Ứng dụng viễn thám GIS và học sâu trên nền dữ liệu mở để thành lập bản đồ trượt lở đất đối với vùng đồi núi rộng lớn ở việt nam

Để kiểm soát chất lượng thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, việc phát triển một phương pháp phân tích phù hợp để xác định các chất trộn trái p

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DƯƠNG THỊ MAI HOA

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI SIBUTRAMINE

VÀ MỘT SỐ DẪN XUẤT TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE HỖ TRỢ GIẢM CÂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DƯƠNG THỊ MAI HOA

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI SIBUTRAMINE VÀ MỘT

SỐ DẪN XUẤT TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ

SỨC KHỎE HỖ TRỢ GIẢM CÂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 8440112.03

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo

PGS TS Phạm Thị Ngọc Mai

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Đề tài được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực

phẩm quốc gia, 65 Phạm Thận Duật, Phường Mai Dịch, Quận Cầu Giấy, Thành phố

Hà Nội

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn PGS.TS Lê Thị

Hồng Hảo, PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ

em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích, trường Đại

học Khoa học tự nhiên đã nhiệt tình dạy dỗ, cung cấp cho em những kiến thức quan

trọng, cần thiết và bổ ích

Đồng thời, em xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh

thực phẩm quốc gia, ThS Cao Công Khánh, phụ trách khoa Nghiên cứu phát triển, các

đồng nghiệp trong Viện đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình và người thân đã luôn

quan tâm, động viên em trong suốt thời gian qua

Trong quá trình thực hiện đề tài, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực

tế còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự

góp ý của quý thầy cô và các bạn đồng nghiệp

Xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine 3

1.1.1 Sibutramine 3

1.1.2 N-desmethyl sibutramine và N-didesmethyl sibutramine 5

1.2 Tình trạng thừa cân, béo phì và một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì 6

1.2.1 Tình trạng thừa cân, béo phì 6

1.2.2 Một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì 7

1.3 Phương pháp xác định SB, DSB và DDSB 9

1.3.1 Một số kỹ thuật xử lý mẫu 9

1.3.2 Phương pháp phân tích 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.2.1 Khảo sát các điều kiện LC-MS/MS 22

2.2.2 Khảo sát dung môi chiết, điều kiện chiết và quy trình làm sạch mẫu 22

2.2.3 Xác nhận giá trị sử dụng 23

2.2.4 Xác định hàm lượng sibutramine, desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong mẫu thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cân có mặt trên thị trường 23

2.3 Thiết bị phân tích 23

2.4 Dụng cụ phân tích 24

2.5 Dung môi, hóa chất 24

2.5.1 Dung môi 24

2.5.2 Chất chuẩn 24

2.5.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 24

2.6 Phương pháp nghiên cứu 25

2.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 25

2.6.2 Phương pháp xử lý mẫu 27

2.6.3 Phương pháp thẩm định 29

2.6.4 Phương pháp lấy mẫu 30

2.6.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Kết quả khảo sát điều kiện LC-MS/MS xác định đồng thời SB, DSB và DDSB trong TPBVSK hỗ trợ giảm cân 31

3.1.1 Điều kiện MS/MS 31

3.1.2 Khảo sát điều kiện LC 32

3.2 Khảo sát quá trình chuẩn bị mẫu 36

3.2.1 Khảo sát dung môi chiết 36

3.2.2 Khảo sát thời gian siêu âm và số lần chiết 36

3.2.3 Khảo sát quy trình làm sạch mẫu 40

3.2.4 Khảo sát khối lượng than hoạt tính 42

3.3 Thẩm định phương pháp 45

3.3.1 Độ đặc hiệu 45

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 47

3.3.3 Xây dựng đường chuẩn 49

3.3.4 Độ lặp lại và độ thu hồi 51

3.4 Phân tích mẫu thực tế 52

KẾT LUẬN 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các điều kiện MS/MS để phân tích SB, DSB và DDSBPhụ lục 2 Các thông số tối ƣu của MS để phân tích SB, DSB và DDSBPhụ lục 3 Kết quả khảo sát số lần chiết

Phụ lục 4 Danh sách các mẫu TPBVSK hỗ trợ giảm cân đƣợc

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt,

KH2PO4 Potassium dihydrophotphate Kali dihydro phốt phát

HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPTLC-

UV High performance thin layer chromatography

Sắc ký lỏng khối phổ ion hóa phun điện tử LC-MS

hay

HPLC

MS

Liquid chromatography-mass spectrometry or

High performance liquid chromatography

mass spectrometry

Sắc ký lỏng khối phổ hay sắc ký lỏng hiệu năng cao khối phổ

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SPE - Solid phase extraction – hydrophilic lipophilic Chiết pha rắn – cột HLB

chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu

năng

TEM

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine 3

Bảng 1.2 Tổng hợp kết quả một số kỹ thuật xử lý mẫu 12

Bảng 2.1 Quy trình làm sạch mẫu 28

Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích SB, DSB, DDSB 31

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS để phân tích SB, DSB và DDSB 32

