Nghiên cứu thu nhận gellan từ sphigomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm dày và chất tạo gel.. Sản phẩm khử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ

Sphigomonas paucimobilis ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ

Sphigomonas paucimobilis ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Ngành: Công ngh ệ sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1.PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm 2.TS Trần Thị Mai

Hà Nội - 2018

L ỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự chân thành và biết ơn nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn

Thị Xuân Sâm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS Trần Thị Mai - Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch đã tận tình hướng dẫn, động viên tinh thần cho tôi trong suốt thời gian làm luận án; cảm ơn các Cô đã trang bị thêm cho em cách tiếp cận với các phương pháp khoa học để em tự tin hơn trên con đường phía trước

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền tải cho em thêm nhiều kiến

thức chuyên môn sâu cũng như cho những góp ý quí báu trong quá trình học tập và hoàn thiện các nghiên cứu của luận án

Nhân dịp này, xin bày tỏ niềm tri ân tới Ban lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch, Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học Sau thu hoạch và các

bạn bè, đồng nghiệp, đã hết sức giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi yên tâm học tập

và nghiên cứu

Lúc này đây, với tư cách là người con, người vợ và người mẹ, tôi muốn gửi thật nhiều lời cảm ơn sâu sắc, tình cảm yêu thương vô bờ của tôi đến gia đình - nơi luôn là điểm

tựa tinh thần vững chắc và tiếp sức cho tôi trong suốt sự nghiệp phấn đấu

Hà N ội, ngày 25 tháng 12 năm 2018

Nguy ễn Thị Hồng Hà

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả

luận án là trung thực và chưa được tác giả khác công bố Trong luận án có sử dụng một

phần kết quả của đề tài ĐT.04.13/CNSHCB - Bộ Công thương và đã được sự đồng ý của các thành viên trong nhóm nghiên cứu Việc tham khảo nguồn tài liệu đã được thực hiện trích dẫn theo đúng yêu cầu

Hà N ội, ngày 25 tháng 12 năm 2018

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN i

L ỜI CAM ĐOAN ii

M ỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ x

M Ở ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 THÔNG TIN CHUNG V Ề GELLAN VÀ GELLAN KH Ử ACYL 4

1.1.1 Cấu tạo 4

1.1.2 Tính chất 4

1.1.3 Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel 5

1.1.4 Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan 7

1.1.4.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 7

1.1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp gellan 8

1.1.4.2 Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S paucimobilis 9

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL 11

1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp gellan 11

1.2.1.1 Ảnh hưởng của tuổi giống và tỷ lệ giống 11

1.2.1.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men 11

1.2.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí 14

1.2.1.4 Cải tạo chủng giống cho tăng khả năng sinh tổng hợp gellan 15

1.2.2 Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men 18

1.2.3 Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 20

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU ỨNG D ỤNG GELLAN VÀ GELLAN KH Ử ACYL 21

1.3.1 Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây 21

1.3.2 Ứng dụng trong chế biến thực phẩm 23

1.3.3 Ứng dụng trong các lĩnh vực khác 25

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU TRONG NƯỚC VÀ V ẤN ĐỀ C ẦN NGHIÊN C ỨU 26

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN C ỨU VÀ TRANG THI ẾT B Ị 29

2.1.1 Chủng giống, nguyên liệu chuối 29

2.1.2 Môi trường 29

2.1.3 Hóa chất 30

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 31

2.2.1 Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl 31

2.2.2 Phân tích cấu trúc gellan và gellan khử acyl (phổ MNR) 32

2.2.3 Xác định khối lượng phân tử của gellan 33

2.2.4 Xác định mức độ deacyl hóa (ĐĐA) của gellan khử acyl 34

2.2.5 Xác định độ bền gel của gellan khử acyl 35

2.2.6 Xác định khả năng tạo gel với các ion Ca+2 và Na+ 35

2.2.7 Phân tích các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của gellan 35

2.2.8 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn 36

2.2.9 Xác định hàm lượng protein 36

2.2.10 Xác định hàm lượng màu carotenoid 36

2.2.11 Phương pháp xử lí số liệu 36

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.3.1 Nhân giống và điều kiện bảo quản giống 36

2.3.2 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của S paucimobilis GL4 36

2.3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL12 37

2.3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 37

2.3.3.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung axit amin 37

2.3.3.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 37

2.3.4 Tối ưu hóa môi trường sinh tổng hợp gellan cho S paucimobilis GL12 38

2.3.5 Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít 40

2.3.5.1 Xác định tốc độ khuấy 40

2.3.5.2 Xác định thời gian thu gellan 40

2.3.6 Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men 40

2.3.6.1 Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ 40

2.3.6.2 Loại màu khỏi kết tủa gellan 41

2.3.7 Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột 41

2.3.7.1 Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột 41

2.3.7.2 Nghiên cứu lựa chọn bao bì 42

2.3.7.3 Xác định chế độ bảo quản 42

2.3.8 Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl 42

2.3.8.1 Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 42

2.3.8.2 Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl 43

2.3.8.3 Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl 43

2.3.8.4 Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl 43

2.3.9 Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối …… ……… 43

2.3.9.1 Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan 44

2.3.9.2 Xác định thông số công nghệ của dung dịch tạo màng gellan 44

2.3.9.3 Đánh giá hiệu quả bảo quản của màng 47

2.3.10 Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa 48

2.3.10.1 Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch 48

2.3.10.2 Đánh giá hiệu quả bổ sung gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa 48

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

3.1 L ỰA CH ỌN CH ỦNG CHO KH Ả NĂNG SINH T ỔNG H ỢP GELLAN CAO 50

3.1.1 Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL4 50

3.1.2 So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL4 và S paucimobilis GL12 53

3.2 NGHIÊN C ỨU THU NH ẬN GELLAN T Ừ CH ỦNGS PAUCIMOBILISGL12 54

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan 54

3.2.1.1 Ảnh hưởng của nitơ 54

3.2.1.2 Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin 55

3.2.1.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 56

3.2.1.4 Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan 57

3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan từ S paucimobilis GL12 58

3.2.3 Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít 61

3.2.3.1 Xác định tốc độ khuấy 61

3.2.3.2 Xác định thời gian thu hồi gellan 62

3.2.4 Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men 63

3.2.4.1 Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối 63

3.2.4.2 Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ 65

3.2.4.3 Loại màu khỏi kết tủa gellan 66

3.2.5 Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột 68

3.2.6 Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan 70

3.2.6.1 Nghiên cứu lựa chọn bao bì thích hợp cho chế phẩm 70

3.2.6.2 Xác định điều kiện bảo quản 72

3.2.7 Đề xuất qui trình thu nhận gellan từ S paucimobilis GL12 74

3.3 CHUY ỂN HÓA GELLAN THÀNH GELLAN KH Ử ACYL 76

3.3.1 Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 76

3.3.1.1 Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan 76

3.3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl 78

3.3.2 Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol 80

3.3.3 Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl 81

3.3.4 Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl 82

3.3.5 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl 83

3.4 ĐÁNH GIÁ CH ẤT LƯỢNG CÁC CH Ế PH ẨM 85

3.4.1 Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S paucimobilis GL12 85

3.4.1.1 Xác định cấu trúc gellan 85

3.4.1.2 Xác định khối lượng phân tử gellan 87

3.4.1.3 Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan 88

3.4.2 Đánh giá chất lượng gellan khử acyl 90

3.4.2.1 Xác định cấu trúc gellan khử acyl 90

3.4.2.2 Đánh giá các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng và vi sinh vật của gellan khử acyl90 3.5 TH Ử NGHI ỆM ỨNG D ỤNG CH Ế PH ẨM GELLAN VÀ GELLAN KH Ử ACYL 91

3.5.1 Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối 91

3.5.1.1 Xác định hàm lượng gellan thích hợp trong công thức dung dịch tạo màng 91

3.5.1.2 Xác định thông số kỹ thuật của màng bao gellan lựa chọn 93

3.5.1.3 Đánh giá hiệu quả bảo quản chuối của màng bao gellan 93

3.5.2 Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa 97

3.5.2.1 Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho trong công thức thạch 97

3.5.2.2 Đánh giá chỉ tiêu cảm quan sản phẩm thạch 98

3.5.2.3 Đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm thạch 100

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102

K ẾT LU ẬN 102

KI ẾN NGH Ị 103

DANH M ỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 104

TÀI LI ỆU THAM KHẢO……… 105

DANH M ỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Axit deoxyribonucleic

HDPE Polyethylene tỷ trọng cao

MDPE Polyethylene tỷ trọng trung bình

DANH M ỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Đặc điểm khác nhau giữa gellan và gellan khử acyl 5

Bảng 1.2 Ảnh hưởng chủng giống, nguồn dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh t ổng hợp gellan 17

Bảng 1.3 Đặc điểm và hiệu quả gellan 24

Bảng 2.1 Đặc tính của gellan và gellan khử acyl dùng làm mẫu chuẩn 30

Bảng 2.2 Thời gian và liều lượng H 2 O 2 kh ảo sát 38

Bảng 2.3 Các yếu tố và các mức của yếu tố trong thí nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng h ợp gellan từ chủng S pausimobilis GL12 38

Bảng 2.4 Ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S pausimobilis GL12 39

Bảng 2.5 Chỉ số màu chuẩn cho chuối 44

Bảng 2.6 Tỷ lệ thành phần trong các công thức tạo dung dịch màng gellan 44

Bảng 2.7 Các chỉ tiêu đánh giá cảm quan chuối 46

Bảng 2.8 Phiếu cho điểm của phép thử cảm quan 47

Bảng 2.9 Bảng điểm cảm quan của sản phẩm thạch dứa 48

Bảng 2.10 Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình của thành viên trong h ội đồng cảm quan 49

Bảng 3.1 So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S paucimobilis GL4 và

S paucimobilis GL12 53

Bảng 3.2 Ảnh hưởng các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp gellan

c ủa S paucimobilis GL12 54

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các axit amin đến khả năng sinh tổng hợp gellan 56

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung H 2 O 2 t ới khả năng tích lũy sinh khối và gellan 57

