khảo sát tác dụng trị nám của cao chiết từ lá tía tô trên mô hình thỏ gây nám da bằng progesteron kết hợp chiếu tia uv

TÓM TẮT Mục tiêu Khảo sát tác động ức chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin của cao chiết lá tía tô in vitro.. Khảo sát tác động ức chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin củ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ THANH HẢO

KHẢO SÁT TÁC DỤNG TRỊ NÁM CỦA CAO CHIẾT

TỪ LÁ TÍA TÔ TRÊN MÔ HÌNH THỎ GÂY NÁM DA BẰNG PROGESTERON KẾT HỢP CHIẾU TIA UV

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

ĐỖ THANH HẢO

KHẢO SÁT TÁC DỤNG TRỊ NÁM CỦA CAO CHIẾT

TỪ LÁ TÍA TÔ TRÊN MÔ HÌNH THỎ GÂY NÁM DA BẰNG PROGESTERON KẾT HỢP CHIẾU TIA UV

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Chuyên ngành: Dược lý và Dược lâm sàng

Mã số: 8720205

Người hướng dẫn Khoa học: PGS TS Huỳnh Ngọc Trinh

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này là công trình nghiên cứu khoa học của riêng Tôi dưới sự hướng dẫn của Thầy PGS TS Huỳnh Ngọc Trinh Các

số liệu, kết quả báo cáo trong Luận văn là do Tôi nghiên cứu, tham khảo tài liệu, kế thừa và tiến hành làm thực nghiệm một cách trung thực, khách quan dưới sự cố vấn của Thầy hướng dẫn và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Các trích dẫn mà Tôi viết trong Luận văn này đều đã được nêu rõ nguồn gốc

TP Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 10 năm 2020

Học viên

ĐỖ THANH HẢO

TÓM TẮT Mục tiêu

Khảo sát tác động ức chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin của cao

chiết lá tía tô in vitro Mô phỏng mô hình gây nám da trên thỏ bằng

progesteron kết hợp chiếu tia UV Khảo sát tác động ức chế tyrosinase và

quá trình tổng hợp melanin của cao chiết lá tía tô in vivo

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Cao toàn phần (cao TP) của lá Tía tô được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với ethanol 50% Các cao phân đoạn được chiết bằng phương pháp lắc phân bố lỏng-lỏng với cloroform và ethylacetat thu được cao ethylacetat (EA) và acetat/clorofom (EA/CF) Tác động ức chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin của các cao Tía tô được đánh giá thông qua hoạt độ tyrosinase, hàm lượng melanin trên tế bào B16F10 Mô phỏng mô hình gây

nám da trên bằng progesteron kết hợp chiếu tia UV trên thỏ British giant

và New Zeland, giống cái, khoảng 4 - 5 tháng tuổi Đánh giá tác động ức

chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin của các cao Tía tô trên mô hình thỏ đã gây nám

Kết quả

89,96 µg/ml; 105,78 µg/ml Mô hình gây nám da bằng chiếu tia UV 30 phút/ngày kết hợp với tiêm Progesteron liều 5 mg/kg cách ngày cho thấy

có sự khác biệt rõ rệt giữa lô chứng bệnh với lô sinh lý Cao phân đoạn EA

ở nồng độ 5% và 10% cho tác động phòng ngừa tương đương Cao EA 5% cho hiệu quả điều trị tương đương Hydroquinon 4%

Kết luận

Cao EA và EA/CF đều ức chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin trên tế bào B16F10 Tác động phòng ngừa của cao EA 5% tương đương 10% Tác động điều trị cao EA 5% tương đương Hydroquinon 4%

Từ khóa: melanin, tyrosinase, Tía tô

SUMMARY Objectives

Investigation of tyrosinase inhibitory effects and melanin synthesis of

perilla leaf extract in vitro Simulating the model of skin pigmentation in

rabbits with progesterone combined with UV irradiation Investigating the inhibitory effect of tyrosinase and melanin synthesis of perilla leaf extract

in vivo

Materials and methods

Total extract (TP) was obtained by maceration method with 50% ethanol from perilla leaves TP extract were then by fractionaited by a liquid-liquid distribution with chloroform and ethylacetate to obtain extract ethylacetate (EA) and acetate/chloroform (EA/CF) The inhibitory effect of tyrosinase and melanin synthesis of the perilla extracts were assessed by tyrosinase activity, melanin content in B16F10 cells Simulating upper skin pigmentation by progesterone combined with UV irradiation in British giant and New Zealand rabbits, female, about 4-5 months old Evaluation

of tyrosinase inhibitory effects and melanin synthesis of perilla extract in a rabbit model causing melasma

Results

ml, respectively; 105.78 µg / ml The model of 30 minutes / day UV irradiated skin pigmentation combined with progesterone injection at a dose of 5 mg/kg every other day showed that there was a clear difference between the control group and the physiological group EA concentrations

of 5% and 10% gave equivalent preventive effects EA 5% for effective treatment equivalent to Hydroquinon 4%

Conclusions

All studies extracts inhibited tyrosinase and melanin synthesis on B16F10 cells Preventive effectiveness of EA 5% is equivalent to 10% Therapeutic effectiveness of EA 5% equivalent to Hydroquinon 4%

Key words: melanin, tyrosinase, Perilla

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC HÌNH iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Cấu trúc và chức năng của da 1

1.1.1 Cấu trúc da 1

1.1.2 Chức năng sinh lý của da 3

1.2 Quá trình tạo sắc tố da 3

1.2.1 Nguồn gốc tế bào hắc tố (melnaocyte) 3

1.2.2 Hình thái tế bào hắc tố 4

1.2.3 Vai trò của các enzym tạo sắc tố 5

1.2.4 Tính chất của melanin 6

1.2.5 Sinh tổng hợp melanin 6

1.3 Nám da 8

1.3.1 Nguyên nhân 8

1.3.2 Các phương pháp chẩn đoán nám da 9

1.3.3 Dịch tễ 10

1.3.4 Sinh lý bệnh 11

1.3.5 Điều trị 12

1.4 Một số thử nghiệm ức chế hoạt tính ức chế tyrosinase và tổng hợp melanin in vitro 15

1.5 Mô hình gây nám da in vivo 16

1.5.1 Mô hình gây viêm và tăng sắc tố bằng tia UV 16

1.5.2 Mô gây tăng sắc tố bằng hormon 17

1.5.3 Mô hình gây tăng sắc tố do thuốc 18

1.6 Dược liệu tía tô 19

1.6.1 Thành phần hóa học 19

1.6.2 Công dụng 21

1.6.3 Tác dụng dược lý 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Dược liệu tía tô 24

2.1.2 Động vật thí nghiệm 26

2.1.3 Tế bào melanoma B16F10 27

2.1.4 Hóa chất và thuốc thử 28

2.1.5 Dụng cụ và trang thiết bị 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Khảo sát ức chế tyrosinase và tổng hợp melanin in vitro 30