Bảng 3.3 Chương trình gradient dung môi phân tích SB, DSB, DDSB 33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pha động đến diện tích píc các chất phân tích 34

Bảng 3.5 Chương trình dung môi tối ưu 34

Bảng 3.6 Kết quả hiệu suất thu hồi (H%) của SB, DSB và DDSB 36

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi SB, DSB và DSB sau khi làm sạch 41

Bảng 3.8 Ảnh hưởng lượng GCB đến hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB 42

Bảng 3.9 Tỷ lệ ion và sai số cho phép 45

Bảng 3.10 Khoảng đường chuẩn và độ chệch 50

Bảng 3.11 Độ lặp lại (RSD%) và độ thu hồi (R%) của SB, DSB và DDSB trên các nền mẫu 51

Bảng 3.12 Kết quả định lượng SB, DSB và DDSB một số mẫu TPBVSK 54

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của sibutramine 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo N- desmethyl sibutramine 5

Hình 1.3 Công thức cấu tạo N-didesmethyl sibutramine 5

Hình 2.1 Thiết bị LC-MS/MS 5500QQQ được lựa chọn sử dụng 26

Hình 3.1 Sắc ký đồ của SB (3.1a), DSB (3.1b) và DDSB (3.1c) sau khi tối ưu hóa chương trình dung môi pha động 35

Hình 3.2 Kết quả hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB trên nền viên nang cứng 37

Hình 3.3 Kết quả hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB trên nền viên nang mềm 37

Hình 3.4 Kết quả hiệu suất thu hồi SB, DSB, DDSB trên nền trà túi lọc 38

Hình 3.5 Hiệu suất thu hồi của SB, DSB, DDSB sau 1 lần chiết, 2 lần chiết, 3 lần chiết / nền viên nang cứng 39

Hình 3.6 Hiệu suất thu hồi của SB, DSB, DDSB sau 1 lần chiết, 2 lần chiết, 3 lần chiết / nền viên nang mềm 39

Hình 3.7 Hiệu suất thu hồi của SB, DSB, DDSB sau 1 lần chiết, 2 lần chiết, 3 lần chiết / nền trà túi lọc 40

Hình 3.8 Dung dịch mẫu trước và sau khi sử dụng làm sạch bằng GCB 42

Hình 3.9 Quy trình tối ưu xác định SB, DSB và DDSB trong mẫu 44

Hình 3.10 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn SB 46

Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn DSB 46

Hình 3.12 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn DDSB 47

Hình 3.13 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn SB (0,05 µg/kg) trên nền mẫu nang mềm 48

Hình 3.14 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn DSB (0,1 µg/kg) trên nền mẫu nang mềm 48

Hình 3.15 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn DDSB (0,1 µg/kg) 48

Hình 3.16 Đường chuẩn SB 49

Hình 3.17 Đường chuẩn DSB 50

Hình 3.18 Đường chuẩn DDSB 50

Hình 3.19 Sắc đồ các mẫu có chứa sibutramine 52

Hình 3.20 Sắc đồ các mẫu chứa desmethyl sibutramine 53

Để kiểm soát chất lượng thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng, việc phát triển một phương pháp phân tích phù hợp để xác định các chất trộn trái phép này có vai trò rất quan trọng Xác định SB

và các chất chuyển hóa của SB đã có một số phương pháp phân tích được sử dụng

đó là phương pháp HPLC, LC-MS [23, 33, 36], GC, v v Những phương pháp này

đã xác định được SB, DSB trong nền mẫu thảo dược, mẫu huyết tương [3, 31], mẫu nước tiểu [17] Năm 2007, Zou et al đã xây dựng phương pháp LC ghép nối khối phổ (MS) 3 tứ cực, nhưng phương pháp chỉ thành công ở bước nhận dạng SB, chất chuyển hóa của SB và một chất tương tự SB trong mẫu thảo dược hỗ trợ giảm cân, không phải là phương pháp định lượng [44] Năm 2008, ZiqiangHuang đã xây dựng

thành công phương pháp phân tích đồng thời SB và N-didesmethyl sibutramine trong thực phẩm bổ sung Phương pháp có độ nhạy, độ chính xác và quá trình chuẩn

bị mẫu đơn giản [16] Trong đề tài này, dựa trên nghiên cứu của ZiqiangHuang, nhóm nghiên cứu tiếp tục phát triển phương pháp định lượng N-didesmethyl sibutramine, một chất tương tự SB và DSB, có thể được trộn trái phép trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp LC-MS/MS, đồng thời cũng tìm phương pháp làm sạch mẫu phù hợp để loại tạp màu tăng hiệu suất thu hồi các chất phân tích

Do đó, đề tài ―Xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất trong thực

phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp LC-MS/MS‖ đã được

thực hiện với các mục tiêu như sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời sibutramine desmethyl sibutramine và didesmethyl sibutramine trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng LC-MS/MS

2 Ứng dụng phương pháp để phát hiện và định lượng SB và một số dẫn xuất của SB trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân trên địa bàn thành phố Hà Nội

