào trong điều trị bệnh Quy trình bảo quản và trữ đông các exosome đơn giản hơn so với tế bào Hơn nữa, thể tiết exosome khá bền và ổn định, có thể bảo quản lạnh ít nhất sáu tháng tại – 80 ℃ mà không ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng Việc sử dụng exosome rất an toàn và chúng có thể vượt qua rào chắn thần kinh - máu mà tế bào không thể vượt qua được rào chắn này

Mặc dù exosome đã được chứng minh là có tiềm năng trong chẩn đoán và điều trị các bệnh ung thư cũng như các bệnh lý phức tạp khác, tuy nhiên việc lựa chọn điều kiện nuôi cấy tế bào tiết exosome, phương pháp phân lập tối ưu và xác định các đặc điểm

đặc trưng của chúng vẫn còn gặp khó khăn Dựa trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Đặc điểm exosomes tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn và tế bào tua biệt hóa từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn”. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc thiết lập một quy trình phân lập thành công exosome từ môi trường nuôi cấy

tế bào với mục đích tạo ra exosome trong điều kiện GMP và có hoạt tính sinh học làm

cơ sở để khẳng định sự khả thi của việc phân lập thể tiết exosome nhằm ứng dụng điều trị bệnh lý trong tương lai

Mục đích nghiên cứu:

- Phân lập được thể tiết EX từ hai loại tế bào tua trưởng thành và tế bào gốc trung mô dây rốn được nuôi cấy trong môi trường thương mại không bổ sung huyết thanh đạt tiêu chuẩn thực hành lâm sàng tốt (Good Manufacture Practice – GMP)

- Xác định đặc điểm hình thái và kích thước của thể tiết EX tiết ra từ hai loại tế bào tua trưởng thành và tế bào gốc trung mô dây rốn

- Xác định đặc điểm protein chỉ thị đặc trưng của EX tiết từ hai loại tế bào tua trưởng thành và tế bào gốc trung mô dây rốn

3

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Thể tiết exosome

1.1.1 Giới thiệu chung về exosome và thể tiết ngoại bào

Thể tiết ngoại bào (extracellular membrane vesicles - EV) là các túi nhỏ có lớp màng lipid kép giống như màng tế bào và được tiết ra từ nhiều loại tế bào khác nhau Chúng được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy tế bào và nhiều loại dịch cơ thể như huyết tương, nước tiểu, nước bọt, dịch ối và sữa mẹ [30] Thể tiết hay EV được phân làm

3 loại: thể tế bào chết theo chương trình - apoptotic body (AB, 1 - 5 µm) là sản phẩm của quá trình tế bào chết theo chương trình; vi bóng bào - microvesicles (MV, 100 - 1000 nm) được hình thành theo phương thức mọc chồi trực tiếp từ màng tế bào; và thể tiết exosome (EX, 40 - 250 nm) được hình thành do sự nhập bào tạo thành thể đa bào, sau

đó nhờ sự dung hợp với màng tế bào để giải phóng EX ra môi trường ngoại bào [18, 24, 29] Trong đó, hiện nay EX đặc biệt được chú ý và nghiên cứu nhiều nhất về thành phần sinh học phân tử và chức năng của nó

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu và cơ chế hình thành

Cơ chế giải phóng ra các túi tiết có tên là “apoptotic body” trong quá trình tế bào chết theo chu trình đã được biết đến từ năm 2004 [21], nhưng thực tế có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các tế bào hoàn toàn khỏe mạnh cũng tiết ra các túi tiết ngoại bào mà hiện nay được gọi là thể tiết [18] Exosome ban đầu được sử dụng để mô tả những túi tiết có kích thước từ 40 – 1000 nm và được tiết ra từ nhiều loại tế bào khác nhau [58], tuy nhiên tại thời điểm này thì nguồn gốc hình thành của những túi tiết này thì vẫn chưa được rõ ràng Sau đó, vào năm 1984, các nhà khoa học đã sử dụng danh pháp này để mô tả những túi tiết có kích thước từ 40 – 100 nm, được tiết ra trong quá trình biệt hóa tế bào hồng cầu lưới [19] Tuy nhiên một thập kỷ sau đó, các nhà khoa học

đã phát hiện ra rằng EX được tiết ra từ tế bào lympho B và tế bào tua thông qua một cơ chế giống nhau [18] Trước đây, việc đặt tên cho các túi tiết rất đa dạng, không có quy luật xác định do chưa rõ cơ chế hình thành Hầu hết các túi tiết được đặt tên có liên quan

tế bào mẹ tiết ra chúng Mặc dù những nghiên cứu phát hiện ra các túi tiết có nguồn gốc

từ các tế bào có trong mô hoặc dịch cơ thể của động vât có vú được mô tả từ rất lâu, nhưng mãi đến năm 2011 người ta mới xếp chung những túi tiết đó vào nhóm thể tiết ngoại bào và cấu trúc đều được bao quanh bởi lớp lipid kép [29]

Ngày nay, thể tiết ngoại bào được phân chia thành ba loại chính dựa trên cơ chế hình thành của từng quần thể thể tiết, gồm có: AB (thể tế bào chết theo chương trình),

MV (vi bóng bào) và EX (thể tiết exosome) Trong đó, EX là quần thể nhỏ nhất với kích thước đường kính dao động từ 40 – 250 nm và có hình thái dạng cốc (cup-shaped) khi được quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) [24, 30] Quá trình hình thành

EX thông qua sự nhập bào tạo thành các thể nội bào, các thể nội bào dung hợp tạo nên thể nội bào sớm Bộ máy Golgi và lưới nội chất cũng góp phần vào việc hình thành nên thể nội bào sớm [29] Thể nội bào sớm tiếp tục trưởng thành để trở thành thể nội bào muộn Các thể nội bào muộn có hai số phận: hoặc là phát triển thành tiêu thể hoặc phát triển tạo thành thể đa bào (multivesicle body - MVB) có chứa EX bên trong [24, 29, 30, 53] Thể đa bào này dung hợp màng với màng tế bào và giải phóng EX ra môi trường ngoại bào [18, 29, 30, 53] Trong quá trình hình thành và giải phóng, các phân tử sinh học được đóng gói vào trong EX và sau đó được giải phóng cùng EX ra môi trường ngoại bào Sơ đồ tóm tắt quá trình hình thành và giải phóng EX được mô tả trong Hình 1