2.2.2 Thử nghiệm ức chế tyrosinase và tổng hợp melanin in vivo 34

2.2.3 Khảo sát tác động của cao chiết lá tía tô 35

2.2.4 Đánh giá kết quả 36

2.2.5 Xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40

3.1 Đánh giá dược liệu và các cao chiết 40

3.1.1 Xác định độ ẩm bột dược liệu và cao chiết 40

3.1.2 Hiệu suất chiết 40

3.2 Tác động ức chế tyrosinase và tổng hợp melanin in vitro 41

3.2.1 Thử nghiệm MTT 41

3.2.2 Xác định hoạt độ tyrosinase tế bào 42

3.2.3 Xác định hàm lượng melanin 45

3.3 Mô phỏng mô hình gây nám da 47

3.3.1 Khảo sát giống thỏ 47

3.3.2 Khảo sát thời gian chiếu tia UV 48

3.3.3 Đánh giá đáp ứng của thuốc đối chứng HQ 4% 49

3.4 Khảo sát tác động của cao tía tô 50

3.4.1 Khảo sát tác động phòng ngừa của cao chiết tía tô 50

3.4.2 Khảo sát tác động điều trị của cao tía tô 52

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 57

4.1 Thử nghiệm ức chế tyrosinse và tổng hợp melanin in vitro 57

4.2 Mô phỏng mô hình gây nám da 58

4.3 Khảo sát tác động trị của cao tía tô 59

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mô phỏng cấu trúc da 2

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình tạo melanin 7

Hình 1.3 Cơ chế hình thành sắc tố da 12

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của các hợp chất phenolic trong tía tô 21

Hình 2.5 Qui trình chiết suất cao tía tô 25

Hình 3.6 Đồ thị tương quan giữa độ hấp thu và nồng độ BSA chuẩn 42

Hình 3.7 Đồ thị tương quan giữa logC và phần trăm ức chế tyrosinase cao EA 43

Hình 3.8 Đồ thị tương quan giữa logC và phần trăm ức chế tyrosinase cao EA/CF 44

Hình 3.9 Đồ thị tương quan giữa logC và phần trăm ức chế tyrosinase của 44

Hình 3.10 Đồ thị tương quan nồng độ và độ hấp thu của dung dịch melanin chuẩn 45

Hình 3.11 Hàm melanin (% so với đối chứng âm) 46

Hình 3.12 Đồ thị tương quan nồng độ và độ hấp thu dung dịch melanin chuẩn 53

Hình 3.13 Sự phân bố melanin trong nang lông ở lớp hạ bì da thỏ 55

Hình 3.14 Melanocyte trong biểu bì (nhuộm HE và S-100) 56

Hình 3.15 Melanocyte trong nang lông hạ bì (nhuộm HE và S-100) 56

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Điểm đánh giá nám 10

Bảng 2.2 Danh mục hóa chất và thuốc thử 28

Bảng 2.3 Danh mục thiết bị 29

Bảng 3.4 Mất khối lượng do làm khô bột dược liệu và cao chiết 40

Bảng 3.5 Khối lượng các cao sau khi chiết và hiệu suất chiết 41

Bảng 3.6 Phần trăm ảnh hưởng của cao lên quá trình tăng sinh tế bào 41

Bảng 3.7 Hoạt độ tyrosinase tế bào (% so với chứng âm) 42

Bảng 3.8 Giá trị IC 50 của các cao và acid kojic 45

Bảng 3.9 Hàm lượng melanin (% so với chứng âm) 46

Bảng 3.10 Các dấu hiệu cảm quan trên da thỏ 47

Bảng 3.11 Các dấu hiệu cảm quan trên da thỏ 49

Bảng 3.12 Tỷ lệ % nám đánh giá đáp ứng của HQ 4% 50

Bảng 3.13 Tỷ lệ % nám khảo sát tác động phòng ngừa của cao tía tô 51

Bảng 3.14 Sự phân bố melanin trong nang lông ở lớp hạ bì da thỏ 52

Bảng 3.15 Tỷ lệ % nám khảo sát tác động điều trị của cao tía tô 52

Bảng 3.16 Tỷ lệ % giảm nám của các lô so với ngày 14 53

Bảng 3.17 Nồng độ melanin của các lô 54

Bảng 3.18 Sự phân bố melanin trong nang lông ở lớp hạ bì da thỏ 54

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

α-MSH Melanocyte stimulating factor Hormone kích thích tế bào hắc tốACTH Adrenocorticotropic hormone Hormone kích thích thượng thận

binding Yếu tố liên kết đáp ứng c-AMP

MAPK Mitogen activator protein

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nám da là một rối loạn phổ biến của tăng sắc tố ảnh hưởng đến hàng triệu người trên toàn thế giới Nám thường khó điều trị và ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân Nám gây lắng đọng melanin mạn tính trong lớp biểu bì, đặc trưng bởi các hạt màu nâu không đều phân bố đối xứng trên các khu vực tiếp xúc với ánh nắng mặt trời của cơ thể, đặc biệt là trên khuôn mặt [21] Trong những năm gần đây, có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ hơn về bệnh học và các yếu tố ảnh hưởng đến nám

da Ngoài các yếu tố kích hoạt gây nám da (tiếp xúc với ánh nắng mặt trời, mang thai, hormon sinh dục, quá trình viêm, sử dụng mỹ phẩm, steroid, thuốc cản quang, thuốc chống trầm cảm) còn do yếu tố di truyền [52][58]

Tỷ lệ nám phổ biến nữ/nam dao động từ 6/1 đến 39/1, cho thấy nữ có tỷ lệ nám cao hơn do sử dụng thuốc tránh thai, hormon trị liệu thay thế và quá trình mang thai [37] Các nghiên cứu còn cho thấy tỷ lệ nám da giảm đáng

kể sau 50 tuổi, có thể do mãn kinh, quá trình lão hóa làm giảm số lượng và hoạt động của tế bào sản sinh melanin [19] Việc điều trị nám thường kéo dài, chi phí cao nhưng chưa đạt hiệu quả như mong muốn Một số thuốc trị nám bôi ngoài da chứa methimazol, hydroquinon, tretionin cũng như liệu

[51] Tuy nhiên, sử dụng kéo dài các biện pháp này dẫn đến nhiều tác dụng không mong muốn như dị ứng, ban đỏ, tăng sắc tố sau viêm thứ phát [14][54]

Do đó, nhu cầu phát triển nguồn thuốc mới an toàn, hiệu quả để điều trị nám là việc cần thiết Ngày nay, các thuốc có nguồn gốc dược liệu càng

được quan tâm nhằm phát huy tài nguyên sẵn có và được cho là ít tác dụng không mong muốn hơn nếu phải sử dụng trong thời gian dài

Tía tô (hay tử tô, tử tô tử, tô ngạnh) tên khoa học: Perilla frutescens (L.)