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine

Công thức phân tử, khối lượng phân tử của sibutramine và dẫn xuất của sibutramine được thể hiện trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Sibutramine và các dẫn xuất của sibutramine

phân tử

Khối lượng phân tử

2 N-Desmethyl sibutramine DSB C16H24ClN 265,0

3 N-Didesmethyl sibutramine DDSB C15H22ClN 251,1

1.1.1 Sibutramine

a) Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của sibutramine

Sibutramine HCl là tinh thể kết tinh có màu từ trắng đến kem Công thức phân tử: C17H26ClN (Khối lượng phân tử 279,86 g/mol), pKa = 9,6 [11]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của sibutramine

Danh pháp quốc tế: dimethylcyclobutan-methylamine

(+/-)-1-(p-chlorophenyl)-α-isobutyl-N-N-Trong các chế phẩm chúng thường tồn tại ở dạng sibutramine hydroclorid monohydrate, nhiệt độ nóng chảy ở 119oC, ở dạng kiềm có nhiệt độ nóng chảy 55,15oC và enthalpy là 60,75 J/mol

Độ tan: Độ tan của sibutramine hydrocloride monohydrate trong nước là 5,2 mg/mL ở pH = 5,2 [3, 11], độ tan trong methanol và nước là 2,9 mg/L ở pH = 5,2 [26], độ tan trong octanol : H2O là 30,9 ở pH = 5,0 [11] Sibutramine kiềm tan nhiều hơn trong alcol, độ tan tăng dần theo độ dài mạch C từ methanol đến octhanol [3]

b) Tính chất dược động học, tác dụng dược lý

Tính chất dược động học

- Hấp thu: Sibutramine hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (77 %) Thời gian để thuốc đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương là 1 giờ và thời gian bán thải là 1,1 giờ

- Phân bố: Phân bố nhanh chóng và rộng rãi đến các mô

- Chuyển hóa: Khi dùng đường uống sibutramine bị chuyển hóa đáng kể khi qua gan lần đầu Sibutramine được chuyển hóa bởi cytochrome P450 CYPA4 thành hai amin (gọi là chất chuyển hóa có hoạt tính 1 và 2) với chu kỳ bán rã tương ứng là

14 giờ và 16 giờ Nồng độ đỉnh trong huyết tương của chất chuyển hóa có hoạt tính

Sibutramine là một chất ức chế tái thu hồi serotonin - noradrenalin, thúc đẩy giảm cân ở người béo phì Sibutramine làm giảm cảm giác thèm ăn, cho cảm giác

no và gây ra sự sinh nhiệt

Trong cơ thể, sibutramine chuyển hóa nhanh chóng thành các chất chuyển hóa desmethyl: M1 (mono-desmethyl sibutramine) và M2 (di-desmethyl sibutramine) và sibutramine tác động dược lý chủ yếu thông qua 2 chất chuyển hóa này để gây ra tác dụng giảm cân [37]

Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh sibutramine có hiệu quả như một chất giảm cân với liều lượng khác nhau, từ 10 đến 20 mg/ngày

Tác dụng không mong muốn: Sibutramine kích thích quá mức hệ thần kinh trung ương và ảnh hưởng một vài khía cạnh như bồn chồn, khô miệng, đau đầu, tê liệt và những dị cảm (cảm giác khác thường như bị châm chích, kiến bò) có thể xảy ra Hơn thế nữa nó còn liên quan đến tăng nguy cơ tim mạch như tăng áp lực máu, nhịp tim và thương tăng nguy cơ đau tim cũng như đột quỵ [17]

1.1.2 N-desmethyl sibutramine và N-didesmethyl sibutramine

Sibutramine ban đầu được phát triển như một thuốc chống trầm cảm, được kết hợp với serotonin (5- HT) và chất ức chế tái hấp thu noradrenaline (NA) Trong

cơ thể sibutramine được chuyển hóa nhanh chóng thông qua dethyl hóa tạo thành N-desmethyl sibutramine (DSB) (hình 1.2) và N-didesmethyl sibutramine (DDSB) (hình 1.3) [33]

Hình 1.2 Công thức cấu tạo N- desmethyl sibutramine

- Danh pháp quốc tế: 1-[1-(4-chlorophenyl) 1-amine

cyclobutyl]-N,3-dimethylbutan Công thức phân tử: C16H24ClN

- Khối lượng mol: 265,83 g/mol

Hình 1.3 Công thức cấu tạo N-didesmethyl sibutramine

- Danh pháp quốc tế: 1–[1–(4–chlorophenyl) cyclobutyl]–3–methylbutan–1–amine

- Công thức phân tử: C15H22ClNO

- Khối lượng mol: 251,1 g/mol

DSB và DDSB đều có hoạt tính dược lý gây cảm giác no và kích thích sinh nhiệt

Các tác dụng phụ của DSB và DDSB đã được ghi chép lại rõ ràng Ba trường hợp loạn thần có liên quan đến việc sử dụng các sản phẩm giảm béo có chứa DSB

và các tác dụng lên tim mạch ở một người đàn ông đã sử dụng thực phẩm bổ sung

hỗ trợ giảm cân dạng thảo dược có chứa DDSB cũng đã được ghi nhận lại

DSB và DDSB đã được tìm thấy trong một số mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân dạng thảo dược Nguồn tài liệu tham khảo cũng chỉ ra rằng DSB và DDSB

có tác dụng dược lý in vivo tương tự như sibutramine Dựa trên sự hấp thu của norepinephrine, serotonin và dopamine, các tác giả đã ước tính DSB và DDSB có tác dụng mạnh gấp 50 lần so với SB [32]