Có nhiều thành phần protein tham gia vào sự hình thành EX, trong đó có vai trò quan trọng của phức hệ phân loại của thể nội bào cần thiết cho vận chuyển (endosomal sorting complexes required for transport, ESCRT) ESCRT gồm bốn phức hợp protein khác nhau, ESRCT-0, -I, -II, và -III, và phức hệ AAA-ATPase Vps4 Các nghiên cứu chỉ ra rằng việc loại bỏ đi các protein ESCRT-0, Hrs, TSG101, ESCRT-I, và STAM1 sẽ làm giảm quá trình tiết EX; trong khi đó nếu loại đi các protein ESCRT-III và các protein

có liên quan như CHMP4C, Vps4B, VTA1, và Alix sẽ tăng khả năng tiết EX [20] Bên cạnh protein ESCRT thì lipid và một số protein khác chẳng hạn như lactadherin, thụ thể của yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (platelet-derived growht factor, PDGF), annexin, flotillins, GTPases, protein shock nhiệt, và tetraspanins cũng tham gia vào quá

5

trình hình thành và giải phóng EX [18] EX sau khi được tiết ra đóng vai trò như một sứ giả, giao tiếp với các tế bào khác thông qua quá trình neo đậu và dung hợp màng nhờ phức hệ thụ thể protein gắn yếu tố nhạy cảm với Nethylmaleimide (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors, SNAREs), cụ thể là liên kết giữa protein v-SNARE trên tế bào cho và protein t-SNARE trên tế bào nhận) và ESCRT [18]

Hình 1: Quá trình hình thành EX [20]

Sử dụng cả kỹ thuật truyền thống và hiện đại, rất nhiều protein, lipid và microRNA đã được phát hiện trong EX Theo thống kê, hiện có 41.860 protein, 2.838 microRNA và 1.116 lipid đã đăng tải trên cơ sở dữ liệu ExoCarta để tham khảo (http://www.exocarta.org/, truy cập 16/3/2020)

1.1.2.1 Protein

Protein và lipid là hai thành phần chính của màng EX [65] Tuy nhiên, thành phần protein của EX có thể thay đổi phụ thuộc vào bản chất của tế bào tiết ra chúng Một họ

protein cytosol thường thấy trong EX đó là protein Rab, họ protein lớn nhất thuộc lớp G protein nhỏ giúp điều hòa quá trình gắn và hợp màng của EX [30] Ngoài Rab ra, annexin cũng có rất nhiều trong EX (annexin I, II, IV, V, VII, và X1) hỗ trợ quá trình vận chuyển,

và dung hợp màng [30]

EX còn được làm giàu bởi họ protein tetraspanins (CD63, CD81, và CD9) tương tác với nhau tạo thành một phức hệ có vai trò trong việc trao đổi các protein xuyên màng Các protein shock nhiệt (HSP60, HSP70, và HSP90) cũng được biểu hiện trong EX Bên cạnh đó, EX chứa cả những protein đặc hiệu cho tế bào như A33 (tế bào biểu mô đại tràng), CD86 (tế bào trình diện kháng nguyên), và CD24 (đặc trưng cho các EX phân lập

từ nước tiểu và nước ối) [30]

Ngoài ra, các protein ngoại bào khác cũng được phát hiện nhiều trong EX, bao gồm các enzyme chuyển hóa (GAPDH, enolase 1, aldolase 1, PKM2, PGK1, PDIA3, GSTP1, DPP4, AHCY, TPL1, ), ribosomal protein (RPS3), protein chuyển màng (PIGR, LAMP1, và CD59), protein truyền tín hiệu (syntenin, G protein ), protein bám dính màng (MFGE8 và integrin), ATPase, khung xương tế bào (actin, tubulin, keratin, fibronectin 1, ), và các phân tử ubiquitin (ubiquitin B và C) (Hình 2) [30]

mẹ [57] Nhưng ngược lại, thành phần phosphatidylcholine lại được tìm thấy ít hơn trong

EX [57] Quan trọng hơn, các nhà khoa học đã phát hiện thấy nồng độ ceramide khá cao tại vị trí MVB được hình thành, điều này đưa ra đề xuất rằng có thể ceramide là thành phần hữu ích giúp tạo điều kiện cho việc hình thành EX [57] Ngoài ra, màng bên trong của MVB được chứng minh là chứa rất nhiều axit lyosbisphosphatidic (LBPA), và do đó LBPA cũng được cho là đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành EX [30]

tế bào ung thư dạ dày AZ-P7a cùng với một số dòng tế bào ung thư khác bao gồm: dòng

tế bào ung thư phổi SBC-3/DMS-35/NCI-H69, dòng tế bào ung thư đại trực tràng SW480/ SW620, và dòng tế bào ung thư dạ dày AZ-521 Kết quả, các tác giả phát hiện thấy rằng các phân tử thuộc họ let-7 miRNA có rất nhiều trong EX có nguồn gốc từ dòng

tế bào ung thư dạ dày AZ-P7a và ít hơn trong EX có nguồn gốc từ những dòng tế bào còn lại [38] Ngoài ra, mức độ biểu hiện của miRNA thay đổi theo các điều kiện sinh lý khác nhau [65] Ví dụ mức độ biểu hiện của miR-21 trong EX có nguồn gốc từ huyết tương của người khỏe mạnh thấp hơn so với bệnh nhân mắc bệnh u não [47] Do vậy, thành phần và hàm lượng miRNA trong EX cũng phản ánh nguồn gốc tế bào tiết và tình trạng sinh lý bình thường hay bệnh lý của tế bào tiết ra chúng Điều này cho thấy miRNA trong EX có tiềm năng sử dụng như là dấu ấn sinh học (biomarker) để chuẩn đoán bệnh [65] Một số nghiên cứu cũng chỉ ra rằng miRNA có thể được sử dụng để hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng chẳng hạn như một tập hợp các miRNA có trong EX có nguồn gốc từ huyết tương gồm let-7a, miR-1229, miR-1246, miR-150, miR-21, miR-223, và miR-23a

có thể được sử dụng để chẩn đoán ung thư đại trực tràng [37]