Bảng 3.5 Kết quả ma trận thực nghiệm tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S pausimobilis GL12 59

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phương sai Anova của mô hình 60

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào vi khu ẩn 64

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch tới khả năng loại protein khỏi dịch lên men 65 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng lo ại màu 67

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hiệu suất và chất lượng gellan thành phẩm 68

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thời gian sấy đến hiệu suất thu hồi gellan 69

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của độ dày lớp vật liệu sấy đến hiệu suất thu hồi gellan 70

Bảng 3.13 Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch nổi lên men chủng S paucimobilis GL12 70

Bảng 3.14 Sự thay đổi độ ẩm và độ nhớt của gellan sau 06 tháng bảo quản 72

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sản phẩm gellan 73

Bảng 3.16 Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gellan trước và sau khi b ảo quản 06 tháng 73

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của pH xử lý tới mức độ deacyl của gellan 78

Bảng 3.18 Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl 81

Bảng 3.19 Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch nổi lên men chủng S paucimobilis GL12 82

Bảng 3.20 Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý và vi sinh của chế phẩm gellan khử acyl trước và sau khi bảo quản 06 tháng 82

Bảng 3.21 Kết quả phân tích chất lượng và ATTP của chế phẩm gellan 89

Bảng 3.22 Kết quả phân tích chất lượng của sản phẩm gellan khử acyl 91

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của hàm lượng gellan trong công thức tạo màng đến hiệu quả bảo qu ản chuối 92

Bảng 3.24 Một số chỉ tiêu và đặc tính hóa lý của dung dịch tạo màng gellan 93

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của màng bao đến các chỉ tiêu sinh lý của chuối trong quá trình b ảo quản 94

Bảng 3.26 Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan chuối sau 18 ngày bảo quản 96

Bảng 3.27 Xác định tỉ lệ gellan khử acyl bổ sung thích hợp trong thành phần thạch 98

Bảng 3.28 Đánh giá chỉ tiêu cảm quan thạch dứa có bổ sung gellan 99

Bảng 3.29 Chỉ tiêu ATTP và các tính chất cảm quan của thạch 101

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 C ấu trúc hóa học của gellan (A) và gellan khử acyl (B) 4

Hình 1.2 Cơ chế tạo gel của gellan 6

Hình 1.3 Cơ chế tạo gel của gellan khi có mặt các cation 6

Hình 1.4 Cơ chế sinh tổng hợp gellan 9

Hình 1.5 Động học quá trình STH gellan từ chủng S paucimobilis ATCC 31.461 10

Hình 1.6 Sơ đồ chung thu nhận gellan từ dịch lên men 19

Hình 1.7 Sơ đồ chung thu nhận gellan khử acyl từ gellan 20

Hình 2.1 Khu ẩn lạc của S paucimobilis GL12 (A) và S paucimobilis GL4 (B) 29

Hình 2.2 Đường chuẩn gellan 32

Hình 2.3 Đường chuẩn gellan khử acyl 32

Hình 2.4 Phương pháp xác định độ nhớt thực 34

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S paucimobilis GL4 50

Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ trypton tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S paucimobilis GL4 51

Hình 3.3 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp gellan

t ừ S paucimobilis GL4 52

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới khả năng sinh tổng hợp gellan

t ừ S paucimobilis GL4 52

Hình 3.5 Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL4 53

Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tương đến khả năng sinh tổng hợp gellan

c ủa S paucimobilis GL12 55

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan 56

Hình 3.8 Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gellan của chủng S paucimobilis GL12 58

Hình 3.9 B ề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng các yếu tố đến hàm lượng gellan 60

Hình 3.10 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy tới khả năng tạo gellan 62

Hình 3.11 Động học quá trình sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL12 trên h ệ thống bình lên men sục khí 63

Hình 3.12 Ảnh hưởng của các loại dung môi tới hiệu suất thu hồi gellan 65

Hình 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol đến hiệu suất thu hồi gellan 66

Hình 3.14 S ự cải thiện màu sắc của kết tủa gellan qua các lần kết tủa lặp lại 67

Hình 3.15 Qui trình công ngh ệ thu nhận gellan dạng bột từ chủng S paucimobilis GL12

trên h ệ thống bình lên men 10 lít 75

Hình 3.16 Ph ổ IR của các mẫu gellan và gellan khử acyl 77

Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian deacyl đến độ deacyl của gellan 79

Hình 3.18 Ph ổ IR của gellan khử acyl ( phản ứng pH = 10/10 phút) 80

Hình 3.19 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch gellan khử acyl/ethanol đến hiệu suất thu hồi 80

Hình 3.20 K ết tủa gellan khử acyl sau 1 lần kết tủa cồn 81

Hình 3.21 Qui trình thu nh ận chế phẩm gellan khử acyl 84

Hình 3.22 Ph ổ cộng hưởng từ hạt nhân - NMR hai chiều của mẫu gellan chuẩn 86

Hình 3.23 So sánh ph ổ proton của gellan chuẩn và gellan từ S paucimobilis GL12….87 Hình 3.24 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ nhớt rút gọn và nồng độ gellan 88

Hình 3.25 So sánh ph ổ proton của gellan khử acyl chuẩn và gellan khử acyl từ S paucimobilis GL12 90

Hình 3.26 S ự biến đổi hàm lượng chất khô tổng số của chuối theo thời gian bảo quản 96

Hình 3.27 M ột số hình ảnh bảo quản chuối từ màng bao gellan 97

Hình 3.28 Ứng dụng gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa 99

M Ở ĐẦU

Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu

khí Sphingomonas sp Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm dày và chất tạo gel

So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở nhiệt độ cao (trên 90o

C), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nước giải khát Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel

mềm, mọng nước và tăng được nhiệt độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản

phẩm Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi, trong và với tính chất tạo vi màng, có khả năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng bao bảo quản quả

Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội với sự trong suốt cao,

tạo gel giòn ở nồng độ thấp (dưới 0,4 %), có khả năng hồi phục nhiệt khi đun nóng và làm

lạnh, được ứng dụng nhiều trong sản xuất thạch

Sở hữu những đặc tính quí báu trên, nên hiện nay gellan được ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quản thực phẩm, nhu cầu về thị trường ngày một tăng Các công bố về quá trình sinh tổng hợp, thu nhận gellan trên thế giới cũng luôn được cập nhật, bổ sung các thông tin về cải tạo chủng giống, điều kiện lên men, thu hồi nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng cho chế phẩm

Ở Việt Nam, hiện chưa có cơ sở nào sản xuất được gellan, gellan nhập ngoại đã được

sử dụng để bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, tuy nhiên giá của chúng vẫn còn cao (khoảng 20-50 usd/kg tùy loại) Trong giai đoạn 2013-2015, nhóm nghiên cứu của

đề tài chúng tôi đã phân lập được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp gellan khá cao (18-20 g/lít dịch nuôi) Đề tài cũng đã bước đầu khảo sát được các điều kiện lên men, thu hồi gellan, tuy nhiên công nghệ chưa sẵn sàng cần phải có các nghiên cứu cải tiến hơn nữa nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp gellan và hoàn thiện hơn các đánh giá về đặc tính, chất lượng cho các chế phẩm gellan, gellan khử acyl làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng chúng Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định

hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” đã được lựa chọn trong khuôn khổ của

luận án này

M ục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis sp lựa chọn

- Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng

S paucimobilis sp lựa chọn

- Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm

- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S paucimobilis GL4

- So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S paucimobilis GL4 và

S paucimobilis GL12

- Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác

- Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men10 lít

- Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột

- Nghiên cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm

- Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis sp lựa chọn

- Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl

- Xác định điều kiện tách chiết và sấy kết tủa gellan khử acyl

- Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl

- Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl

4 Đánh giá chất lượng các chế phẩm gellan

- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S paucimobilis sp

- Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl

- Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối

- Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch dứa

- Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis GL12 phân lập

tại Việt Nam Sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan có giá thành rẻ hơn thay

thế cho nguồn trypton, kết hợp với việc bổ sung theo bậc H2O2 khắc phục độ nhớt dịch

lên men, cải thiện phương thức cấp ôxi đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp gellan và đạt 32,8 g/lít

- Đã xây dựng được quy trình chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl có độ deacyl đạt 86% đáp ứng yêu cầu cho việc tạo ra gel có độ giòn và độ trong cao

- Đã đánh giá được một số đặc tính của chế phẩm gellan và gellan khử acyl từ chủng S

paucimobilis GL12 làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

- Luận án đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng gellan trong tạo màng bao bán thấm

có khả năng ngăn khí và giữ nước để kéo dài thời gian bảo quản chuối (18 ngày so với đối

chứng chỉ đạt 9 ngày) Gel tạo ra từ chế phẩm gellan khử acyl của đề tài khá bền và ổn định trong môi trường pH thấp (pH<4) nên thích hợp cho việc sản xuất các sản phẩm có độ axit cao như thạch dứa

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 THÔNG TIN CHUNG V Ề GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL

Gellan - một polysaccharit dị thể ngoại bào, được sản xuất bằng quá trình lên men

bởi vi khuẩn hiếu khí Sphingomonas paucimobilis

Cấu trúc phân tử của gellan là một polyme lặp lại của các đơn phân, mỗi đơn phân

gồm bốn gốc đường: hai gốc glucose (Glc), một gốc acid glucurunic (GlcA) và một gốc rhamnose (Rha) Chúng liên kết với nhau bởi các liên kết glucozit theo trật tự: [3)-β-D-Glc-(14)-β-D-GlcA-(14)-β-D-Glc(14)-α-Rha-(1)] Trong đó, ở gốc đường liên kết (1 3)-β-D-Glc- thường gắn thêm nhóm O-5-acetyl và O-2- glyceryl (hình 1.1-A) Trong phân tử của gellan khử acyl, nhóm acyl và glyceryl bị khử (hình 1.1- B) [64]

khử acyl có độ bền gel 300-800 g/cm2

còn gellan có khả năng giữ nước tốt Gellan có khối

(A)