1.2 Tình trạng thừa cân, béo phì và một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì

1.2.1 Tình trạng thừa cân, béo phì

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), thừa cân béo phì là tình trạng tích lũy

mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân gây ra nhiều nguy hại tới sức khỏe Nhìn chung, bệnh thừa cân béo phì được thể hiện khi trọng lượng cơ thể cao hơn trọng lượng chuẩn ở một người khỏe mạnh Bệnh thừa cân béo phì là bệnh mãn tính do sự dư thừa quá mức lượng mỡ trong cơ thể Trong cơ thể chúng ta luôn có một lượng mỡ nhất định và lượng mỡ này cần thiết để lưu trữ năng lượng, giữ nhiệt, hấp thụ những chấn động và thể hiện các chức năng khác [29]

Dấu hiệu dễ nhận thấy nhất của thừa cân béo phì là sự gia tăng trọng lượng

cơ thể, khối lượng mỡ tích tụ tại một số phần đặc biệt của cơ thể như: bụng, đùi, eo,

và ngực [11]

Thừa cân béo phì khiến cơ thể trở nên quá khổ, vì vậy nó gây ra cảm giác tự

ti, căng thẳng cho bản thân người thừa cân hay béo phì Người thừa cân béo phì thường mất tự tin trong giao tiếp, ngại giao tiếp và xuất hiện trước đám đông kèm theo tình trạng căng thẳng, kém linh hoạt trong cuộc sống hàng ngày dẫn đến làm giảm sút hiệu quả công việc [28]

Người thừa cân béo phì dễ bị thoái hóa khớp, loãng xương, đau nhức triền miên do áp lực từ trọng lượng cơ thể gây lên xương khớp Khớp gối, cột sống tổn thương sớm nhất Người thừa cân béo phì dễ mắc bệnh gout [28]

Người thừa cân béo phì thường đi kèm với bệnh rối loạn lipid máu hay thường gọi là bệnh mỡ trong máu hoặc cholesterol cao Khi cholesterol cao gây xơ hóa lòng mạch máu, tăng huyết áp, đột quỵ, nhồi máu cơ tim Mặt khác, ở người thừa cân béo phì thì tim phải thường xuyên làm việc nhiều hơn để bơm máu đi nuôi

cơ thể và lâu dài gây quá tải cho tim do đó ở người béo phì dễ mắc các bệnh về tim mạch Hiện nay, tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch đang đứng đầu trong các nguyên nhân, trong đó rất nhiều trường hợp là biến chứng của bệnh béo phì

Bệnh thừa cân béo phì có liên quan mật thiết với bệnh tiểu đường type 2 do gây đề kháng insulin (hormon điều hòa đường huyết và đưa nhanh glucose vào tế bào để sử dụng) nên là nguyên nhân trực tiếp gây ra đái tháo đường týp 2 ở người béo phì [29]

Hậu quả của thừa cân béo phì còn gây rối loạn chuyển hóa mỡ, sinh ra sỏi mật, suy giảm trí nhớ, một số bệnh lý đường hô hấp, rối loạn nội tiết, và cũng gia tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư [29]

1.2.2 Một số biện pháp điều trị, phòng ngừa thừa cân, béo phì

Để giảm thiểu nguy cơ gặp những biến chứng nặng nề do thừa cân béo phì, các bác sĩ khuyến cáo mỗi người nên kiểm soát cân nặng của mình với một chế độ dinh dưỡng khỏe mạnh, cân bằng, kết hợp với vận động hợp lý để nâng cao sức khỏe cũng như phòng tránh các căn bệnh nguy hiểm do thừa cân béo phì gây nên Một số trường hợp kiểm soát cân nặng bằng chế độ tập luyện và dinh dưỡng là chưa

đủ, họ phải kết hợp với sử dụng thuốc [32]

Một số thuốc được sử dụng trong điều trị thừa cân, béo phì là: Phentermine, sibutramine, tetrahydrolipostatin, ephedrine, caffeine… Để tăng hiệu quả sử dụng, một số thuốc có phối hợp nhiều hơn một dược chất như ephedrine kết hợp caffeine [30]

Năm 1997, cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa kỳ đã phê duyệt sibutramine sử dụng để điều trị bệnh béo phì, hiện nay sibutramine là một loại thuốc được khuyên dùng để giúp những người béo phì giảm cân [16] Các thử nghiệm

kiểm soát ở bệnh nhân béo phì đã cho thấy hàm lượng tối ưu cho mỗi ngày là 10-15

mg, được duy trì khoảng 12 tháng [30]

