Nghiên cứu đa dạng thành phần loài và mối quan hệ di truyền của các loài trong giống megophrys (amphibia megophryidae) ở việt nam

Địa điểm thu thập mẫu vật các loài ếch thuộc giống Megophrys ở Việt Nam ...19 Hình 2.2.Chỉ số đo hình thái LC của loài trong giống Megophrys...23 Hình 3.1.. Do đó, việc nghiên cứu kĩ lưỡ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

−−−−−−−−−−−−−−−

LƯƠNG MAI ANH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI TRONG GIỐNG

MEGOPHRYS (AMPHIBIA: MEGOPHRYIDAE) Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI−2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

−−−−−−−−−−−−−−−

LƯƠNG MAI ANH

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI TRONG GIỐNG

MEGOPHRYS (AMPHIBIA: MEGOPHRYIDAE) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành : Động vật học

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

HÀ NỘI−2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nêutrong luận án là trung thực, các số liệu tham khảo đều có nguồn trích dẫn rõ ràng.Bản thảo luận án này chưa từng được bảo vệ để nhận học vị trước bất kỳ hội đồngnào trước đây

Tác giả

Lương Mai Anh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Lân Hùng Sơn và GS.TS Nguyễn QuảngTrường đã hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài, phân tích số liệu, công bốkết quả nghiên cứu và hoàn thiện luận án

Xin cảm ơn GS.TS Thomas Ziegler (Vườn thú Cologne, CHLB Đức),PGS.TS Nguyễn Thiên Tạo, NCS Ninh Thị Hòa (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam),

TS Phạm Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật), ThS Ngô Thị Hạnh(Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội), PGS TS Phạm Văn Anh (Đại họcTây Bắc), TS Lê Trung Dũng (Bộ Giáo dục và Đào tạo), NCS Hoàng Văn Chung(Viện Sinh học Thành Đô, Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc) và các đồngnghiệp đã hỗ trợ trong quá trình khảo sát thực địa và phân tích số liệu của luận án.Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư Phạm, Ban Chủnhiệm Khoa Sinh học, Bộ môn Động vật học và Bảo tàng Sinh vật đã tạo điều kiện

và hỗ trợ cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu Xin cảm ơn Tổ Giám địnhmẫu động vật, thực vật và Phòng Động vật có xương sống (Viện Sinh thái và Tàinguyên sinh vật), Phòng Bảo tồn thiên nhiên (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam) đã

hỗ trợ tôi trong quá trình phân tích số liệu của luận án; Ban Giám đốc, các cán bộkiểm lâm của các VQG, KBTTN các khu vực, lãnh đạo và người dân địa phương đãcung cấp thông tin, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình khảo sát thực địa.Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và những người thân đã hết lònggiúp đỡ, động viên tôi để hoàn thành luận án này

Nghiên cứu được hỗ trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia(Nafosted) trong đề tài mã số 106.05−2017.329 Khảo sát thực địa ở khu vực TâyNguyên được hỗ trợ bởi Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Đề tài thuộcChương trình Tây nguyên giai đoạn 2016-2020, mã số TN18/T07) Trang thiết bị thựcđịa được hỗ trợ bởi tổ chức Idea Wild (Hoa Kỳ) và Vườn thú Cologne (CHLB Đức)

Hà Nội, tháng năm 2021

Nghiên cứu sinh

Lương Mai Anh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

CITES Công ước về buôn bán quốc tế các loài động thực vật hoang dã nguy cấp

EL AL Và nhiều người khác

HNUE Mã mẫu vật được lưu giữ tạiTrường Đại học Sư phạm Hà NộiICZN Ủy ban Quốc tế về Danh pháp Động vật

IEBR Mã mẫu vật được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vậtIUCN Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế

KBTTN Khu Bảo tồn thiên nhiên

KVNC Khu vực nghiên cứu

SĐVN Sách Đỏ Việt Nam

VNMN Mã mẫu vật được lưu giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

5 Những đóng góp mới của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Lược sử nghiên cứu về ếch nhái ở các nước trong khu vực 4

1.2 Tổng quan về nghiên cứu ếch nhái ở Việt Nam 5

1.2.1 Các nghiên cứu về khu hệ và phát hiện mới 5

1.2.2 Các nghiên cứu tu chỉnh về phân loại học 9

1.2.3 Nghiên cứu về phân vùng địa lý động vật của khu hệ lưỡng cư bò sát ở Việt Nam 11

1.3 Các nghiên cứu về họ Megophryidae và giống Megophrys ở Việt Nam 13

1.3.1 Nghiên cứu về họ Megophryidae 13

1.3.2 Nghiên cứu về giống Megophrys 13

CHƯƠNG 2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 17

2.2 Cách tiếp cận 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Khảo sát thực địa 20

2.3.2 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 21

2.4 Phân tích sinh học phân tử 25

2.5 Phân tích đặc điểm phân bố của các loài trong giống Megophrys 26

2.6 Đánh giá loài có giá trị bảo tồn 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Thành phần loài của giống Megophrys và các phát hiện mới ở Việt Nam 29

3.1.1 Thành phần loài 29

3.1.2 Các phát hiện mới 32

3.2 Đặc điểm hình thái và phân bố các loài thuộc giống Megophrys 33

3.2.1 Mô tả đặc điểm hình thái của các loài 33

3.2.2 Khóa định loại các loài thuộc giống Megophrys 54

3.2.3 Đánh giá đặc điểm phân bố của các loài 56

3.2.4 Đặc điểm phân bố của các loài trong giống Megophrys theo phân vùng địa lý 60

3.3 Mối quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Megophrys 72

3.3.1 Sự sai khác di truyền giữa các loài 72

3.3.2 Quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Megophrys 88

3.4 Các yếu tố tác động đến các loài thuộc giống Megophrys ở Việt Nam và đề xuất giải pháp bảo tồn 91

3.4.1 Các yếu tố tác động đến các loài thuộc giống Megophrys ở Việt Nam 91

3.4.2 Đề xuất một số giải pháp bảo tồn 95

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 100

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 PHỤ LỤC

DANH LỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Các chỉ số đo hình thái của lưỡng cư (Đơn vị: mm) 22

Bảng 2.3 Màng bơi của một số loài LC được mô tả theo Glaw và Vences (2007) 24 Bảng 2.4 Các mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống Megophrys .25

Bảng 3.1 Danh sách các loài thuộc giống Cóc mắt ghi nhận ở Việt Nam 30

Bảng 3.2 Thông tin về trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu 73

Bảng 3.3 Khoảng cách di truyền giữa các loài trong giống Megophrys 76

Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền giữa các loài trong phân giống Ophryophryne .79

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền giữa các loài trong phân giống Panophrys 80

Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền giữa các loài trong phân giống Xenophrys 81

Bảng 3.7 Khoảng cách di truyền giữa các quần thể của loài Megophrys (Xenophrys) maosonensis 82

Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền giữa các quần thể của loài Megophrys (Ophryophryne) microstoma ở Việt Nam 85

Bảng 3.9 Khoảng cách di truyền giữa các quần thể của loài Megophrys (Panophrys) palpebralespinosa 86

Bảng 3.10 Diễn biến diện tích rừng Việt Nam giai đoạn 2010-2019 92

Bảng 3.11 Các nhân tố tác động đến các loài trong giống Cóc mắt ghi nhận tại các địa điểm khảo sát 94

Bảng 3.12 Đánh giá thang điểm các địa điểm cần ưu tiên bảo tồn ở KVNC 96

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phân vùng địa lý lưỡng cư, bò sát khu vực Đông Dương 12

Hình 2.1 Địa điểm thu thập mẫu vật các loài ếch thuộc giống Megophrys ở Việt Nam .19