Nhờ các thành phần được đóng gói vào bên trong mà EX được chứng minh là có vai trò quan trọng trong việc điều hòa các quá trình sinh học của cơ thể theo các cơ chế

9

khác nhau: (1) tương tác qua phối tử/thụ thể: thể tiết nhận diện tế bào đích và tác động điều chỉnh chức năng tế bào đích thông qua các thụ thể trên bề mặt tế bào; (2) tương tác thông qua dung hợp trực tiếp màng: thể tiết nhận ra tế bào đích thông qua thụ thể trên bề mặt tế bào, sau đó màng thể tiết dung hợp với màng tế bào và giải phóng các phân tử nội tại trong thể tiết vào tế bào chất của tế bào nhận; và (3) tương tác thông qua nhập nội bào: toàn bộ thể tiết nhập vào trong tế bào trước khi màng thể tiết bị phân giải để giải phóng các thành phần phân tử nội tại trong thể tiết vào tế bào chất của tế bào nhận [51]

Sự hoạt động của EX như vậy được gọi là cơ chế truyền tin Kết quả của quá trình là gây

ra sự thay đổi chức năng sinh lý của cơ thể

1.1.3 Chức năng của exosome

EX có vai trò quan trọng trong các quá trình sinh lý học của cơ thể do chúng có thể tác động đến chính nhóm tế bào tiết ra chúng hoặc tác động đến các tế bào khác ở môi trường xung quanh [51] EX ngày càng được nghiên cứu nhiều trong việc thiết lập nguồn dấu ấn sinh học (biomarker) để chẩn đoán bệnh và là vec tơ mang thuốc đến đích cho các ứng dụng điều trị lâm sàng [42] Tính đến năm 2019, theo thống kê đã có 93 thử nghiệm lâm sàng liên quan đến EX đăng tải trên trang thử nghiệm lâm sàng

www.clinicaltrials.gov Phần lớn các thử nghiệm này tập trung vào việc sử dụng EX từ một số dịch lỏng của cơ thể làm công cụ chuẩn đoán bệnh sớm để dự đoán kết quả của các phương pháp điều trị khác nhau [31] Năm 2016, sản phẩm thương mại đầu tiên trên thế giới sử dụng EX trong máu bệnh nhân để chẩn đoán ung thư phổi có tên ExoDx Lung của công ty Exosome Diagnostics ở Cambridge (Massachusetts, Mỹ) đã được lưu hành [46] Ngoài ra, việc sử dụng EX cho việc chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt đang trải qua

sự kiểm tra phê duyệt của Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) [8] Ngày càng có nhiều nghiên cứu đã chứng minh được vai trò của EX trong việc điều trị các bệnh lý tim mạch, thoái hóa thần kinh, ung thư và cả viêm gan [23, 45]

Bảng 1: Một số thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp EX [8]

đoạn

Mã số thử nghiệm lâm sàng

Hiệu quả của EX có nguồn

gốc từ huyết tương trong

việc chữa lành vết thương ở

da: thử nghiệm tiềm năng

Loét da Huyết tương giàu

EX tự thân

Bước đầu của giai đoạn 1

NCT02565264

Nghiên cứu khả năng của

EX có nguồn gốc từ thực

vật trong việc vận chuyển

curcumin đến các mô đại

EX

Giai đoạn 2

MV, và EX có nguồn gốc từ MSC dây rốn

Giai đoạn 2

và 3

NCT02138331

Thử nghiệm lâm sàng sơ bộ

đánh giá khả năng của EX

nguồn gốc từ thực vật để

loại bỏ viêm niêm mạc

miệng gây ra bởi hóa trị và

xạ trị ở bệnh nhân ung thư

đầu và cổ

Ung thư đầu và cổ

Bổ sung chế độ ăn: chiết xuất nho

Thuốc: lortab, miếng dán fent- anyl, nước súc miệng

Giai đoạn 1

NCT01668849

Nghiên cứu trọng điểm về

ảnh hưởng của metformin

đến các cytokine tiền viêm

Ung thư đầu và cổ

Xạ trị: ngoại phóng xạ

Bước đầu của

NCT03109873

giai đoạn 1

Thử nghiệm giai đoạn 2

tiêm vắc xin sử dụng EX

nguồn gốc từ tế bào DC

cảm ứng với kháng nguyên

ung thư đối với bệnh nhân

mắc bệnh ung thư phổi

không tế bào nhỏ đáp ứng

với hóa trị

Ung thư phổi không

tế bào nhỏ

EX nguồn gốc từ

tế bào DC cảm ứng với kháng nguyên ung thư

Giai đoạn 2

ác tính

Các vi hạt có nguồn gốc từ khối u

Thuốc: cisplatin

Giai đoạn 2

NCT02657460

1.2 Exosome từ tế bào tua máu cuống rốn người

1.2.1 Giới thiệu chung về tế bào tua

Tế bào tua (Dendritic cells – DC) là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp, hữu hiệu nhất trong cơ thể chúng ta và đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng Khi được cảm ứng với các kháng nguyên, các DC sẽ hoạt hóa cả tế bào T hỗ trợ và tế bào T gây chết cũng như các

tế bào B [54] Trong quá trình hoạt hóa tế bào T, thông qua sự tương tác với thụ thể của

tế bào T (T cell receptor – TCR), các tế bào DC tiết ra các cytokine đặc hiệu và kích hoạt các đáp ứng miễn dịch đối với tế bào TH1, TH2 hoặc T điều hòa [28] Chính vì sự chuyên nghiệp trong quá trình trình diện kháng nguyên chéo (sự trình diện cho cả tế bào T CD4+

và T CD8+) mà DC đã được sử dụng làm nền tảng cho việc tạo ra các vắc xin dựa trên

tế bào tua nhằm thúc đẩy các đáp ứng miễn dịch chống ung thư của tế bào T một cách hiệu quả Nhiều loại vắc xin dựa trên tế bào DC đã được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng [28]