Britton thuộc họ Hoa môi Lamiaceae Tía tô được trồng khắp nơi ở Việt Nam để lấy lá ăn, làm gia vị và làm thuốc Nhiều kinh nghiệm dân gian cho rằng tía tô có tác dụng trị nám, tàn nhang, tẩy trắng da, mụn nhọt [2][3] Một số nghiên cứu đã chứng minh cao chiết từ lá tía tô có tác động ức chế tyrosinase, enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp melanin [4][11]

Để cung cấp thêm các bằng chứng cho các bài thuốc dân gian, chúng tôi

thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT TÁC DỤNG TRỊ NÁM CỦA CAO

CHIẾT TỪ LÁ TÍA TÔ TRÊN MÔ HÌNH THỎ GÂY NÁM DA BẰNG PROGESTERON KẾT HỢP CHIẾU TIA UV” với mục tiêu

sau:

1 Khảo sát tác động ức chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin

của cao chiết lá tía tô in vitro

2 Mô phỏng mô hình gây nám da trên thỏ bằng progesteron kết hợp

chiếu tia UV

3 Khảo sát tác động ức chế tyrosinase và quá trình tổng hợp melanin

của cao chiết lá tía tô in vivo

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc và chức năng của da

1.1.1 Cấu trúc da

Cấu trúc mô học của da bao gồm thượng bì, trung bì và hạ bì (Hình 1.1) Thượng bì: các tế bào tạo sừng (keratinocytes) là thành phần chủ yếu tạo nên thượng bì da Căn cứ vào quá trình biến đổi của các tế bào tạo sừng từ trong ra ngoài, thượng bì chia làm 5 lớp [1][70]:

màng đáy Chúng có khả năng sinh sản mạnh, các tế bào mới di chuyển lên các lớp phía trên làm thượng bì luôn được đổi mới, trung bình 20 đến 30 ngày

này có các cầu nối bào tương thực chất là những chồi bào tương của các

tế bào nằm cạnh nhau được liên kết với nhau bởi các thể liên kết làm cho tế bào có hình gai hay sợi nối với nhau

bào này chứa hạt keratohyalin

o Lớp sáng (lớp bóng): là một lớp mỏng như một đường đồng nhất, thường khó quan sát Các tế bào của lớp này kết dính chặt chẽ, rất mỏng Những tế bào ở lớp này là những tế bào chết, không còn bào quan và nhân

bào tương có chứa nhiều keratin, tùy theo từng vùng mà có chiều dày khác nhau

Trung bì: là một mô liên kết xơ vững chắc có chiều dày thay đổi tùy từng vùng và được ngăn cách với thượng bì bởi màng đáy Trung bì chia thành

2 lớp:

lồi lõm về phía thượng bì tạo thành các nhú bì Lớp nhú có nhiều ở vùng phải chịu áp lực và cọ xát mạnh

kết đặc hơn, các sợi keo tạo thành bó, đa số có hướng song song với mặt giao nhau

Hạ bì: là mô liên kết thưa, lỏng lẻo nối da với các cơ quan bên dưới giúp

da trượt được trên các cấu trúc nằm ở dưới Tùy vùng cơ thể, mức độ nuôi dưỡng mà có thể tạo thành những thùy mỡ hoặc lớp mỡ dày hay mỏng Ngoài ra còn có các phần phụ của da như: các tuyến mồ hôi, các tuyến bã, nang lông

Hình 1.1 Mô phỏng cấu trúc da

1.1.2 Chức năng sinh lý của da

Bảo vệ: là hàng rào bảo vệ các cơ quan sâu như thần kinh, mạch máu, cơ xương, phủ tạng khỏi các tác hại của các yếu tố cơ học, lý học, hoá học, vi khuẩn có hại

Điều hoà nhiệt độ: bằng 2 cơ chế chính là ra mồ hôi và phản ứng vận mạch Bài tiết: tham gia cân bằng nhiệt và thải trừ các chất cặn bã, độc hại

Dự trữ chuyển hoá: chuyển hoá cholesterol thành vitamin D Ngoài ra, da

chứa rất nhiều loại men như oxydase, protease, hyaluronidase các men này tham gia vào sự chuyển hoá chất hoặc ngăn cản tác động của vi sinh vật hoặc nấm xâm nhập vào cơ thể

Tạo keratin và melanin: chức năng đặc hiệu của tế bào thượng bì Chất sừng, có sắc tố giúp bảo vệ da chống lại các tác động có hại như tia cực tím Số lượng và loại melanin thượng bì là yếu tố chính quyết định loại của

da và độ nhạy với tia cực tím

Cảm giác: do các thụ thể trên da tiếp nhận

Miễn dịch: các tế bào như Langerhans, lympho T khi có kháng nguyên xâm nhập, tế bào Langerhans xuất hiện bắt giữ, xử lý và trình diện kháng nguyên với lympho T Tế bào sừng cũng có vai trò miễn dịch và tiết ra interferon [60]

1.2 Quá trình tạo sắc tố da

1.2.1 Nguồn gốc các tế bào sản sinh melanin

Các tế bào sản xuất melanin của thượng bì là melanocyte (tế bào hắc tố) Các tế bào này có nguồn gốc từ mào thần kinh của phôi thai và di cư đến thượng bì ở khoảng thời gian trước sinh Tại đây, melanocyte nằm ở ranh giới giữa thượng bì và trung bì Thân của các melanocyte có dạng hình bán cầu nằm ở dưới hoặc giữa hai tế bào lớp đáy Các melanocyte tạo thành

một mạng lưới ở mặt ranh giới giữa thượng bì và trung bì, chúng có mặt trong các nang tóc và nang lông hoạt động theo chu kỳ phát triển của lông tóc [69]

Sự phân bố của melanocyte: tỷ lệ melanocyte trên các tế bào thượng bì khác nhau rất lớn ở các vùng da khác nhau trên mỗi cá thể Tỷ lệ cao nhất

là ở thượng bì da đầu, da vùng mặt (1/4 đến 1/5) Ở thượng bì đùi và cánh tay (1/10 đến 1/12) Thấp nhất là ở thân mình, trung bình có 1560

Đơn vị melanin thượng bì: là hệ thống tổ hợp đa tế bào bao gồm một melacoyte và các tế bào tạo sừng được nó cung cấp melanin Đơn vị melanin thượng bì là đơn vị chức năng về hình thái của quá trình nhiễm sắc tố da Sự điều chỉnh nhiễm sắc tố của da chịu tác động của các yếu tố môi trường và các yếu tố nội sinh [64]

1.2.2 Hình thái tế bào hắc tố

Các melanocyte vùng thượng bì nằm ở lớp đáy, đây là những tế bào hình bán nguyệt hoặc hình dạng không xác định, bào tương sáng, chất nhân bắt màu đậm và thuần nhất Từ mặt trên của các tế bào này có các sợi nhánh phân ly đi vào khe giữa các tế bào sừng của thượng bì, chủ yếu là lớp đáy

và lớp gai, bên trong melanocyte có chứa các melanosom Trong bào tương, melanocyte có chứa nhiều các ribosom và tổ hợp ribosom Nhánh bào tương cũng như bào tương của melanocyte sáng hơn so với tế bào sừng xung quanh Nhân melanocyte không có hình dạng nhất định, màng nhân

gồ ghề Trong melanocyte chứa nhiều melanosom ở các giai đoạn phát triển khác nhau [69][70]

1.2.3 Vai trò của các enzym tạo sắc tố

Tyrosinase là enzym chịu nhiệm chính trong quá trình tổng hợp melanin Tyrosinase là một glycoprotein nằm trên màng melanosom gồm vùng bên trong, vùng xuyên màng và vùng tế bào chất Đây là một loại enzym phụ thuộc vào đồng (Cu), xúc tác quá trình chuyển đổi L-tyrosine thành L-DOPA, giai đoạn giới hạn tốc độ tổng hợp melanin Nếu Cu bị oxy hóa, tyrosinase sẽ bị bất hoạt và có thể được kích hoạt bởi các chất cho điện tử như L-DOPA, acid ascorbic, anion superoxide và cả oxit nitric [10][56] Tyrosine hydroxylase isoform I (THI) hiện diện trong màng melanosom tiếp giáp với tyrosinase và xúc tác chuyển đổi L-tyrosine thành L-DOPA, thúc đẩy sự hoạt hóa của tyrosinase [64]