Hình 2.2.Chỉ số đo hình thái LC của loài trong giống Megophrys 23

Hình 3.1 Số lượng các loài thuộc giống Cóc mắt theo sinh cảnh 57

Hình 3.2 Số lượng các loài thuộc giống Cóc mắt theo nơi thu mẫu 58

Hình 3.3 Số lượng các loài thuộc giống Cóc mắt theo độ cao 59

Hình 3.4 Số lượng các loài thuộc giống Cóc mắt ghi nhận theo đai độ cao 60

Hình 3.5 Mặt lưng M gigantica 61

Hình 3.6 Mặt bụng M gigantica 61

Hình 3.7 Sơ đồ phân bố của loài M gigantica 61

Hình 3.8 Mặt lưng M feae 61

Hình 3.9 Mặt bụng M feae 61

Hình 3.10 Sơ đồ phân bố của loài M feae 61

Hình 3.11 Mặt lưng M intermedia 62

Hình 3.12 Mặt bụng M intermedia 62

Hình 3.13 Sơ đồ phân bố của loài M intermedia 62

Hình 3.14 Mặt lưng M elfina 62

Hình 3.15 Mặt bụng M elfina 62

Hình 3.16 Sơ đồ phân bố của loài M elfina 62

Hình 3.17 Mặt lưng M gerti 63

Hình 3.18 Mặt bụng M gerti 63

Hình 3.19 Sơ đồ phân bố của loài M gerti 63

Hình 3.20 Mặt lưng M hansi 63

Hình 3.21 Mặt bụng M hansi 63

Hình 3.22 Sơ đồ phân bố của loài M hansi 63

Hình 3.23 Mặt lưng M microstoma 64

Hình 3.24 Mặt bụng M microstoma 64

Hình 3.25 Sơ đồ phân bố của loài M microstoma 64

Hình 3.26 Mặt lưng M synoria 64

Hình 3.27 Mặt bụng M synoria 64

Hình 3.28 Sơ đồ phân bố của loài M synoria 64

Hình 3.29 Mặt lưng M caobangesnsis 65

Hình 3.30 Mặt bụng M caobangesnsis 65

Hình 3.31 Sơ đồ phân bố của loài M caobangensis 65

Hình 3.32 Mặt lưng M daweimontis 65

Hình 3.33 Mặt bụng M daweimontis 65

Hình 3.34 Sơ đồ phân bố của loài M daweimontis 65

Hình 3.35 Mặt lưng M fansipanensis 66

Hình 3.36 Mặt bụng M fansipanensis 66

Hình 3.37 Sơ đồ phân bố của loài M fansipanensis 66

Hình 3.38 Mặt lưng M hoangliensensis 66

Hình 3.39 Mặt bụng M hoangliensensis 66

Hình 3.40 Sơ đồ phân bố của loài M hoanglienensis 66

Hình 3.41 Mặt lưng M jingdongensis 67

Hình 3.42 Mặt bụng M jingdongensis 67

Hình 3.43 Sơ đồ phân bố của loài M jingdongensis 67

Hình 3.44 Mặt lưng M minor 67

Hình 3.45 Mặt bụng M minor 67

Hình 3.46 Sơ đồ phân bố của loài M minor 67

Hình 3.47 Mặt lưng M palpebralespinosa 68

Hình 3.48 Mặt bụng M palpebralespinosa 68

Hình 3.49 Sơ đồ phân bố của loài M palpebralespinosa 68

Hình 3.50 Mặt lưng M rubimera 68

Hình 3.51 Mặt bụng M rubimera 68

Hình 3.52 Sơ đồ phân bố của loài M rubrimera 68

Hình 3.53 Mặt lưng M maosonensis 69

Hình 3.54 Mặt bụng M maosonensis 69

Hình 3.55 Sơ đồ phân bố của loài M maosonensis 69

Hình 3.56 Mặt lưng M parva 69

Hình 3.57 Mặt bụng M parva 69

Hình 3.58 Sơ đồ phân bố của loài M parva 69

Hình 3.59 Sơ đồ phân bố các loài trong giống Megophrys ở Việt Nam 70

Hình 3.60 Phân tích mức độ tương đồng về thành phần loài Cóc mắt theo các phânvùng địa lý ở Việt Nam 71

Hình 3.61 Cây quan hệ di truyền giữa các quần thể của loài Megophrys (Xenophrys) maosonensis ở Việt Nam bằng phương pháp Bayesian 83 Hình 3.62 Tương đồng về hình thái giữa các quần thể của loài Megophrys (Xenophrys) maosonensis ở Việt Nam 84

Hình 3.63 Cây quan hệ di truyền giữa các quần thể của loài Megophrys (Ophryophryne) microstoma ở Việt Nam bằng phương pháp Bayesian 85 Hình 3.64 Cây quan hệ di truyền giữa các quần thể của loài Megophrys (Panophrys) palpebralespinosa ở Việt Nam bằng phương pháp Bayesian 87 Hình 3.65 Cây quan hệ di truyền của các loài trong giống Megophrys ở Việt Nam bằng

phương pháp Bayesian 90

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là nước có tiềm năng đa dạng sinh học (ĐDSH) cao trên thế giới [95],trong đó có các loài lưỡng cư (LC) [134] Số lượng loài LC ghi nhận ở Việt Nam tăngnhanh trong các thập kỉ gần đây: từ 82 loài vào năm 1996 [31] lên đến 176 loài vàonăm 2009 [105] và cho tới nay khoảng hơn 283 loài Có rất nhiều loài mới được mô tả

và ghi nhận mới được phát hiện ở Việt Nam trong những năm gần đây, đặc biệt là cácnhóm còn ít được nghiên cứu như các loài ếch nhái thuộc họ Megophryidae ([105],

[61]) Orlov et al (2015) đã mô tả một loài mới Megophrys latidactyla với mẫu vật thu

ở tỉnh Nghệ An [112] Le et al (2015) ghi nhận bổ sung loài M daweimontis ở Việt Nam với mẫu vật thu ở Điện Biên và Sơn La [80] Từ năm 2017, có 6 loài mới cho khoa học đã được mô tả với mẫu chuẩn thu ở Việt Nam: M koui ở Nghệ An, Hà Tĩnh [89], M elfina ở Đắk Lắk [118], M rubrimera thu ở Lào Cai [139], M fansipanensis

và M hoanglienensis ở Lào Cai, M caobangensis ở Cao Bằng [61] Bên cạnh đó, việc

áp dụng các phương pháp nghiên cứu hiện đại như phân tích và so sánh trình tự Axitđêôxi ribônuclêic (DNA) đã góp phần phân biệt các quần thể có đặc điểm hình tháigiống nhau từ đó mô tả thành các loài riêng biệt

Giống Megophrys Kuhl và Van Hasselt, 1822 hiện ghi nhận tổng số 97 loài trên

thế giới, có vùng phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á từ phía nam Trung Quốc tới

Phi-lip-pin [61] Ở Việt Nam, đã ghi nhận 22 loài thuộc giống này bao gồm: M brachykolos, M daweimontis, M elfina [118], M fansipanensis, M feae, M gerti, M gigantica, M hansi, M hoanglienensis, M intermedia, M jingdongensis, M koui [89],

M latidactyla [112], M maosonensis [90], M microstoma, M minor, M pachyproctus, M palpebralespinosa, M parva, M rubrimera [139] và M synoria [61]) Về mặt phân loại học, vị trí phân loại của một số loài thuộc giống Megophrys chưa thực sự rõ ràng do có đặc điểm hình thái khá giống nhau ví dụ như: Megophrys brachykolos, M jingdongensis, M microstoma và M major Loài M major có vùng

phân bố rất rộng ở hầu hết các vùng rừng núi ở miền Bắc và miền Trung Việt Nam

Tuy nhiên, các quần thể của loài này ở miền Bắc và miền Trung có những sai khác nhấtđịnh về đặc điểm hình thái (kích cỡ, màu sắc) và đặc điểm sinh thái Bên cạnh đó, có nhiềumẫu vật thu thập được ở vùng biên giới rất giống với các loài ghi nhận ở Trung Quốc vàLào Do đó, việc nghiên cứu kĩ lưỡng về phân loại học, phân bố, quan hệ di truyền và biến

dị quần thể của các loài thuộc giống Megophrys hứa hẹn có phát hiện mới Chính vì vậy,

nghiên cứu sinh (NCS) chọn thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng thành phần loài và

mối quan hệ di truyền của các loài trong giống Megophrys

(Amphibia: Megophryidae) ở Việt Nam” Trong nghiên cứu này, sẽ kết hợp phân

tích và so sánh đặc điểm hình thái, trình tự DNA của các quần thể và các loài ếch

nhái thuộc giống Megophrys nhằm tu chỉnh về phân loại học, đánh giá mối quan hệ

di truyền giữa các loài và quần thể của chúng

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá được sự đa dạng thành phần loài, đặc điểm phân bố và mối quan hệ

di truyền của các loài thuộc giống Megophrys ở Việt Nam.

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Điều tra về thành phần loài của giống Megophrys ở các địa

điểm đại diện cho các vùng địa lý ở Việt Nam.