1.2.2 Tế bào tua biệt hóa và trưởng thành từ tế bào bạch cầu mono (moDC)

Trong cơ thể, DC có thể được phân lập từ nhiều nguồn như máu ngoại vi, tủy xương, và máu cuống rốn,…Tuy nhiên, tỷ lệ của DC trong các dịch cơ thể thường khá thấp, chỉ chiếm ít hơn 1% tổng số tế bào bạch cầu mono trong máu ngoại vi [28] Do vậy, để có được số lượng DC đủ lớn cho đáp ứng miễn dịch, các phương pháp tạo ra DC bằng cách biệt hóa từ tế bào gốc tạo máu CD34+ hoặc tế bào bạch cầu mono được sử dụng phổ biến

Tế bào bạch cầu mono là một loại tế bào bạch cầu có khả năng biệt hóa để trở thành đại thực bào và DC Thông thường, tế bào mono chiếm khoảng 10% tổng số tế bào máu có nhân [9] Dựa vào sự biểu hiện các dấu ấn bề mặt, quần thể tế bào mono được chia thành các tập con gồm: CD14++ CD16-, CD14dim CD16++ và CD14++ CD16+ Trong đó các tế bào mono CD14++ CD16- chiếm tới 85% tổng số tế bào mono trong máu

ngoại vi [9] Một số thí nghiệm in vitro cũng đã chứng minh được rằng trong môi trường

có chất kích thích phù hợp như GM-CSF (granulocyte/macrophage colony stimulating factor) và IL-4 (interleukin-4), tế bào mono CD14+ có khả năng biệt hóa thành DC Sự trưởng thành của DC này có thể đạt được bằng cách nuôi cấy bổ sung với yếu tố hoại tử khối u (TNF-∝) cùng sự kích thích của kháng nguyên [33, 35] DC có nguồn gốc từ tế

bào mono được tạo ra trong điều kiện in vitro biểu hiện cao các phân tử đặc trưng của tế

bào trình diện kháng nguyên gồm: HLA-DR, CD40, CD80 và CD86 [10, 33, 35]

1.2.3 Máu cuống rốn – một nguồn cung cấp tế bào mono

Máu cuống rốn là máu còn lại trong dây rốn và nhau thai sau khi sinh con Máu cuống rốn có chứa tất cả các thành phần của máu gồm: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và huyết tương Bên cạnh đó, máu cuống rốn cũng là một nguồn cung cấp tế bào gốc tạo

13

máu rất phong phú, tương tự như tủy xương Do vậy, máu cuống rốn có thể được sử dụng như một nguồn thay thế cho tủy xương trong cấy ghép Với các lý do như: có thể thu thập máu cuống rốn dễ dàng mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe sản phụ và trẻ

sơ sinh; việc thu thập và lưu giữ cuống rốn không vi phạm đạo đức; các đơn vị tế bào máu cuống rốn được bảo quản đông lạnh lâu dài trong Ngân hàng, máu cuống rốn ngày càng được sử dụng nhiều cho các nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng để điều trị nhiều bệnh lý của hệ tạo máu, những bệnh lý rối loạn miễn dịch di truyền, đem lại nhiều hứa hẹn cho lĩnh vực y học tái tạo

1.2.4 Exosome từ tế bào tua

Không thể phủ nhận hiệu quả mà vắc xin dựa trên tế bào tua mang lại, tuy nhiên, vắc xin tế bào tua vẫn còn một số mặt giới hạn: nguồn và loại DC được sử dụng, tần suất tiêm vắc xin, khả năng di cư của DC tới hạch bạch huyết Hơn nữa DC được tiêm vào

cơ thể có thể không trực tiếp kích hoạt các đáp ứng miễn dịch, nhưng thay vào đó có thể gián tiếp kích hoạt thông qua DC đã có sẵn trong hạch bạch huyết [2] Ngoài ra, các thành phần phân tử của DC có thể thay đổi và rất khó để xác định; phức hệ MHC-II trên

bề mặt màng tế bào ít hơn so với Dex [43] Các tế bào ung thư có thể tiết một số cytokine

ức chế miễn dịch làm chuyển đổi DC trưởng thành thành các DC dung nạp và có thể dẫn đến sự hoạt hóa các tế bào T điều hòa, ngăn chặn các đáp ứng miễn dịch [41] Các DC sống thường khó để lưu trữ và phải đòi hỏi quá trình thu nhận phức tạp cũng như cần nhiều kỹ thuật đánh giá chất lượng tế bào [43]

Để khắc phục những khó khăn khi ứng dụng vắc xin tế bào tua trong liệu pháp miễn dịch chống ung thư, các EX tiết từ DC (Dexosomes – Dex) được phát triển để sử dụng như là một cách thay thế trong liệu pháp vắc xin Giống với DC, thành phần phân

tử của Dex bao gồm sự biểu hiện bề mặt của phức hệ MHC-II, các phân tử đồng kích hoạt và các thành phần khác có khả năng tương tác với các tế bào miễn dịch [43] Dex

có thể tạo điều kiện cho việc loại bỏ khối u phụ thuộc tế bào miễn dịch và có những lợi thế khác biệt so với liệu pháp miễn dịch dựa trên DC như: thành phần phân tử của Dex hoàn toàn có thể xác định được đối với mỗi bệnh nhân; Dex rất giàu phân tử MHC-II,

gấp 10 - 100 lần so với tế bào tua [43] Thành phần lipid của Dex có tính ổn định cao lên đến 6 tháng nếu bảo quản ở -80 oC [3] Theo đó, các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I và

II dựa trên Dex đã được tiến hành đối với các khối u ác tính, cho thấy tính khả thi và độ

an toàn của phương pháp này [60]