Sau khi người và động vật uống sibutramine, sibutramine sẽ chuyển hóa thành N-desmethyl sibutramine và N-didesmethyl sibutramine Tác dụng dược lý được gây ra bởi sibutramine chính là do hai chất chuyển hóa này Trong trường hợp quá liều, sibutramine sẽ gây ra một số tác dụng phụ nghiêm trọng bao gồm buồn nôn, khô miệng, tức ngực, suy gan [16]

Thực phẩm bổ sung (thực phẩm chức năng, thực phẩm bảo vệ sức khỏe) là một sản phẩm được bổ sung thêm vào khẩu phần ăn uống Các thành phần của thực phẩm bổ sung bao gồm: vitamin, khoáng chất, thảo dược hoặc các thành phần khác như axit amin, các enzyme hỗ trợ quá trình chuyển hóa chất [16] Tập luyện kết hợp với sử dụng thực phẩm bổ sung là sự lựa chọn của nhiều bệnh nhân mắc bệnh thừa cân, béo phì

Hiện nay, thực phẩm bổ sung được bán rộng rãi thông qua nhiều kênh phân phối như quầy thuốc, hiệu thuốc, siêu thị, các cửa hàng thảo dược và đặc biệt qua kênh phân phối internet Các sản phẩm thực phẩm bổ sung được quảng cáo có nguồn gốc từ các thảo dược tự nhiên, có tác dụng giảm cân an toàn Với một thị trường rất rộng lớn và dễ tiếp cận, vấn đề pha trộn các tân dược không an toàn ngày càng tăng [8, 10, 43], bởi vì thực phẩm bổ sung không trải qua quá trình kiểm tra nghiêm ngặt như thuốc Các thành phần được mô tả trên nhãn chỉ dựa trên công bố của nhà sản xuất Việc bổ sung sibutramine trái phép gần đây đã được phát hiện trong nhiều loại thực phẩm bảo vệ sức khỏe, ảnh hưởng nghiêm trọng sức khỏe người tiêu dùng [6, 39, 41] Vào năm 2010, sibutramine đã bị rút khỏi thị trường Châu Âu (Cơ quan Dược phẩm Châu Âu 2010) và Hoa Kỳ (FDA 2010) vì tỷ lệ rủi

ro cao và khả năng gây ra các biến chứng tim mạch hoặc đột quỵ

Ngày 14/4/2011 Cục quản lý Dược - Bộ Y Tế đã ban hành Quyết định số: 120/QĐ-QLD về việc rút số đăng ký của thuốc do phản ứng có hại, theo đó tất cả các thuốc có chứa hoạt chất sibutramine ra khỏi danh mục các loại thuốc được cấp

số đăng ký thông hành trên thị trường Việt Nam

1.3 Phương pháp xác định SB, DSB và DDSB

1.3.1 Một số kỹ thuật xử lý mẫu

Thực phẩm bổ sung là sản phẩm mà trong đó có chứa thêm thành phần bổ sung, phần bổ sung này đa dạng có thể là vitamin, khoáng, thảo dược, amino acid, enzyme, chất chuyển hóa [16] Xác định được sibutramine và dẫn xuất của SB trong nền thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân cũng gặp khó khăn vì nền mẫu phức tạp Mục tiêu của quá trình xử lý mẫu là chiết chọn lọc chất phân tích, loại bớt tạp

để giảm ảnh hưởng của tạp đối với thiết bị phân tích Nhiều kỹ thuật xử lý mẫu đã được sử dụng bao gồm chiết bằng dung môi, lọc dịch chiết bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ, chiết pha rắn, chiết QuEChERS

1.3.1.1 Chiết bằng dung môi

Peng Zou và các cộng sự đã xây dựng thành công phương pháp phát hiện sibutramine, 2 chất chuyển hóa của sibutramine và một chất tương tự sibutramine trong mẫu thảo dược hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp LC-MS-TOF, trong đó tác giả đã xử lý mẫu bằng cách cân 1 gam mẫu, chiết bằng 10 mL dung môi methanol, siêu âm 30 phút, dịch chiết thu được sẽ được lọc qua màng lọc và được bơm vào hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Đây là bài báo đầu tiên nghiên cứu phát hiện được 2 chất chuyển hóa của sibutramine và một chất mới tương tự sibutramine trong sản phẩm thảo dược bằng phương pháp LC/MS/MS [44]

Ziqiang Huang và cộng sự cũng xây dựng phương pháp xác định đồng thời sibutramine và N-didesmethyl sibutramine trong thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp HPLC-ESI-MS Để có thể xác định được SB và DSB, tác giả

đã chuẩn bị dung dịch mẫu bằng cách cân 0,5 gam mẫu rắn đã được đồng nhất và chiết bằng MeOH, siêu âm 10 phút Sau khi lọc, dung dịch mẫu được pha loãng thành 10 mL với MeOH, 5 µL dung dịch mẫu được bơm vào hệ thống HPLC, độ thu hồi của 2 chất nằm trong khoảng 93,3 – 106,7% [16]

Methanol là dung môi đang được sử dụng phổ biến để chiết SB và dẫn xuất của SB, tuy nhiên nếu nền mẫu thực phẩm bổ sung có thêm một số chất màu thì việc loại bỏ các tạp này là không thực hiện được