(B)

lượng phân tử khoảng 1 - 2 x 106

Da và gellan khử acyl có khối lượng phân tử khoảng 2 - 3

x 105 Da [36, 91]

Gellan có chức năng như chất ổn định, tác nhân làm đặc, tác nhân tạo cấu trúc, tạo nhũ tương, khả năng tương thích cao, giải phóng mùi vị, chất kết dính, màng bao, chất bôi trơn, chất tạo độ dày và huyền phù, tác nhân tạo gel linh hoạt và có thể tạo kết cấu gel mong muốn trong các dạng sản phẩm thực phẩm khác nhau từ cứng, giòn hay lỏng [14, 32, 48]

Gellan và gellan khử acyl có những tính chất giống nhau Điều khác nhau căn bản

giữa hai loại gellan này là khả năng tạo gel Gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra những gel có tính chất khác nhau Gellan tạo gel mềm, đàn hồi và thuận nghịch nhiệt Sự khử các gốc acyl trong phân tử gellan sẽ tạo ra gellan khử acyl cho gel chắc, giòn Phụ thuộc vào mức độ deacyl mà gellan khử acyl có độ deacyl hóa càng cao thì khối lượng phân tử và độ nhớt càng giảm, gel thu được có độ chắc và độ giòn càng tăng Có thể tóm tắt sự khác nhau giữa hai loại gellan này về một số chỉ tiêu chính ở bảng 1.1.[14, 15,

27, 35, 61]

Bảng 1.1 Đặc điểm khác nhau giữa gellan và gellan khử acyl [ 14, 15, 27, 35, 61 ]

Khối lượng phân tử 1 - 2 x 106 Da 2 - 3 x 105 Da

Nhiệt độ bắt đầu tạo gel 70~80oC 30~50oC

Khả năng chịu nhiệt Ổn định nhiệt Ổn định nhiệt

Khả năng hòa tan trong nước Tan trong nước ấm Tan trong nước lạnh hoặc nóng

Cấu trúc gel Gel mềm và đàn hồi Gel cứng và giòn

Độ nhớt 1% (Cp) Rất nhớt (+++) Độ nhớt giảm mạnh (+)

Gellan

Ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan tồn tại trong dung dịch dưới

dạng sợi cuộn ngẫu nhiên Khi hạ nhiệt độ của dung dịch xuống, các sợi duỗi ra và xoắn

với nhau tạo ra sợi kép Các sợi kép này tiếp tục liên kết với nhau tạo nên mạng lưới gel 3 chiều (hình 1.2)

Hình 1.2 Cơ chế tạo gel của gellan [6, 25]

Gel gellan hình thành nhanh chóng khi nâng và hạ nhiệt độ của dung dịch gellan với sự

có mặt của các cation Khi nhiệt độ thấp, các sợi kép của gellan hình thành những vòng xoắn

có trật tự, còn ở nhiệt độ cao xuất hiện các polysaccarit dạng sợi đơn làm giảm độ nhớt của dung dịch Nhờ tính chất này, gellan sẽ được tách khỏi tế bào vi khuẩn khi xử lý ở nhiệt độ cao Nhiệt độ dưới 30 - 35o

C, cấu trúc của dung dịch trở nên cứng dần và kết quả là hình thành gel Các sợi xoắn liên kết với nhau bằng các mối nối và hình thành nên mạng lưới không gian ba chiều bằng cách tạo phức với các cation và liên kết hydro với nước Việc bổ sung các cation hóa trị một và hóa trị hai trong suốt quá trình làm lạnh làm tăng số cầu muối

tại các mối nối, nên đã cải thiện được tính chất tạo gel của gellan (hình 1.3) Các cation như

Na, K, Ca và Mg thúc đẩy sự tạo gel của gellan Cation tetramethylammonium (TMA) lại kìm hãm sự tạo gel Gel hình thành bởi các ion hóa trị 2 như Ca2+

và Mg2+ mạnh hơn so với các ion hóa trị 1như Na+

và K+ Nồng độ bổ sung cho sự tạo gel gellan với catrion hóa trị 1 thường là

100 mM còn với cation hóa trị 2 là 5 mM Sự bổ sung các cation thúc đẩy quá trình tạo gel sẽ

dẫn đến sự tinh thể hóa những sợi này và hình thành gel bền [25, 34, 43]

Hình 1.3 Cơ chế tạo gel của gellan khi có mặt các cation [6, 25]

Nhóm thế acyl có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của gel gellan Các nhóm acetyl và glyceryl cồng kềnh ngăn chặn liên kết chặt chẽ giữa các chuỗi polymer gellan trong dạng

xoắn lớn và cản trở cuộn lại của chuỗi xoắn kép Vì vậy, gel của loại gôm này có tính mềm

đủ lượng ion cần thiết cho việc tạo gel

Nhiệt độ tạo gel là nhiệt độ bắt đầu có sự tạo gel Quá trình tạo gel của gellan khử acyl diễn ra nhanh khi nhiệt độ vừa đạt tới nhiệt độ tạo gel Nhiệt độ nóng chảy gel và nhiệt

độ tạo gel sẽ càng tăng khi nồng độ các ion tăng Với loại gel này, trong đa số trường hợp gel sẽ không có tính thuận nghịch về nhiệt và nó sẽ nóng chảy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ

bắt đầu tạo gel Gellan khử acyl hình thành gel vững chắc, giòn và hồi biến nhiệt vì sự vắng

mặt của các nhóm acetyl và glyceryl Gellan khử acyl có thể tạo gel ở nồng độ thấp khoảng 0.05%, gel tạo ra sẽ cứng và không bị tách lỏng nếu không cắt hoặc phá hủy gel

Tóm l ại, gellan với những hàm lượng acyl khác nhau sẽ cho ra gel có tính chất khác nhau Gellan t ự nhiên cho ra gel mềm, đàn hồi còn gellan khử acyl cho ra gel chắc, giòn Tùy thu ộc vào cấu trúc và tính chất của mỗi loại gellan mà chúng sẽ được ứng dụng cho các m ục đích khác nhau Do vậy, việc nghiên cứu đánh giá cấu trúc và các đặc tính công ngh ệ cho mỗi loại gellan mới sinh tổng hợp là công việc cần thiết của các nghiên cứu thu nhận nguồn chế phẩm này

Năm 1993, Takeuchi và cộng sự đã chỉ ra Sphingomonas được chia thành 4 chi:

Sphingomonassensu stricto, Sphingobium, Novosphingobium và Sphingopyxis [73, 74] Các

khảo sát đã cho thấy hầu hết các chủng S paucimobilis sp đều có khả năng sản xuất gellan

và chỉ có vi khuẩn này mới có khả năng sinh tổng hợp gellan [14]

Sphingomonas sp là vi khuẩn gram âm, hình que có kích thước 0,3-0,8 x 1,0-2,7

µm, khuẩn lạc có màu vàng, màu cam hoặc màu trắng không bào tử, bề mặt khuẩn lạc có

dạng nhầy, phản ứng oxidase dương tính, dị dưỡng, hiếu khí hoàn toàn và sinh sắc tố vàng

Sphingomonas sp có khả năng di động nhanh nhờ các lông roi và đa số có khả năng phát quang dưới ánh sáng cực tím [20]

Vi khuẩn Sphingomonas sp được tìm thấy trong môi trường tự nhiên như trong nước, trong đất và trong hệ thống rễ cây [72] Nhiều tài liệu cho thấy, Sphingomonas sp có

thể tồn tại trong nhiều môi trường sống khác nhau là do chúng có khả năng sử dụng đa

dạng nguồn cơ chất, phát triển tốt ở dải nhiệt độ từ 28 - 32o

C và trong điều kiện thiếu dinh dưỡng Vi khuẩn này sử dụng glucose và một số loại đường khác cho sự sinh trưởng và phát triển

Con đường sinh tổng hợp gellan từ S paucimobilis là một quá trình khá phức tạp, có

thể chia ra làm 3 bước chính như sau: (a) sinh tổng hợp nội bào các tiền chất đường, (b) lắp ráp các tiểu phần lặp lại tetrasaccharide, (c) quá trình polymer hóa và tiết gellan thông qua màng ngoại bào (hình 1.4)

sự tổng hợp các tiền chất đường đơn như UDP-D-glucose, UDP-D-glucuronic acid và dTDP-L-rhamnose Các enzyme cần thiết cho quá trình này gồm phosphoglucomutase (PgmG), UDP glucose pyrophosphorylase (UgpG), UDP-glucose dehydrogenase (UgdG), TDP-glucose pyrophosphorylase (RmlA), dTDP-D-glucose-4,6-dehydratase (RmlB), dTDP-6-deoxy-D-glucose-3,5-epimerase (RmlC) và dTDP-6-deoxy-L-mannose dehydrogenase (RmlD) Glucose-1-P giữ vai trò quan trọng, trung gian cho 2 con đường sinh tổng hợp dTDP-L-rhamnose và UDP-D-glucuronic acid [27].

b/ Lắp ráp tiểu phần tetrasaccharide: sau quá trình hình thành các tiền chất đường là sự

hình thành các tiểu phần lặp lại Các gen thuộc cụm gen khác nhau đã được tìm thấy tham gia xúc tác vào quá trình hình thành gellan, vào quá trình sinh tổng hợp dTDP-L-Rha, các glycosyltransferase, các protein có mặt trong quá trình polymer hóa và vận chuyển gellan

Do gellan là polysaccarit ngoại bào được tổng hợp bên trong màng tế bào và sau đó được

tiết ra ngoài màng tế bào

Các tiểu phần lặp lại tetrasaccharid được lắp ráp vào chất mang lipid nhờ sự xúc tác

của các glycosyltransferase đặc hiệu Glycosyltransferase, vận chuyển glucose-1-phosphate

từ Glc đến chất mang lipid Gốc đường thứ 2 thêm vào là glucuronic acid, từ glucuronic acid Các gốc đường thứ 3 và thứ 4 (glucose và rhamnose) được thêm vào các

UDP-tiểu phần lặp lại, sự xúc tác tương ứng nhờ các enzyme GelL và GelQ Cuối cùng, việc lắp

ráp các đơn vị lặp lại được hoàn thành khi các nhóm acetate và glycerate gắn vào gốc glucose đầu tiên nhờ enzyme acetyltransferase và glyceryltransferase, theo thứ tự [27]

c/ Quá trình polymer hóa và tiết gellan thông qua màng ngoại bào: bước tiếp theo trong

quá trình sinh tổng hợp gellan là quá trình polymer hóa những tiểu phần lặp lại để chúng thành dạng chuỗi dài hơn Độ dài của chuỗi gellan được quyết định bởi các enzyme thuộc

họ PCP (polysaccarit co-polymerase), được mã hóa bởi các gen gel C và gel E [59].

Bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp là sự tiết gellan ra ngoài màng tế bào

Trong S paucimobilis ATCC 31.461, quá trình này được thực hiện nhờ các protein trung gian nằm ở lớp ngoài màng hay còn gọi là các protein phụ trợ, mã hóa bởi gen gelD Các

protein này sẽ hình thành kênh protein nơi các chuỗi polysaccarit có thể tiếp cận với màng

tế bào[21].

Hình 1.4 Cơ chế sinh tổng hợp gellan [16, 21]

1.1.4.2 Động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan của S paucimobilis

Động học quá trình sinh trưởng của S paucimobilis sp cũng tương tự như các vi

sinh vật khác đều trải qua lần lượt 4 giai đoạn: tiềm phát, logarit, cân bằng và suy vong

Chủng S paucimobilis sp đã được ghi nhận là loài có khả năng tiết ra một chất nhầy

(gellan) bao quanh tế bào như một tác nhân bảo vệ trong quá trình sinh trưởng và duy trì

của chúng Lượng chất này sẽ thay đổi theo chu kỳ phát triển của vi khuẩn Sau 6h lên men, tốc độ tạo sinh khối diễn ra mạnh mẽ và đạt cực đại ở khoảng 24h Năng suất gellan cũng tăng đáng kể và đạt cao nhất ở giờ lên men thứ 60 và sau đó có xu hướng ổn định Ở pha suy vong có thể một lượng nhỏ polyme bị phân hủy do vi khuẩn sinh enzym zhamnose lyzae làm thủy phân gellan Kanar và cộng sự đã báo cáo rằng, 48h đầu là thời gian tối ưu cho sản xuất gellan bởi S paucimobilis sp Wang và cộng sự đã quan sát thấy hàm lượng

gellan đạt tối ưu sau 56 giờ lên men Jin và cộng sự cũng đã chỉ ra 50 giờ đầu là thời gian

tối ưu cho việc sản xuất gellan Thời gian và tốc độ sinh trưởng và phát triển phụ thuộc vào đặc tính của chủng giống khác nhau [26, 27, 95] Động học quá trình sinh tổng hợp gellan

từ chủng S paucimobilis ATCC 31.461 được cho ở hình 1.5 [95]

Hình 1.5 Động học quá trình sinh tổng hợp gellan từ chủng S paucimobilis ATCC 31.461 [ 95]

Từ con đường sinh tổng hợp gellan của S paucimobilis sp cho thấy vai trò của

nguồn tiền chất cacbon có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp gellan Nó ảnh hưởng xuyên suốt đến quá trình hình thành gellan Sự tiết nhiều polysaccarit ngoại bào này cũng được nhận thấy khi vi khuẩn được cung cấp nhiều cacbon và nồng độ nitơ tối thiểu [94] Điều này có thể do nguồn đường là thành phần cấu tạo nên gellan còn nguồn nitơ chỉ

cần cấp một lượng vừa đủ để tạo sinh khối, khi môi trường cạn nguồn nitơ, vi khuẩn chuyển sang pha cân bằng, quá trình sinh tổng hợp gellan sẽ được kích thích nhằm bảo vệ chúng

Một điều nữa, với các chủng S paucimobilis sp khi tăng sinh khối sẽ đồng thời

tăng khả năng tích lũy gellan, do vậy trong những điều kiện nhất định về thành phần môi

trường, pH, nhiệt độ nuôi thì yếu tố không thuận lợi cho tạo gellan là việc cấp thiếu oxy Lượng oxy cấp không đủ sẽ ức chế sự sinh trưởng của chủng, dẫn tới giảm sản lượng gellan

Quá trình polymer hóa gellan cũng cần hoạt hóa tiền chất trước khi lắp ráp đơn vị

lặp lại Năng lượng cần thiết đó là UDP và ADP có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan Trong nghiên cứu của Bajaj và cộng sự 2006, khi sử dụng tinh bột tan trong môi trường nghiên cứu thì nồng độ ADP và UDP được tối ưu hóa cho sản xuất gellan ở mức 1 mM đã cho năng suất gellan cao nhất là 32,15 g/1 [14,59]

Tóm l ại, gellan được tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn S paucimobilis sp Khả năng sinh tổng hợp gellan mạnh hay yếu tùy thuộc khá nhiều vào đặc điểm và các tính chất sinh lý, sinh hóa c ủa từng chủng Vì vậy, việc phân lập, tuyển chọn hay cải biến các chủng

có kh ả năng sinh gellan cao luôn giành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

M ặt khác, là sản phẩm trao đổi bậc hai và được tích lũy ngay từ pha logarit và kéo dài qua pha cân b ằng Đây là điểm cần lưu ý khi nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh t ổng hợp gellan, vừa tìm các điều kiện thích hợp cho việc tăng sinh khối vừa đảm bảo các điều kiện tối thiểu cho duy trì chủng

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL

Chiều dài của pha logarit thường bị ảnh hưởng bởi lượng giống và tuổi giống Do đó,

chất lượng giống (tuổi giống cấp, tỷ lệ giống) là một thông số cần quan tâm khi nghiên cứu sinh tổng hợp gellan

Nghiên cứu của Ashok Pandey và cộng sự đã khảo sát thời gian lên men từ 12 giờ -

96 giờ cho sản xuất gellan và xác định được lượng gellan đạt cao nhất sau 48 giờ lên men Theo tác giả, gellan được hình thành ở pha sinh trưởng và tiếp tục được tạo ra nhiều ở pha cân bằng, sự tăng trưởng tế bào đồng thời sinh tổng hợp gellan cũng được hình thành Để

lựa chọn giống khỏe mạnh, Nampoothiri và cộng sự tiến hành tiếp giống ở các tuổi giống (8, 12, 16, 20 và 24 giờ) Kết quả đã thu lượng gellan tối đa là 22,3 g/l khi cấp giống ở tuổi giống

20 giờ Cũng với kết quả nghiên cứu về các tỷ lệ tiếp giống (1, 2, 4, 6, 8 và 10%), lượng gellan cao nhất đã thu được ở tỉ lệ giống 10% Nhìn chung các nghiên cứu thường sử dụng 6 -10%

giống và tuổi giống ở 18 - 24 giờ là thích hợp cho lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S

paucimobilis sp [13, 14, 16, 35, 61]

Nguồn cacbon

Nhiều công trình nghiên cứu nâng cao sản lượng gellan từ chủng vi khuẩn

Sphingomonas sp trên các nguồn cacbon khác nhau đã được công bố Giavasis, Lobas và West đã cho thấy, vi khuẩn này có khả năng tổng hợp gellan trên các nguồn cacbon khá đa

dạng như glucose, sucrose, lactose, mannose, galactose, fructose, maltose, rỉ đường, xiro ngô, tinh bột tan Hàm lượng sử dụng khác nhau tùy chủng và điều kiện lên men khác nhau, thường dao động trong khoảng 2 - 4% [28, 51, 89]

Banik và cộng sự năm 2007 đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ sung khác

nhau vào môi trường lên men đến khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng vi khuẩn S

paucimobilis ATCC 31461 Trong số 20 chất thử nghiệm, rỉ đường, trypton, casamino acid, disodium hydrogen orthophosphate và manganese chloride có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp gellan Khi nuôi cấy chủng này trên môi trường có thành phần rỉ đường 112.5 g/l, trypton: 1 g/l, axit casamino: 1 g/l, disodium hydrogen orthophosphate: 1 g/l và manganese chloride: 0.947 g/l đã cho sản lượng gellan cao nhất đạt 13,81 g/l [16]

Cũng với chủng trên (S paucimobilis ATCC 31461), Nampoothiri và Bajaj đã thử

nghiệm bổ sung riêng lẻ 2% các nguồn cacbon như tinh bột tan, lactose, glucose, sucrose

và maltose vào môi trường lên men lại tìm được tinh bột tan là nguồn cacbon tốt nhất cho

sản lượng gellan đạt tới 24 -28 g/l [13, 61]

Bajaj và cộng sự năm 2006 đã chứng minh, cacbon không chỉ đóng vai trò như một thành phần chính cho việc xây dựng tế bào, mà còn được sử dụng trong quá trình tổng hợp polysaccharit Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau đến sản

xuất gellan đã cho thấy, ở nguồn carbon thích hợp không những hỗ trợ trong sản xuất tối

đa sinh khối mà còn trong sản xuất gellan và ngược lại Sau 48 giờ lên men, môi trường tối

ưu thu được khi sử dụng tinh bột hòa tan đã cho hàm lượng sinh khối và gellan cao nhất

lần lượt là 0,46 g/l và 19,32 g/l [13]

Nhóm nghiên cứu của Zhang (2015) khi thử nghiệm với chủng S paucimobilis

QHZJUJW CGMCC2428 lại chỉ ra sucrose là nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh tổng

hợp gellan đạt 19,89 g/l sau 72 giờ lên men Theo đó, môi trường tối ưu được sử dụng với nguồn sucrose 40g/l, peptone 3g/l, MgSO4 3,2 g/l, Na2HPO4 7,5 g/l, KH2PO4 9,2 g/l,

K2SO4 4,3 g/l, với pH 7 [94]

Qua các nghiên cứu cho thấy, tùy vào đặc tính chủng cũng như thông số và điều

kiện lên men cụ thể mà mỗi thực nghiệm sẽ có thông số lên men tối ưu khác nhau Tuy nhiên, các nguồn cacbon từ glucose, tinh bột tan, maltose, saccarose, lactose là nguồn cacbon thông dụng, an toàn cho hiệu quả tốt trong sinh tổng hợp gellan

Ngu ồn nitơ

Nhìn chung nguồn nitơ, nồng độ nitơ và tỉ lệ C/N đều có ảnh hưởng tới sự phát triển sinh khối và sự tạo thành sản phẩm Dreveton và cộng sự (1996) cho rằng nguồn nitơ thúc đẩy sự phát triển tế bào và sinh tổng hợp gellan là nguồn nitơ hữu cơ như nước chiết ngô và các nguồn nitơ vô cơ như ammonium nitrate và potassium nitrate Nampoothiri và

cộng sự (2003) đã so sánh các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau cho sản xuất gellan

từ chủng vi khuẩn S.paucimobilis ATCC 31461, sản lượng gellan đạt cao nhất khi bổ sung

trypton vào môi trường lên men (là 32,1 g/l) Cũng với chủng trên, Bajaj và cộng sự (2006

và 2007) đã chỉ ra, nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho hỗ trợ sinh tổng hợp gellan còn các nguồn nitơ vô cơ chỉ hỗ trợ sản xuất sinh khối, nhưng không thể tăng sản lượng gellan Vì các nguồn nitơ hữu cơ còn chứa các axit amin và vitamin, nên có thể giả định rằng các thành phần này có thể chịu trách nhiệm cải thiện năng suất của gellan Trong số các nguồn nitơ khác nhau được sử dụng, chỉ có chiết xuất men và peptone được tìm thấy là hữu ích Chiết xuất nấm men đã hỗ trợ sản xuất gellan tối đa (19,82 g/1), trong khi peptone cho năng suất gellan đạt 18,18 g/1 vào cuối 48 giờ lên men [14, 24, 61]

Thử nghiệm của West và Strohfus (1998) lại cho thấy đậu tương có thể được sử dụng như là nguồn nitơ để sản xuất gellan góp phần giảm giá thành của sản phẩm [89] Tương tự Hyuck và cộng sự (2003) đã sử dụng bactopeptone và chất chiết đậu tương cho sản xuất gellan từ vi khuẩn S.paucimobilis NK 2000, sản lượng gellan đạt 3,27 và 7,33 g/l [35]

Ngoài nguồn cacbon và nitơ thông thường, môi trường sản xuất gellan thường được

bổ sung thêm một số vitamin và axit amin để kích thích tăng sự phát triển của tế bào và sinh tổng hợp gellan Theo nghiên cứu của Bajaj và cộng sự năm 2006, trong số các axit amin được nghiên cứu: L- valine, L- tryptophan, L- isolucine, L- threonine, L- glutamine, L- leucine, L- lysine, L- cystine hoặc L- arginine thì tryptophan và threonine đã được tìm

thấy là có khả năng tăng sản lượng gellan nhất, năng suất gellan thu được tương ứng là 39,5 g/l và 36,4 g/l khi bổ sung ở nồng độ 0,05% Tác giả cho rằng, threonine và tryptophan đã ảnh hưởng đến chuyển hóa của các nguồn carbon trong sinh tổng hợp gellan

từ S paucimobilis ATCC 31461 Khẳng định này, dựa trên kết quả thí nghiệm về cân bằng

nguồn carbon trong sinh tổng hợp gellan sử dụng tinh bột làm chất nền để sản xuất polysaccharit Môi trường lên men không bổ sung axit amin (Đối chứng), hàm lượng gellan thu được 28,55 g/l và hiệu suất chuyển hóa cacbon chỉ đạt 67% Với môi trường được bổ sung axit amin đã làm tăng hiệu suất chuyển hóa cacbon lên 88% Điều đó là do

sự giảm đáng kể lượng carbon tiêu hao để tạo carbon dioxide ở các phản ứng dị hóa trong

con đường sinh tổng hợp gellan, cũng đồng nghĩa là làm tăng lượng carbon tham gia vào hình thành các phân tử đường đơn [13, 14]

Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH

Ảnh hưởng của nhiệt độ trong sản xuất gellan từ vi khuẩn S paucimobilis sp đã

được một số tác giả công bố Dreveton và cộng sự (1996) cho rằng yếu tố nhiệt độ lên men

đã ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển và sinh tổng hợp gellan, khi nhiệt độ lên men duy trì ở 25o

C sản lượng gellan chỉ được 16,2 g/l, còn khi nhiệt độ lên men là 30o

C sản lượng

gellan đạt 24 g/l ở chủng S paucimobilis sp [24] Với nghiên cứu của West (2003) cũng

đã chứng minh, chủng S.paucimobilis ATCC 31461 đã cho khả năng sinh tổng hợp gellan

cao nhất ở dải nhiệt độ 30 và 31o

C sau 72 giờ lên men [87]

Mỗi chủng vi sinh vật có thể phát triển ở dải các giá trị pH khác nhau, khi thay đổi

pH môi trường, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật cũng bị thay đổi Tại giá trị pH môi trường tối ưu, vi sinh vật sẽ có tốc độ sinh trưởng và phát triển lớn nhất Nhìn chung, giá trị

pH tối ưu cho sản xuất polysaccarit ngoại bào từ vi khuẩn thường cao hơn so với từ nấm Giá

trị pH thích hợp cho sản xuất gellan nằm trong khoảng 6,5 - 7,0 [24, 26, 40] Môi trường nhiều axit hoặc kiềm sẽ làm giảm sự phát triển tế bào và sản lượng gellan

Ảnh hưởng của điều kiện cấp khí

Nhiều nghiên cứu cho thấy S paucimobilis sp sinh tổng hợp gellan cùng với quá

trình sinh trưởng và phát triển của chúng Nếu kiểm soát tốc độ cấp khí tốt sẽ thúc đẩy quá trình tăng trưởng diễn ra mạnh mẽ và sẽ kéo theo quá trình sinh tổng hợp gellan cũng được tăng cường Do vậy, việc cấp khí cho môi trường lên men được đặc biệt quan tâm trong quá trình sinh tổng hợp gellan

Dreveton và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sản lượng của gellan Quá trình lên men được tiến hành trên hệ thống 14 lít ở nhiệt độ nuôi cấy duy trì 30oC và pH 6,5 Ở tốc độ khuấy 250 vòng/phút là thích hợp cho quá trình lên men,

ở tốc độ khuấy thấp hơn lượng sinh khối tạo thành ít và gellan tạo được cũng không nhiều Giavasis và cộng sự (2006) cũng đã chứng minh ảnh hưởng của tốc độ khuấy và thông khí

đến khối lượng phân tử và sinh tổng hợp gellan từ vi khuẩn S paucimobilis sp cho rằng:

với tốc độ thông khí cao và khuấy mạnh sẽ làm tăng sự phát triển của vi khuẩn S.paucimobilis

Nồng độ gellan cao nhất có thể thu được ở tốc độ khuấy 500 vòng/phút với độ thông khí 1-2 v/v/ph (12,4 g/l gellan) [24, 28]

Kiểm soát tốc độ khuấy và oxy hòa tan là quan trọng trong quá trình lên men hiếu khí, đặc biệt trong sản xuất polysaccarit Mức độ oxy hòa tan trên 10% cho thấy không ảnh

hưởng nhiều đến sinh trưởng của vi khuẩn S paucimobilis sp Ở mức độ 10%, giới hạn oxy

đã dẫn đến lượng sinh khối tạo thành thấp (3.2 g/l) Ở tốc độ lắc tối đa, mức độ oxy hòa tan

hoạt động như một lực đẩy để tăng tỉ lệ hấp thu oxy của các tế bào, dẫn đến tăng sản xuất gellan Điều này phù hợp với nghiên cứu của Dreventon và cộng sự (1996), các điều kiện

vận chuyển oxy cao thuận lợi cho sản xuất gellan Phân tích thành phần hóa học của gellan

ở mức độ oxy hòa tan cao cũng cho thấy sự giảm hàm lượng acetyl và tăng hàm lượng glyceryl của polymer, không thấy sự thay đổi đáng kể về hàm lượng glucose, rhamnose và axit glucuronic trong phân tử gellan

Sinh trưởng của vi khuẩn S paucimobilis sp liên quan mật thiết với tốc độ lắc

Sinh khối cao nhất 4.5 g/l đạt được ở 1000 vòng/phút, trong khi đó sinh khối không quá 3.4 g/l quan sát được ở 500 vòng/phút và độ thông khí 1 v/v/ph Khi tốc độ lắc giảm (250 vòng/phút, 1 v/v/ph) sự tích lũy sinh khối cũng giảm

Trong những năm gần đây, để nâng cao sản lượng gellan từ lên men vi sinh vật trong những thiết bị khó cung cấp oxy thông qua cánh khuấy hay sục khí, các nhà khoa học

đã quan tâm đến việc bổ sung hydrogen peroxide (H2O2) vào quá trình sản xuất gellan Tăng cường hiệu quả cấp oxi cho khối dịch lên men nhờ H2O2 khắc phục hiện tượng dính

nhớt do chính gellan gây ra Zhu và cộng sự năm 2014 đã báo cáo H2O2 có khả năng cải thiện việc sinh tổng hợp các polysaccarit Đây là biện pháp tăng cường oxy cung cấp cho

vi khuẩn dựa trên sự chuyển hóa H2O2 thành O2 trong dịch lên men Tuy nhiên, nồng độ

H2O2 quá mức lại là một trong những tác nhân gây tổn thương tế bào vi sinh vật, dẫn đến

việc ức chế sự phát triển của tế bào cũng như sinh tổng hợp gellan Thí nghiệm được thiết

kế dựa trên đường cong sinh trưởng chủng nghiên cứu, kết hợp việc sử dụng một dải nồng

độ H2O2 khác nhau Kết quả cho thấy năng suất sản xuất gellan đạt tối đa (22,52 g/l) ở các

nồng độ H2O2 : 2, 2, 3, 4 mM được bổ sung tương ứng ở các mốc thời gian 6, 12, 18, 24 giờ trong pha logarit và hiệu suất sinh tổng hợp gellan cũng được tăng lên 35,58% Bên cạnh đó, tác giả cũng đã chỉ ra việc bổ sung H2O2ở chế độ này đã làm tăng hoạt tính của các enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase và glucosyltransferase là những enzyme tham gia quá trình sinh tổng hợp gellan [95]

Bản chất của quá trình sinh tổng hợp gellan từ Sphingomonas sp đã được làm sáng

tỏ [14, 21] Quá trình tổng hợp này gồm nhiều giai đoạn và nhiều thành phần tham gia, do

vậy việc nghiên cứu cải thiện chủng vi khuẩn Sphingomonas sp có các đặc tính mong

muốn ứng dụng trong sản xuất gellan là một vấn đề khá phức tạp

Để nâng cao khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng tự nhiên Sphingomonas sp

31461, West và cộng sự (2002, 2005) đã sử dụng phương pháp đột biến ngẫu nhiên bằng ethylmethane sulfonate (EMS) nồng độ 1%, kết hợp với chất kháng sinh ampicillin nồng

độ 100 mg/l Kết quả, đã tuyển chọn được dòng đột biến có khả năng sinh tổng hợp gellan tăng gấp 2 lần so với chủng tự nhiên Không có sự khác nhau về hàm lượng acid glucuronic trong cấu trúc gellan giữa dòng đột biến và chủng tự nhiên [86, 88] Lobas và

cộng sự (1992) khi đột biến chủng vi khuẩn Sphingomonas sp bằng EMS, đã tạo được

dòng đột biến có khả năng sinh gellan tăng gấp 4 lần so với chủng gốc [49]

Gần đây, Xuechang Wu và cs (2011) đã chứng minh trong quá trình lên men sinh

tổng hợp gellan, chủng Sphingomonas sp cũng sản sinh ra một lượng khá lớn các sắc tố

carotenoit màu vàng Đây là một tạp chất và để loại bỏ chất màu này cần một lượng lớn dung môi như ethanol hoặc isopropanol cho quá trình tinh sạch, do đó chi phí xử lý và giá thành sản phẩm sẽ tăng Nhóm tác giả đã tiến hành tạo chủng Sphingomonas sp đột biến

khuyết carotenoit bằng việc sử dụng chất gây đột biến ethyl methanesulfonate kết hợp với chiếu tia cực tím Sản lượng gellan của chủng đột biến cao hơn 13% so với chủng tự nhiên

và giảm được đáng kể lượng isopropanol dùng cho quá trình tinh sạch loại các sắc tố carotenoit, tăng hiệu quả kinh tế lên 20% so với sản xuất gellan từ chủng tự nhiên [90]

Năm 2014, Attallah và cộng sự đã sử dụng phương pháp dung hợp tế bào trần giữa

Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 (S.p.ATCC 31461) với 2 chủng S.p.Q6 và S.p G1 Kết quả đã tạo ra 17 thể dung hợp (S.p.ATCC 31461:: S.p.G1) và 3 thể S.p.Q6 :: S.p.G1) ổn định về mặt di truyền Bên cạnh đó, khi tiến hành phân tích hệ gen của các thể dung hợp đều cho thấy sự có mặt của gen PgmG và gen RmlA là các gen tham gia quá trình

sinh tổng hợp gellan Năng suất gellan đạt 16,82 g/l đối với thể dung hợp S.p.ATCC 31461:: S.p.G1 và 17,16 g/l đối với thể S.p.Q6:: S.p.G1 Tiến hành thủy phân gellan, kết

quả thu được 3 loại đường glucose, glucuronic acid và rhamanose với tỷ lệ 2:1:1 Nghiên

cứu này cho thấy sự cải tiến về mặt di truyền nhờ sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần

giữa các chủng sản xuất khác nhau, nhằm cải thiện chất lượng và năng xuất sản phẩm gellan tạo ra [11] Nhìn chung, các nghiên cứu này vẫn đang trong giai đoạn nghiên cứu, chưa tạo ra được chế phẩm thương mại

Qua các tài liệu thu thập được có thể tóm lược và so sánh các điều kiện sinh tổng

hợp gellan cho một số chủng S paucimobilis sp ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Ảnh hưởng chủng giống, nguồn dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy

đến khả năng sinh tổng hợp gellan

S paucimobilis sp Glucose 2%; pH 7.0; 8%; khuấy 200

vòng/phút; 52 giờ 8,12 19

S paucimobilis NK

2000

Glucose 2%; bacto-peptone 0,05%; pH 6.5 – 6.8; 5%; khuấy 400 vòng/phút; 30o

L-threonine 0,05%; 10%; khuấy 180 vòng/phút; 30oC; 48 giờ

C; 48

giờ

43,6 13

Tóm l ại, khả năng sinh tổng hợp gellan không những phụ thuộc vào từng chủng

gi ống, mà ngay cả cùng một chủng giống nhưng thành phần môi trường và điều kiện lên men khác nhau cũng sẽ cho sản lượng gellan rất khác nhau Do vậy, với mỗi chủng, mỗi điều kiện nuôi khác nhau cần phải tiến hành khảo sát, nghiên cứu để tìm ra các thông số

thích h ợp cho quá trình sinh tổng hợp gellan cao Gần đây bên cạnh việc tìm kiếm các ngu ồn cacbon, nitơ có giá thành rẻ hơn cho dịch lên men, bổ sung H 2 O 2 theo b ậc, khắc phục độ nhớt dịch lên men, cải thiện phương thức cấp oxy cũng được ghi nhận là giải pháp làm tăng khả năng sinh tổng hợp gellan

Các chủng S paucimobilis sp sinh ra gellan có đặc tính bám dính quanh tế bào,

hơn nữa dịch lên men thường có độ nhớt cao, gây khó khăn khi tách tế bào khỏi gellan Do

vậy, cần phải có các giải pháp thích hợp cho việc thu nhận nguồn polyme này

Để tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn cần giảm độ nhớt, giảm độ kết dính của gellan

với tế bào bằng cách nâng nhiệt khối dịch sau lên men, khi đó ở nhiệt độ cao gellan có

dạng sợi đơn làm giảm độ nhớt, giảm độ kết dính, tách khỏi thành tế bào Đồng thời ở nhiệt độ cao, enzyme và vi sinh vật sẽ bị bất hoạt Tiếp đó mới tiến hành ly tâm để tách sinh khối và thu dịch nổi chứa gellan Gellan bản chất là một polysaccharit dị thể, có trọng lượng phân tử khá lớn và có đặc tính hòa tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi hữu cơ [87, 91] do vậy chúng có thể dễ dàng bị kết tủa với các dung môi phân cực

Nampoothiri và cộng sự năm 2003 đã đề xuất qui trình thu nhận gellan như sau: giữ 15 phút ở 100o

C, tiếp đến ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC để tách tế bào vi khuẩn

Dịch ly tâm được bổ sung isopropyl alcohol lạnh với tỷ lệ 1:3 và ủ qua đêm ở 4oC để kết tủa gellan Ly tâm thu tủa ở 8000 vòng/phút trong 30 phút ở 4o

C, thu nhận gellan bằng cách sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 80o

C, 12 giờ

Thu hồi gellan cũng được mô tả bởi Kang và cộng sự (1982) hay Bajaj và cộng sự

(2007) [14, 40, 41] Dịch lên men được làm nóng đến 90 - 95°C trong 10 - 15 phút Tách gellan ra khỏi tế bào bằng cách lọc hoặc ly tâm Dịch nổi được thêm isopropyl alcohol lạnh

và hỗn hợp này được giữ ở 4°C trong 12 giờ để gellan kết tủa hoàn toàn Kết tủa được thu

hồi bằng ly tâm và sấy khô ở 55°C trong 1 giờ Với Fialho và cộng sự lại tủa với 2,5 thể tích ethanol 95% lạnh, rửa sạch kết tủa, sau đó sấy khô ở 80°C trong 24h để thu gellan [27] Wang và các cộng sự đã thêm ba lần thể tích ethanol 95% vào trong dịch lên men để kết tủa gellan, sau đó thu hồi bằng cách ly tâm và sấy khô ở 60o

C trong 24h [14, 82, 85]

Tùy mục đích sử dụng mà có các phương pháp tinh sạch gellan khác nhau Xuechang Wu và cs (2011) đã chỉ ra, quá trình lên men sinh tổng hợp gellan, chủng

Sphingomonas sp cũng sản sinh ra một lượng khá lớn các sắc tố carotenoit màu vàng Đây

là một tạp chất và để loại bỏ chất màu này cần tiến hành rửa tủa nhiều lần với nước khử ion, tiếp đó sử dụng dung môi như ethanol hoặc isopropanol để thu tủa, kết tủa được sấy

thu gellan tinh sạch [35, 90] Tác giả Dreveton và cộng sự mô tả phương pháp tinh sạch gellan bằng cách lấy 0,1% dung dịch gellan thô khuấy đều ở 40°C trong 16 giờ Sau đó, dung dịch được nâng nhiệt ở 95°C trong 30 phút, ly tâm ở 13.000 vòng trong 30 phút Dịch

nổi được đun nóng ở 95°C và lọc với tấm lọc kích thước 0,7μm [24] Bên cạnh đó việc tinh

sạch gellan cũng có thể được thực hiện như sau: kết tủa với cồn được rửa sạch nhiều lần

với acetone và ete, trong nước khử ion Sau đó tiến hành thẩm tách bằng ống thẩm tách có

khối lượng phân tử cut-off 12.000-14.000 Sau khi thẩm tách trong 2-3 ngày với 4-5 lần thay nước khử ion, dung dịch được đông khô để tạo dạng bột gellan Ngoài ra, các phương pháp sắc ký như sắc ký lọc gel (GFC) cũng có thể được sử dụng để tinh chế gellan [35] Công nghệ chiết xuất thu hồi gellan có thể tóm tắt ở hình 1.6

Hình 1.6 Sơ đồ chung thu nhận gellan từ dịch lên men

1.2.3 Chuy ển hóa gellan thành gellan khử acyl

Độ deacyl hóa (ĐĐA) là một thông số rất quan trọng của gellan khử acyl, quyết định đến đặc tính của gel tạo thành Gellan khử acyl có mức độ deacyl hóa khác nhau sẽ

dẫn tới sự khác nhau về khối lượng phân tử, độ nhớt, độ giòn Gellan có độ deacyl hóa càng cao thì khối lượng phân tử và độ nhớt càng giảm, gel thu được có độ chắc và độ giòn càng tăng Kỹ thuật chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl đã có nhiều tác giả công bố, tác nhân chủ yếu được sử dụng là kiềm và có thể tóm lược như sơ đồ hình 1.7

Hình 1.7 Sơ đồ chung thu nhận gellan khử acyl từ gellan

Tùy thuộc vào lượng kiềm, nhiệt độ và thời gian xử lí khác nhau sẽ thu được các gellan có mức độ deacyl khác nhau, thông thường quá trình được thực hiện ở pH 10, nhiệt

Kết thúc quá trình khử, dịch được hạ nhiệt tới nhiệt độ môi trường và điều chỉnh về

pH 7 bằng axit trichloroacetic Các dung môi hữu cơ như ethanol, isopropyl alcohol thường được sử dụng để kết tủa gellan khử acyl ra khỏi dịch (tỷ lệ ethanol 95%/dịch nổi bằng 3/1,

ở 4°C trong 20 phút) Sau đó, kết tủa được thu hồi qua bước ly tâm (4500 vòng/phút trong

30 phút ở 25o

C) hoặc kết tủa được thu hồi qua hệ thống lọc với kích thước màng lọc 0,45

µm Tủa gellan khử acyl được làm khô ở 80o

C, 12 giờ [16, 24, 41, 80]

Tóm l ại, tùy thuộc vào lượng kiềm sử dụng cũng như khống chế về nhiệt độ và thời gian khác nhau ta s ẽ có thể chủ động tạo ra được các dạng gellan khử acyl với các mức độ deacyl và các tính ch ất lý hóa khác nhau, đáp ứng nhu cầu đa dạng của thị trường Bên

c ạnh đó, cũng rất cần có các nghiên cứu thêm để chuẩn hóa phương pháp phân tích mức

độ deacyl hóa cho các chế phẩm gellan khử acyl để tăng công cụ đánh giá cho dòng sản

ph ẩm này

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU ỨNG DỤNG GELLAN VÀ GELLAN KH Ử ACYL

Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm và y tế [39] So

với polysaccarit khác, gellan có nhiều lợi thế như có sự ổn định nhiệt và axit, điều chỉnh độ đàn hồi gel và độ cứng, độ trong suốt cao, giải phóng hương vị tốt Hàng năm, chỉ tính riêng

thị trường Tây Âu đã tiêu thụ khoảng 60.000 tấn gellan, trong đó 80% dùng làm phụ gia thực

phẩm [35] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng ứng dụng của gellan là rất lớn Do đặc tính lưu biến tuyệt vời và cấu trúc độc đáo, gellan có phổ ứng dụng rộng trong thực phẩm, dược

phẩm và các ngành công nghiệp khác Nhu cầu thị trường về sản phẩm này ngày càng tăng

và nó dần trở thành một polysaccarit sinh học thương mại hóa quan trọng nhất [48, 93]

Phương pháp kỹ thuật phủ màng là tạo ra một dịch lỏng dạng composit hoặc nhũ tương rồi phủ lên bề mặt từng quả bằng cách phun, nhúng, xoa, lăn Khi dịch lỏng khô, tạo

ra một lớp màng mỏng gần như trong suốt trên quả Nhờ tính chất bán thấm điều chỉnh khí

và hơi nước của màng mà quả được giữ tươi lâu hơn Màng phủ có tác dụng làm giảm tổn

thất khối lượng và làm chậm sự khô héo của quả do hạn chế quá trình mất nước Màng phủ

có thể tạo ra vùng vi khí quyển điều chỉnh xung quanh quả do đó làm thay đổi sự trao đổi khí với không khí xung quanh Sau thời điểm thu hoạch, các tế bào của mô thực vật vẫn

diễn ra các hoạt động sinh lý mạnh, chúng tiêu thụ oxy và thải ra khí cacbonic Khi quả được phủ màng thì một môi trường vi khí quyển được tạo ra bên trong quả, phụ thuộc vào tính thấm của màng Nồng độ O2 thấp và CO2 cao làm giảm sự hô hấp và chậm sự tạo thành ethylene, dẫn tới chậm chín Màng làm giảm tổn thất khối lượng và sự khô bề mặt vì

rau quả để tự nhiên sẽ thoát nước ra không khí xung quanh dưới dạng hơi nước, quá trình này gọi là sự thoát hơi nước [2]

Với tính chất tạo vi màng, ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với sản phẩm, gellan được coi là vật liệu lý tưởng trong sử dụng tạo màng bao gói ăn được Để hạn chế nhược điểm

của màng gellan ngăn cản chống mất nước kém, người ta thường bổ sung các chất lipit (glycerol, dầu tự nhiên ) ở tỷ lệ hợp lý để tạo thành phần vi khí quyển cân bằng tối ưu cho

bảo quản rau quả [75, 77]

Một số nghiên cứu đã được thực hiện để xác định ảnh hưởng của màng bao ăn được gellan - whey protein trên một số loại quả xoài, đu đủ, lê, chuối và ở dạng cắt lát ăn ngay

Kết quả chứng minh màng bao ăn được gellan - whey protein đã kéo dài thời gian bảo

quản của các sản phẩm cắt lát ăn ngay nêu trên, tạo độ cứng cho quả, cải thiện độ bóng của

bề mặt quả do đó gia tăng giá trị thương mại của các loại quả này

Tác giả Grau và cộng sự đã nghiên cứu tạo màng bao ăn được chứa 0,5% gellan, alginate và một số chất chống nâu hóa như N-acetylcystein và glutathione trên táo cắt lát

Kết quả cho thấy màng bao gellan, alginate có tác dụng ngăn cản sự nâu hóa, giữ tươi và

bảo vệ được bề mặt sản phẩm [30] Moreira và cộng sự cũng đã sử dụng sung ánh sáng với cường độ 12 J/cm2

kết hợp với màng sinh học từ gellan (0,5% w/v) để bảo quản táo cắt lát

Kết quả cho thấy giảm khả năng nâu hóa, hao hụt vitamin và tăng thời gian bảo quản của táo cắt lát lên đến 14 ngày trong điều kiện 4o

C [60]

Để bảo quản một số loại quả có múi và đu đủ tươi cắt lát, Tapia và cộng sự năm

2008 đã nghiên cứu công thức tạo màng có chứa gellan (0,5%), glycerol (1-2%) và axit ascorbic (1%) Kết quả thấy công thức tạo màng này có khả năng kháng hơi nước đến 66%, cải thiện độ săn chắc và thời gian bảo quản của sản phẩm Hơn nữa, việc bổ sung axit ascorbic là chất chống oxy hóa vào màng nhằm bảo quản hàm lượng axit ascorbic tự nhiên

của đu đủ tươi cắt lát và giúp duy trì chất lượng dinh dưỡng của quả trong suốt quá trình

bảo quản Công thức tạo màng này được nhóm tác giả khuyến cáo cũng có thể sử dụng để

bảo quản một số loại quả như cam, quýt [75]

Ngoài ra, để tăng khả năng ứng dụng của màng có thể thêm một số chất như kháng sinh, kháng nấm, chất tạo màu, tạo hương, vị, chất dinh dưỡng và các loại gia vị…trong quá trình tạo màng [10, 83] Gần đây, Tapia và cộng sự năm 2007, đã nghiên cứu phát triển trái cây probiotic bằng cách bổ sung vi khuẩn Bifidobacterium lastis Bb12 trong màng gellan và

alginate để bảo quản táo và đu đủ cắt lát Kết quả cho thấy gellan và alginate đã có hiệu quả trong việc hỗ trợ B lastis phát triển

Để bảo quản chuối, bên cạnh những vật liệu chính tạo màng, việc bổ sung CaCl2

trong công đoạn phủ màng đã làm tăng khả năng bám dính của màng gellan và sản phẩm ứng dụng Ngoài ra, khi bổ sung CaCl2 trên quả đã làm tăng thời gian bảo quản của quả do CaCl2 gây rối loạn sinh lý, trao đổi chất và do đó gián tiếp làm giảm hoạt động của một số

vi sinh vật gây bệnh ví dụ như Botrytis cinerea và P expansum Tác giả Dionisio và cộng

sự đã đánh giá khả năng ức chế của CaCl2 và một số muối vô cơ đối với các nấm gây bệnh trên chuối như Lasiodiplodia theobromae, Thielaviopsis paradoxa, Colletotrichum musae,

C gloeosporioides, Fusarium verticillioides và F oxysporum Kết quả cho thấy khi bổ sung CaCl2 trong công thức chế phẩm bảo quản chuối đã ức chế sự phát triển của nấm gây

bệnh L theobromae, T paradoxa và F verticillioides 35%, 28% và 5%, theo thứ tự [23]

Cho đến nay, trên thế giới chưa có công trình nào nghiên cứu tạo màng gellan trong

bảo quản chuối, có lẽ đây không phải là sản phẩm chủ lực của họ Nhưng chuối lại là một trong những hoa quả chủ lực xuất khẩu lâu bền của Việt Nam, để phục vụ cho việc thương

mại hóa quả chuối nên luận án lựa chọn ứng dụng màng gellan trong bảo quản chuối tiêu Chuối là quả có hô hấp đột biến, quá trình chín xảy ra sau thu hoạch Do vậy, tổn thất sau thu hoạch của chuối là do tác động của cả quá trình mất nước và hô hấp của quả Gellan

bản chất là polyme sinh học, có khả năng tạo màng tốt và ngăn cản sự trao đổi khí oxy, cacbonic, hương thơm Tuy nhiên gellan không có khả năng giữ ẩm so với đa số các màng

chất dẻo tổng hợp khác [9] Trong khi đó các chất béo lipit, glycerol là chất kỵ nước lại có

khả năng ngăn cản mất hơi nước tốt hơn so với polysaccharit và protein Nhưng, do bản

chất không phải là polyme nên khả năng tạo màng của lipit bị hạn chế [44] Vì vậy màng được tạo từ sự kết hợp của polyme và lipit ở một tỷ lệ hợp lý cùng các phụ gia tạo màng sẽ

khắc phục được điều này

Một số các sản phẩm điển hình có chứa gellan gồm: mứt quả, các loại bánh kẹo, nước giải khát, sản phẩm sữa, sản phẩm thạch, lớp kem phủ lên bánh, nước xốt, thực phẩm

kết cấu Các đặc điểm và tính chất của dung dịch gellan được nghiên cứu rất rộng rãi với

số lượng lớn các patent đã đăng ký ứng dụng gellan trong thực phẩm và trong sinh học [14, http://pdf-edu.com/kelcogel-gellan-gum.html]

Gellan ở trạng thái tự nhiên hình thành dạng gel mềm và đàn hồi, tuy nhiên khi đã

khử nhóm acyl bằng kiềm sẽ hình thành một dạng gel cứng như agar và có thể được sử

dụng thay thế agar Gel này có đặc tính đông kết tương tự như agar và là tác nhân làm đông vượt trội với sự trong suốt cao, tạo gel giòn ở nồng độ thấp hơn nhiều so với môi trường

thạch agar, nó được ứng dụng trong làm các loại thạch [18] Gellan khi được tạo thành ở

dạng gel lỏng có cấu trúc gel yếu, có thể giữ các tiểu phần ở trạng thái lơ lửng mà không làm

thay đổi độ nhớt, dính của dung dịch Nó được ứng dụng trong sản xuất đồ uống trái cây và bánh kẹo dẻo

Cung cấp chất tạo gel cho nước giải khát với vị như của gelatin Khi thêm gellan sẽ làm tăng nhiệt độ nóng chảy, giúp cho gel mềm, ngon ngọt, mọng nước nhưng lại không tan chảy và mất hình dạng của nó, đồng thời tạo trực quan tốt, cần khoảng 0.3% gellan cho ứng dụng này Nhờ đặc tính ổn định trong môi trường axit nên gellan có lợi thế ứng dụng trong sản xuất các dạng nước giải khát có độ pH thấp [14, 25, 35, 68]

Gellan được ứng dụng thành công trong sản xuất mứt, có thể thay thế cho pectin Hàm lượng gellan sử dụng khoảng 0,15 - 0,4% thấp hơn so với pectin (khoảng 0.6% đối với methoxypectin cao và 0.8% đối với methoxypectin thấp) Ở những sản phẩm này, tùy thuộc vào mỗi loại mứt để bổ sung lượng gellan tối thiểu mà chất lượng mứt vẫn đảm bảo được chất lượng tốt, như độ cứng thấp, ít năng lượng với độ bóng tốt [14]

Trong công nghệ sản xuất bánh kẹo, gellan sẽ góp phần tạo cấu trúc và kết cấu để giảm

sự đông cứng của bột theo thời gian Ngoài ra, gellan có thể ngăn ngừa sự chảy nước của đường, sự đóng băng [14]

Theo tác giả Iurciuc và cộng sự năm 2015, để cải thiện độ bền nhiệt và nâng cao nhiệt độ đông kết mà không cần làm lạnh của các món tráng miệng bằng cách thêm một lượng nhỏ gellan Gellan được ứng dụng rộng trong quá trình sản xuất thạch như một tác nhân tạo đông So với các chất tạo đông khác như: alginate natri, thạch, gelatin và carrageen, agar được bổ sung gellan trong và giòn hơn Ngoài ra, gellan có thể được dùng trong các sản phẩm sữa để thay thế cho carrageen, gelatin, alginate natri, pectin và carboxymethyl cellulose (CMC)

Bảng 1.3 tóm tắt những đặc điểm và tính chất chức năng của gellan được sử dụng để định hướng cho các ứng dụng trong lĩnh vực bảo quản và chế biến thực phẩm

Bảng 1.3 Đặc điểm và hiệu quả gellan

[Haoting et al., frank@ahlandy.com& landy@ahlandy.com]

- Gellan ở dưới dạng bột khá ổn định và có thời

hạn sử dụng lâu dài, ngay cả dưới điều kiện axit

Bổ sung ion natri hoặc ion kali có thể

hình thành gel hồi nhiệt, trong khi ion

magie hay canxi có khả năng tạo gel

không hồi nhiệt

Có thể tạo thành gel hồi nhiệt và gel không

hồi nhiệt

Có khả năng giải phóng hương vị Nâng cao chất lượng sản phẩm

Có khả năng kết hợp với hydrocolloid

khác Điều chỉnh độ đàn hồi gel và độ cứng

Có khả năng tương thích với các thành

Chức năng chống lão hóa Ngăn ngừa lão hóa và nâng cao độ nhớt của

tinh bột

Không dễ bị phân hủy bởi enzyme

Cho phép sự linh hoạt trong quy trình sản

xuất, rất thích hợp làm môi trường nuôi cấy

vi sinh vật và nuôi cấy mô thực vật

Sở hữu các thuộc tính như khả năng ổn định ở nhiệt độ cao (≥ 90o

C), gel tạo ra giòn,

có độ trong suốt cao và bền trong khoảng pH rộng (từ 3 đến 10) nên chế phẩm gelan khử acyl tạo ra của luận án sẽ được sử dụng như một chất tạo đông trong nghiên cứu chế biến

thạch dứa, một sản phẩm có pH thấp (pH 4)

Gellan có nhiều tiềm năng trong dược phẩm, chúng có đặc tính kết dính nên được

sử dụng trong thành phần thuốc chữa lành vết thương và để gắn răng giả Bên cạnh đó gellan là một polysaccharit anion, nó có thể dùng để ngăn chặn sự bám dính tế bào Nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy, màng gellan có ảnh hưởng như rào cản, ức chế sự tăng trưởng của các nguyên bào sợi tại các vết thương [45, 47]

Gellan còn được sử dụng làm vỏ nang thuốc hoặc chất dẫn thuốc mà không làm thay đổi đặc tính của thuốc Hiện nay, gellan được sử dụng làm vỏ nang cho các loại thuốc tân dược và đặc biệt là các vitamin C, E, D Vỏ nang từ gellan có ưu điểm hơn so với loại

truyền thống như tăng cường tính năng chống ẩm, hoà tan dễ dàng, gia tăng độ ổn định chất lượng trong thời gian lưu hành Thuốc tân dược truyền thống thường được đóng trong viên nang gelatin có nguồn gốc động vật, có thể gây khó khăn tiêu hoá đối với một số người ăn kiêng Do vậy, gellan là sự lựa chọn thích hợp cho các nhà sản xuất vỏ nang dược phẩm [63]

Gellan ở trạng thái khử acyl bằng kiềm sẽ hình thành một dạng gel cứng như agar

và có thể được sử dụng thay thế agar trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Loại gellan thô được sử dụng như là chất thay thế cho agar trong việc làm môi trường rắn để nuôi cấy vi sinh vật Môi trường này có thể chịu được nhiều chu trình tiệt trùng và nó có cấu trúc

giống với cấu trúc của agar Trong môi trường, lượng gellan sử dụng chỉ là 6g/l so với agar là 15g/l Nhiều tác giả cũng đã chứng minh gellan là môi trường lý tưởng để nuôi cấy

mô thực vật [14, 53, 70] Ngoài ra gellan còn được sử dụng bổ sung vào dầu gội đầu để giữ

trạng thái đặc trưng cho sản phẩm

Gellan được sử dụng trong cố định tế bào, theo Camelin và cộng sự, gel của gellan cung cấp một giá thể bền cơ học trong việc cố định tế bào Bifidobacterium longum (gel ổn

định trong hơn 150 giờ lên men trong môi trường whey) Sử dụng thay thế agarose tinh chế

để làm giá thể rắn trong quá trình điện di tách ADN [14, 15]

Tóm l ại, sở hữu đặc tính lưu biến tuyệt vời và cấu trúc độc đáo, gellan có phổ ứng

d ụng rộng trong thực phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác với các chức năng như chất ổn định, tác nhân làm đặc, tác nhân tạo cấu trúc, tạo nhũ tương, khả năng tương thích cao, gi ải phóng mùi vị, chất kết dính, màng bao, chất bôi trơn, chất tạo độ dày và huy ền phù, tác nhân tạo gel linh hoạt và có thể tạo kết cấu gel mong muốn trong các dạng

s ản phẩm thực phẩm khác nhau từ cứng, giòn hay lỏng Việc nghiên cứu khai thác và mở rộng các khả năng ứng dụng trên của gellan vào các lĩnh vực của đời sống sản xuất nói chung và trong chế biến, bảo quản thực phẩm nói riêng đang giành được rất nhiều sự quan tâm c ủa các nhà khoa học, nhằm nâng cao giá trị sử dụng cho dòng sản phẩm này

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU TRONG NƯỚC VÀ VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN

C ỨU CỦA LUẬN ÁN

Hiện tại Việt Nam chưa sản xuất được gellan, chỉ có một số chế phẩm gellan nhập ngoại đã được đưa vào sử dụng như các tác nhân ổn định trong chế biến một số thực phẩm

Nhờ có các tính chất đặc biệt, phổ ứng dụng rộng nên nhu cầu dòng sản phẩm này ngày càng tăng Do đó, năm 2013, Bộ Công Thương đã cấp kinh phí cho nhóm nghiên cứu của chúng tôi thuộc Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch để thực hiện đề tài

“Nghiên c ứu công nghệ sản xuất gellan từ vi sinh vật ứng dụng trong chế biến và bảo quản