Sự quan tâm của các nhà miễn dịch học liên quan đến EX bắt nguồn từ một nghiên cứu vào năm 1996, người ta đã xác định được các tế bào B tiết các EX mang kháng nguyên có khả năng kích thích đáp ứng của tế bào T đặc hiệu với MHC lớp II Hai năm sau đó, Zitvogel và cộng sự đã phân tích rằng các tế bào miễn dịch bắt đầu các đáp ứng miễn dịch bằng cách trình diện phức hệ MHC đến tế bào T non [66] Họ chỉ ra rằng DC cũng tiết các EX có khả năng trình diện kháng nguyên Cả tế bào tua non và trưởng thành đều có thể giải phóng EX Các Dex mang rất nhiều phân tử cần thiết cho sự trình diện kháng nguyên, như MHC lớp I, MHC lớp II, các phân tử đồng kích thích như CD40, CD80, và CD86 cũng như các phân tử liên kết, phân tử bám dính giữa các tế bào (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1), integrin [32] Dex có khả năng hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch mắc phải [7, 44, 52, 62] Các Dex đã cảm ứng với các peptide ung thư có khả năng hoạt hóa các tế bào T gây độc (cytotoxic T

lymphocyte – CTL) in vitro và ngăn chăn sự phát triển của khối u theo cách phụ thuộc

MHC và tế bào CTL [66]

EX có nguồn gốc từ DC có khả năng thực hiện các chức năng miễn dịch quan trọng [43] Khả năng điều hòa các đáp ứng miễn dịch thông qua các đặc điểm tự nhiên của EX trong đó bao gồm việc phân phối các phân tử “hàng hóa” (cargo molecules) dưới dạng hoạt tính sinh học đặc biệt phải kể đến ở đây đó là vận chuyển kháng nguyên bề mặt [60] Chức năng này lần đầu tiên được chứng minh trên một mô hình chuột khi EX sau khi được cảm ứng với các peptide khối u có khả năng loại bỏ khối u ở chuột [66] Kết quả trên mô hình chuột đã này đã khuyến khích tiến hành hai thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trong đó EX có nguồn gốc từ tế bào DC chưa trưởng thành từ bệnh nhân mắc ung thư hắc tố di căn và ung thư phổi không tế bào nhỏ được cảm ứng với kháng nguyên ung thư và sau đó EX tự thân đã được hoạt hóa sẽ được truyền trở lại cho chính các bệnh

15

nhân mắc bệnh [14, 34] Mặc dù những nghiên cứu đã chứng minh sự an toàn và khả thi của việc sử dụng EX trong các ứng dụng lâm sàng, tuy nhiên các nhà khoa học đã thất bại trong việc tạo ra các đáp ứng miễn dịch mạnh đặc hiệu với kháng nguyên, có thể do khả năng kích thích miễn dịch yếu của EX có nguồn gốc từ DC chưa trưởng thành [60]

Tiếp theo đó, trong một thử nghiệm pha II gần đây nhất đã được đăng trên tạp chí Oncoimmunology, những bệnh nhân mắc ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được điều trị bằng việc sử dụng EX cảm ứng với Interferon gamma (IFN-γ)và kháng nguyên ung thư [4] INF-γ đã được chứng minh là có khả năng kích thích sự biểu hiện các phân tử đồng kích hoạt và ICAMs trên tế bào DC [61] So với Dex thế hệ đầu (không cảm ứng bằng IFN), các EX thế hệ hai biểu hiện các kiểu hình của các EX trưởng thành, với sự tăng biểu hiện MHC lớp II, tetraspanin, CD40, CD86 và ICAM-1/CD54 Kết quả cho thấy việc sử dụng Dex là an toàn và Dex có thể hoạt hóa các tế bào tiêu diệt tự nhiên (natural killer cell – NK) giết tế bào ung thư [4] Tuy nhiên, tác giả chỉ phát hiện được

sự đáp ứng nhẹ từ tế bào T đối với Dex [4] Hiệu quả điều trị của nghiên cứu này không đạt được như kì vọng, điều này có thể là do EX tiết ra bởi tế bào DC chưa trưởng thành

có thể gây ức chế miễn dịch; lượng kháng nguyên ung thư sử dụng chưa đủ liều lượng cho lâm sàng; liều lượng và số lần tiêm Dex cho bệnh nhân chưa được tối ưu; và lí do quan trọng hơn cả là thiếu các đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T gây độc [64] Mặc

dù còn có một số hạn chế và thách thức, Dex vẫn được coi như là một chiến lược nhiều tiềm năng trong miễn dịch trị liệu ung thư Với những tiến bộ trong nghiên cứu cũng như phát triển, những nghiên cứu cơ bản cũng như các thử nghiệm lâm sàng tiếp theo là rất cần thiết để khắc phục các hạn chế trên và sớm đưa liệu pháp vào ứng dụng trong điều trị ung thư

1.3 Exosome từ tế bào gốc trung mô

1.3.1 Giới thiệu chung về tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells - MSC) là loại tế bào gốc có tiềm năng tăng sinh mạnh và có thể dễ dàng phân lập được từ nhiều loại mô khác nhau của cơ thể Chúng cư trú trong hầu hết các mô liên kết bao gồm tủy xương, mô mỡ, dây rốn

[23] Hiệp hội quốc tế về liệu pháp tế bào (International Society for Cellular Therapy – ISCT) đã đưa ra các tiêu chuẩn tối thiểu nhằm xác định một quần thể MSC sau khi phân lập và nuôi cấy bao gồm: khả năng bám dính bề mặt khi chúng được nuôi cấy trong điều kiện tiêu chuẩn; biểu hiện các kháng nguyên bề mặt đặc trưng CD105, CD73 và CD90

và không biểu hiện CD45, CD34, CD14/CD11b, CD79α/CD19, và HLA-DR; và khả

năng biệt hóa thành các tế bào mỡ, nguyên bào xương và nguyên bào sụn in vitro [12]

Hiệu quả trị liệu của MSC được cho là nhờ khả năng di chuyển, tích hợp vào mô bệnh hoặc tổn thương và biệt hóa để thay thế cho các tế bào bệnh hoặc bị tổn thương Bên cạnh những tác dụng trị liệu có lợi mà MSC mang lại thì vẫn tồn tại một số nhược điểm, chẳng hạn như trong số các ca ghép MSC mang lại hiệu quả trị liệu, chỉ quan sát thấy dưới 1% MSC được truyền vào tham gia biệt hoá để sửa chữa mô tổn thương [11, 15,

22, 48, 59], độc tính sau khi truyền gây ra bởi các tế bào lớn bị mắc kẹt trong các vi mạch phổi, hiện tượng thải ghép, và hình thành mô ngoài tử cung [31] Hơn nữa, ngày càng nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu quả trị liệu của MSC chủ yếu thông qua các chất tiết hơn

là cơ chế biệt hoá trực tiếp của chúng và có thể đóng vai trò thay thế cho liệu pháp tế bào [31]

1.3.2 Dây rốn - Nguồn cung cấp tế bào gốc trung mô

Dây rốn là phần mô kết nối giữa nhau thai và bào thai, có nhiệm vụ cung cấp oxi

và dinh dưỡng cho thai nhi trong quá trình phát triển Dây rốn là nguồn chứa rất nhiều loại tế bào gốc khác nhau bao gồm tế bào gốc biểu mô (Epithelial Stem Cells) và nội mô (Endothelial Stem Cells) nhưng chiếm tỷ lệ lớn là MSC Trước đây, nguồn thu nhận chủ yếu của MSC là tủy xương Tuy nhiên, việc phân lập MSC từ tủy xương gây đau đớn cho bệnh nhân và dễ gặp những rủi ro như nhiễm khuẩn, và tiềm năng của MSC bị giảm dần theo tuổi tác của bệnh nhân và chỉ sử dụng để ghép tự thân [1] Hiện nay, dây rốn được coi là nguồn thu nhận MSC số lượng lớn và ít gây tranh cãi nhất bởi dây rốn là phần thường được bỏ đi trong quá trình sinh sản Tương tự như máu cuống rốn, việc thu thập dây rốn khá dễ dàng mà không gây ảnh hưởng đến sức khỏe sản phụ và trẻ sơ sinh, việc thu thập và lưu giữ dây rốn không vi phạm đạo đức và các đơn vị tế bào phân lập từ

17

dây rốn được bảo quản đông lạnh lâu dài; do vậy, dây rốn ngày càng được sử dụng nhiều cho các nghiên cứu và ứng dụng lâm sàng trong cấy ghép và lĩnh vực y học tái tạo

1.3.3 Exosome từ tế bào gốc trung mô

Tương tự như EX tiết từ các tế bào khác, EX có nguồn gốc từ MSC (Mexosomes – Mex) có mang protein, mRNA, và microRNA và tham gia vào quá trình giao tiếp giữa các tế bào Tính đến thời điểm hiện tại, theo thống kê đã có khoảng 900 protein được phát hiện trong Mex [31] Ngoài các marker bề mặt đặc trưng cho EX như CD9, CD81

và CD63, Mex cũng biểu hiện một số phân tử bề mặt tương tự như MSC bao gồm CD44, CD73, và CD29 [27] Bên cạnh đó, mỗi loại Mex đều chứa một nhóm protein riêng biệt tùy thuộc vào bản chất tế bào tiết và chúng quy định vai trò của thể tiết exosome Chẳng hạn như Mex có nguồn gốc từ tủy xương đóng góp vào việc điều hòa miễn dịch thông qua các cytokine và các yếu tố tăng trưởng tế bào như interleukine – 10 (IL-10), interleukine – 6 (IL – 6), yếu tố tăng trưởng cảm biến dịch chuyển (transforming growth factor beta 1, TGF-β1) và yếu tố tăng trưởng tế bào gan (hepatocyte growth factor, HGF) [8] Ngoài protein, các Mex có chứa miRNA cũng tham gia điều hòa các quá trình sinh

lý cũng như bệnh lý của cơ thể, chẳng hạn như điều hòa di truyền ngoại gen, điều hòa miễn dịch, và các quá trình hình thành và phát triển khối u [8] Cụ thể như các miR-23b, miR-125b, miR-451, miR-223, miR-31, miR-24, miR-214 và miR-122 trong Mex tham gia điều hòa quá trình tế bào chết theo chương trình và ức chế sự phát triển khối u thông qua nhiều cơ chế khác nhau [16, 39] Ngoài ra, Mex cùng với sự phong phú về các thành phần được đóng gói trong chúng có tiềm năng ứng dụng trong điều trị các bệnh lý tim mạch, sửa chữa mô (thận, gan, da, và giác mạc), bệnh miễn dịch và các bệnh thần kinh [8] Cơ chế hoạt động chủ yếu của Mex là thông qua việc liên tục truyền các thành phần sinh học phân tử đến tế bào đích, hay còn gọi là cơ chế cận tiết, và dẫn đến sự thay đổi của một loạt các hoạt động bên trong tế bào đích [8]

Ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh Mex mang lại hiệu quả trị liệu thông qua cơ chế truyền tin cận tiết [23] Chẳng hạn như nghiên cứu của Bi cùng cộng sự

(2007) đã chứng minh rằng môi trường điều kiện nuôi cấy in vitro MSC kích thích quá

trình tăng sinh và di chuyển các tế bào biểu mô có nguồn gốc từ thận và cải thiện tỷ lệ

sống của tế bào ống thận in vivo [5] Năm 2008, Timmer và cộng sự đã chỉ ra khi tiêm

môi trường điều kiện nuôi cấy MSC vào tĩnh mạch lợn thì làm giảm đến 60% kích thước cục máu đông trong nhồi máu cơ tim [55] Thêm vào đó, nghiên cứu của Wang và cộng

sự cho thấy thể tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn giúp tăng cường biểu hiện Smad7 thông qua việc ức chế miR-125b-5p dẫn đến làm giảm quá trình tổn thương cũng như quá trình tế bào chết theo chu trình của tế bào cơ tim [63]

Hiệu quả điều trị của MSC trong việc điều trị tổn thương gan đã được ghi nhận Nghiên cứu về mô hình chuột bị xơ hóa gan do carbon tetrachloride (CCl4) gây ra đã chứng minh rằng Mex có thể thúc đẩy tái tạo gan bị tổn thương thông qua sự tăng sinh của tế bào gan và giảm đáng kể tỷ lệ chết ở nhóm chuột bị xơ hóa gan [49] Khả năng phục hồi tổn thương gan của Mex được cho là có liên quan tới biểu hiện của các gene trong giai đoạn khởi động tái tạo gan dẫn tới sự biểu hiện cao của protein PCNA (proliferating cell nuclear antigen) và cyclin D1 và thông qua sự ức chế tế bào gan chết theo chương trình bởi protein Bcl-xL (B-cell lymphoma-extra large) [49]

Theo nghiên cứu của Zhang và cộng sự, EV có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô dây rốn (UCMSC) có thể làm tăng khả năng tăng sinh và khả năng sống sót của tế bào

sừng (keratinocyte) và nguyên bào sợi (fibroblast) in vitro cũng như thúc đẩy quá trình tái tạo da ở mô hình chuột bị bỏng da in vivo bằng cách hoạt hóa con đường truyền tín

hiệu AKT và Wnt4/ β-catenin liên quan đến sự sống sót của tế bào da, tăng sinh và chữa lành vết thương [6] Trong một nghiên cứu khác, thể tiết từ tế bào gốc trung mô dây rốn

có thể kích thích chức năng của các nguyên bào sợi ở người bình thường in vitro bằng

cách tăng cường tạo ra các thành phần của cấu trúc nền hay chất nền ngoại bào (extracellular matrix-ECM) như collagen, fibronectin và elastin [26] Ngoài ra, môi trường nuôi cấy MSC và Mex cải thiện sự thoái hóa tế bào thần kinh do viêm gây ra ở

mô hình chuột bị chấn thương não [13]; giảm tích tụ mảng peptide trong bệnh Alzheimer [25]

19

Không chỉ nghiên cứu in vitro và trên các mô hình động vật, các thử nghiệm lâm

sàng ứng dụng của Mex cũng đang được tiến hành [8, 26, 36] Nassar và cộng sự (2016)

đã tiến hành thử nghiệm trên một nhóm gồm 20 bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính được điều trị bằng EV nguồn gốc từ UCMSC (UCMSC-EV) và một nhóm khác là nhóm đối chứng gồm 20 bệnh nhân sử dụng giả dược [36] Kết quả cho thấy rằng nhóm sử dụng UCMSC-EV không có tác dụng phụ và cải thiện đáng kể chức năng thận Họ cũng tiến hành kiểm tra nồng độ của TGF–β, IL-10 và TNF-α và nhận thấy rằng nồng độ của TGF–

β và IL-10 tăng đáng kể ở những bệnh nhân được điều trị bằng UCMSC-EV ngắn hạn (12 tuần) Nồng độ của TNF-α, một cytokine tiền viêm, giảm ngay sau khi dùng UCMSC-EV và trong năm tiếp theo khi được điều trị với UCMSC-EV [36] Các kết quả này cho thấy tiềm năng to lớn và quan trọng của Mex trong việc phát triển thành liệu pháp chữa bệnh không phải tế bào trong tương lai

CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu máu cuống rốn

Nghiên cứu được thông qua bởi Hội đồng Y đức của Viện nghiên cứu Y sinh Đinh Tiên Hoàng, văn bản số IRB.009, ký ngày 20 tháng 6 năm 2018

Máu cuống rốn được cung cấp bởi Ngân hàng máu cuống rốn - Bệnh viên Đa khoa Quốc tế Vinmec, Hà Nội (Hình 3) Máu cuống rốn được thu thập trực tiếp từ tĩnh mạch dây rốn của trẻ sơ sinh ngay sau khi mẹ sinh em bé Trong đó, người mẹ đã được thông báo đầy đủ về mục đích của nghiên cứu và đồng ý hiến tặng mẫu dây rốn cũng như máu cuống rốn Yêu cầu người mẹ khỏe mạnh, không mắc các bệnh truyền nhiễm như HIV, HBV, HCV, CMV và HSV

Hình 3: Mẫu máu cuống rốn được thu thập tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec,

Hà Nội

2.1.2 Tế bào gốc trung mô dây rốn người

Tế bào UCMSC được cung cấp bởi nhóm EV – Phòng dự án sản xuất, Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec, Hà Nội

21

2.1.3 Tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549

Dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549 được mua từ Ngân hàng ATCC,

Mỹ

2.2 Hóa chất và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

Bảng 2: Các hóa chất được sử dụng

1 Human Lymphocyte KBM 551 medium Corning, Trung Quốc

2 Recombinant Human GM-CSF Peprotech, Mỹ

3 Recombinant Human IL-4 Peprotech, Mỹ

4 Recombinant Human TNF-α Peprotech, Mỹ

Technologies, Canada

Mỹ

12 HLADR – FITC conjugated antibody Beckman Coulter, Mỹ

13 CD40 – PE conjugated antibody Beckman Coulter, Mỹ

14 CD80 – PE conjugated antibody Beckman Coulter, Mỹ

15 CD86 – PE conjugated antibody Beckman Coulter, Mỹ

16 CD14 – PC7 conjugated antibody Beckman Coulter, Mỹ

17 CD123 – APC Vio conjugated antibody Miltenyi Biotech,

Đức

18 IgG1 mouse – FITC Isotype Control antibody Beckman Coulter, Mỹ

19 IgG1 mouse – PE Isotype Control antibody Beckman Coulter, Mỹ

20 IgG2a mouse – PC7 Isotype Control antibody Beckman Coulter, Mỹ

21 IgG1 mouse – APC Vio Isotype Control

antibody

Miltenyi Biotech,

Đức

22 Human MSC Analysis Kit BD Biosciences, Mỹ

Mỹ

25 Pierce™ BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific,

Mỹ

26 NuPAGE™ LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen, Mỹ

27 NuPAGE™ MOPS SDS Running Buffer(20X) Invitrogen, Mỹ

28 Pierce® Silver Stain Kit Thermo, Mỹ

31 Anti – GAPDH antibody Santa Cruz, Mỹ

32 Amersham ECL

TM Anti – mouse IgG Peroxidase conjugated (HRP) GE Healthcare, Mỹ

TM ECLTM start Western Blotting

37 AmershamTM HybondTM P 0.45 PVDF GE Healthcare, Đức

41 Fetal bovine serum (FBS) Thermo, Mỹ

42 Penicillin/ streptomycine Thermo, Mỹ

Nha

45 AmershamTM ECLTM blocking reagent GE Healthcare, Mỹ

46 Tris Buffered Saline 10X Santa Cruz, Mỹ

48 Restore™ PLUS Western Blot Stripping

49 Pierce Silver Stain Kit Thermo, Mỹ

50 Axit acetic Merck, Đức

51 AmershamTM ECLTM Rainbow marker GE Healthcare, Mỹ

2.2.2 Thiết bị

Bảng 3: Các thiết bị được sử dụng

12 Bình chứa nito lỏng Taylor-Wharton, Mỹ

13 Hệ thống chạy điện di và chuyển màng lai

14 Máy lắc có điều nhiệt MAXQ 4000 Thermo, Mỹ

15 Máy chụp ảnh gel điện di quang hóa và huỳnh

quang ImageQuant LAS500

GE Healthcare, Nhật

Bản

16 Tủ thao tác với hóa chất bay hơi ESCO, Indonesia

17 Bể ổn nhiệt khô MG-2200 EYELA, Nhật Bản

25

18 Máy ly tâm lạnh 5427R Eppendorf, Đức

20 Kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL, Nhật Bản

2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Bảng 4: Dụng cụ và vật tư tiêu hao

1 Chai nuôi cấy tế bào 75 cm2 Falcon, Mỹ

2 Ống ly tâm (15 ml, 50 ml, 225 ml) Falcon, Mỹ

3 Micropipette tips (10 μl, 200 μl, 1000 μl) Falcon, Mỹ

4 Micropipette (2.5 μl, 10 μl, 200 μl, 1000 μl) Eppendorf, Đức

8 Xy lanh 10 ml và 20 ml Terumo, Philippines

11 Ống lưu trữ (2.0 ml, 5 ml) Corning, Mỹ

14 Ống ly tâm Thinwall Ultra-Clear 38.5 ml Beckman Coulter, Mỹ

15 Ống ly tâm Thinwall Ultra-Clear 14.0 ml Beckman Coulter, Mỹ

16 Serological pipette (5 ml, 10 ml, và 25 ml) Thermo, Mỹ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy biệt hóa và trưởng thành tế bào tua từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người

Quy trình thí nghiệm nuôi cấy và biệt hoá tế bào tua trưởng thành được tiến hành theo trình tự các bước như trên Hình 4 Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện các quá trình phân lập, biệt hóa và trưởng thành DC dựa theo hướng dẫn sử dụng môi trường Human Lymphocyte Serum – Free Medium KBM551 của nhà cung cấp

Máu cuống rốn

Phân lập tế bào đơn nhân

Phân lập tế bào mono

Biệt hóa thành tế bào

Cảm ứng imDC với kháng nguyên ung thư

Dịch ly giải tế bào A549

Cảm ứng thành mDC TNF-α

Thu hoạch mDC, môi trường nuôi mDC

Phân tích tế bào sử dụng Flow cytometry

Ngày 5

Ngày 6

Ngày 7 Ngày 1

Hình 4: Quy trình nuôi cấy biệt hóa và trưởng thành DC từ tế bào bạch cầu mono máu cuống rốn người

27

2.3.1.1 Phương pháp phân lập tế bào đơn nhân (mononuclear cell – MNC) từ máu cuống rốn

Phân lớp tế bào bằng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng sử dụng Ficoll

Pha loãng máu cuống rốn toàn phần bằng Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) (Gibco, Mỹ) theo tỉ lệ 1 : 1 về thể tích và cho vào ống đã chứa sẵn dung dịch Ficoll theo

tỉ lệ 2 : 1 về thể tích Ly tâm với tốc độ 840 × g trong 20 phút Sau khi ly tâm, dung dịch

trong ống sẽ phân thành 4 lớp như trên Hình 5gồm có: (1) lớp trên cùng có màu vàng nhạt gồm có PBS và plasma; (2) lớp thứ hai có màu trắng đục chính là lớp buffy coat chứa phần lớn tế bào đơn nhân (gồm tế bào mono, tế bào lympho, và tế bào NK) và một

số ít tiểu cầu; (3) lớp thứ ba gồm dung dịch Ficoll có lẫn một số ít bạch cầu hạt (granulocytes); và (4) lớp cuối cùng là các tế bào hồng cầu Loại bỏ huyết tương phía trên, thu lớp tế bào đơn nhân (lớp buffy coat) ở giữa và chuyển sang ống ly tâm 50 ml

Bổ sung PBS vào lớp buffy coat để thể tích trong ống đạt 45 ml và trộn đều, ly tâm với

tốc độ 640 × g trong 10 phút Loại bỏ dung dịch nổi phía trên, tiếp tục bổ sung thêm 20

ml PBS và ly tâm với tốc độ 270 × g trong 8 phút Cặn tế bào được đánh tan trong dung

dịch PBS để đếm số lượng tế bào bạch cầu đơn nhân (mononuclear cells – MNC) bằng buồng đếm tế bào tiêu chuẩn Nhuộm tế bào đơn nhân với thuốc nhuộm Turk theo tỉ lệ 1:1 về thể tích và đếm trên buồng đếm tế bào Số lượng tế bào được tính như sau:

MNC = 𝐒ố 𝐭ế 𝐛à𝐨 𝐛ắ𝐭 𝐦à𝐮 𝐭í𝐦

𝟒 × Độ pha loãng × Thể tích (ml) × 𝟏𝟎𝟒

Các tế bào MNC được thu nhận để đánh giá chất lượng bằng kỹ thuật đếm tế bào

theo dòng chảy và chuẩn bị cho nuôi cấy