1.3.1.2 Chiết và loại tạp bằng phương pháp chiết pha rắn

Một trong những phương pháp chiết đang được phát triển để nhận biết các tân dược là phương pháp chiết pha rắn Dung dịch thu được sau chiết pha rắn có thể được bơm thẳng vào hệ thống sắc ký lỏng

Kỹ thuật chiết pha rắn SPE – HLB đã được Tarita Kamardi và cộng sự xây dựng để nhận dạng sibutramine HCl trong thuốc truyền thống bằng phương pháp sắc ký lỏng acid phosphoric 3% được lựa chọn làm dung môi chiết sibutramine HCl ra khỏi nền mẫu thuốc Sau khi lắc 30 phút và lọc, dung dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn SPE (cột được hoạt hóa bằng ethanol và nước) Rửa tạp bằng ammoni hydroxide trong ethanol 80%, chất phân tích được rửa giải bằng Acetonitril Độ thu hồi của phương pháp thu được là 38,0 – 45,0 % [40]

Trong nghiên cứu xây dựng phương pháp nhanh và nhạy để xác định chất chuyển hóa của sibutramine trong huyết thanh người bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo ghép nối khối phổ, Jignesh Bhatt và cộng sự cũng sử dụng phương pháp chiết pha rắn, rút ngắn quá trình xử lý mẫu Hút chính xác 0,5 mL dịch huyết thanh

có chứa DSB, DDSB, thêm nội chuẩn imipramine nồng độ 40 ng/mL, lắc voltex Mẫu sau đó được acid hóa bằng acid phosphoric 10% Hỗn hợp mẫu được nạp lên cột SPE - HLB đã được hoạt hóa bằng 1,0 mL MeOH và 2,0 mL nước Rửa tạp bằng nước, MeOH 30%/ H2O Chất phân tích được rửa giải bằng 0,8 mL Acetonitrile và được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ Kết quả độ thu hồi của DSB và DDSB tương ứng là 93,5% và 77,9% [7]

1.3.1.3 Kỹ thuật QuEChERS

Trong nghiên cứu của Juanhui Li và cộng sự, tuy tác giả không áp dụng phương pháp chiết QuEChERS làm sạch mẫu để phân tích sibutramine và dẫn xuất của sibutramine trong nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân, nhưng tác giả đã sử dụng phương pháp chiết này để phân tích được 14 chất thuộc nhóm β-agonist cũng trong nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân bằng phương pháp sắc ký lỏng UHPLC kết nối khối phổ Mẫu được chuẩn bị như sau: Cân chính xác một lượng mẫu vào ống ly tâm, thêm 3 mL nước, lắc voltex 30 giây, thêm 10 mL ACN, lắc tay 30 giây, thêm 2,0 gam MgSO4 (magie sulfate), 1,0 gam NaCl (natri clorua) lắc mạnh 1 phút Dịch chiết sau ly tâm sẽ được làm sạch bằng

150 mg chất chất phụ có thêm 900 mg MgSO4 Kết quả 14 β-agonist đã được tách

với giới hạn phát hiện nằm trong khoảng 1,8 – 23,1 µg kg-1, hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 67,1 – 107,3% [24]

Bảng 1.2 Tổng hợp kết quả một số kỹ thuật xử lý mẫu

Tác giả Nền mẫu PP xử lý mẫu Các chất PT Độ thu hồi

(%)

Peng Zou

Thảo dược

hỗ trợ giảm cân

Cân mẫu, chiết mẫu bằng MeOH, lắc 30 phút, lọc qua màng lọc

Định tính SB,

02 chất chuyển hóa của SB và

Cân mẫu, chiết mẫu bằng MeOH, siêu âm 10 phút, lọc qua màng lọc

Định lượng SB, DDSB 93,3 – 106,7 %

Tarita

Kamardi

Thuốc truyền thống

Cân mẫu, chiết mẫu bằng H3PO43%, lắc 30 phút, lọc mẫu, làm sạch bởi cột chiết pha rắn SPE

Định lượng SB 38,0 – 45,0%

Jignesh

Bhatt Huyết thanh

Cân mẫu, chiết mẫu bằng H3PO4 10%, làm sạch bằng cột SPE-HLB

DSB, DDSB DSB: 93,5%;

DDSB: 73,9%

Juanhui Li

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân

Cân mẫu, thêm nước, lắc voltex

30 giây, thêm ACN, lắc tay 30 giây Làm sạch bằng phương pháp QuEchERS

14 chất thuộc nhóm β-agonist 67,1 – 107,3%

Kết quả bảng 1.2 cho thấy các tác giả đều xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc chọn dung môi thích hợp để hòa tan được chất phân tích, chiết được chất phân tích

từ các nền mẫu khác nhau, chọn lựa phương pháp làm sạch mẫu, loại được tạp, chiết

chọn lọc chất phân tích và hiệu suất thu hồi tốt nhất Trong đó, Juanhui Li đã lựa chọn phương pháp QuEchERS để làm sạch mẫu, 14 chất thuộc nhóm β-agonist trong nền thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân đều được định lượng và có độ thu hồi nằm trong khoảng 67,1 – 107,3% Mặc dù chưa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc xác định SB và dẫn xuất trong nền mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân có sử dụng kỹ thuật QuEChERS để loại tạp, nhưng nghiên cứu của Juanhui cũng là tiền đề cho việc loại tạp trong nền mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân

1.3.2 Phương pháp phân tích

1.3.2.1 Phương pháp UV-Vis

Daniela F Maluf và các cộng sự đã phát triển phương pháp UV-Vis để định lượng sibutramine hydrochloride monohydrate trong viên nang Mẫu phân tích được hòa tan trong nước (n=3) và được đo ở bước sóng 223,0 nm trên thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử UV-1601 PC, Shimazdzu, Kyoto, Japan, khoảng bước sóng từ 200

nm đến 800 nm Đường chuẩn xây dựng được có hệ số tương quan là 0,9997, khoảng tuyến tính từ 5,0 đến 30,0 µg/mL Độ chính xác lần lượt là 101,4 ± 1,2%, 99,1 ± 0,9% và 102,2 ± 1,9% tương ứng với các nồng độ 10,0, 20,0 và 30,0 µg/mL

Độ tái lặp và lặp lại được thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) tương ứng là 1,4359 và 1,9234 Ưu điểm của phương pháp UV-Vis là đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp Tuy nhiên, phương pháp chỉ định lượng SB, không xác định đồng thời SB

và các dẫn xuất của SB [26]

1.3.2.2 Phương pháp điện di mao quản

Danwang và cộng sự đã xây dựng phương pháp điện di mao quản phát hiện được đồng thời sibutramine và phenolphthalein có trong mẫu thực phẩm chức năng Dung dịch đệm được sử dụng là hỗn hợp đệm phosphate 20 mM và natri dodecyl sulphate 20 mM (pH = 11) Chất phân tích được phát hiện ở bước sóng 223 nm, điện thế 25 kV ở 20o

C Giới hạn phát hiện của sibutramine là 0,03 µg/mL, phenolphthalein là 0,18 µg/mL Khoảng tuyến tính của sibutramine là 0,1 – 50 µg/mL, phenolphthalein là 0,8 – 50 µg/mL Độ thu hồi của 2 chất tương ứng là 95,3% và 103,4% [38]

Nhóm tác giả Yang Li và các cộng sự đã phát triển phương pháp điện di mao quản hiệu năng cao để xác định đồng thời 07 hoạt chất trong mẫu thực phẩm chức năng là fenfluramin, pseudoephedrine, norpseudoephedrine, amfepramone, sibutramine, sildenafil và strychnine Sử dụng hỗn hợp đệm của natri tetraborate 20

mM, natri dodecyl sulfat 10 mM và acetonitrile 5% (pH=9,0), bước sóng phát hiện

là 195 nm, điện áp tách là 17kV ở 25o

C Giới hạn trên của đường chuẩn là 100 mg/L với hệ số tương quan R lớn hơn 0,998 Độ lệch chuẩn tương đối dao động từ 4,5 và 7,9% (n=7) Độ thu hồi trung bình trong khoảng 79,6% - 112,0% Giới hạn phát hiện (S/N=3) nằm trong khoảng 0,16 và 0,65 mg/L Phương pháp đã được áp dụng thành công cho việc xác định 7 hoạt chất trong mẫu thực phẩm chức năng [25] Tuy nhiên giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp cao, phương pháp cũng chưa xây dựng để xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất

Shigeki Akamatsu và Takao Mitsuhashi (2013) đã sử dụng phương pháp điện

di mao quản khối phổ hai lần để xác định đồng thời 20 thành phần dược phẩm trong thuốc nhuận tràng và thuốc ức chế sự thèm ăn trong đó có SB, DDSB, phenolphthalein Kết quả cho thấy LOD của các chất dao động từ 1,0 – 750 μg/g với tuỳ chất [5]

1.3.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao – HPTLC

Phương pháp HPTLC đã được phát triển và được áp dụng để xác định sibutramine trong mẫu thực phẩm bổ sung dạng thảo dược

Trong nghiên cứu của Mathon C và các cộng sự, tác giả đã sử dụng phương pháp HPTLC-UV để định lượng sibutramine trong thực phẩm bổ sung dạng thảo dược Dịch chiết mẫu được chấm trực tiếp lên bản mỏng silica gel HPTLC, pha động là hỗn hợp toluene-methanol Sibutramine được định lượng ở bước sóng 225nm và được xác minh bởi detector khối phổ MS Trong hai cuộc điều tra, 52 mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân đã được sàng lọc Một nửa trong số đó phát hiện có pha trộn với sibutramine, hàm lượng lên tới 35 mg/ viên Kết quả thu nhận được từ phương pháp HPTLC được so sánh với kết quả thu được khi thực hiện phép phân tích bằng phương pháp HPLC-UV và HPLC-MS/MS Kết quả cho thấy không

có sự khác biệt đáng kể giữa ba phương pháp [27]