Trong bào tương, các phenylalanin hydroxylase (PAH), đồng yếu tố

6BH4(6-tetrahydrobiopterin), xúc tác chuyển hóa L-phenylalanin thành L-tyrosine chính là cơ chất tyrosinase

Ngoài ba loại enzym cần thiết cho sự bắt đầu của quá trình hình thành melanin, hai protein tương tự như tyrosinase (40% acid amin tương đồng), protein liên quan đến tyrosinase-1 (TRP-1) và protein liên quan đến tyrosinase-2 (TRP-2) cũng có trên màng melanosom Mặc dù vai trò của vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể TRP-1 có vai trò trong việc kích hoạt tyrosinase, tổng hợp melanosom, tăng tỷ lệ eumelanin/pheomelanin TRP-2 hoạt động như một dopachrome tautomerase và cần một ion kim loại cho hoạt động của nó, kẽm (Zn) thay vì Cu [64]

1.2.4 Tính chất của melanin

Melanin là yếu tố chính quyết định màu của da, tóc và mắt ở người, có hai loại

ở những người có da và tóc đen Eumelanin có hiệu quả hơn trong việc bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV [61]

bởi sự kết hợp của dopaquinon với cystein hoặc glutathion; thường xuất hiện ở những người tóc đỏ, da loại I, II và có tỉ lệ gây ung thư da cao hơn Ngoài ra còn có melanin hỗn hợp chứa cả eumelanin và pheomelanin [60]

Melanin bảo vệ cơ thể khỏi những tác hại của ánh sáng mặt trời vì trực tiếp hấp thụ các photon của tia UV, các gốc tự do sinh ra bởi sự tương tác giữa tia UV với màng tế bào và nhiễm sắc thể [62] Melanin, đặc biệt là eumelanin hoạt động như bộ lọc hấp thụ, hạn chế sự xâm nhập của tia UV

từ 50-75% Với người da đen, melanin có hiệu quả gấp đôi so với người da trắng trong việc ức chế tác động của UVB Melanin chỉ cho 7,4% UVB và 17,5% UVA thâm nhập vào người da đen, trong khi đó ở người da trắng có đến 24% UVB và 55% UVA được hấp thụ qua da Đáp ứng của da khi tiếp xúc với bức xạ mặt trời phụ thuộc vào thời gian, đặc điểm quang phổ của tia UV, loại phơi nhiễm và đặc tính di truyền của mỗi người trên da [13][45]

ứng tiếp theo có thể xảy ra tự động ở pH sinh lý Eumelanin được hình thành thông qua một loạt phản ứng oxy hóa từ các sản phẩm chuyển hóa của dopachrom là 5,6-dihydroxyindol (DHI) và acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic (DHICA) Trong trường hợp có sự tham gia của cystein hoặc glutathion, dopaquinon sẽ được chuyển hóa thành cysteinyldopa hoặc glutathionyldop, cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng để tạo thành pheomelanin Mặc dù ba enzym tyrosinase, TRP-1 và TRP-2 đều tham quá trình tổng hợp melanin, tyrosinase là đặc biệt cần thiết và quan trọng nhất vì nó trực tiếp điều chỉnh lượng melanin được sản xuất Trong khi đó, nếu tác động trên các enzym khác, chúng có thể dễ dàng sửa đổi loại melanin được tổng hợp [10][56]

Sau khi được tổng hợp trong melanocyte, melanin được chuyển đến các tế bào thượng bì bằng hai con đường chính:

- Các tế bào thượng bì thực bào hạt melanin ở các nhánh của melanocyte

- Các melanin được melanocyte chuyển giao cho các tế bào thượng bì [67][69]

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình tạo melanin

1.3 Nám da

1.3.1 Nguyên nhân

Nám là một tình trạng tăng sắc tố bất thường của da gây ra bởi sự tăng sản xuất melanin Nám thường xảy ra trên những vùng da tiếp xúc với ánh nắng mặt trời như mặt và cẳng tay có thể ở mức độ nhẹ, vừa hoặc nặng Tia UV là nguyên nhân quan trọng trong cả 3 giai đoạn của quá trình hình thành nám Tia UVA kích thích mạnh hơn so với tia UVB trong giai đoạn

1 và giai đoạn 2 của quá trình nám Giai đoạn 1 xuất hiện thoáng qua, gọi

là tăng sắc tố tức thì, xảy ra trong vòng vài phút sau khi tiếp xúc với tia

UV Giai đoạn 2 kéo dài hơn, tăng sắc tố dai dẳng, tùy thuộc vào thời gian tiếp xúc với tia UV và màu da của từng cá thể Giai đoạn 2 thường xảy ra trong vòng một giờ và tồn tại ít nhất 3-5 ngày Giai đoạn 3 của quá trình tăng sắc tố là hình thành nám, tồn tại 10 ngày đến 3-4 tuần Có thể sau vài tuần hoặc vài tháng da mới trở lại màu sắc bình thường [13] Tia UV chỉ tác động gián tiếp, thông qua việc kích thích sản xuất quá mức các cytokine

gây hắc tố như α‐MSH và ET‐1 [29][31]

Nám da còn thường xuất hiện kết hợp với những thay đổi nội tiết tố Do

đó nám da phát triển thường trong khi mang thai, sử dụng liệu pháp hormon thay thế (HRT) hoặc uống thuốc tránh thai Nám da khi mang thai tương đối phổ biến, thường kéo dài cho đến khi thai kỳ kết thúc và vài tháng sau khi sinh Các hormon sinh dục như estrogen và progesteron là 1 trong những yếu tố tham gia vào quá trình hình thành nám da Estrogen đặc biệt là 17β estradiol (E2) và progesteron tham gia vào quá trình hình thành melanin, hàm lượng collagen, lão hóa, độ ẩm và độ dày của da Phụ

nữ sau mãn kinh được sử dụng progesteron sẽ bị nám, trong khi những

người chỉ dùng estrogen thì không, cho thấy progesteron đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của nám [28][34]

Di truyền cũng là một nguyên nhân gây nám da Tổng hợp melanin bị ảnh hưởng bởi các yếu tố di truyền và rất khác nhau giữa các cá thể, gia đình

và dân tộc Một nghiên cứu tại Ấn Độ trên phụ nữ mang thai đã báo cáo 57,4% do di truyền, tương tự tại Singapore là 10,2% Một nghiên cứu trên

324 phụ nữ bị nám khắp thế giới cho thấy 48% trường hợp do tiền sử gia đình bị nám da Cặp song sinh đều bị nám tượng tự nhau, trong khi các anh chị em khác không bị nám da [30][58]

Một nghiên cứu cho rằng bệnh tuyến giáp gia tăng hình thành nám gấp 4 lần so sánh với nhóm đối chứng Nguyên nhân liên quan đến việc giải phóng α-MSH ở vùng dưới đồi [58]

1.3.2 Các phương pháp chẩn đoán nám da

Soi dưới đèn Wood có bước sóng từ 340 đến 400 nm làm nổi bật sự khác biệt về sắc tố của vùng da bị nám so với các vùng da xung quanh Nám thượng bì thường hiện rõ dưới đèn Wood [13]

Soi da vùng nám bằng kính hiển vi tiêu điểm phản xạ (RCM) melanocyte tăng sinh được hiển thị ở độ phân giải cao, melanin được phát hiện trong

cả các lớp của biểu bì và hạ bì Trong lớp đáy của biểu bì, melanin màu nâu sẫm và trong lớp hạ bì melanin có màu xanh lam hoặc xanh xám [30]

Chỉ số vùng nám và mức độ nghiêm trọng (MASI) [51][58] dựa vào điểm

đánh giá vùng bị nám (A), tăng sắc tố (D) và tính đồng nhất của sắc tố (H) (Bảng 1.1) Trên khuôn mặt được chia thành bốn vùng: trán, má phải, má trái và cằm Điểm MASI là tổng điểm của cường độ sắc tố và điểm về tính đồng nhất nhân với điểm vùng và hệ số nhân cho từng vùng theo công thức:

MASI = 0,3A (D + H) [trán] + 0,3A (D + H) [má phải] + 0,3A (D + H) [má trái] + 0,1A (D + H) [cằm]

Điểm nám có giá trị từ 0 đến 48

Xét nghiệm mô học dựa vào nám da có đặc điểm tăng sắc tố biểu bì trong nám Melanocyte tăng sinh, phát triển thêm đuôi gai và bào quan tế bào chất Có sự gia tăng số lượng hắc tố trong tất cả các lớp của biểu bì và tăng

số lượng các melanosom trưởng thành Ở lớp hạ bì, có thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân nhẹ, có sự hiện diện của tế bào mast, tăng sinh mạch máu và

sự thoái hóa sợi đàn hồi (elastosis) [30][58]

1.3.3 Dịch tễ

Một nghiên cứu hồi, từ hồ sơ bệnh án của 1076 bệnh nhân da liễu tại ở Ả Rập Saudi cho thấy nám xếp loại thứ tư trong các bệnh lý về da thường gặp Các nghiên cứu khác cũng đã báo cáo tỷ lệ nám cao, chẳng hạn như người Á Đông (Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc), Ấn Độ, Pakistan, Trung Đông và Địa Trung Hải Ở Châu Mỹ, nám da phổ biến ở những người Mỹ gốc Tây Ban Nha và người Brazil sống ở các khu vực có tiếp xúc nhiều hơn với bức xạ cực tím [30][54]

Tỷ lệ nám da ở phụ nữ gấp 9 lần ở nam giới, đặc biệt đối với phụ nữ Châu

Á, Trung Đông và Nam Mỹ [30] Yếu tố nguy cơ chính gây nám da ở nam

giới chủ yếu là bức xạ UV (48,8%) và tiền sử gia đình (39,0%) Ở nữ giới, yếu tố nguy cơ liên quan đến thai kỳ (14,5 - 56%), phơi nắng (23,9%) và

sử dụng thuốc tránh thai phối hợp đường uống (11,3 - 46%) [22]

Nám hiếm gặp trước tuổi dậy thì và thường xảy ra ở phụ nữ trong những năm sinh sản, từ 30 đến 39 tuổi, trong đó 15-50% phụ nữ mang thai [37]

1.3.4 Sinh lý bệnh

Nám được xác định do di truyền về mức độ melanin và có thể được thay đổi bởi yếu tố nội tại (khởi phát từ tế bào sừng, nguyên bào sợi, tế bào nội tiết, viêm và tế bào thần kinh) hoặc ngoại sinh (tia UV và thuốc) [27] Khi tiếp xúc với tia UV, các tế bào sừng sản xuất cytokin như interleukin-1, endothelin-1, α-MSH và ACTH, sẽ kích thích sự hình thành hắc tố Khi ACTH, α-MSH gắn vào thụ thể melanocortin-1 (MC1-R) sẽ truyền tín hiệu

AC dẫn đến tăng tổng hợp c-AMP Khi tăng c-AMP, sẽ kích hoạt PKA gây phản ứng phosphoryl hóa CREB và MITF dẫn đến khởi động các gen tyrosinase, TRP-1, TRP-2 làm tăng sản xuất melanin trong melanosom [30] Với vai trò sinh lý, melanocortin và ET-1 là các yếu tố kích thích sản xuất melanin trong melanocyte chống lại apoptosis gây ra bởi tia UV [27][67]

Mặc dù POMC/MC1-R/c-AMP là con đường chính nhưng có những thụ thể melanocyte khác cũng liên quan đến sản xuất adenyl cyclase và c-AMP như thụ thể muscarinic, estrogen và progesteron Trong melanocyte, 2 hormon estrogen và Progesteron thông qua 2 thụ thể G-protein (ER), proestin adipoQ7 (PR) cũng làm tăng sản xuất tyrosinase [34][64]

Hình 1.3 Cơ chế hình thành sắc tố da

1.3.5 Điều trị

Tránh tiếp xúc với ánh nắng mặt trời thường là biện pháp phòng ngừa

ngừa sự phát triển của nám Trong một nghiên cứu trên 200 phụ nữ Ma-rốc

HQ làm giảm tổng hợp DNA, từ đó làm tăng cường sự thoái hóa của

Hình thành sắc tố

melanosom gây phá hủy melanocyte Nồng độ sử dụng thường từ 2% đến 5% Tất cả các nồng độ đều có khả năng gây kích ứng da, tăng sắc tố sau viêm thứ phát và có thể gây nám đậm hơn ngay cả khi sử dụng HQ 2% lâu dài Khi bôi tại chỗ HQ 1 lần/ngày, hiệu quả điều trị thấy rõ sau 4-6 tuần

và đạt tối ưu sau 6-10 tuần [14][25] Tuy nhiên, những năm gần đây, một

số lo ngại đã được đặt ra về khả năng gây ung thư của HQ Do HQ chuyển hóa tại gan thành các dẫn xuất của benzen Với dạng dùng tại chỗ HQ chuyển hoá rất ít qua gan mà phần lớn được chuyển hóa trong hệ thống mạch máu và đào thải qua thận Như vậy các chất chuyển hóa ở dạng gốc

tự do có thể gây ra tổn thương thận cấp tính hoặc mạn tính Tuy nhiên, không có mối liên hệ nào được chứng minh sau hơn 50 năm HQ được đưa vào sử dụng để điều trị nám [58]

Tretionin (acid retinoic) có thể có hiệu quả khi dùng đơn trị liệu Các tác nhân này là dẫn xuất của vitamin A và dẫn đến tăng lượng tế bào sừng và giảm hoạt động của melanocyte Tretionin cũng làm tăng tính thấm của lớp biểu bì, cho phép các liệu pháp bổ trợ được hấp thu tốt hơn Tuy nhiên, cần thận trọng với tác nhân này, vì các thuốc retinoid có thể gây quái thai nên tránh kê đơn đường toàn thân cho người mang thai hoặc muốn mang thai Mặc dù không có bằng chứng cho thấy retinoid dùng tại chỗ có liên quan đến dị tật bẩm sinh, người mang thai nên được tư vấn về các rủi ro và lợi ích của việc điều trị Đơn trị liệu nám da bằng retinoid tại chỗ cũng ít hơn

và có hiệu quả chậm so với HQ, hiệu quả cải thiện sau 6 tháng hoặc lâu hơn Thuốc mỡ tại chỗ duy nhất hiện được Cơ quan Quản lý Thực phẩm

và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn để điều trị nám là phối hợp HQ 4%, tretinoin 0,05% và fluocinolon acetonid 0,01% (Tri-Luma) Các

nghiên cứu cho thấy kem dạng phối hợp hiệu quả hơn so với HQ đơn trị liệu trong việc giảm sắc tố nám nhưng phản ứng bất lợi tăng nhẹ [51][58] Acid Azelaic được FDA chấp thuận cho sử dụng dạng kem với nồng độ 15% hoặc 20%, như một thay thế hiệu quả cho HQ 4% và có thể vượt trội hơn HQ 2% trong điều trị nám Cơ chế tác dụng của acid azelaic tương tự như của HQ, nhưng chỉ nhắm đến các melanocyte tăng hoạt và không tác động lên các melanocyte hoạt động bình thường Tác dụng không mong muốn chủ yếu là kích ứng da [14]

Acid kojic là một chất chuyển hóa của nấm Aspergillus, Penicillium và

thường dùng nồng độ 1% đến 4% Acid kojic tạo phức chelate với đồng nên bất hoạt tyrosinase, ngoài ra acid kojic cũng ức chế dopachrom chuyển thành DHICA [54] Một nghiên cứu thực hiện trong 3 tháng, trên 39 bệnh nhân bị nám đã được dùng thuốc 1 lần/ngày với dạng phối hợp acid glycolic 5%, HQ 4% so với acid glycolic 5% và acid kojic 4% Kết quả cho thấy trong 51% bệnh nhân đáp ứng điều trị, công thức phối hợp acid glycolic 5%, HQ 4% cho hiệu quả là 21% và acid glycolic 5%, acid kojic 4% là 28% Acid kojic thường được dung nạp tốt, tác dụng không mong muốn là chủ yếu là ban đỏ Tuy nhiên, các nghiên cứu dài hạn thực hiện ở Nhật Bản

đã ghi nhận có khả năng bị nám tái phát, viêm da kích ứng và tìm thấy mối tương quan giữa việc sử dụng acid kojic tại chỗ với sự hình thành các khối

u gan trên chuột thiếu dị hợp tử p53 Acid kojic có thể gây đột biến trên tế bào buồng trứng của chuột lang [51]

Corticosteroid tại chỗ cũng có tác dụng trị nám, nhưng cơ chế tác dụng của chúng vẫn chưa được làm sáng tỏ Corticosteroid không nên sử dụng đơn trị liệu, thường được dùng phối hợp với các hoạt chất khác để giảm tác

dụng kích ứng Sử dụng corticosteroid tại chỗ trong thời gian dài có thể gây teo da, mụn trứng cá [14][51]

Methimazol là một loại thuốc kháng giáp đường uống Nghiên cứu đánh giá hiệu quả và độ an toàn của methimazol so với HQ 4% trong điều trị nám cho thấy mặc dù hiệu quả kém hơn HQ 4% nhưng methimazol có tác dụng ức chế peroxidase nên không gây độc tế bào và không gây dị ứng Methimazole có thể dùng điều trị nám đơn thuần hoặc trong kết hợp với các loại thuốc khác [25]

Trong nỗ lực tìm kiếm một phương pháp điều trị nám mới, một nghiên cứu trên 100 phụ nữ bị nám được tiêm trong da acid tranexamic (TA) mỗi tuần trong 12 tuần cho thấy thuốc được dung nạp và đáp ứng tốt là 76,5% [51] Colferai và cộng sự đã tiến hành một thử nghiệm có đối chứng với giả dược chứng minh TA đường uống cho thấy cải thiện 50% sau 12 tuần so với 5,9% ở nhóm dùng giả dược Nhìn chung, TA đường uống dung nạp tốt, tác dụng không mong muốn thường gặp nhất là trên đường tiêu hóa Tác dụng không mong muốn nghiêm trọng như huyết khối tĩnh mạch sâu, hoại

tử vỏ thận cấp tính, nhồi máu cơ tim cấp và thuyên tắc phổi thường hiếm gặp có thể là do sử dụng TA liều thấp [66]

1.3 Một số thử nghiệm ức chế hoạt tính tyrosinase và tổng hợp

melanin in vitro

Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hạnh Trúc và các cộng sự, 2020 đã khảo sát tác động của cao chiết từ lá tía tô gồm các phân đoạn cloroform, etylacetat, cloroform/etylacetat trên hoạt tính chống oxi hóa và ức chế tyrosinase nấm Kết quả cho thấy các cao phân đoạn đều có khả năng ức chế tyrosinase, trong đó cao cloroform/etylacetat thể hiện đồng thời khả năng chống oxi hóa và ức chế tyrosinase mạnh nhất [4]

Nghiên cứu của Lê Quỳnh Loan và các cộng sự, 2018 đã khảo sát hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế hoạt tính tyrosinase ngăn tổng hợp melanin của cây hoa hòe cũng cho thấy cao methanol có hoạt tính chống oxi hóa và khả năng ức chế tyrosinase trên tế bào B16F10 [3]

Nghiên cứu của Chan, Y Y và các cộng sự, 2011 đã khảo sát khả năng ức

chế hoạt tính tyrosinase và quá tổng hợp melanin của cao Sargassum

polycystum với các nồng độ 100; 250; 500 μg/mL Kết quả cho thấy cao Sargassum polycystum có khả năng ức chế tyrosinase trên tế bào B16F10

hiệu quả và đáng tin cậy hơn tyrosinase nấm [16]

Nghiên cứu của Lee, S.-G và các cộng sự, 2017 đã khảo sát khả năng ức chế hoạt tính tyrosinase lên quá trình tổng hợp melanin của flavonoid

glycosid trong Limonium tetragonum với các nồng độ 50; 100; 200 μg/mL

cũng cho thấy có khả năng ngăn ngừa hình thành sắc tố thông qua tác động

ức chế hoạt tính tyrosinase và sản xuất melanin trên tế bào B16F10 [41] Nghiên cứu của Wang, Z.-J và các cộng sự, 2017 đánh giá tác động Fucoidan với các nồng độ từ 0 - 550 μg/mL Kết quả cho thấy Fucoidan ức chế tyrosinase trên tế bào B16F10 tốt hơn tyrosinase nấm Ngoài tác dụng

ức chế hoạt tính tyrosinase và tổng hợp melanin trên, Fucoidan còn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư [68]

Nghiên cứu của Chao và các cộng sự, 2017 cho thấy tinh dầu chiết từ lá

Melalaeuca qurowenervia với các nồng độ 5; 10; 20 μg/mL có tác động ức

chế tyrosinase trên tế bào B16F10 [17]

1.5 Mô hình gây nám da in vivo

1.5.1 Mô hình gây viêm và tăng sắc tố bằng tia UV

Nghiên cứu của Serra và các cộng sự, 1970 thực hiện trên 2 nhóm thỏ giống

Black GiantFlemish và giống NewZealand uống Chlorpromazine liều

20-30 mg/kg/ngày trong 3-6 tháng và 20-30 phút chiếu xạ UV trên vùng da cạo lông mỗi ngày Sau khoảng 3 tuần, vùng da đã cạo lông xuất hiện các khu

vực tăng sắc tố riêng biệt Da thỏ New Zealand và những vùng da trắng của thỏ Black Giant Flemish chỉ có biểu hiện ban đỏ nhẹ Các vùng da màu của thỏ Black Giant Flemish có sự tăng sắc tố đáng kể ở lớp biểu bì và cả

hạ bì [32]

Nghiên cứu của Flesch và cộng sự, 1949 thực hiện chiếu tia UV trong vòng

15 phút trên 2 nhóm thỏ màu và thỏ trắng cho thấy lượng SH trong dịch chiết từ biểu bì da của thỏ màu giảm đáng kể so với thỏ trắng Điều này do tăng melanin trong lớp biểu bì da của thỏ màu nên ngăn hấp thụ tia UV và làm giảm lượng SH trong melanocyte Trong khi đó, tia UV có thể xuyên qua lớp biểu bì da của thỏ trắng nên lượng SH trong melanocyte không thay đổi [24]

Nghiên cứu của Abbas S và cộng sự, 2019 tiến hành trên chuột không lông SKH-1 được tiếp xúc với benzanthrone liều 25 và 50 mg/kg đơn độc hoặc

tia UVB làm tăng tình trạng viêm da SKH-1 do benzanthrone gây ra có thể thông qua trung gian oxy hóa của tín hiệu MAPKs-NF-κB/AP-1, sau đó

làm tăng biểu hiện của COX-2 và iNOS và dẫn đến viêm da [7]

1.5.2 Mô gây tăng sắc tố bằng hormon

Nghiên cứu của Laugier P.,1979 nhằm kiểm tra tác động của thuốc tránh thai trên núm vú lợn đực bằng cách thoa dung dịch chứa 0,5 mg ethinyloestradiol mỗi ngày Sau 3 tuần, phân tích hình thái các tế bào lớp biểu bì cho thấy có tình trạng tăng gai (acanthosis) và tăng sắc tố mạnh Thuốc có chứa mestranol cũng như các chất proestogen tinh khiết không

có tác động này [15]

Nghiên cứu của Jadassohn W, 1970 thực hiện trên các nhóm chuột như sau: sinh lý, đối chứng liều 0,05 mcg hormon (p, p-dioxydiphenylhexane), các nhóm chuột còn lại cho uống lần lượt Noracyclin, Anovlar, Eugynon, Provera và progesteron với liều 0,025 mcg hoặc 0,25 mcg (estrogen) mỗi ngày trong 21 ngày Kết quả cho thấy tất cả các nhóm có chứa estrogen gây tăng gai (acanthosis) và tăng sắc tố của mạnh ở cả 2 liều, hormon là mạnh nhất Phì đại tuyến bã nhờn phát triển ở các nhóm hormon, Noracyclin, Provera và progesterone, Eugynon chỉ với liều 0,025 mcg nhưng không thấy phì đại với liều 0,25 mcg Không thấy phì đại tuyến bã nhờn của Anovlar ở cả hai liều Các kết quả về sắc tố được coi là có ý nghĩa trên lâm sàng với việc điều trị nám [53]

Nghiên cứu của ZHOU Kai-yi và cộng sự, 2014 đã gây nám bằng progesteron liều 12 mg/kg kết hợp với chiếu tia UV một giờ/ngày trong 36 ngày Chuột ICR, giống cái được chia ngẫu nhiên thành nhóm sinh lý, nhóm chứng, nhóm thuốc đối chứng Baixiao dan liều 3 g/kg, nhóm Xiaozheng Wan liều thấp 1 g/kg, nhóm liều trung bình 2 g/kg, nhóm dùng liều cao 4 g/kg Kết quả cho thấy nhóm điều trị làm giảm đáng kể hàm lượng tyrosinase của gan và da so với nhóm chứng [43]

1.5.3 Mô hình gây tăng sắc tố do thuốc

Mô hình kết hợp chất kích thích DOPAJ4C vào khối u melanoma bằng clorpromazine và reserpine thực hiện bởi William và cộng sự, 1970 Trong

mô hình này, chuột nhắt trắng Swiss-Webster, giống đực, trọng lượng từ 18-22 g đã cấy khối u melanoma Chuột được tiêm phúc mô chlorpromazine liều 5 mg/kg/ngày, trong 7 ngày Vào ngày thứ 5, tiêm phúc mô DOPAJ4C (3,93 mCi/mM) Sau ngày thứ 7, chuột có biểu hiện tăng sắc tố da [57]

Mô hình khảo sát cơ sở hóa lý của Clofazimin gây ra sắc tố da thực hiện bởi Rosania và cộng sự, 2017 Trong mô hình này, chuột Balb/c và C57B/6

từ 4-5 tuần tuổi dùng đường uống liều 10 mg/kg/ngày Sau 3-4 tuần dùng thuốc, kết quả cho thấy có kết tủa Clofazimin tích lũy trong các đại thực bào và nhiều nhất ở gan, lá lách Clofazimin gây tăng sắc tố da đáng kể nhưng không hình thành kết tủa trên da [44]

1.6 Dược liệu tía tô

Tên khoa học: Perilla frutescens (L.) Britt

Tên đồng nghĩa: Ocimum frutescens L., Perilla ocymoides L

Tên khác: tử tô, tử tô tử, tô ngạnh

Tên nước ngoài: Perilla, purple common perrilla (Anh), Pérille (Pháp) Thuộc họ Hoa môi Lamiaceae

Tía tô được trồng khắp nơi ở Việt Nam để lấy lá ăn, làm gia vị và làm thuốc Các bộ phận lá (tô diệp), thân (tô ngạnh) và quả (tô tử) được thu hái

về, phơi trong râm mát hay sấy nhẹ cho khô để giữ nguyên mùi vị [1][2]

1.6.1 Thành phần hóa học

Dựa theo tính chất hóa học, các hợp chất trong cây tía tô được chia làm hai nhóm: nhóm thân nước (các hợp chất phenolic, flavonoid và triterpen) và nhóm kỵ nước (tinh dầu, acid béo, policosanol, tocopherol và phytosterol) Ngoài ra còn có một số hợp chất khác như hydrocarbon, rượu, aldehyd và furan [72]

1.6.1.1 Nhóm hợp chất phenolic

Acid rosmarinic, acid caffeic, acid ferulic, acid caffeic-3-O-glucosid và acid rosmarinic-3-O-glucosid (Hình 1.4) đã được xác định trong lá, thân và hạt của cây tía tô Trong đó, acid rosmarinic đã được chứng minh là một

trong những hợp chất phenolic chính trong lá tía tô và tập trung nhiều trong giai đoạn từ ra hoa đến gieo hạt [72]

1.6.1.2 Flavonoid và triterpen

Flavonol chủ yếu được phát hiện trong lá và hạt của cây tía tô Các flavonol

đã được xác định bao gồm apigenin, luteolin và (+)-catechin Hơn nữa, các triterpen bao gồm acid tormentic, acid oleanolic và acid ursolic đã được xác định ở tía tô bằng HPLC [33][72]

1.6.1.3 Tocopherol và phytosterol

Các tocopherol đã được xác định có trong cây tía tô, bao gồm α-tocopherol, β-tocopherol, γ-tocopherol, δ-tocopherol Ngoài ra phytosterol cũng đã được xác định có trong cây này; β-sitosterol và γ-tocopherol đồng thời đã được chứng minh có sự tương quan với sự có mặt của acid linolenic trong tía tô [72]

1.6.1.5 Tinh dầu

Tinh dầu có chủ yếu trong lá, hoa của cây tía tô Các tinh dầu đã được báo cáo có 0,821% trong lá, 0,269% trong hoa, 0,022% trong thân và 0,011% trong hạt [72] Dựa theo công thức hóa học, các hợp chất này có thể được chia thành 7 nhóm Các hợp chất đại diện cho mỗi nhóm bao gồm

perillaldehyd và limonen đại perillaketon, isoegomaketon, trans-citral và egomaketon [8][33]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của các hợp chất phenolic trong tía tô

1.6.2 Công dụng

Theo tài liệu cổ, tía tô có vị cay, tính ôn, vào hai kinh phế và tỳ Có tác dụng phát tán phong hàn, lý khí khoan hung; giải uất, hóa đờm, an thai, giải độc cua cá Cành không có tác dụng phát biểu, chỉ có tác dụng lý khí Dùng chữa ngoại cảm phong hàn, nôn mửa, động thai, ngộ độc cua cá Thông thường lá tía tô có tác dụng là cho ra mồ hôi, chữa ho, giúp sự tiêu hóa, giảm đau, giải độc, chữa cảm mạo, còn có tác dụng chữa bị ngộ độc nôn mửa, đau bụng do ăn cua cá [2]

1.6.3 Tác dụng dược lý

1.6.3.1 Chống oxy hóa và ức chế tyrosinase

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu về tía tô đã chứng minh các hợp chất phenolic và flavonoid có vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa [42][65] Cao chiết từ lá tía tô đã được đánh giá có tác động chống oxy hóa

và ức chế tyrosinase do tương tác với Cu tại vị trí hoạt động của enzyme này, tiềm năng trong điều trị tăng sắc tố da [4] Acid rosmarinic, một

polyphenol được tìm thấy trong lá tía tô, là một trong những chất chống oxy hóa tiềm năng [36][40]

1.6.3.2 Ngăn ngừa lão hoá do bức xạ UV gây ra

Bức xạ UV gây ra các loại phản ứng oxy hoá (ROS), kích hoạt tín hiệu protein kinase Kích hoạt này sau đó làm tăng hoạt động phiên mã của phức hợp protein hoạt hóa 1 (AP-1) dẫn đến tăng biểu hiện của MMP-1,3 làm giảm tổng hợp collagen Cao chiết lá tía tô ức chế đáng kể biểu hiện của MMP-1,3 do làm giảm quá trình phosphoryl hóa kinase điều hòa tín hiệu ngoại bào, kinase c-Jun N-terminal Hơn nữa, cao lá tía tô thúc đẩy sản xuất Procollagen loại I và làm giảm đáng kể độ dày của tế bào biểu bì và giảm biểu hiện MMP-1,3 gây ra bởi UV [12]

1.6.3.3 Kháng viêm, kháng dị ứng

Dịch chiết tía tô được chứng minh là có thể ức chế tế bào sản sinh TNF-α, làm giảm quá trình viêm gây ra bởi acid arachidonic Acid triterpene được

cô lập từ tía tô cũng thể hiện tác động kháng viêm ở chuột [12][22]

Theo một nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm trên tai chuột trên mô hình gây viêm bằng dầu ba đậu (croton oil), dịch chiết toàn phần lá tía tô cho hiệu quả kháng viêm rõ rệt từ mức liều 4 mg/tai chuột Flavonoid từ dịch chiết tía tô được chứng minh có khả năng kháng viêm đáng kể như là giảm tính thấm mạch máu, ức chế sản xuất các chất trung gian gây viêm, tăng cường các gốc tự do và ức chế quá trình peroxy hóa lipid [6]

1.6.3.4 Tác dụng ức chế khối u và kháng ung thư

Cao chiết tía tô đã được chứng minh trên in vitro là có tác dụng ức chế sự

phát triển và làm chết tế bào trên dòng tế bào HepG2 (ung thư gan), dòng HL-60 (ung thư bạch cầu), dòng HTC116 (ung thư đại tràng) Acid rosmarinic từ tía tô ức chế tăng sinh tế bào Jurkat (ung thư máu) bằng cách

thay đổi biểu hiện cyclin, các chất ức chế cyclin phụ thuộc kinase và chết

có điều trị [63]

1.6.3.5 Các tác dụng khác

Ngoài ra, tía tô cũng thể hiện nhiều tác dụng dược lý khác như tác động lên thị giác, khả năng học hỏi và ghi nhớ ở chuột; tác dụng hạ huyết áp và tác dụng làm hạ lipid máu [46] Bên cạnh đó, dịch chiết tía tô còn thể hiện tác động kích thích mọc lông, cảm ứng pha anagen [9]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Dược liệu tía tô

2.1.1.1 Thu hái

Tía tô được thu hái tại Hà Nội vào tháng 06/2020 Sau đó được nhặt lấy lá, rửa sạch rồi phơi âm can đến khô Xay thô dược liệu đến kích thước khoảng

4 mm để tiến hành chiết xuất và điều chế thành cao

2.1.1.2 Phương pháp chiết xuất

Bột lá tía tô được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi là ethanol 50% theo quy trình như sau: làm ẩm 1900 gam bột dược liệu với dung môi trong 20 phút Rửa sạch, tráng cồn, lót bông gòn ở đáy bình chiết Cho dược liệu đã được làm ẩm vào thành từng lớp với lực nén vừa phải, dung môi ngập mặt dược liệu khoảng 3 cm, ngâm lạnh trong 24 giờ Rút dịch chiết với tốc độ khoảng 100 giọt/phút đến khi dịch chiết không còn

Toàn bộ dịch chiết cao toàn phần được thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không 20 lít ở 55 °C Dịch sau khi cô quay được chia làm 3 phần Cô trên bếp cách thủy 1/3 dịch chiết ở nhiệt độ 95 °C đến thể chất cao đặc là cao toàn phần (cao TP), 2/3 dịch chiết còn lại chia làm 2 phần bằng nhau: phần thứ 1 lắc phân bố lỏng lỏng với ethylacetat, phần thứ 2 lắc lần lượt với cloroform sau đó đến ethylacetat; khi các dịch lắc không còn phản ứng

máy cô quay, tiếp tục loại dung môi đến thể chất cao đặc trên bếp cách thủy

ở 95 °C Cao đặc được bảo quản nhiệt độ 2-8 °C Sơ đồ chiết xuất cao từ tía tô được trình bày trong hình 2.5

Hình 2.5 Qui trình chiết xuất cao tía tô

Chiết ngấm kiệt bằng ethanol 50%

Lắc phân bố cloroform

Phần 2:

2/3 dịch chiết

Chia 2 phần bằng nhau

Lắc phân bố ethylacetat

Cô thu hồi dung môi

Cô thu hồi dung môi