Nội dung 2: Đánh giá đặc điểm phân bố của các loài theo dạng sinh cảnh,

theo nơi thu mẫu và đai độ cao

Nội dung 3: Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các quần thể và giữa các

loài thuộc giống Megophrys dựa trên kết quả phân tích DNA.

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học:

- Đã công bố 3 loài mới cho khoa học, ghi nhận bổ sung 1 loài Cóc mắt cho khu

hệ LC của Việt Nam và ghi nhận bổ sung phân bố của 8 loài ở các tỉnh

- Đã cập nhập thông tin về thành phần loài, đặc điểm hình thái, đặc điểm phân

bố của các loài Cóc mắt ở Việt Nam

- Đã xây dựng cây quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Cóc mắt

Megophrys ở Việt Nam và so sánh với một số loài ở các nước lân cận.

- Đề tài cung cấp thông tin cập nhật làm cơ sở khoa học cho công tác quản lý

và quy hoạch bảo tồn đa dạng sinh học ở Việt Nam

5 Những đóng góp mới của đề tài

- Xây dựng được danh sách 18 loài thuộc giống Megophrys ở Việt Nam trong

đó ghi nhận bổ sung phân bố của 8 loài ở các tỉnh của Việt Nam, ghi nhận bổ sung 1 loàicho khu hệ LC của Việt Nam và mô tả 3 loài mới cho khoa học

- Đánh giá được đặc điểm phân bố của các loài Cóc mắt theo đai độ cao, theo sinh cảnh và theo vị trí ghi nhận

- Cung cấp dữ liệu về đặc điểm hình thái, xây dựng khóa định loại và bản đồ

phân bố cho các loài thuộc giống Megophrys ở Việt Nam.

- Phân tích mối quan hệ di truyền các loài Cóc mắt phân bố ở Việt Nam và so sánh với một số loài phân bố ở các nước lân cận

- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quần thể các loài Cóc mắt và đưa ra một

số kiến nghị đối với công tác bảo tồn các loài trong giống Megophrys ở Việt Nam.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lược sử nghiên cứu về ếch nhái ở các nước trong khu vực

Trên thế giới đã hiện đã ghi nhận 8.121 loài LC [61] Số lượng các loài ếchnhái tăng lên đáng kể từ 6.300 năm 2010 lên đến 7.480 loài năm 2015 và cho tớinay đã có khoảng 8.121 loài [61] Các khu vực rừng nhiệt đới có mức độ đa dạngloài cao nhất với khoảng 50% tổng số loài đã được định danh và còn có số lượng rấtlớn các loài chưa được mô tả [51] Ếch nhái là nhóm động vật biến nhiệt, vì vậy,những nghiên cứu về mức độ đa dạng của các loài LC thường được tiến hành ở cácvùng nhiệt đới như Châu Phi, Nam Mỹ và Châu Á [51] Trên thế giới đã có rấtnhiều công trình công bố có liên quan đến phân loại, sinh thái và quan hệ di truyềncủa các loài ếch nhái, tuy nhiên, NCS chỉ nêu sơ lược tình hình nghiên cứu ở cácnước giáp ranh với Việt Nam theo hướng nghiên cứu của đề tài:

Ở Trung Quốc: Zhao và Adler (1993) ghi nhận có 274 loài ếch nhái [154].Yang và Rao (2008) mô tả 115 loài ếch nhái ghi nhận ở tỉnh Vân Nam [149] Fei et al.(2009, 2010) đã ghi nhận 370 loài và hiện nay đã ghi nhận 543 loài ([55], [58])

Từ năm 2010 đến nay, có một số loài mới được mô tả với mẫu vật thu ở hai tỉnh Quảng

Tây và Vân Nam, Trung Quốc giáp ranh với Việt Nam như: Odorrana lipuensis Mo, Chen, Wu, Zhang & Zhou, O fengkaiensis Wang, Lau, Yang, Chen, Liu, Pang & Liu, Limnonectes longchuanensis Suwnnapoom, Yuan, Chen, Hou, Zhao, Wang, Nguyen, Murphy, Sullivan, McLeod & Che, Rhacophorus pinglongensis Mo, Chen, Liao &

Zhou, Amolops xinduquiao Fei, Ye, Wang & Jiang, Liuixalus feii Yang, Rao & Wang, Limnonectes longchuanensis Suwannapoom, Yuan, Sullivan & McLeod, Leptobrachella mangshanensis (Hou, Zhang, Hu, Li, Shi, Chen, Mo & Wang), Leptobrachella tengchongensis (Yang, Wang, Chen & Rao), Leptobrachella yingjiangensis (Yang, Zeng & Wang), L wuhuangmontis Wang, Yang & Wang, Amolops wenshanensis Yuan, Jin, Li, Stuart & Wu, Leptobrachella flaviglauulosa Chen, Wang & Che, L niveimontis Chen, Poyarkov, Yuan & Che, L shangsiensis Chen, Liao, Zhou & Mo, L shangsiensis Chen, Liao, Zhou & Mo,

Amolops mengdingensis Yu, Wu & Yang, Nidirana yaoica Lyu, Mo, Wan, Li, Pang

& Wang, Gracixalus tianlinensis Chen, Bei, Liao, Zhou & Mo, G yunnanensis Yu,

Li, Wang, Rao, Wu & Yang, Kurixalus yangi Yu, Hui, Rao & Yang, Nasutixalus yingjiangensis Yang & Chan, Raorchestes cangyuanensis Wu, Suwannapoom, Xu, Murphy & Chen, Zhangixalus pachyproctus Yu, Hui, Hou, Wu, Rao & Yang Ngoài

ra trong nghiên cứu của Li et al (2008, 2009) dựa vào kết quả phân tích phân tử đã

tu chỉnh phân loại một giống nhái cây như chuyển một số loài của các giống

Aquixalus và Philautus sang các giống Kurixalus và Gracixalus ([81], [82]).

Ở Lào: Stuart (1999) đã ghi nhận 58 loài ếch nhái và cho đến nay đã có khoảng

162 loài LC ([135], [61]) Trong đó có nhiều loài mới và ghi nhận mới được phát hiện

trong thời gian gần đây như Rhacophorus spelaeus Orlov, Gnophanxay, Phimminith

Phimmachak, Phoumixay & Stuart; Limnonectes coffeatus Phimmachak, Sivongxay, Seateun, Yodthong, Rujirawan, Neang, Aowphol & Stuart, L savan Phimmachak, Richards, Sivongxay, Seateun, Chuaynkern, Makchai, Som & Stuart, Sylvirana annamitica Sheridan và Stuart [61].

Ở Cam-pu-chia: Các nghiên cứu tại khu vực này còn rất hạn chế: Ohler et al.(2002) ghi nhận 34 loài ếch nhái ở vùng núi Cadamom phía Đông Nam, Cam-pu-chia [109], Grismer et al (2008) ghi nhận 41 loài ếch nhái ở vùng núi Cadamomphía Đông Nam, Cam-pu-chia [66] Stuart et al (2006) ghi nhận 30 loài ếch nhái ởkhu vực miền núi thuộc Đông Cam-pu-chia, giáp ranh với biên giới Việt Nam[136] Hartmann et al (2013) ghi nhận 22 loài ếch nhái ở khu vực Tây Bắc Cam-pu-chia [68] Cho đến thời điểm hiện tại, đã ghi nhận 79 loài LC ở nước này [61]

1.2 Tổng quan về nghiên cứu ếch nhái ở Việt Nam

1.2.1 Các nghiên cứu về khu hệ và phát hiện mới

Theo Nguyễn Văn Sáng và cộng sự (cs.) (2009), nghiên cứu về ếch nhái ở ViệtNam có lịch sử khá lâu đời nhưng bắt đầu phát triển mạnh vào các giai đoạn cuối thế kỷ

19, giữa và cuối thế kỷ 20 và đặc biệt là những năm đầu thế kỷ 21 [33] Có hàng loạtcông trình công bố về loài mới được công bố vào nửa đầu thế kỷ 20 nhưng đáng

chú ý có công trình của Bourret (1942) mang tựa đề Les Batraciens de l’Indochine.

Cuốn sách đã mô tả 171 loài và phân loài ếch nhái ở vùng Đông Dương (Việt Nam,Lào, Cam-pu-chia), đây có thể coi là tài liệu đầy đủ nhất về ếch nhái trong khu vựcvào những năm giữa thế kỷ XX [158]

Năm 1977, Đào Văn Tiến đã công bố khóa định loại 87 loài ếch nhái trong bài

báo “Về định loại ếch nhái Việt Nam” [37] Năm 1981, Trần Kiên và cs đã thống kê

thành phần loài động vật Miền Bắc Việt Nam (1955−1976) trong đó có 69 loài ếchnhái [22] Năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc xuất bản chuyên khảo

Danh lục bò sát và ếch nhái Việt Nam ghi nhận 82 loài ếch nhái [31] Nguyễn Văn Sáng và cs (2005) thống kê trong cuốn Danh lục ếch nhái và bò sát Việt Nam có

162 loài ếch nhái [32] Cuốn danh lục gần đây nhất của Nguyen et al (2009) ghinhận tổng số 171 loài ếch nhái ở Việt Nam [61]

Kể từ năm 2010 trở lại đây đã có 58 loài ếch nhái mới ghi nhận và mô tả vớimẫu chuẩn thu ở Việt Nam Các nhóm có nhiều loài mới được phát hiện ở Việt Namnhư: Họ Cá cóc Salamandridae (3 loài) họ Ếch giun Ichthyophidae (3 loài), họ Ếchnhái chính thức Dicroglossidae (4 loài), họ Ếch nhái Ranidae (8 loài), họ Nhái bầuMicrohylidae (14 loài) và họ Ếch cây Rhacophoridae (26 loài)

Phân vùng núi cao Tây Bắc: Ohler et al (2000) ghi nhận 42 loài ếch nhái ở

Vườn quốc gia (VQG) Hoàng Liên Sơn, tỉnh Lào Cai [108] Lê Nguyên Ngật và cs.(2011) ghi nhận 59 loài ếch nhái thuộc 9 họ, 3 bộ ở 4 tỉnh thuộc vùng Tây Bắc ViệtNam (Lai Châu, Điện Biên, Sơn La và Hòa Bình) [27] Luu et al (2014) ghi nhận 33loài ếch nhái ở Khu bảo tồn thiên nhiên (KBTTN) Thượng Tiến, tỉnh Hòa Bình [87].Hoàng Văn Chung và cs (2016) ghi nhận 30 loài thuộc 7 họ ở KBTTN Bát Xát, tỉnhLào Cai [10] Phạm Thế Cường và cs (2016) cung cấp danh sách thành phần loài LC

ở KBTTN Ngọc Sơn-Ngổ Luông, tỉnh Hòa Bình với 41 loài thuộc 7 họ [15] PhạmVăn Anh và cs (2016) ghi nhận 11 loài thuộc họ Dicroglossidae ở tỉnh Sơn La [3]

Phạm Văn Anh và cs (2017) ghi nhận 16 loài thuộc 12 giống, 6 họ, 1 bộ ở khu vựcđèo Pha Đin thuộc tỉnh Điện Biên, Sơn La [5] Nguyễn Quảng Trường và cs (2017)nghiên cứu thành phần LC ở khu vực Mường Bang, Phù Yên, tỉnh Sơn La ghi nhận

22 loài thuộc 15 giống, 6 họ, 1 bộ [41] nghiên cứu của Trần Văn Huy và các cs.(2018) đã ghi nhận 2 loài ếch suối mới nâng tổng số loài được ghi nhận cho tỉnh LaiChâu lên 24 loài [19] Trong nghiên cứu của Phạm Văn Nhã và các cs (2018) đãghi nhận 12 loài LC thuộc 8 giống, 5 họ và 1 bộ tại khu vực rừng Tông Lạnh, huyệnThuận Châu, tỉnh Sơn La [27] Phạm Văn Anh và Nguyễn Quảng Trường (2019) đãcông bố thành phần 14 loài LC thuộc 6 họ ở khu vực Rừng xã Pú Bẩu, huyện Sông

Mã, tỉnh Sơn La [6] Phạm Văn Anh và cs (2019) đã ghi nhận thành phần và đặcđiểm phân bố theo sinh cảnh của 36 loài LC ở khu vực xã Mường Do, huyện PhùYên, tỉnh Sơn La [2]

Phân vùng núi cao Đông Bắc: Bain và Nguyen (2004) đã thống kê được 36 loài

ếch nhái và mô tả hai loài mới Rana iriodes và Rana tabaca ở KBTTN Tây Côn Lĩnh,

tỉnh Hà Giang [44] Nguyễn Văn Sáng và cs (2009) điều tra đa dạng ếch nhái bò sát tạiVQG Xuân Sơn, tỉnh Phú Thọ đã ghi nhận 29 loài ếch nhái thuộc 8 họ, 3 bộ [33].Nguyễn Thiên Tạo (2009) điều tra ở khu vực rừng núi Pia Oắc, huyện Nguyên Bình,tỉnh Cao Bằng đã ghi nhận cho khu hệ 29 loài ếch nhái thuộc 7 họ, 3 bộ [35] Hecht et

al (2013) ghi nhận 36 loài ếch nhái ở KBTTN Tây Yên Tử, tỉnh Bắc Giang [69].Ziegler et al (2014) ghi nhận bổ sung 8 loài ếch nhái cho tỉnh Hà Giang nâng tổng sốloài được ghi nhận lên 50 loài [156] Ngô Thị Hạnh và cs (2016) ghi nhận 16 loài

thuộc giống Odorrana và quan hệ di truyền của chúng ở Miền Bắc Việt Nam [18].

Nghiên cứu của Hoàng Văn Ngọc và Phạm Văn Anh (2018) đã ghi nhận vùng phân bốmới của 3 loài LC cho tỉnh Thái Nguyên [29] Pham et al (2019) công bố vùng phân bố

mới 3 loài Odorrana mới ở tỉnh Tuyên Quang [116].

Phân vùng đồng bằng Bắc Bộ: Ziegler et al (2015) nghiên cứu khu hệ LC, bò

sát ở Trạm Đa dạng Sinh học Mê Linh đã ghi nhận 22 loài LC thuộc 7 họ, 2 bộ [155]

Lê Trung Dũng và cs (2016) công bố danh sách thành phần loài LC ở KBTTN Đấtngập nước Vân Long, tỉnh Ninh Bình với 17 loài thuộc 11 giống, 6 họ và 1 bộ [16]

Phân vùng núi cao Bắc Trường Sơn: Lê Vũ Khôi và cs (2011) đã thống kê

được 25 loài ếch nhái thuộc 7 họ, 1 bộ ở KBTTN Pù Huống, tỉnh Nghệ An [20] PhạmThế Cường và cs (2012) ghi nhận 36 loài ếch nhái ở KBTTN Xuân Liên, tỉnh Thanh

Hóa [13] Luu et al (2013) ghi nhận 50 loài ếch nhái ở VQG Phong Nha-Kẻ Bàng,tỉnh Quảng Bình [88] Đậu Quang Vinh và cs (2016) ghi nhận 6 loài thuộc 5 giốngếch cây ở KBTTN Pù Luông, tỉnh Thanh Hóa [42] Nguyen et al (2016) ghi nhận

16 loài ếch nhái tại KBTTN Bắc Hướng Hóa, tỉnh Quảng Trị [96] Ông Vĩnh An và

cs (2016) ghi nhận 9 loài thuộc 4 giống ếch cây ở KBTTN Pù Huống, tỉnh Nghệ An[1] Đỗ Văn Thoại và cs (2017) ghi nhận bổ sung 2 loài thuộc họ Megophridae ởtỉnh Nghệ An [38] Phạm Thế Cường và cs (2019) đã nghiên cứu ở khu vực Rừngphòng hộ Động Châu, tỉnh Quảng Bình ghi nhận 30 loài LC [14]

Phân vùng núi cao Trung Trường Sơn: Hoàng Xuân Quang và cs (2012) điều tra khu hệ ếch nhái, bò sát ở VQG Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên-Huế đã thống kê

được 44 loài ếch nhái thuộc 6 họ, 1 bộ [30] Hoàng Văn Chung và cs (2013) ghinhận 52 loài ếch nhái ở VQG Kon Ka Kinh, tỉnh Gia Lai [11] Dương Đức Lợi và

cs (2016) cung cấp danh sách 9 loài ếch nhái thuộc họ Ranidae ở tỉnh Bình Định[24] Nguyễn Thành Luân và cs (2016) ghi nhận bổ sung 5 loài Leptolalax choVQG Bạch Mã, tỉnh Thừa Thiên-Huế nâng tổng số loài ghi nhận được lên 51 loài[25] Gần đây nhất trong nghiên cứu của Do et al (2018) ghi nhận bổ sung 8 loàiếch nhái nâng tổng số loài ếch nhái của tỉnh Phú Yên lên 33 loài [52] Phạm HồngThái và cs (2019) đã cập nhập danh sách 19 loài LC nâng tổng số loài lên 52 thuộc

8 họ, 2 bộ ở KBTTN Bà Nà-Núi Chúa, tỉnh Đà Nẵng [36]

Phân vùng núi cao Nam Trường Sơn: Hồ Thu Cúc và Nguyễn Thiên Tạo

(2009) điều tra tại KBTTN Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai năm 2008−2009 và thống kêđược 31 loài ếch nhái thuộc 5 họ, 1 bộ [12] Nguyễn Thành Luân và cs (2017) bướcđầu công bố danh sách thành phần loài LC ở KBTTN Hòn Bà, tỉnh Khánh Hòa với

35 loài thuộc 6 họ, 12 giống [26] Cao Tiến Trung và cs (2019) ghi nhận 6 loàithuộc họ Ranidae ở KBTTN Núi Ông, tỉnh Bình Thuận [39]

Phân vùng đồng bằng sông Cửu Long: Goodall và Faithfull (2010) ghi nhận

8 loài ếch nhái ở VQG U Minh Thượng [65]

Phân vùng ven biển Miền Nam: Poyarkov (2011) đã thống kê được 11 loài

ếch nhái thuộc 6 họ, 2 bộ ở VQG Côn Đảo, tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu [120]

Các đảo trong vịnh Bắc Bộ: Gawor et al (2014) tiến hành khảo sát tại VQGBái Tử Long, tỉnh Quảng Ninh đã ghi nhận được 8 loài ếch nhái [62].

1.2.2 Các nghiên cứu tu chỉnh về phân loại học

Trong thời gian gần đây, nhiều nghiên cứu về phân loại học dựa trên kết quả

so sánh hình thái và sinh học phân tử đã góp phần hoàn thiện hơn hệ thống phân loạicủa nhiều nhóm LC

Năm 2008, Fei et al mô tả mới cho khoa học ở Trung Quốc hai loài:

Hylarana hekouensis và H menglaensis [59] Đến năm 2010, Fei et al tiếp tục thực hiện nghiên cứu và chuyển các loài này sang giống Sylvirana [58].

Inger et al (2010) ghi nhận loài Limnonectes hascheanus ở Việt Nam và được định loại lại là loài L limborgi [75] Matsui et al (2010) và McLeod (2010) phân tích mối quan hệ di truyền của giống Limnonectes ở Đài Loan, Lào, Ma-lai-xi-a, Nhật Bản, Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam và khẳng định loài Limnonectes kuhlii

không phân bố ở Lào và Việt Nam, ghi nhận trước đây của loài này ở khu vực Đông

Dương tạm thời được định danh là loài L bannaensis, một loài phân bố ở Nam

Trung Quốc ([93], [94])

Kurashi et al (2012) phân tích quan hệ di truyền của giống Polypedates và kết luận loài Polypedates leucomystax không có ở Việt Nam Hai loài nhái cây hiện ghi nhận ở Việt Nam là Polypedates mutus và P megacephalus [79].

Li et al (2012) dựa trên kết quả phân tích quan hệ di truyền nhóm loài

Rhacophorus dugritei và kết luận những ghi nhận về loài R dugritei ở phía Bắc Việt Nam và Nam Trung Quốc cũng như của loài Rhacophorus hungfuensis ở việt Nam thực chất là loài Rhacophorus puerensis [83].

Orlov et al (2012) đã đưa ra đánh giá về hiện trạng phân loại và phân bố của ếchcây thu được trong hệ thống núi bị cô lập ở phía Nam dãy Trường Sơn và khu vực phụ

cận Các tác giả này đã công bố 3 loài ếch cây mới là Theloderma chuyangsinensis, T bambusicola và Rhacophorus robertingeri (trước đây được định loại là R calcaneus) đồng thời chuyển loài Philautus laevis sang giống Theloderma [113].

Yu et al (2010, 2013) phân tích mối quan hệ di truyền của giống Kurixalus và Gracixalus ở một số nước Đông Nam Á trong đó có Việt Nam khẳng định loài Kurixalus verrucosus ghi nhận ở Tam Đảo là loài K bisacculus ([152], [153]).

Nguyen et al (2014) phân tích hình thái và sinh học phân tử đã ghi nhận hai

loài mới là Kurixalus motokawai và K viridescens, tuy nhiên tác giả vẫn gợi ý rằng

K motokawai, K viridescens nên được xếp vào nhóm K banaensis mặc dù sự phân

bố của 2 loài mới là rất hẹp [100].

Poyarkov et al (2015) phân tích quan hệ di truyền của giống Theloderma ở khu vực Đông Dương đã khẳng định loài T chuyangsinensis (Orlov et al 2012) là tên đồng vật của loài T palliatum (Rowley et al 2011), loài T stellatum trước đây ghi nhận ở Việt Nam được mô tả là một loài mới T vietnamensis, loài T asperum không phân bố ở Việt Nam, các quần thể ở Việt Nam được định loại lại là loài T albopunctatum, một loài phân bố ở Trung Quốc ([119], [113], [127]).

Yu et al (2017) so sánh hình thái và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các

loài trong nhóm K odontotarsus phức tạp và sắp xếp lại hệ thống phân loại của một

số loài như Kurixalus verrucosus từ Tây Tạng, Trung Quốc, có thể được chuyển sang loài Kurixalus naso Loài K hainanus trước đó được đa số các tác giả cho là loài đồng danh của K bisacculus thì nay được coi là loài chính thức khác biệt về

hình thái và di truyền [151]

Matsui et al (2018) phân tích về mối quan hệ của quần thể loài K appendiculatus dựa trên phân tích gen ty thể ở Ma-lai-xi-a, Borneo và Phi-lip-pin và khẳng định một quần thể ở bán đảo Ma-lai-xi-a là loài Kurixalus chaseni mà không phải K appendiculatus [92].

Chen et al (2018) phân tích quan hệ di truyền dựa trên đoạn DNA nhân của 2

giống Leptolalax và Leptobrachella kết quả cho thấy rằng giống Leptobrachella là một nhánh tiến hóa của giống Leptolalax chính vì vậy tất cả các loài Leptolalax trước đây được xếp vào giống Leptobrachella [47].

Ohler và Deuti (2018) đã phân tích hình thái của nhóm loài Polypedates smaragdinus và cho rằng nó là đồng danh của loài Rhacophorus maximus [107] Jiang

et al (2019) đã phân tích đoạn gen 1972 bp của 3 gen 12SrRNA, tRNA-val và

16sRNA ti thể đã phục hồi giống Leptomatis đồng thời mô tả một giống mới và chuyển loài Rhacophorus smaragdinus sang giống Zhangixalus [77] Yu et al (2019) đã phân tích hình thái và sinh học phân tử của nhóm loài Zhangixalus smaragdinus và chỉ ra rằng các loài trước đây phân bố ở Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan là một loài mới được đặt tên là loài Z pachyprotus còn loài Z smaragdinus chỉ phân bố ở My-an-ma, Ấn Độ và Tây Tạng [150].

1.2.3 Nghiên cứu về phân vùng địa lý động vật của khu hệ lưỡng cư bò sát ở Việt Nam

Trần Kiên và Hoàng Xuân Quang (1992) đã phân tích mối quan hệ địa lý độngvật giữa các vùng dựa trên các dẫn liệu về 363 loài LCBS của Việt Nam và phânchia thành 7 phân khu địa lý động vật bao gồm: Tây Bắc, Đông Bắc, Đồng BằngBắc Bộ-Thanh Nghệ Tĩnh, Bắc Trung Bộ, Trung Trung Bộ, Nam Trung Bộ vàĐồng Bằng Nam Bộ ([21])

Inger et al (1999) chia vùng Đông Dương thành 3 phân vùng địa lý động vật,theo đó thì Việt Nam cũng được tách ra thành 3 phân khu bao gồm vùng Đông Bắc,vùng cao nguyên Thái Lào và vùng đồng bằng châu Á [73]

Bain và Hurley (2011) dựa trên việc phân tích tổng hợp các yếu tố về địa chất,địa hình, khí hậu đã phân vùng Đông Dương thành 19 phân vùng địa lý động vật,theo đó phân vùng thì trên đất liền Việt Nam được phân chia thành 13 phân vùng,bao gồm: Phân vùng núi cao Đông Bắc, Phân vùng núi cao Tây Bắc, Phân vùng núicao Bắc Trường Sơn, Phân vùng núi cao Trung Trường Sơn, Phân vùng núi caoNam Trường Sơn, Phân vùng đồng bằng Bắc Bộ, Phân vùng đồng bằng Nam Trung

Bộ, Phân vùng đồng bằng sông Mêkông, Phân vùng ven biển Miền Bắc, Phân vùngven biển Miền Trung, Phân vùng ven biển Miền Nam, các đảo trong vịnh Bắc Bộ,các đảo dọc ven biển miền Nam [43]

Khu vực Tây Bắc có địa hình phức tạp do đó có sự đa dạng cao về sinh cảnh tựnhiên và tiềm năng ĐDSH, đặc biệt là dãy núi Hoàng Liên, được coi là phần mở rộngcủa dãy Hi-ma-lay-a về phía nam [134] Các loài LC ở đây có sự đa dạng di truyền cao

do sự đa dạng về yếu tố địa lý như khí hậu, độ cao [60] Điều này được thể hiện ở số

loài LC đặc hữu và số loài được ghi nhận: 24 loài đặc hữu trong tổng số 101 loài

LC Trong khi đó vùng núi cao Đông Bắc có 16 trong tổng số 69 loài là đặc hữu, vàvùng núi thấp Đông Bắc có 5 trong tổng số 44 loài được ghi nhận [43]

Trong khi ở phía bắc, sông Hồng được xem là ranh giới tự nhiên để phân chiavùng địa lý động vật thì ở phía nam, Bain và Hurley (2011) cho rằng chưa có đủdẫn liệu về thành phần loài để chứng minh sông Mêkông đóng vai trò như là ranhgiới cách ly địa lý giữa các vùng.Vào thời điểm đó, Bain và Hurley (2011) chỉ ghinhận 1 loài đặc hữu trong tổng số 21 loài LC được ghi nhận ở khu vực này [43].Geissler et al (2015) nghiên cứu về sự phân bố của các loài LC ở 2 phía sôngMêkông nhận thấy rằng có sự khác biệt về thành phần loài LC ở vùng núi Cadamomcủa Cam-pu-chia và vùng núi phía Nam Trường Sơn của Việt Nam, chứng tỏ ởvùng hạ lưu sông Mê Kông thì sông này chính là ranh giới cách ly trong quá trìnhtiến hóa của các loài LC [63]

Hình 1.1 Phân vùng địa lý lưỡng cư, bò sát khu vực Đông Dương [43]

1.3 Các nghiên cứu về họ Megophryidae và giống Megophrys ở Việt Nam

1.3.1 Nghiên cứu về họ Megophryidae

Họ Megophryidae hiện biết 255 loài trên thế giới và ở Việt Nam đã ghi nhậnphân bố của 61 loài thuộc họ này [61] Kể từ năm 2010 trở lại đây đã có 15 loài mới

cho khoa học được ghi nhận và mô tả bao gồm: Leptobrachella crocea [125]; Leptobrachella bidoupensis [128]; Leptobrachium leucops [138]; Leptobrachella firthi [126]; Leptobrachella botsfordi [124]; Oreolalax sterlingae [98]; Leptobrachella isos [129]; Leptobrachella ardens, L kalonensis, L maculosa, L pallida và L tadungensis [130]; Leptobrachella petrops [123]; Leptobrachella puhoatensis [122]; Leptopbrachella rowleyae [97] Có 10 loài mới ghi nhận phân

bố cho Việt Nam gồm: Leptobrachium xanthops [137]; Leptobrachium guangxiense [48]; Leptobrachella eos [115]; Leptobrachella applebyi [130]; Leptobrachella aerea, L melica, L minima và L nyx [47]; Leptobracella macrops [54]; Leptobrachella namdongensis [70].

1.3.2 Nghiên cứu về giống Megophrys

Giống Megophrys Kuhl & Van Hasselt, 1822 phân bố chủ yếu ở khu vực

Đông Nam Á, về phía nam Trung Quốc tới Phi-lip-pin [61] Trên thế giới hiện biết

97 loài Theo Nguyen et al (2009), ở Việt Nam giống Megophrys ghi nhận 14 loài

và cho đến nay đã ghi nhận 22 loài ([105], [61])

Dubois và Ohler (1998) giống Megophrys gồm 4 phân giống: Megophrys, Xenophrys, Brachytarsophrys và Atympanophrys Nghiên cứu về phân loại giữa 2 giống Xenophrys và Megophrys còn chưa thực sự rõ ràng [53] Pyron và Wiens (2011) khi nghiên cứu về trình tự di truyền giữa các loài trong giống Xenophrys cho thấy, loài Xenophrys baluensis có đặc điểm gần với giống Megophrys hơn là với các loài thuộc giống Xenophrys [121].

Theo Chen et al (2016) chia giống Megophrys thành 5 phân giống: Atympanophrys, Brachytarsophrys, Megophrys, Ophryophryne, Xenophrys Ophryophryne và Brachytarsophrys có sự phân bố chồng chéo ở Đông Dương và Nam Trung Quốc Xenophrys phân bố rộng khắp Nam Trung Quốc, Đông Nam Châu

po, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a và Phi-lip-pin [89].

Fei et al (1983) cho rằng loài M jingdongensis là một phân loài của M.

omeimontis [56] Fei et al (1990) đã nâng cấp phân loài này thành loài riêng biệt M.

jingdongensis [57].

Trước đây loài M major được xem là loài đồng danh với loài Leptolalax lateralis Humtsoe et al (2008) đã tách loài Leptolalax lateralis thành loài riêng biệt [72] Trong nghiên cứu của Bourret (1937) đã mô tả 1 loài thuộc phân loài M longipes và đặt tên là M longipes maosonensis [157] Ohler (2003) đã phân tích lại mẫu vật và cho rằng phân loài

mà Bourret đã mô tả trước đây được chuyển thành loài M major [106].

Le et al (2015) đã ghi nhận bổ sung loài M daweimontis cho khu hệ LC của

Việt Nam dựa trên các mẫu vật thu thập tại Điện Biên và Sơn La [80]

Orlov et al (2015) đã mô tả 1 loài mới cho khoa học, M latidactyla với mẫu

chuẩn được thu tại KBTTN Pù Mát, tỉnh Nghệ An Mẫu vật này có đặc điểm hình

thái gần giống nhất với loài M papebralespinosa Nhiều nghiên cứu trước đây đã có

sự nhầm lẫn giữa các loài này nhưng khi phân tích về đặc điểm hình thái chúng có

sự sai khác, riềm da ở bàn chân của loài M latidactyla lớn hơn so với loài M papebralespinosa [112].

Stuart et al (2006) đã ghi nhận các loài LC và bò sát tại Cam-pu-chia trong đó

đã ghi nhận loài mới O synoria với mẫu chuẩn thu tại khu bảo tồn ĐDSH Seima

[136] Trong nghiên cứu của Mahony et al (2017) và Poyarkov et al (2017) đã ghinhận phân bố mới của loài này tại VQG Bù Gia Mập (Bình Phước), VQG Cát Tiên(Đồng Nai) và VQG Bidoup-Núi Bà (Lâm Đồng) ([89], [118])

Poyarkov et al (2017) đã công bố loài mới cho khoa học, M elfina, với mẫu

chuẩn thu tại VQG Chư Yang Sin, tỉnh Đắk Lắk Mẫu vật này trước đây bị nhầm

lẫn với loài M gerti nhưng có sự khác biệt với loài M gerti bởi kích thước nhỏ hơn

ở con đực SVL 26,9−33,9 mm so với SVL 31,7−42,2 mm ở loài M gerti Con đực của loài M elfina có chai sinh dục màu đỏ tươi hoặc cam đỏ so với màu nâu vàng hoặc nâu đen ở loài M gerti [118].

Về quan hệ di truyền, các nghiên cứu về các loài thuộc giống Megophrys còn rất

hạn chế Một số công trình công bố có liên quan như Stuart et al (2006) [136], Li et al.(2014) [84], Wang et al (2012, 2014) ([144], [146]), Wang et al (2019) [143] và Wu et

al (2019) [147] đã phân tích mối quan hệ di truyền của một số loài của giống

Megophrys ở Thái Lan và một số tỉnh thuộc Trung Quốc đồng thời ghi nhận các loài mới như M lekaguli, M acuta, M obesa, M cheni, M lini, M jinggangensis,

M. dongguanensis, M nankunensis, M jiulianensis, M nanlingensis, M wugongensis, M mufumontana và M angka Các nghiên cứu đều dựa trên so sánh trình

tự của đoạn gen ty thể 16S rRNA và COI Nghiên cứu của Mahony et al (2018) về sinh

học phân tử của các quần thể loài M major đã chỉ ra rằng các mẫu vật ở Việt Nam được định loại lại là M maosonensis, loài M major chỉ phân bố ở khu vực Đông Bắc Ấn Độ

Trước đây loài M koui được coi là tên đồng danh của M pachyproctus Qua so

sánh các mẫu vật thu ở Vân Nam (Trung Quốc), Việt Nam và Lào các nhà nghiên cứu

đã kết luận M koui và M pachyproctus là hai loài khác biệt (Yang 1991, Inger et al.

1999, Orlov et al 2002) Loài M koui chỉ phân bố ở Vân Nam, Tây Nam Trung Quốc

và hai tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh của Việt Nam Loài M pachyproctus phân bố ở phía

Tây Nam Tây Tạng, Trung Quốc và Tây Bắc của Việt Nam ([148], [73], [111])

Loài M rubrimera được thu trên núi Phan-xi-pang, VQG Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai bị nhầm lẫn với loài M kuatunensis và được Orlov et al (2012) ghi nhận

phân bố Việt Nam [113] Trong nghiên cứu của Tapley et al (2017) về các mẫu vật

của nhóm loài M cf kuatunensis thu tại Lào Cai, dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích đoạn gen 16S rDNA cho thấy quần thể loài M kuatunensis được Orlov ghi nhận trước đây là một loài mới và đặt tên là loài M rubrimera Loài này phân

bố tại tỉnh Lào Cai, Việt Nam và phía Nam Trung Quốc Nghiên cứu này cũng ghi

nhận loài M kuatunensis chỉ phân bố hẹp ở phía Đông Trung Quốc [139].

Những dẫn liệu về sinh học phân tử của giống Megophrys ở Việt Nam còn rất

hạn chế, những loài mới ghi nhận dựa trên kết quả sinh học phân tử được tách từ cácnhóm loài phức tạp Đồng thời sự đa dạng và vị trí phân loại của một số loài trong

giống Megophrys ở Việt Nam vẫn có nhiều vấn đề chưa rõ ràng và cần tiếp tục được

nghiên cứu

CHƯƠNG 2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Khảo sát thực địa được thực hiện ở 16 tỉnh thuộc 5 phân

vùng địa lý khác nhau ở Việt Nam Đồng thời, NCS đã phân tích mẫu vật thu thập ở

23 tỉnh đang được lưu trữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng Thiênnhiên Việt Nam, Bảo tàng Sinh vật thuộc Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Phân vùng núi cao Đông Bắc: Hà Giang, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc.Phân vùng núi cao Tây Bắc: Lào Cai

Phân vùng đồng bằng Bắc Bộ: Thái Nguyên, Ninh Bình, Hải Dương

Phân vùng núi cao Trung Trường Sơn: Thành phố Đà Nẵng, Kon Tum, Gia Lai.Phân vùng núi cao Nam Trường Sơn: Đắk Lắk, Đắk Nông, Lâm Đồng, BìnhPhước, Ninh Thuận

Các điểm khảo sát được trình bày cụ thể ở Hình 2.1

Thời gian nghiên cứu: khảo sát thực địa được tiến hành từ tháng 03 năm 2016

đến tháng 10 năm 2019 với 29 đợt khảo sát và 220 ngày thực địa (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Số ngày Số điểm Số lượt

KBTTN Thần Sa−Phượng 9−16/4/2019 11 11 3Hoàng, Thái Nguyên

Di sản thiên nhiên Tràng An, 3−11/6/2019 9 11 4Ninh Bình

Nẵng

VQG Bù Gia Mập, Bình Phước 16/4−2/5/2017 17 17 3KBTTN Nam Nung, Đắk Nông 21−30/10/2017 10 10 2VQG Phước Bình, Ninh Thuận 25−30/4/2018 6 6 4

VQG Bidoup-Núi Bà, Lâm 3−19/5/2018 17 17 5Đồng

KBTTN Kon Chư Răng, Gia 12−21/11/2018 10 10 3

Lai

Hình 2.1 Địa điểm thu thập mẫu vật các loài ếch thuộc giống Megophrys ở Việt Nam

2.2 Cách tiếp cận

Sử dụng phương pháp tiếp cận dựa trên phân tích đặc điểm hinh thái và di

truyền Các loài ếch nhái thuộc giống Megophrys được nghiên cứu ở các cấp độ

khác nhau

- Ở cấp độ hệ sinh thái, nghiên cứu tập trung về đặc điểm phân bố của các loàitheo dạng sinh cảnh, đai độ cao và nơi sống (chủ yếu là nơi ghi nhận mẫu vật) và một sốthông số về khí hậu (nhiệt độ không khí, độ ẩm)

- Ở cấp độ loài, nghiên cứu so sánh sai khác về đặc điểm hình thái giữa các loài và giữa các quần thể của cùng một loài ở các khu vực địa lý khác nhau

- Ở cấp độ phân tử, nghiên cứu so sánh sự sai khác và đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các loài và giữa các quần thể dựa trên phân tích trình tự gen ty thể

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát thực địa

* Chuẩn bị dụng cụ đi thực địa: Bản đồ, GPS, túi ni-lông, cồn, xi lanh, khay,

bút kim, giấy can, bộ đồ mổ, lọ đựng mẫu vật, sổ ghi nhật ký, máy ảnh, đèn pin (cỡ lớn,

cỡ nhỏ)

* Chọn địa điểm thu mẫu: Thường tập trung ven các suối nhỏ, vũng nước, ao

nhỏ, vùng đầm lầy, hang hốc, nơi phủ nhiều lá mục ven các đường mòn trong rừng Tọa

độ các điểm nghiên cứu được xác định bằng máy định vị vệ tinh GPS Garmin

60CX

* Thời gian thu mẫu: Các loài LC thường hoạt động vào ban đêm, do đó thường

tiến hành thu mẫu vào khoảng 18h00−24h00 Ngoài ra, có một số loài hoạt động vào

ban ngày nên cũng tiến hành thu thập mẫu vật vào ban ngày từ 9h00−14h00

* Thu thập số liệu về đặc điểm sinh thái: Thông tin về sinh cảnh sống, nơi thu

mẫu và điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm được ghi bằng máy nhiệt kế TFA, Đức)cũng sẽ được ghi nhận tại địa điểm thu mẫu để phục vụ việc phân tích đặc điểm phân bốcủa từng loài

* Phương pháp thu mẫu: Chủ yếu thu thập bằng tay.

* Xử lý mẫu vật: Mẫu LC được thu để trong túi ni-lông Sau khi chụp ảnh một

số mẫu được trả về tự nhiên Mẫu vật đại diện cho các loài được giữ lại làm tiêu bảnnghiên cứu

- Gây mê: Mẫu vật được gây mê bằng miếng bông thấm etyl acetate để trong lọ kín

[132] Mẫu cơ hay mẫu gan được thu thập ngay sau khi gây mê để phân tích DNA, mẫu được lưu trữ trong cồn 95% và bảo quản trong tủ lạnh

- Cố định mẫu: Việc cố định mẫu cần đảm bảo mẫu được định hình ở hình thái dễ

quan sát Sắp xếp mẫu vật theo hình dạng mong muốn, sau đó phủ giấy mỏng thấm cồn ướtlên toàn khay cố định mẫu Mẫu được ngâm trong cồn 80% trong vòng 4−8

giờ tùy kích cỡ mẫu vật Đối với LC cỡ lớn cần tiêm cồn 70% vào bụng và cơ của con vật để tránh thối hỏng mẫu

- Ký hiệu mẫu: Mỗi mẫu được đeo một nhãn kí hiệu Nhãn và chỉ buộc không

thấm nước, chữ viết trên nhãn không bị tan trong cồn Nhãn được buộc quanh khớp giữaxương đùi và ống chân

- Bảo quản mẫu vật: Mẫu vật được ngâm cồn 70% để bảo quản lâu dài Các

bình đựng mẫu phải có nắp kín để tránh bay hơi cồn và làm khô mẫu Mẫu vật phải đượcbảo quản trong phòng đủ điều kiện (nhiệt độ và độ ẩm thấp, tránh ánh sáng trực tiếp củamặt trời, có khay và giá đựng)

2.3.2 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

* Phân tích đặc điểm hình thái

Các chỉ tiêu về kích thước được đo bằng thước kẹp đồng hồ Mitutoyo với độchính xác 0,1 mm theo tài liệu của Ohler et al (2011) (Bảng 2.2 và Hình 2.2) [110]

Bảng 2.2 Các chỉ số đo hình thái của lưỡng cư (Đơn vị: mm)

MN Khoảng cách sau hàm-mũi Từ gốc hàm đến lỗ mũi

MFE Khoảng cách sau hàm-góc trước ổ mắt Từ gốc hàm đến góc trước ổ mắtMBE Khoảng cách sau hàm-góc sau ổ mắt Từ gốc hàm đến góc sau ổ mắt

DAE Khoảng cách giữa góc trước ổ mắt Khoảng cách giữa hai góc trước ổ

mắtDPE Khoảng cách giữa góc sau ổ mắt Khoảng cách giữa hai góc sau ổ mắt

IN Khoảng cách gian mũi Khoảng cách giữa hai lỗ mũi

EN Khoảng cách góc trước ổ mắt-lỗ mũi Từ góc trước ổ mắt đến lỗ mũi

TYD Đường kính màng nhĩ Phần rộng nhất của màng nhĩ

TYE Khoảng cách góc sau ổ mắt-rìa trước Từ góc sau ổ mắt đến màng nhĩ

màng nhĩ

NS Khoảng cách lỗ mũi-mút mõm Từ mút mõm đến lỗ mũi

trước ổ mắtIOD Khoảng cách nhỏ nhất gian ổ mắt Khoảng cách ngắn nhất giữa hai ổ mắtUEW Chiều rộng mí mắt trên Chiều rộng nhất của mí mắt trên

HAL Chiều dài bàn tay Từ khuỷu tay đến mút ngón tay III

F-III Chiều dài ngón tay III Từ củ bản trong đến mút ngón tay IIIIPT Chiều dài củ bàn trong ở tay Chiều dài nhất của củ bàn trong ở tay

TW Chiều rộng ống chân Chiều rộng nhất của ống chân

T-I Chiều dài ngón chân I Từ cử bàn trong đến mút ngón chân IT-IV Chiều dài ngón chân IV Từ cử bàn trong đến mút ngón chân VIIMT Chiều dài củ bàn trong ở chân Chiều dài nhất của củ bàn trong ở chân

Hình 2.2.Chỉ số đo hình thái LC của loài trong giống Megophrys

(Chỉ số đo được xây dựng trên mẫu vật của loài Megophrys maosonensis)

Bảng 2.3 Màng bơi của một số loài LC được mô tả theo Glaw và Vences (2007) [64]

màng bơi:

màng bơi hoàntoàn 4i(0)

Các ngón tay và ngón chân đượcđánh số thứ tự từ trong ra ngoài Mỗingón chân hoặc ngón tay lại được đánh

số thứ tự các đốt không có màng từngoài vào trong (trong ngoặc đơn), từcác đầu mút mỗi ngón tay hoặc ngónchân

“i” có nghĩa là phía bên trong, “e”

có nghĩa là bên ngoài của một ngón tayhoặc ngón chân Vì vậy, “4i” có nghĩa

là “ở phía bên trong của ngón chân thứ

tư có một đốt không có màng bơi”

“4i(0)”: ở phía bên trong của ngónchân thứ 4, các đốt đều có màng bơi

“4i(1)”: ở phía bên trong của ngónchân thứ 4 có một đốt không có màngbơi

“4i(2)”: ở phía bên trong của ngónchân thứ 4 có hai đốt không có màng bơi

“4i(3)”: ở phía bên trong của ngónchân thứ 4 có ba đốt không có màng bơi

Ngoài ra có một số đặc điểm hình thái đặc trưng cho giống Megophrys như:

Gai trên mí mắt, nếp gờ da trên lưng, các nốt sần

* Định loại

So sánh hình thái của mẫu vật thu được với các mẫu đã được định tên đang lưugiữ ở Bảo tàng Sinh vật (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội), Viện Sinh thái và Tàinguyên sinh vật, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Định loại các loài LC theo tài liệucủa Boulenger (1908) [46], Smith (1921) [133], Bourret (1942) [158], Liu (1950)[85], Inger et al (1999) [73], Taylor (1962) [140], Ohler (2003) [106], Fei et al.(2009, 2010) ([55], [58]), Hecht et al (2013) [69], Pham et al (2014) [115], Orlov

et al (2015) [112], Tapley et al (2017) ([139]) và theo các tài liệu cập nhật

Danh lục, tên khoa học và tên phổ thông các loài theo tài liệu của Nguyen et

al (2009), Frost (2020) ([105], [61])

2.4 Phân tích sinh học phân tử

Phân tích sinh học phân tử được thực hiện tại Phòng Bảo tồn thiên nhiên, Bảotàng Thiên nhiên Việt Nam với sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Thiên Tạo và hỗtrợ kỹ thuật của ThS Ngô Thị Hạnh, NCS Ninh Thị Hòa và NCS Hoàng Văn Chung.Mẫu cơ hoặc gan của các loài ếch nhái được thu thập và bảo quản trong cồn 70% ở

−20oC Các mẫu được tách chiết DNA tổng số sử dụng bộ kit Dneasy Blood & Tissue(Qiagen, CHLB Đức) Quy trình tách chiết được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sảnxuất Phản ứng PCR được tiến hành sử dụng HotStar Taq (Qiagen, CHLB Đức) với nhữngmẫu có nồng độ DNA thấp và DreamTaq Mastermix (ThermoFisher Scienctific, Hoa Kỳ)với những mẫu có nồng độ DNA cao Đoạn gen 16S được lựa chọn để khuếch đại Mồi sửdụng cho nghiên cứu này được tổng hợp từ các nghiên cứu trước đây như Palumbi et al.(1991), Simon (1994), Nguyen et al (2014) ([114], [131], [101])

Bảng 2.4 Các mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống Megophrys

LR-N-13398 5'-CGC CTG TTT ACC AAA AAC AT-3' [131]

Tổng thể tích mỗi phản ứng PCR là 20 µl, bao gồm 10 µl mastermix, 7 µl nước,0,5 µl mỗi chiều mồi, 2 µl DNA khuôn Điều kiện phản ứng PCR: 950C ở 5’ đối vớiDreamTaq mastermix và 15’ đối với HotStarTaq mastermix; 40 chu kỳ phản ứng ở

95oC trong 30s, 56,5oC trong 30s, 72 oC trong 1 phút; bước kéo dài cuối cùng ở 72oCtrong 7 phút và gửi tinh sạch và giải trình tự hai chiều ở FirstBase (Ma-lai-xi-a) Kếtquả giải trình tự cuối cùng được xác thực bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng gen.Các trình tự thu nhận được từ nghiên cứu này cùng với các trình tự sẵn có trênNgân hàng gen (Genbank) được gióng cột bằng phần mềm ClustalX với các lựa chọnmặc định cho chức năng sắp xếp hoàn chỉnh Cây quan hệ di truyền được xây dựng dựatrên phương pháp Bayesian sử dụng phần mềm Bayesian Với phân tích Bayesian, môhình tiến hóa tối ưu được xác định bằng phần mềm Modeltest v3.7 với các thông sốkhác được phần mềm Bayesian xác định Các phân tích được thực hiện dựa trên câyngẫu nhiên lúc ban đầu và chạy trong 1×107 thế hệ, lấy mẫu sau 1000 thế hệ Giá trịcủa gốc nhánh được coi là đáng tin cậy khi xác suất hậu nghiệm ≥ 95% Các loài nhómngoài được lựa chọn tùy theo đối tượng và mục đích nghiên cứu Việc ước tính khoảngcách di truyền giữa các mẫu được thực hiện trên phần mềm PAUP v4.0b10

2.5 Phân tích đặc điểm phân bố của các loài trong giống Megophrys

Phân bố theo sinh cảnh: Để đánh giá sự thay đổi về thành phần loài ở các dạng

sinh cảnh khác nhau, trong nghiên cứu này phân bố của các loài theo sinh cảnh đượcphân tích và thảo luận căn cứ vào sự phân chia thảm thực vật của UNESCO (1973) vàmức độ tác động của con người đến sinh cảnh tự nhiên theo tài liệu theo Lê NguyênNgật trong “Sổ tay hướng dẫn điều tra và giám sát ĐDSH” (2003) ([142], [17]) Mức

độ tác động của con người đến sinh cảnh sống của các loài ếch nhái dựa trên quan sát