Hayun và các cộng sự đã xác định sibutramine trộn trái phép trong sản phẩm thảo dược giảm cân, trong nghiên cứu, tác giả sử dụng phương pháp đo mật độ phổ lớp mỏng (TLC) với pha tĩnh là bản mỏng nhôm TLC silica gel 60 F254, pha động

là hỗn hợp toluene-diethylamine (10:0,3, v/v) Đường chuẩn xây dựng có khoảng định lượng từ 0,50 đến 5,00 µg/mL, hệ số tương quan R2= 0,9986 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) lần lượt là 217,5 ng và 724,9 ng Phương

pháp sau khi thẩm định được sử dụng để xác định hàm lượng sibutramine trong sản phẩm thảo dược giảm cân được lấy từ một số nhà thuốc ở thành phố Depok, Indonesia Kết quả định lượng cho thấy có 6 trong 7 mẫu phân tích chứa sibutramine HCl với hàm lượng từ 2,45 - 26,24 mg/viên [15]

Phattanawasin P và cộng sự đã xây dựng phương pháp phân tích sắc ký lớp mỏng để xác định nhanh và định lượng sibutramine HCl trộn trái phép trong sản phẩm thảo dược giảm cân Pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254, pha động là hỗn hợp dung môi toluene-n-hexane-diethylamine (9:1:0,3 v/v/v), Dragendorff được sử dụng là thuốc thử hiện màu Đường chuẩn được xây dựng có dải nồng độ từ 1 µg/mL - 6 µg/mL LOD và LOQ tương ứng là 190 và 634 ng/g [31]

Phương pháp HPTLC đã được phát triển thường sử dụng để định tính sibutramine LOD và LOQ trong trường hợp định lượng thấp hơn phương pháp UV-VIS và điện di mao quản, tuy nhiên các nghiên cứu cũng chỉ xác định sibutramine

mà không xác định đồng thời sibutramine và dẫn xuất của sibutramine

1.3.2.4 Phương pháp sắc ký khí (GC-MS)

Để xác định đồng thời sibutramine và một số dẫn xuất, phương pháp GC-MS

đã được nghiên cứu và phát triển

Tác giả Sabina Strano-Rossi và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc kí khí khối phổ nhằm xác định các chất chuyển hóa của sibutramine trong nước tiểu Mẫu nước tiểu được tiền xử lý bằng phương pháp chiết lỏng/ lỏng, thủy phân enzyme…,

ủ nhiệt và chiếu xạ vi sóng Sản phẩm chuyển hóa của sibutramine bao gồm: mono desmethyl sibutramine, didesmethyl sibutramine… Các chất chuyển hóa này được phát hiện rõ ràng trong khoảng nồng độ 10 đến 50 ng/mL, đáp ứng các giới hạn hiệu suất tối thiểu cần thiết (MRPL) của Cơ quan chống doping thế giới (WADA) [36]

Tại Iran, Khazan và cộng sự đã tiến hành lấy 8 mẫu giảm cân dạng thảo dược trên thị trường Bằng phương pháp GC-MS và LC-MS, tác giả đã xác định được sự

có mặt của sibutramine, phenolphthalein, bumetanide và phenytoin Các thành phần này không được công bố trên nhãn của sản phẩm Kết quả định tính có ý nghĩa quan trọng Lí do, tại Iran, sibutramine vẫn được sử dụng làm thuốc điều trị giảm cân Liều khuyến cáo là 5 – 15mg/ngày, tuy nhiên mẫu thảo dược giảm cân có liều là 2 đến 3 viên/ 1 ngày Do đó, nếu những bệnh nhân sử dụng thuốc sibutramine kết hợp với thực phẩm giảm cân thảo dược có chứa sibutramine sẽ dẫn đến tình trạng quá liều, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe [21]

1.3.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng và sắc ký lỏng khối phổ

Zhou Yu và cộng sự xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 hoạt chất cấm bao gồm orlistat, cetilistat, sibutramine và rimonabant trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe Các chất phân tích được tách và định lượng bởi phương pháp HPLC-PDA

ở bước sóng 222 nm Sự phân tách các chất phân tích được thực hiện bằng việc sử dụng chế độ gradient rửa giải gồm acetonitrile và acid phosphoric 0,02 mol/L, cột sắc ký C18 Độ thu hồi nằm trong khoảng 96,1% đến 97,2% Độ tái lặp trong ngày

và giữa các ngày thay đổi nhỏ hơn 1% Giới hạn phát hiện là 189 ng/g, đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính tốt R2

A.P Suthar và cộng sự đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC pha đảo để định lượng sibutramine trong viên nén Sử dụng cột C18, 5 µm, 250 x 4.6

mm, chế độ đẳng dòng, pha động ACN : Amoni dihydro photphat 50 mM (65:35, v/v; pH 6) Tốc độ dòng 1 mL/ phút, bước sóng 225 nm Thời gian lưu của sibutramine là 6,18 phút LOD và LOQ tương ứng 0,09 µg/mL và 0,26 µg/mL Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 99,87 – 100,45 % [37]

Tarita Kamardi và các cộng sự tại viện Kỹ thuật Bandung đã lựa chọn kