(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị

(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella Multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị

LƯƠNG NGỌC MINH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA

HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI BA

HUYỆN THUỘC TỈNH QUẢNG NINH

VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Thái Nguyên - 2020

LƯƠNG NGỌC MINH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA

HỌC CỦA VI KHUẨN PASTEURELLA MULTOCIDA

GÂY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI BA

HUYỆN THUỘC TỈNH QUẢNG NINH

VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

Ngành: THÚ Y

Mã số ngành: 8.64.01.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: TS ĐỖ QUỐC TUẤN

Thái Nguyên - 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng:

- Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi trực tiếp nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của TS Đỗ Quốc Tuấn, sự giúp đỡ của cán bộ Trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật - Cơ quan Thú y vùng II và Chi cục Thú y tỉnh Quảng Ninh

- Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, khách quan, được rút ra từ tình hình thực tế của tỉnh Quảng Ninh trong những năm qua và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

- Mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu và viết luận văn

đã được cảm ơn Tất cả các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2020

TÁC GIẢ

Lương Ngọc Minh

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực tập và thực hiện Luận văn này, tôi đã nhận được

sự quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và sự động viên khích lệ của gia đình Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Thầy giáo TS Đỗ Quốc Tuấn đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết

sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn

Trân trọng cảm ơn Chi cục Chăn nuôi - Thú y và Cục thống kê tỉnh Quảng Ninh đã cung cấp số liệu giúp tôi hoàn thành luận văn này Xin trân trọng cảm ơn các hộ gia đình nuôi trâu, bò, lợn nái tại Quảng Ninh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình điều tra và thu thập mẫu

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2020

TÁC GIẢ

Lương Ngọc Minh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

BHI:

BL: Cs:

DNA:

FAO:

HSND:

MR:

OIE:

PCR: PRRSV:

PƯ: QY:

THT:

TSI:

TT:

TW:

VK:

VP:

YPC:

Brain Heart Infusion Bình Liêu

Cộng sự Deoxyribonucleic Acid Food and Agriculture Oganization

Hệ số năm dịch Methylen Red Office International Epizooties Tổ chức dịch tễ thế giới Polymerase Chain Reaction

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Phản ứng

Quảng Yên

Tụ huyết trùng Triple sugar iron agar

Thể trọng

Trung ương

Vi khuẩn Voges Proskauer Yeast extract Pepton-L-Cystin

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng giai đoạn 2016 -

2019 tại Quảng Ninh 33

Hình 3.1 Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do bệnh tụ huyết trùng

tại Quảng Ninh qua các năm 2016 - 2019 34

Bảng 3.2 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh

theo mùa vụ 35 Bảng 3.3 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh

theo tuổi 38 Bảng 3.4 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh

theo loài 40 Bảng 3.5 Triệu chứng lầm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 43 Bảng 3.6 Các bệnh tích đại thể ở trâu, bò chết do tụ huyết trùng 44

Bảng 3.7 Kết quả phân lập vi khuẩn P multocida từ dịch ngoáy mũi của

trâu, bò khoẻ 46

Bảng 3.8 Phân lập vi khuẩn P multocida từ mẫu bệnh phẩm trâu, bò nghi

mắc bệnh tụ huyết trùng 49 Bảng 3.9 Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi

khuẩn P mutocida phân lập được 50 Bảng 3.10 Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng vi khuẩn P

multocida phân lập được 52

Bảng 3.11 Kết quả xác định serotype kháng nguyên của các chủng P

multocida phân lập được 53

Bảng 3.12 Xác định độc lực của các chủng P multocida 55phân lập được 55 Bảng 3.13 Kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P

multocida phân lập được 57

Bảng 3.14 Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng

trâu, bò 59 Bảng 3.15 Kết quả tiêm phòng vaccine tụ huyết trùng cho trâu, bò của tỉnh

Quảng Ninh trong các năm 2018 - 2019 61

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Pasteurella multocida 30

Hình 3.1 Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do bệnh tụ huyết trùng

tại Quảng Ninh qua các năm 2016 - 2019 34

Hình 3.2 Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng theo mùa vụ 36 Hình 3.3 Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò chết do tụ huyết trùngtại Quảng Ninh theo

mùa vụ trong năm 38 Hình 3.4 Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại Quảng Ninh

theo loài 41 Hình 3.5 Biểu đồ về tỷ lệ trâu, bò chết do bệnh tụ huyết trùng 42 Hình 3.6 Biểu đồ về tỷ lệ mẫu dịch ngoáy mũi của trâu, bò khoẻ dương tính

với vi khuẩn P multocida 47

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

1.1 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida 4

1.1.2 Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P multocida gây ra 10

1.2 TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 18

1.3 TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Đối tượng 24

2.1.2 Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu 24

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Thời gian nghiên cứu 25

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 25

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh từ năm 2016 - 2019 25

2.3.2 Triệu chứng, bệnh tích điển hình ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 25

2.3.3 Phân lập và xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn P multocida 25

2.3.4 Thử nghiệm phác đồ điều trị và đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại tỉnh Quảng Ninh 26

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò 26

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu 26

2.4.3 Phương pháp xác định triệu chứng, bệnh tích ở trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng 26

2.4.4 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P multocida 27

2.4.5 Kiểm tra độc lực của vi khuẩn P multocida phân lập được 29

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn P multocida 30

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÂU, BÒ TẠI TỈNH QUẢNG NINH 33

3.1.1 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng giai đoạn 2016 - 2019 tại Quảng Ninh 33

3.1.2 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh và chết do tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo mùa vụ 35

3.1.3 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại Quảng Ninh theo tuổi 38

3.1.4 Tỷ lệ trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Quảng Ninh theo loài 40

3.2 TRIỆU CHỨNG, BỆNH TÍCH ĐIỂN HÌNH Ở TRÂU, BÒ MẮC BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG 42

3.2.1 Triệu chứng lâm sàng ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 42

3.2.2 Bệnh tích đại thể ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 44

3.3 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT, HÓA HỌC CỦA VI KHUẨN P MULTOCIDA 45

3.3.1 Phân lập vi khuẩn P multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khỏe mạnh tại các địa điểm nghiên cứu 45

3.3.2 Phân lập vi khuẩn P multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng tại các địa phương nghiên cứu 48

3.3.3 Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P mutocida phân lập được 50

3.3.4 Xác định serotype kháng nguyên của các chủng vi khuẩn P multocida phân lập được 53

3.3.5 Xác định độc lực của các chủng P multocida phân lập được 54

3.3.6 Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn P multocida phân lập

được với một số loại kháng sinh và hóa dược 57

3.4 THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ ĐIỀU TRỊ VÀ ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG CHO TRÂU, BÒ TẠI QUẢNG NINH 58

3.4.1 Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò 58

3.4.2 Đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại Quảng Ninh 60

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64

1 KẾT LUẬN 64

2 ĐỀ NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chăn nuôi trâu, bò đang phát triển mạnh trên cả nước và là một ngành quan trọng trong nền nông nghiệp Việt Nam Chăn nuôi trâu, bò không chỉ cung cấp sức kéo mà còn cung cấp lượng phân bón lớn cho ngành trồng trọt, cung cấp rất lớn nguồn thực phẩm như: thịt, sữa có chất lượng và giá trị dinh dưỡng cao cho nhu cầu

sử dụng của con người

Chăn nuôi trâu, bò muốn phát triển tốt và cho hiệu quả kinh tế, ngoài công tác giống, thức ăn, quản lý chăm sóc thì công tác phòng chống dịch bệnh là rất quan trọng Trong thực tế những năm qua, ngành thú y cả nước hoạt động rất mạnh

mẽ đã hạn chế nhiều bệnh truyền nhiễm và các bệnh khác Nhưng do đặc điểm của từng vùng, từng khu vực và từng địa phương, do nhiều yếu tố và nguyên nhân khác nhau nên vẫn còn một số bệnh truyền nhiễm xảy ra

Quảng Ninh là tỉnh nằm ở phía Đông Bắc Việt Nam, địa bàn kinh tế động lực trong vùng trọng điểm kinh tế Bắc Bộ Dân số 1,415 triệu người (Chi cục Thống

kê tỉnh Quảng Ninh, 2020) sinh sống tại 186 xã, phường, thị trấn thuộc 14 huyện, thị xã, thành phố Đây cũng là tỉnh duy nhất của cả nước có 4 thành phố (Uông Bí,

Hạ Long, Cẩm Phả, Móng Cái) và 2 thị xã (Đông Triều, Quảng Yên) Cùng với sự phát triển kinh tế, xã hội của tỉnh thì nhu cầu về thực phẩm sạch và an toàn tại Quảng Ninh là rất lớn Hằng năm, chăn nuôi trong tỉnh mới đáp ứng khoảng 60% nhu cầu tiêu dùng của người dân và khách du lịch, phần thiếu hụt phải nhập từ nơi khác về Đây là điều kiện cho dịch bệnh trên gia súc, gia cầm xâm nhập, phát sinh

và lây lan Một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm mà ngành chăn nuôi tỉnh Quảng Ninh thường gặp phải đó là bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

Bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thể bại huyết (Hemorrhagic Septicemia) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở hầu hết các lứa tuổi trâu, bò Hằng năm, trên địa bàn các tỉnh miền núi phía Bắc nước ta, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò gây ra những thiệt hại kinh tế to lớn cho ngành chăn nuôi

Do đặc điểm, vị trí địa lý, khí hậu, thời tiết, đất đai và điều kiện kinh tế xã hội, phong tục tập quán và trình độ tiếp thu khoa học kỹ thuật vào sản xuất và chăn nuôi của người dân ở tỉnh Quảng Ninh, tình hình chăn nuôi trâu, bò đang rất phát triển Tuy nhiên, hằng năm bệnh tụ huyết trùng vẫn xảy ra khá phổ biến, gây ốm, chết số lượng đáng kể trâu, bò của địa phương và đã trở thành vấn đề bức xúc, cần được nghiên cứu Vì vậy, ngoài việc áp dụng các biện pháp chăn nuôi an toàn sinh học thì việc nghiên cứu sự lưu hành của vi khuẩn gây bệnh, chọn vaccine tiêm phòng và thuốc điều trị có hiệu quả là vấn đề cấp thiết để hạn chế thiệt hại do dịch bệnh gây ra

Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất chăn nuôi, trên cơ sở kế thừa kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước, căn cứ vào cơ sở vật chất, trang

thiết bị tại đơn vị thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Pasteurella multocida gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại ba huyện thuộc tỉnh Quảng Ninh và biện pháp phòng trị”

- Giám định đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố gây bệnh và serotype kháng

nguyên của vi khuẩn P multocida phân lập được

- Đề xuất các biện pháp phòng và trị bệnh hiệu quả

3 Ý nghĩa của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ, sự lưu hành của vi khuẩn P

multocida gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò tại tỉnh Quảng Ninh

Bổ sung thêm tư liệu về đặc tính sinh vật, hóa học, yếu tố gây bệnh và

serotype kháng nguyên của vi khuẩn P multocida phân lập được

Đề xuất biện pháp phòng chống và điều trị bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò

có hiệu quả cao

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Việc đánh giá tình trạng mang khuẩn P multocida ở trâu, bò khỏe là cơ sở

cho việc điều chỉnh chiến lược phòng bệnh tụ huyết trùng tại tỉnh Quảng Ninh

Đề xuất biện pháp phòng chống và điều trị bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò

có hiệu quả cao

Chương 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1.1 Vi khuẩn Pasteurella multocida

1.1.1.1 Phân loại vi khuẩn

Theo phân loại của Bergey’s (1994), vi khuẩn P multocida thuộc bộ (order)

Eubacteriales, họ (family) Parvobacteriaceae, tộc (tribe) Pasteurelliae, giống

(genus) Pasteurella, loài (species) P multocida

1.1.1.2 Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn Pasteurella multocida (P multocida) là vi khuẩn có dạng cầu trực

khuẩn nhỏ, gram âm, kích thước khoảng 0,25 - 0,4 × 0,4 - 1,5 µm, vi khuẩn có thể đứng riêng lẻ, thành đôi hoặc thành chuỗi, có giáp mô, không sinh nha bào, không

có lông, không di động, bắt màu lưỡng cực Khi nuôi cấy nhiều lần trong phòng thí nghiệm hoặc trên các môi trường nuôi cấy lâu ngày, với các điều kiện không thuận lợi vi khuẩn có khuynh hướng biến dạng, thay đổi hình thái từ trực khuẩn dài hơn cho tới dạng sợi mảnh De Alwis (1999)

P multocida dễ dàng bắt màu với thuốc nhuộm fucxin hoặc xanh methylen

Tính chất bắt màu lưỡng cực của vi khuẩn P multocida có thể thấy khi nhuộm bằng

xanh methylen và chỉ thấy ở những tiêu bản làm từ máu động vật hay vi khuẩn phân lập từ con vật mới chết Vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường nhân tạo ít thấy tính chất này (Nguyễn Như Thanh, 2001) Theo OIE (2012) sử dụng kỹ thuật nhuộm Leishman, nhuộm xanh metylen, hoặc kỹ thuật nhuộm Giemsa cho thấy vi khuẩn được nhuộm bắt màu lưỡng cực

Vi khuẩn P multocida có thể nuôi cấy ở nhiều loại môi trường, môi trường

nuôi cấy lỏng, đặc hoặc bán cố thể Tùy vào mục đích nghiên cứu, người ta cho thêm vào môi trường các loại đường, axit amin và hóa chất khác nhau Peter và cs (1996) sử dụng môi trường dinh dưỡng tối thiểu để nuôi cấy chủng sinh độc tố và

không sinh độc tố của P multocida Môi trường này gồm có 17 thành phần, trong

đó có cystein, glutamic axit, leucine, methionine, muối vô cơ, nicotinamide, pantothenate, thiamine Kết quả 40/46 chủng đem thử (87%) mọc tốt trên môi trường này, sau 10 lần cấy chuyển vẫn giữ nguyên khả năng sinh độc tố hoặc không sinh độc tố như lúc đầu

Môi trường BHI và môi trường Hottinger cải tiến là những môi trường thích hợp để sản xuất kháng nguyên tụ huyết trùng theo phương pháp lên men (Đào Trọng Đạt, 1994)

P multocida có nhiều loại hình dạng khuẩn lạc, trên môi trường thạch huyết

thanh P multocida có thể tạo thành 3 dạng khuẩn lạc:

+ Khuẩn lạc dạng S (Smooth): có rìa gọn, bóng láng, có dung quang mạnh và

Trên môi trường thạch máu hay BHI có bổ sung máu: vi khuẩn phát triển mạnh, không gây dung huyết, kích thước khuẩn lạc lớn hơn trên môi trường thạch thường, có màu tro xám, hình giọt sương và có mùi tanh nước dãi khô rất đặc trưng Đặc điểm này rất dễ nhận ra và được nhiều tác giả công nhận như một đặc điểm để chẩn đoán

Trên môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố: khuẩn lạc nhỏ, rìa gọn, có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có hai thị kính với độ phóng đại thấp và góc phản quang của ánh sáng đèn điện là 45o, thấy xung quanh mép khuẩn lạc có hiện tượng phát sắc cầu vồng Khuẩn lạc dạng S có dung quang màu xanh lơ, khuẩn lạc dang R có dung quang vàng, khuẩn lạc dạng M

không có đặc điểm nói trên Hiện tượng phát quang của khuẩn lạc P multocida có

liên quan đến tính chất của một số hợp chất có khả năng hấp thụ những tia sáng nhất định có trong vi khuẩn (Heddleston, 1966)

Theo De Alwis (1999), tuỳ theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau:

+ Nếu vi khuẩn có độc lực cao: khuẩn lạc có màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 diện tích khuẩn lạc là màu vàng kim loại, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent)

+ Nếu vi khuẩn có độc lực vừa: khuẩn lạc màu xanh lơ ít hơn diện tích màu vàng da cam, khuẩn lạc loại này là Fo (Orange Fluorescent)

+ Nếu vi khuẩn có độc lực yếu: khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát quang, khuẩn lạc loại này là Nt (Not Fluorescent) Khuẩn lạc nhỏ tròn trong Theo đặc tính dung quang này còn có quan hệ chặt chẽ với sự tạo giáp mô của vi

khuẩn P mutocida Dựa vào tính chất này, có thể chọn những chủng P multocida

có tính kháng nguyên và miễn dịch cao (Smith, 1990)

1.1.1.3 Đặc tính sinh hóa

P multocida lên men các đường glucose, mannitol, saccarose, fructose,

galactose, không lên men các loại đường lactose, mantose, arabinose Dương tính với phản ứng sinh Indol, oxidase, catalase Phản ứng urease âm tính, không mọc trên môi trường MacConkey (Đặng Xuân Bình, 2010; Lê Văn Dương, 2013)

1.1.1.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn P multocida

* Kháng nguyên

Kháng nguyên P multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên

cũng luôn thay đổi Những nghiên cứu về cấu trúc, số lượng và sự phân bố kháng

nguyên P multocida rất quan trọng trong việc chế tạo vaccine Cho đến nay, người ta

đã xác định được kháng nguyên của P multocida có 3 loại là: Kháng nguyên vỏ K,

kháng nguyên thân O, kháng nguyên màng ngoài OMP (outer membrane protein)

- Kháng nguyên vỏ (K): chỉ có ở P multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không

gặp ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng M và R Kháng nguyên K bao bọc xung quanh thân vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào và ngăn cản sự tiếp

xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O Thành phần và cấu trúc kháng nguyên K khá phức tạp, theo Price và Smith (1966) chúng gồm có 3 loại là α, β, γ Kháng nguyên có cấu tạo dạng phức giữa protein và polysaccharide Kháng nguyên protein của vỏ (giáp mô) có khả năng gây miễn dịch mạnh Kháng nguyên protein đã được nhiều tác giả nghiên cứu và cho rằng nó rất thông dụng, được coi là yếu tố miễn dịch quan trọng

- Kháng nguyên thân (O): vi khuẩn P multocida có kháng nguyên thân là

phức hợp protein - lipid - polysaccharide chiết xuất được nhờ acid trichoaxetic, dung dịch phenol và siêu âm Phát hiện được bằng phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch Các chủng vi khuẩn tụ huyết trùng có serotype khác nhau theo kháng nguyên O, chỉ có serotype B hầu như chỉ thuộc một nhóm kháng nguyên O Những chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S chuyển sang dạng R vẫn giữ được kháng nguyên O Hiện nay, nhiều thực nghiệm xác nhận rằng, kháng nguyên O đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh (Phan Thanh Phượng, 1994)

- Protein màng ngoài (Outer membrane proteins - OPM): kháng nguyên

màng ngoài gồm 3 protein chính là 27kDa, 34kDa và 36kDa được tìm thấy ở hầu hết các chủng (không phụ thuộc vào type của chủng đó) Một trong những protein độc tính quan trọng của protein màng ngoài này là protein gắn huyết cầu tố (hemoglobin-binding protein), protein này có một receptor đặc hiệu trên màng hemoglobin Đoạn gen mã hóa hemoglobin binding protein (hgbA) đã được giải trình tự (Seleim, 2005)

Ba loại protein màng ngoài đã được phát hiện ở các chủng gây viêm teo mũi được đặt tên là là OMP type I, OMP type II, và OMP type III

Kháng nguyên của P multocida rất phức tạp, xét về quan hệ hoá học, các kháng nguyên protein và lipopolysaccharid của P multocida có vai trò chính trong

quá trình hình thành miễn dịch bảo hộ gia súc chống bệnh và kháng nguyên là polysaccharid đóng vai trò hỗ trợ

* Giáp mô của vi khuẩn P multocida

Giáp mô là lớp vỏ nhày bao bọc ngoài tế bào, được sinh ra ở điều kiện nhất định trong quá trình sinh trưởng Giáp mô có tác dụng bảo vệ vi khuẩn chống lại sự thực bào và các tác động có hại của môi trường Giáp mô cũng là nơi dự trữ chất dinh dưỡng cho vi khuẩn, đồng thời là yếu tố độc lực của vi khuẩn, vi khuẩn có giáp

mô thường có độc lực cao Carter (1955) cho biết, khi nuôi cấy vi khuẩn ở 370C trong môi trường nhân tạo qua một đêm thấy vi khuẩn phát triển giáp mô đầy đủ, sau đó mất dần đi Điều này chứng tỏ giáp mô chỉ tồn tại ở những vi khuẩn mới phân lập từ gia súc mắc bệnh hoặc nuôi cấy trong thời gian ngắn Vi khuẩn phân lập được từ động vật mắc bệnh cấp tính đa số đều thấy có giáp mô và có độc lực, khi nuôi cấy những vi khuẩn này lâu trong môi trường nhân tạo, giáp mô của vi khuẩn

sẽ mất và vi khuẩn không còn độc lực Nhưng nếu cấy những vi khuẩn đã mất giáp

mô trên môi trường có thêm máu hoặc tiêm truyền qua động vật thì vi khuẩn có thể tái tạo lại giáp mô và thể hiện độc lực

Đặc tính kháng nguyên giáp mô của P multocida xác định theo type huyết

thanh A, B, D, E và F (Wilson và cs, 1992) Giáp mô của chủng type A được cấu tạo bởi axit hyaluronic và polysaccharide Axit hyaluronic không bị thực bào phát

hiện do nó không cótính miễn dịch, nhưng khi tinh chế kháng nguyên K của P

multocida serotype A có một protein (300kDa) có thể ức chế đại thực bào của bò

(Seleim, 1993)

* Độc lực của vi khuẩn

Độc lực của P multocida được biết từ thời Pasteur, đầu thế kỷ 20, Baldrey đã

nhắc đến ảnh hưởng của chất lọc canh trùng già trên thỏ và cho rằng vi khuẩn có

độc tính của lipopolysaccharide Các nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P

multocida trên thế giới cho thấy độc lực của vi khuẩn này không ổn định, nó thay

đổi tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, loài vật mà nó ký sinh, cấy chuyển nhiều lầntrong môi trường nhân tạo độc lực của nó cũng yếu đi

Khả năng xâm nhập và nhân lên trong cơ thể vật chủ được tăng cường bởi sự hiện diện của kháng nguyên và polysaccharide đó là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất đối với loài này (Wilkie và cs, 2012)

Độc lực của P multocida rất phức tạp và không ổn định, tuỳ thuộc vào chủng

vi khuẩn và loài vật kí sinh Nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn P multocida các tác giả cho thấy ở những gia súc, gia cầm chết do P multocida gây ra người ta tìm

thấy dấu hiệu tác động của độc tố

* Độc tố của vi khuẩn P multocida

Độc tố của P multocida là chất phân bào mạnh, có khả năng hoạt hóa men

phospholipase C beta Độc tố này cũng thúc đẩy hoạt động của RhoA và tác động tới các protein nhóm G như: G alpha (q), G alpha (12/13) (Orth và cs, 2005)

Những độc tố có bản chất từ protein không chịu nhiệt đã được tìm thấy ở một

số chủng P multocida thuộc type huyết thanh A và D, đặc tính kháng nguyên của

những độc tố này tương đối giống nhau Các vi khuẩn thuộc serotype B hiếm khi có độc tố bản chất là protein, chưa có thí nghiệm nào chứng minh độc tố có bản chất protein của serotype E

- Nội độc tố (Lipopolysaccharide): Lipopolysaccharide là yếu tố độc lực chính

và đóng một vai trò chủ yếu trong việc gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò Các chủng

P multocida thuộc type D gây viêm teo mũi sau khi tiến hành điện di phát hiện thấy

có ít nhất 6 loại lipopolysaccharide đồng nhất với protein màng ngoài

- Ngoại độc tố (Exotoxin): Ngoại độc tố là sản phẩm của giáp mô P

multocida, đặc biệt là của các chủng thuộc type D Yếu tố này là nhân tố gây hoại tử

niêm mạc (dermonecrotic toxin - DNT)

* Serotype của vi khuẩn P multocida

Năm 1943 Little và Lyon đã tìm cách phân loại serotype vi khuẩn P

multocida nhưng không thành công Roberts (1947) đã dựa trên phản ứng chéo bảo

hộ trên chuột để phân loại Tác giả dùng kháng huyết thanh chuẩn bị trên thỏ để bảo

vệ chuột khi công cường độc bằng các chủng P multocida khác nhau, trên cơ sở

chuột được bảo hộ, chia vi khuẩn này thành 4 type là I, II, III và IV, đây là hệ thống phân loại đầu tiên được công nhận Kể từ đó tất cả các chủng gây bại huyết, xuất huyết độc lực cao được xếp vào Roberts type I, các chủng phân lập được từ trâu, bò thuộc type I Điều này giúp ích khá nhiều cho việc phát hiện các chủng độc lực cao

Tiếp đó, Carter sử dụng phản ứng kết tủa và phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp, xác định được 4 serotype (được ký hiệu là A, B, C, D) Phản ứng ngưng kết hồng cầu này được thực hiện trên tế bào hồng cầu người nhóm O, thành phần

tách từ màng tế bào này được chuẩn bị bằng cách đun tế bào sống P multocida ở 56

°C/30 phút, loại bỏ tế bào bằng ly tâm sau đó thu lấy dịch nổi phía trên Dựa trên

phản ứng này, tác giả đã phân loại P multocida thành 4 loại kháng nguyên vỏ là A,

B, C và D Các chủng gây bại huyết, xuất huyết theo cách phân loại của Carter chủ yếu thuộc type B

* Sức đề kháng của vi khuẩn P multocida

Theo Nguyễn Bá Hiên và cs (2009), vi khuẩn tụ huyết trùng dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ, ánh sáng mặt trời và các chất sát trùng thông thường Vi khuẩn bị diệt khi đun ở 580C trong 20 phút, 800C trong 10 phút, 1000C chết ngay Ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp, diệt vi khuẩn trong canh trùng sau 1 ngày Trong tổ chức của động vật bệnh bị thối nát, vi khuẩn sống được 1 - 3 tháng

Trong máu, mô bào, nước tiểu của súc vật chết, vi khuẩn giữ được độc lực trong vòng 5 - 9 ngày Trong tuỷ xương vi khuẩn giữ được độc lực ít nhất 8 ngày sau khi con vật chết Vì vậy, bệnh phẩm được gửi đi chẩn đoán tốt nhất là tuỷ xương

Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn nhanh chóng như axit phenic 5% trong 1 phút, creolin 3%, crezyl 3%, nước vôi 1% trong 3-5 phút Vi khuẩn sống khá lâu và sinh sản trong đất ẩm, thiếu ánh sáng có nhiều muối nitrat và chất hữu

cơ Trong chuồng, trên đồng cỏ, trong đất, vi khuẩn có thể sống hàng tháng có khi hàng năm

1.1.2 Bệnh tụ huyết trùng do vi khuẩn P multocida gây ra

1.1.2.1 Đặc điểm bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

Bệnh do vi khuẩn P multocida gây ra thường ở 2 thể chủ yếu là nhiễm trùng

huyết, xuất huyết (Haemorrhagic septicaemia - HS) và viêm phổi ở bò (Bovine Pneumonia) Thể viêm phổi ở bò thường gặp tại các nước châu Âu và khu vực Bắc

Mỹ do vi khuẩn P multocida type A gây ra (Frank, 1989) Ở một số nước châu Á

như Malaysia, Ấn Độ, Sri Lanka bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết ở lợn quan hệ với serotype B:2 (Gamage và cs, 1995) Chính từ nghiên cứu này, các tác giả cho

rằng, vi khuẩn P multocida serotype B:2 không chỉ gây bệnh tụ huyết trùng thể bại

huyết ở trâu, bò mà còn là tác nhân gây bệnh cho lợn, bệnh có thể lây truyền từ trâu,

bò sang lợn mẫn cảm và ngược lại Benkirane và De Alwis (1999) cho biết chủng

B:2 và E:2 là 2 chủng phổ biến nhất của vi khuẩn P multocida và có liên quan đến

bệnh ở trâu, bò tại nhiều nước châu Á và châu Phi

1.1.2.2 Cơ chế sinh bệnh

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2009), bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò phát triển như sau: Bệnh phát sinh ở các vùng nóng ẩm, vào mùa mưa, vi khuẩn có sẵn trong đất, được nước mưa đưa lên mặt đất, dính vào rơm, cỏ và trôi vào các hồ, ao, mương, máng Trâu, bò ăn phải rơm cỏ và uống nước có nhiễm khuẩn sẽ mắc bệnh

Sau khi vào đường tiêu hóa, vi khuẩn qua niêm mạc nhờ các vết xây xát nhỏ

do rơm cỏ, xâm nhập vào máu, tiến đến hệ thống lâm ba ruột và hạch sau hầu, thường hạch sau hầu sưng rất to Từ đó vi khuẩn đi vào hệ thống hạch lâm ba trước vai, trước đùi làm cho những hạch này sưng và thủy thũng Bởi vậy ta thường thấy trâu, bò bị bệnh tụ huyết trùng có biểu hiện đặc trưng: Sưng hầu mà nhân dân gọi là

“bệnh trâu hai lưỡi”

Bình thường một số trâu bò khỏe cũng mang vi khuẩn tụ huyết trùng trong hệ thống hô hấp và tiêu hóa Nhưng vi khuẩn không gây bệnh và gia súc có sức đề kháng cao, giữa vi khuẩn và gia súc có sự cân bằng sinh học Khi gặp các yếu tố ngoại cảnh bất lợi: Thiếu thức ăn, làm việc nặng, thời tiết thay đổi đột ngột, trâu, bò

bị giảm sức đề kháng, thế cân bằng sinh học bị phá vỡ và vi khuẩn trở nên cường độc, gây bệnh cho trâu, bò Một nghiên cứu ở Ấn Độ cho thấy trong điều kiện chăn nuôi kém phát triển, đàn trâu, bò được chăn thả tự do trên các đồng cỏ tự nhiên, tạo điều kiện thuận lợi cho dịch bệnh bùng phát (Gajendragad và cs, 2012)

1.1.2.3 Đặc điểm dịch tễ học

* Nguồn bệnh và phương thức lây lan

Nguồn lây bệnh tụ huyết trùng là trâu, bò, lợn, gia cầm bị bệnh và mang

trùng Trong cơ thể gia súc khỏe mạnh, ở điều kiện nhất định, vi khuẩn P multocida

thường tồn tại ở đường hô hấp trên của vật chủ Khi sức đề kháng của cơ thể giảm,

vi khuẩn gia tăng về số lượng và độc lực, từ đó tác động gây bệnh Tại các ổ dịch

cũ, phần lớn những gia súc sống sót sau dịch thường trở thành những con vật mang trùng và thường xuyên bài tiết mầm bệnh ra ngoài ngoại cảnh, những gia súc cảm thụ mới là những trâu, bò mới sinh sau vụ dịch hay gia súc mới nhập đàn chưa có miễn dịch (De Alwis, 1999)

Ở nước ta bệnh xuất hiện ở khắp nơi, có khi chỉ là những ổ dịch nhỏ, xảy ra

lẻ tẻ Nhưng bắt đầu vào mùa mưa, khí hậu nóng ẩm bệnh lây lan thành dịch, bởi nhiệt độ ẩm của mùa mưa tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của mầm bệnh Các tỉnh miền Tây Nam Bộ do khí hậu nóng ẩm và nhiều đồng lầy nên bệnh xảy ra quanh năm

* Loài vật và tuổi mắc bệnh

Trong tự nhiên hầu hết các loài gia súc, gia cầm, loài có vú hoang dại và chim đều mẫn cảm với bệnh Nhiều tác giả đã khẳng định, nơi nào có bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thì ở đó người ta cũng phát hiện bệnh này ở động vật hoang dã

Theo De Alwis (1984) loài vật cảm nhiễm mạnh nhất đối với bệnh tụ huyết trùng là trâu và bò trong đó trâu mẫn cảm hơn bò, từ kết quả nghiên cứu các ổ dịch

tụ huyết trùng trâu, bò ở Sri Lanka tác giả đã khẳng định điều đó Robertson (1999) cho biết, ở châu Á, bệnh xảy ra ở trâu mạnh hơn ở bò, tỷ lệ trâu mắc bệnh có thể gấp 3 lần bò

1.1.2.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

* Triệu chứng lâm sàng

Bệnh tụ huyết trùng trâu, bò thường xảy ra với các triệu chứng lâm sàng chủ yếu: sốt cao, bỏ ăn, chảy nước dãi, khó thở, thủy thũng vùng hầu, xuất huyết, tụ huyết niêm mạc mắt, mũi, sưng hạch, viêm phổi Bệnh kéo dài từ vài giờ đến vài ngày và động vật chết ở giai đoạn cuối do nhiễm trùng huyết Theo Lê Văn Năm và

cs (1999), thời kỳ ủ bệnh kéo dài 1 đến 14 ngày, bệnh thường ở hai dạng, nhiễm trùng huyết và bội nhiễm

Theo Trung tâm nghiên cứu UNESCO phổ biến kiến thức văn hóa giáo dục cộng đồng (2005), diễn biến bệnh 3 - 5 ngày, tỷ lệ chết 90 - 100% Bò bệnh bị nhiễm trùng máu chết rất nhanh trong 1 - 1,5 ngày, nếu bệnh ác tính bò sốt cao 41-

420C, hung dữ điên cuồng, đập đầu vào tường, chết nhanh trong vòng 24 giờ Tất cả trâu, bò bị bệnh đều thấy có có các dấu hiệu lâm sàng như: bỏ ăn, mệt mỏi và bồn chồn, 90,74% đàn trâu, bò thở nghe có âm ran Các dấu hiệu lâm sàng khác bao gồm tiết nhiều nước bọt, khó thở, tiết nước mũi nhầy 100% những cá thể đã chết vì nhiễm tụ huyết trùng đều khó thở, tiết nước mũi nhầy, chán ăn, bồn chồn, tiết nhiều nước bọt (Ahrar và cs, 2011)

* Bệnh tích

Phần đầu, cổ và vùng hàm dưới của con vật sung huyết và bị phù nề Các đốm xuất huyết hình thành khắp cơ thể và có thể nhìn thấy máu chảy ra từ khoang ngực và bụng, thận bị sưng lên và sung huyết Có các đốm xuất huyết ở màng ngoài tim Phổi cũng có sự biến đổi, phổi bị phù nề nặng, khí phế thũng vách phổi (Ahrar

dấu hiệu thần kinh, tụ huyết và xuất huyết nặng hầu như ở tất cả các tổ chức Hạch lympho vùng hầu, trước vai và trước đùi sưng to thủy thũng Triệu chứng hô hấp rõ

* Chẩn đoán phân biệt

+ Bệnh tụ huyết trùng: dựa vào các triệu chứng điển hình của bệnh như hạch hầu sưng to, có biểu hiện triệu chứng thần kinh, thè lưỡi, mắt đỏ

+ Bệnh nhiệt thán: dễ nhầm với bệnh tụ huyết trùng do con vật chết đột ngột với triệu chứng phù thũng Bệnh tụ huyết trùng phù thũng nặng hơn và có triệu chứng tụ huyết, xuất huyết, thịt màu hồng tím Còn bệnh nhiệt thán thấy thịt đen, máu đen đặc khó đông, xuất huyết ở các lỗ tự nhiên

+ Bệnh tiêm mao trùng: cũng gây chết đột ngột và phù thũng nhưng thủy thũng có màu hồng, ở bệnh tụ huyết trùng tích nước màu vàng

* Chẩn đoán vi khuẩn học

De Alwis (1999) đã đưa ra phương pháp tốt nhất để phân lập vi khuẩn là tiêm truyền dưới da cho chuột với lượng từ 0,1 - 0,2 ml máu hoặc tủy xương đã được

chuẩn bị nuôi cấy Nếu đúng là P multocida gây bệnh tụ huyết trùng, chuột sẽ chết

trong vòng 24 giờ, lấy máu chuột nuôi cấy sẽ cho kết quả thuần khiết

* Chẩn đoán huyết thanh học

Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học để xác định serotype của P

multocida, dựa vào việc xác định kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân của vi

khuẩn Theo Nguyễn Như Thanh (2001), để khảng định chắc chắn vi khuẩn P

multocida cần xác định serotype phân lập được bằng phản ứng ngưng kết nhanh

trên phiến kính, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu cừu để xác định type kháng nguyên giáp mô và phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch để xác định kháng nguyên thân

+ Phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính: Đây là phương pháp chẩn đoán thường quy phòng thí nghiệm, dựa vào kỹ thuật của Namioka và Murata (1961) để định type kháng nguyên vỏ

+ Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp IHA: Đây là phương pháp được dùng phổ biến trong chẩn đoán để định type kháng nguyên vỏ

+ Phản ứng kết tủa khuếch tán trên thạch AGPT: Theo phương pháp của Heddleston và cs (1972) để định type kháng nguyên thân

+ Các phương pháp định type huyết thanh khác:

Phương pháp điện di miễn dịch đối kháng (Counter - Immmuoelectrophoresis):

Phản ứng đồng ngưng kết (Coaglutination test): Để phân biệt giữa type B và Type E gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò (Rimler, 1992)

+ Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): Phương pháp ELISA đang được các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng để chẩn đoán bệnh

tụ huyết trùng vì hiệu quả của phản ứng này Dawkins và cs (1990) khẳng định, phản ứng ELISA đối với bệnh tụ huyết trùng cho kết quả nhanh, chính xác và là phản ứng chẩn đoán để xác định vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng, nhưng không thể định type

cho P multocida Kỹ thuật ELISA đã áp dụng thành công để kiểm tra miễn dịch và giám định kháng nguyên của vi khuẩn P multocida serotype B:2 (Natalia và cs,

1993, Chandrasekaran và cs, 1994) ELISA cũng được báo cáo là có độ nhậy gấp 3 đến 5 lần so với phương pháp ngưng kết gián tiếp hồng cầu (Pati và cs, 1996, Verma and Jaiswal, 1997) Theo Trần Xuân Hạnh và cs (2007), kỹ thuật ELISE với kháng

nguyên P multocida serotype B:2 có thể dùng để phát hiện hoặc đo sự hiện diện của

kháng thể thu được tự nhiên, kỹ thuật có độ nhạy cao, kinh tế và tiện lợi cho việc kiểm tra với số lượng lớn mẫu huyết thanh Qureshi và Saxena (2014) kiểm tra kháng thể của 100 cá thể bò sau tiêm vaccine tụ huyết trùng phèn kết tủa bằng phản ứng ngưng kết microtiter (MAT), Phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp (IHA) và phương pháp (ELISA) Kết quả cho thấy hiệu giá đo bằng phương pháp ELISA luôn cao hơn so với MAT và IHA trong suốt quá trình thí nghiệm

* Chẩn đoán phi huyết thanh học (Nonserological test)

Một vài kỹ thuật chẩn đoán phi huyết thanh học đã được phát triển để nhận biết nhanh các chủng Những kỹ thuật này bao gồm Acriflavine Flocculation test được miêu tả bởi Carter và Subronto (1973) để nhận biết các chủng type D, kỹ thuật Hyaluronidase decapsulation test để nhận biết các chủng type A, kỹ thuật tạo men Hyaluronidase để nhận biết nhanh các chủng thuộc type B

* Kỹ thuật sinh học phân tử (Molecular Byology techniques)

Trong những năm gần đây, kỹ thuật PCR đã trở nên phổ biến trong việc phát hiện và định type vi khuẩn Trong chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu, bò, phương pháp PCR đã được nhiều nhà nghiên cứu ứng dụng (De Alwis, 1999)

Lê văn Dương (2013) xác định serotype của 42 chủng vi khuẩn P multocida

phân lập được từ lợn mắc bệnh viêm phổi ở Bắc Giang bằng phản ứng PCR thấy có

31 chủng thuộc serotype A, 11 chủng thuộc serotype D, không có chủng nào thuộc serotype B

1.1.2.6 Phòng bệnh

Ngoài những biện pháp chung áp dụng cho các bệnh truyền nhiễm, còn căn

cứ vào đặc tính gây bệnh của vi khuẩn P multocida và tính chất truyền nhiễm của

bệnh mà có các biện pháp phòng bệnh thích hợp Theo Bùi Xuân Đồng (2000), biện pháp phòng bệnh quan trọng nhất là cần phải tuyên truyền sâu rộng về bệnh tụ huyết trùng để nhân dân nhận thức và thực hiện một số biện pháp phòng trị bệnh như chăm sóc, nuôi dưỡng, sử dụng, vệ sinh chuồng trại, tăng cường công tác kiểm dịch động vật, sản phẩm động vật

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2009), khi có dịch cần thực hiện các bước sau để phòng chống dịch lây lan

+ Phát hiện gia súc ốm để cách ly, điều trị kịp thời, tránh lây nhiễm mầm bệnh sang gia súc khỏe

+ Thực hiện pháp lệnh thú y: Công bố dịch, cấm không vận chuyển và giết

mổ trâu, bò vùng có dịch

+ Trâu, bò chết do bệnh không được mổ thịt, phải hủy, chôn sâu, đổ vôi bột vào hố chôn Chuồng trại có súc vật ốm phải quyết dọn sạch, tẩy uế bằng nước vôi 10-20%, phân, rác phải ủ hoặc đốt để diệt mầm bệnh

+ Tổ chức tiêm vaccine vào thẳng ổ dịch, tạo miễn dịch cho súc vật khỏe phòng nhiễm vi khuẩn tụ huyết trùng

Do đặc điểm của bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra ở thể cấp tính và quá cấp tính nên việc sử dụng kháng sinh chỉ có hiệu quả khi được phát hiện sớm Chính vì

vậy việc phòng chống bệnh cho trâu bò là cần thiết, đặc biệt là phòng bệnh chủ động bằng vaccine

Để phòng bệnh tốt hơn, theo De Alwis (1999) ngoài việc tiêm phòng bằng vaccine, cần phải thực hiện 3 biện pháp kèm theo sau:

- Xây dựng hệ thống chuyên môn, quản lý thông báo dịch tốt Điều này sẽ làm cho thông tin về những ổ dịch xảy ra được nhận biết nhanh nhất, từ đó có biện pháp phòng chống nhanh, hiệu quả, tránh được lây lan bệnh

- Thúc đẩy nhận thức của người chăn nuôi về bệnh, hướng dẫn họ cách phát hiện bệnh và biện pháp phòng chống Hướng dẫn chăm sóc, nuôi dưỡng, sử dụng trâu, bò hợp lý, tránh gây ra stress

- Thực hiện nghiêm ngặt việc kiểm soát, kiểm dịch Ngăn chặn việc sát nhập, vận chuyển gia súc từ các vùng có dịch vào hoặc đi qua các địa phương

1.1.2.7 Điều trị bệnh

* Điều trị bằng kháng sinh

Điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò chủ yếu bằng kháng sinh, kèm theo thuốc trợ sức, trợ lực cùng với việc chăm sóc và nuôi dưỡng tốt Kết quả điều trị phụ thuộc vào sự phát hiện bệnh sớm hay muộn và loại kháng sinh điều trị Nếu phát hiện sớm thì điều trị sẽ có kết quả tốt Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2009), do đặc điểm của bệnh thường xảy ra ở thể quá cấp tính và cấp tính nên cần phát hiện bệnh thật sớm, điều trị kịp thời thì mới có hiệu quả cao

Trong khi sử dụng các kháng sinh điều trị, các tác giả đều đề nghị sử dụng thêm các thuốc trợ lực, trợ tim và các loại vitamin như: cafein hoặc long não, vitamin B1, vitamin C

Tuy vậy muốn điều trị có hiệu quả cần làm kháng sinh đồ để lựa chọn kháng sinh phù hợp Để điều trị bệnh trong thực tế có hiệu quả cần nghiên cứu tác động phối hợp của thuốc, đường cho thuốc và đặc biệt là lưu ý điều trị triệu chứng lâm sàng của từng gia súc

* Điều trị bằng kháng huyết thanh

Ngoài việc điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò bằng kháng sinh và hóa dược, một số tác giả còn sử dụng kháng huyết thanh Chế tạo kháng huyết thanh tụ huyết trùng đa giá trên ngựa dùng điều trị bệnh tụ huyết trùng, nhưng tác dụng thường ngắn Thời gian tác dụng tốt nhất trong vòng 16 - 24 giờ sau khi tiêm, giảm sau 48 giờ và biến mất sau 142 giờ

Ở Việt Nam, phân Viện Thú y Nha Trang cũng đã chế kháng huyết thanh đa giá tụ huyết trùng trên ngựa, sử dụng điều trị cho các loại trâu, bò quý, trong phòng bệnh khẩn cấp, liều phòng và trị như sau

Với bê, nghé liều phòng 10-20 ml/con Liều trị 20-40 ml/con

Với trâu, bò liều phòng 30-50 ml/con Liều trị 60-100 ml/con

1.2 TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

Nghiên cứu của Ramdani và cs (1990) cho thấy, một trong những chủng P

multocida phổ biến gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò là chủng M1404 thuộc

serotype B rất độc với chuột bạch, chỉ cần tiêm 20 vi khuẩn/chuột sau 18 giờ chuột

đã có triệu chứng nhiễm trùng huyết

Theo Blocker và cs (2006), độc tố P multocida còn có khả năng tái tạo

polymeractin, làm thay đổi hình thái tế bào dendrite (Dendritic cells), làm cản trở sự xâm nhập của tế bào này vào các hạch lympho trong quá trình đáp ứng miễn dịch ối

với bệnh tụ huyết trùng Tuy nhiên độc tố của P multocida không ảnh hưởng tới sự

ẩm bào của các đại thực bào (macropinocylosis)

Muhammad Imran và cs (2007) nghiên cứu tỷ lệ mang trùng P multocida ở

trâu, bò nuôi tại tỉnh Faisalabad, Pakistan thấy, 100 mẫu dịch ngoáy mũi thu được

từ trâu sau khi tiến hành nuôi cấy chỉ có 3 mẫu dương tính (2 mẫu của trâu trên 1

năm tuổi và 1 mẫu của trâu dưới 1 năm tuổi)

Yoshimura và cs (2008), Kumar và cs (2009) cho biết, enrofloxacin là kháng

sinh hiệu quả nhất chống lại P multocida

Ahrar và cs (2011) nghiên cứu tại Pakistan thấy, tỷ lệ trâu, bò chết do tụ huyết trùng nhiều nhất là 8 - 9 tháng tuổi (47,05%), tiếp theo là trâu bò trên 9 tháng tuổi (29,41%) và từ 6 - 7 tháng tuổi (23,53%) Căn bệnh lây lan trong 10 ngày, đỉnh điểm là ngày thứ 8, khi mà tỉ lệ tử vong lên đến 37%

Naz và cs (2012) kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh của 16 chủng P

multocida phân lập được từ trâu tại Pakistan thấy có 87,5% chủng nhạy cảm với

kháng sinh ciprofloxacin, ofloxacin, enrofloxacin và gentamycin

Theo Gajendragad và cs (2012) dịch bệnh tụ huyết trùng thường xảy ra giữa những đàn gia súc được chăn thả trên các cánh đồng tự nhiên, cùng uống chung 1 nguồn nước và được nhốt cùng nhau

Mitra và cs (2013) cho biết, vi khuẩn P multocida dương tính với phản ứng

Indole, khử nitrat, phản ứng gelatin hóa, lên men đường glucose, sucrose, galactose, fructose và mannitol

Theo Manasa và cs (2013), 100% các chủng vi khuẩn P multocida mẫn cảm

với enrofloxacin, flumequin, penecillin, chloramphenicol và cephalexin Còn các kháng sinh khác lần lượt là pefloxacin 93,2%, gentamycin 90,1%, ampicillin 90%

Annas và cs (2014) cho biết, sau các đợt dịch tụ huyết trùng, vi khuẩn sinh sôi trong amidan những cá thể trâu sống sót và trở thành vật truyền nhiễm, căn bệnh này có thể lây qua đường hô hấp Tác giả cũng làm thí nghiệm nhốt các con bê khỏe

mạnh cùng với 1 con bê bị nhiễm P multocida B: 2, những con bê sống sót đã trở thành vật lây nhiễm bệnh Vi khuẩn Pasteurella đã được phát hiện trong đường hô

hấp, cơ quan tiêu hóa và đường tiết niệu của bê, cho thấy vai trò của các cơ quan, bộ phận này trong việc phát tán bệnh

Theo Kawasaki M và cs (2015), bệnh tụ huyết trùng là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây tử vong chủ yếu cho trâu, bò và bùng phát phổ biến ở Campuchia Tỷ

lệ trâu, bò mắc bệnh trung bình là 10,1% và tỷ lệ chết là 28,8% Trâu có tỷ lệ mắc bệnh và chết cao hơn ở bò

Abu James Sundufu và cs (2015) đã tiến hành giám sát các bệnh truyền nhiễm ở gia súc và gia cầm tại huyện Koinadugu, Sierra Leone và cho biết: trong tổng cộng 5.679 gia súc, gia cầm bệnh được báo cáo có 1.402 gia súc mắc giun đầu gai, 911 gia cầm bị newcastle và 542 gia súc mắc bệnh tụ huyết trùng

Bernardo Augusto França Dias de Oliveira và cs (2016) đã thu thập dịch ngoáy mũi từ 96 gia súc khỏe mạnh ở Bang Sao Paulo, Brazil để phân lập vi khuẩn

P multocida Kết quả có 15,50% số mẫu dương tính với vi khuẩn P multocida

Theo Edouard Timsit và cs (2017), P multocida là vi khuẩn thường gặp nhất được phân lập ở gia súc (54,8%) P multocida có khả năng đề kháng cao với

oxytetracycline (67%) và penicillin (52%)

Tibor Magyar và cs (2017) đã cho biết, bệnh tụ huyết trùng xuất hiện trở lại tại Hungary kể từ năm 1970 Bênh xảy ra tại 3 trại bò nhỏ ở thể cấp tính Bò, bê nhiễm bệnh có biểu hiện mệt mỏi, chán ăn, triệu chứng tích nước và xuất huyết dưới

da, hạch họng hầu sưng to, nhiễm trùng huyết, ở bê có hiện tượng phù thũng tứ chi

Maynou G và cs (2017) nghiên cứu tính kháng thuốc của P multocida phân

lập được từ dịch ngoáy mũi ở bê Holstein với các loại kháng sinh clavulanic acid, ceftiofur, colistin, doxycycline (DO), registerfloxacin (ENR), erythromycin, florfenicol, imipenem và streptomycin Kết quả cho thấy số chủng vi

amoxicillin-khuẩn P multocida kháng colistin chiếm tỷ lệ rất cao.

Chenlu Wu và cs (2017) cho biết, bệnh tụ huyết trùng do P multocida ở gia

súc gây ra dịch bệnh nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi trên toàn thế giới

Zi Wang và cs (2017) đã thử nghiệm tính kháng với aminoglycoside và

spectinomycin của 23 chủng P multocida phân lập được từ đường hô hấp của bò tại

Trung Quốc Kết quả cho thấy tất cả các chủng phân lập đều có tính kháng với ít nhất hai loại aminoglycoside và kháng mạnh với spectinomycin

Drew R Magstadt và cs (2018) cho biết: việc lạm dụng điều trị bằng kháng sinh có thể gây ra hiện tượng kháng thuốc của các loại vi khuẩn nói chung và vi

khuẩn P multocida nói riêng

Clémence Bourély và cs (2019) đã thử nghiệm tính kháng thuốc của 5.356

chủng P multocida đối với registerfloxacin được xác định ở gia súc (4,5%) và chó (5,2%); khả năng kháng florfenicol ở các chủng P multocida là khoảng 1%, tỷ lệ các chủng vi khuẩn P multocida đề kháng với tetracycline, tilmicosin, flumequine

và fluoroquinolones phân lập từ gia súc ngày càng cao

Tại Ấn Độ, Rajeswari Shome và cs (2019) cho biết: bệnh tụ huyết trùng là một

trong những bệnh gây tỷ lệ chết cao nhất trên trâu, bò do vi khuẩn P multocida gây ra,

do đó gây thiệt hại lớn về kinh tế ngành chăn nuôi Các tác giả đã thu thập 346 mẫu huyết thanh bò từ 224 hộ gia đình thuộc ba huyện của bang Assam, Đông Bắc Ấn Độ, kết quả có 88 mẫu huyết thanh dương tính, chiếm tỷ lệ 25,4%

Theo Holschbach C L và cs (2020), trong 4.261 mẫu bệnh phẩm từ bò bệnh được gửi về phòng thí nghiệm Chẩn đoán Thú y Wisconsin (WVDL), có 2.094 mẫu

phân lập dương tính với P multocida Các chủng vi khuẩn này đều có tính kháng

với ít nhất 1 loại kháng sinh

1.3 TỔNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM

Những nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, ổ dịch đầu tiên trong vùng xảy ra từ trâu, bò của địa phương bị bệnh, do việc giết mổ làm dịch lây lan rộng Dịch thường xảy ra và lan rộng theo các triền sông do nước bị nhiễm vi khuẩn gây bệnh (Bùi Quý Huy, 1998)

Bùi Xuân Đồng (2000) khi nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở Hải Phòng cho biết bệnh bắt đầu vào tháng 4, đỉnh cao là tháng 6, 7

Cao Văn Hồng (2002) cho biết, mùa dịch tụ huyết trùng ở Đắc Lắk từ tháng

5 đến tháng 9, đây là những tháng mưa nhiều

Nguyễn Đình Trọng (2002) kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh của 31 chủng

P multocida phân lập tại Bắc Kạn, có 83,87% các chủng vi khuẩn kháng lại với

penicilline, streptomycine 32,26%; ampicilline 19,35%; chlortetracycline 12,9% và 9,67% với furazolidone

Theo Hoàng Đăng Huyến (2004), bệnh tụ huyết trùng xảy ra ở Bắc Giang từ tháng 4 đến tháng 9 hàng năm, thời gian này đang là mùa mưa

Theo Nguyễn Văn Thanh (2004), dùng kháng huyết thanh chống bệnh tụ huyết trùng trâu bò, tiêm dưới da, trâu bò 60 - 100 ml; bê nghé 20 - 40 ml Tiêm Streptomycin 2gr cho 100 kg thể trọng, tiêm ngày 2 lần, tiêm liền trong 4 - 5 ngày, ngoài ra cần trợ sức trợ lực cho con vật

Phạm Sỹ Lăng và cs (2009) cho rằng, ở các vùng có lưu hành bệnh, tổ chức tiêm phòng vaccine cho đàn trâu, bò 6 tháng/lần để đảm bảo cho đàn trâu, bò được miễn dịch chống lại vi khuẩn tụ huyết trùng

Nguyễn Bá Hiên và cs (2009) cho biết, các tỉnh phía Bắc bệnh thường có vào mùa mưa, lũ lụt từ tháng 6 đến tháng 12 Hiện nay bệnh hay gặp ở các tỉnh miền núi như Lạng Sơn, Lai Châu, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Giang, gây nhiều thiệt hại

Đặng Xuân Bình và cs (2010) khi thử độc lực của các chủng P multocida phân

lập được từ trâu, bò và lợn ở 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng thấy các chủng đều có độc lực cao gây chết chuột từ 80 - 100% trong vòng 48 giờ sau khi công cường độc

Theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2011), lúc sắp chết con vật nằm liệt, đái ra máu, thở rất khó khăn, có nhiều chấm xuất huyết đỏ ở các niêm mạc Bệnh tiến triển

3 - 5 ngày, tỷ lệ chết 90 - 100%, nếu bệnh chuyển sang thể nhiễm trùng máu, con vật chết trong 24 - 36 giờ Có thể dùng các loại kháng sinh sau để điều trị bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò: streptomycin, kanamycin, oxytetracyclin, neomycin, gentamycin, nofloxacin

Trương Quang Hải (2012) thấy vi khuẩn mẫn cảm mạnh với ceftiofur (95,0%), florfenicol (90,0%), amoxicillin (80,0%), ofloxacin (75,0%) và streptomycin (70,0%)

Cù Hữu Phú và cs (2014) kiểm tra độc lực của 10 chủng P multocida, thấy

cả 10 chủng đều có độc lực mạnh, có khả năng gây chết chuột trong vòng 16 - 32 giờ sau tiêm

Nguyễn Khắc Đại (2015) cho biết: trâu, bò khoẻ mạnh có mang vi khuẩn P

multocida ở đường hô hấp, tỷ lệ phân lập ở đàn trâu, bò trung bình là 8,40% Tỷ lệ

phân lập được ở trâu cao hơn ở bò Tỷ lệ mang trùng cao nhất là giai đoạn < 2 năm tuổi (trâu 20,83%; bò 23,53%)

Hoàng Văn Khoản và cs (2015) kiểm tra dung quang khuẩn lạc của giống vi

khuẩn P multocida sản xuất vaccine chủng N41, thấy khuẩn lạc có dung quang đặc

trưng, màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm phần lớn diện tích bề mặt khuẩn lạc, phần diện tích khuẩn lạc còn lại có màu vàng da cam chứng tỏ vi khuẩn có độc lực cao

Theo Lê Văn Phượng (2015), trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại 3 huyện Quảng Xương, Nông Cống, Tĩnh Gia thuộc tỉnh Thanh Hóa có sự khác biệt rõ ràng

giữa hai vụ Đông - Xuân và Hè - Thu Vụ Đông - Xuân số trâu, bò chết chiếm 5,88%; vụ Hè - Thu số trâu, bò chết chiếm 3,78%

Phạm Thị Phương Lan (2017) cho biết: Trâu, bò nuôi tại 2 tỉnh Hà Giang, Cao Bằng có hiện tượng khỏe mang trùng, là nguồn bệnh tiềm tàng bệnh tụ huyết trùng và trong số này chỉ có 2,17% cá thể có đáp ứng miễn dịch bảo hộ với bệnh tụ huyết trùng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng

- Vi khuẩn P multocida

- Bệnh tụ huyết trùng trên đàn trâu, bò của tỉnh Quảng Ninh

2.1.2 Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu

* Mẫu bệnh phẩm dùng phân lập vi khuẩn

- Dịch ngoáy mũi lấy từ trâu, bò khỏe mạnh không có triệu chứng lâm sàng

- Thu thập bệnh phẩm là gan, lách, phổi, tủy xương của trâu, bò nghi mắc bệnh tụ huyết trùng

* Động vật thí nghiệm

- Chuột bạch khỏe mạnh, có trọng lượng từ 18 - 20 gam/con

- Trâu, bò khỏe mạnh không mắc bệnh tụ huyết trùng và chưa được tiêm phòng vaccine tụ huyết trùng

* Các loại môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

- Thạch máu

- Thạch Macconkey

- Canh thang BHI

- Thạch urê

- Môi trường nước pepton

* Các loại thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

- Tủ lạnh

- Que cấy

- Đèn cồn

- Đĩa Petri để đổ môi trường

- Panh, kéo, lamen, phiến kính, pipet và lọ thủy tinh các cỡ

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Từ 08/2019 - 08/2020

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện tại ba huyện, thị xã thuộc tỉnh Quảng Ninh (huyện Hải Hà, huyện Ba Chẽ, thị xã Đông Triều);

- Trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật - Cơ quan Thú y vùng II;

- Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng Ninh

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Một số đặc điểm dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò ở tỉnh Quảng Ninh

từ năm 2016 - 2019

- Tình hình trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng trên địa bàn tỉnh

Quảng Ninh từ năm 2016 - 2019

- Tỷ lệ trâu, bò ốm và chết do bệnh tụ huyết trùng theo mùa vụ, lứa tuổi và

loài gia súc

2.3.2 Triệu chứng, bệnh tích điển hình ở trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng 2.3.3 Phân lập và xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn P multocida

- Phân lập vi khuẩn P multocida từ dịch ngoáy mũi của trâu, bò khỏe mạnh

tại các địa phương nghiên cứu

- Phân lập vi khuẩn P multocida từ bệnh phẩm trâu, bò nghi mắc bệnh tụ

huyết trùng tại các địa phương nghiên cứu

- Giám định một số đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng vi khuẩn P

mutocida phân lập được

- Xác định serotype kháng nguyên của các chủng vi khuẩn P multocida phân

lập được

- Xác định độc lực của các chủng P multocida phân lập được

- Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của vi khuẩn P multocida phân lập được

với một số loại kháng sinh và hóa dược

2.3.4 Thử nghiệm phác đồ điều trị và đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng cho trâu, bò tại tỉnh Quảng Ninh

- Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

- Đề xuất biện pháp phòng bệnh tụ huyết trùng trâu, bò tại tỉnh Quảng Ninh

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

Điều tra tình hình dịch tễ bệnh tụ huyết trùng trâu, bò từ năm 2016 - 2019 tại tại tỉnh Quảng Ninh theo phương pháp hồi cứu như mô tả của Nguyễn Như Thanh (2001) Chọn điểm điều tra theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc kết hợp với số liệu báo cáo công tác thú y qua các năm (2016 - 2019) của Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng Ninh

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu

Lấy dịch ngoáy mũi trâu, bò khỏe: dùng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào mũi trâu, bò để thấm dịch tiết, cho que bông vào ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng Natural blood đã hấp vô trùng, đậy nút, ghi ký hiệu (mẫu được cho vào phích lạnh) rồi đưa về phòng thí nghiệm Các mẫu bệnh phẩm được bảo quản trong điều kiện 40C

Bệnh phẩm là gan, lách, phổi thì lấy những vị trí có bệnh tích điển hình; bệnh phẩm là tủy xương thì lấy một đoạn xương ống chân Bệnh phẩm được cho vào túi nylon vô trùng, bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 40C và nhanh chóng đưa về phòng thí nghiệm của trạm Chẩn đoán xét nghiệm bệnh động vật - Cơ quan Thú y vùng II để phân lập vi khuẩn

2.4.3 Phương pháp xác định triệu chứng, bệnh tích ở trâu, bò mắc bệnh và chết do

tụ huyết trùng

2.4.3.1 Phương pháp xác định triệu chứng của bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò

Tiến hành lựa chọn 23 trâu, bò mắc bệnh tụ huyết trùng tại 3 huyện, thị thuộc tỉnh Quảng Ninh trong năm 2019 (huyện Hải Hà, huyện Ba Chẽ và thị xã Đông

Triều) để theo dõi chỉ tiêu này Trong quá trình theo dõi, kết hợp với chủ hộ nuôi trâu, bò; hàng ngày quan sát các biểu hiện của con vật để xác định các biểu hiện bất

thường về ăn uống, đi lại, vận động, các biến đổi ở da, niêm mạc, cơ thể…

2.4.3.2 Phương pháp xác định bệnh tích đại thể ở trâu, bò chết do tụ huyết trùng

Kết hợp với các trạm thú y tại các huyện, thành, thị thuộc tỉnh Quảng Ninh

để thực hiện nội dung này Tất cả 19 trâu, bò chết có biểu hiện đặc trưng của bệnh

tụ huyết trùng tại tỉnh Quảng Ninh năm 2019 đều được mổ khám bệnh tích để xác định các biến đổi đại thể và lấy mẫu bệnh phẩm (gan, lách, xương ống chân và

phổi) phân lập vi khuẩn P multocida

2.4.4 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P multocida

Phương pháp nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn P multocida được tiến

hành theo TCVN 8400-14:2011

2.4.4.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập

Mỗi mẫu (dịch ngoáy mũi hoặc bệnh phẩm) được ria cấy trực tiếp lên các môi trường thông thường và đặc biệt như nước thịt, thạch máu, MacConkey, bồi dưỡng ở 370C trong 24 giờ Sau khi vi khuẩn mọc, căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn khuẩn lạc điển hình đem nuôi cấy lại trên các môi trường chọn lọc để thuần khiết rồi tiến hành các phương pháp thử sinh hóa để giám định vi

khuẩn Khuẩn lạc của P multocida được xác định theo tiêu chuẩn của Heddleston

và cs (1966)

2.4.4.2 Phương pháp xác định tính chất sinh vật, hóa học của P multocida

* Kiểm tra hình thái vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram

- Cố định tiêu bản: Lấy một phiến kính sạch, nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, dùng que cấy lấy một khuẩn lạc điển hình, trộn đều vi khuẩn với giọt nước sinh lý Sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm: Nhỏ một giọt tím tinh thể (crystian violet) để 1 phút, cố định màu bằng dung dịch lugol, để 1 phút, rửa nhanh bằng nước cất Nhuộm lại tiêu bản bằng dung dịch đỏ fucshin, để 2 phút Rửa nhanh bằng nước cất, để khô tự nhiên

- Kiểm tra dưới kính hiển vi: Nhỏ một giọt dầu soi kính lên tiêu bản, sử dụng vật kính dầu, kiểm tra hình thái vi khuẩn ở độ phóng đại 1000 lần

* Thử phản ứng Oxydaza

Phản ứng được tiến hành trên giấy được thấm dung dịch Phenylene Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên mặt giấy đã thấm thuốc thử Nếu chỗ được bôi khuẩn lạc sau 10 giây xuất hiện màu xanh tím là phản ứng dương tính Nếu không xuất hiện màu xanh tím hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính

Tetramethyl-* Thử phản ứng Catalaza

Nhỏ lên phiến kính sạch vài giọt dung dịch H2O2 3%, dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc điển hình trộn đều Sau 5 giây hiện tượng sủi bọt xuất hiện là dương tính, không thay đổi gì là phản ứng âm tính

* Phản ứng sinh Indol

Cấy giống vi khuẩn cần thử vào môi trường Nutrient Broth sau đó bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ Nhỏ 1 - 3 giọt Kowacs dọc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính xuất hiện một vòng đỏ thẫm trên bề mặt

* Kiểm tra khả năng di động của trên môi trường thạch lỏng

Dùng que cấy chích sâu để lấy khuẩn lạc cấy thẳng xuống gần đáy của ống nghiệm có môi trường thạch lỏng Nuôi trong tủ ấm, đọc kết quả sau 24 h

- Phản ứng dương tính (có khả năng di động): môi trường đục, không nhìn rõ đường cấy chích sâu;

- Phản ứng âm tính: môi trường trong và nhìn thấy đường cấy chích sâu

* Khả năng lên men đường, khả năng sinh H 2 S

Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc nghi là vi khuẩn P multocida cấy

lên môi trường thạch nghiêng TSI

- Trên bề mặt thạch nghiêng: Xác định độ lên men đường Lactosa, nếu thạch

chuyển sang màu đỏ là phản ứng dương tính Vi khuẩn P multocida không lên men

- Nếu vi khuẩn sản sinh H2S: Phần tiếp giáp giữa phần đứng và phần nghiêng

có màu đen

2.4.4.3 Phương pháp xác định serotype kháng nguyên của vi khuẩn P multocida

Xác định serotype vi khuẩn bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng sử dụng cặp mồi (Primer sequences) sau:

KTT72 5’-AGG-CTC-GTT-TGG-ATT-ATG-AAG-3’

KTSP61 5’-ATC-CGC-TAA-CAC-ACT-CTC-3’

Phản ứng gồm có các giai đoạn: Tiền biến tính ở 94˚C/3phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94˚C/3 phút, ủ bắt cặp 55˚C/1 phút, kéo dài 72˚C/1 phút ) và kéo dài cuối cùng 72˚C/7 phút

Quá trình điện di được thực hiện trên gel agarose 2%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút Gel được nhuộm trong dung dịch EDTA đã bổ sung 1% ethidium bromide Sau 15 phút, tiến hành đọc kết quả bằng hệ thống Gel-Doc 2000 Các vạch DNA được đánh giá bằng cách so sánh với DNA ladder chuẩn và mẫu đối chứng dương

Serotype giáp mô của vi khuẩn P multocida được xác định dựa trên phản ứng PCR Sử dụng cặp mồi CAPB-F, CAPB-R để xác định serotype B của P

multocida Trình tự các đoạn mồi và kích cỡ của sản phẩm đối với cặp mồi đặc hiệu

trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi dùng để xác định serotype B của vi khuẩn P multocida

760bp

2.4.5 Kiểm tra độc lực của vi khuẩn P multocida phân lập được

2.4.5.1 Kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên chuột bạch

Tiến hành phân lập và kiểm tra độc lực của vi khuẩn P multocida theo

Quinn P J và cs (1994)

Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn P multocida

(Quinn P J và cs, 1994) Sau khi nuôi cấy và tiến hành thuần khiết vi khuẩn phân lập được qua các môi trường nuôi chọn lọc, cấy chủng vi khuẩn thử lên môi trường BHI, bồi dưỡng trong tủ ấm ở 370C trong 24 giờ tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm

Sử dụng chuột bạch (18 - 20g/con) khỏe, mỗi chủng dùng tiêm 2 chuột, liều

Dịch ngoáy mũi, mẫu bệnh phẩm

Thạch máu (Blood agar), 370C/24h

Kiểm tra đặc tính sinh vật, hóa học

Làm tiêu bản, nhuộm Gram

Các phản ứng sinh hóa Oxidase (+), Calatase (+), Indole (+)

Thử phản ứng lên men đường, khả năng dung huyết

Pasteurella multocida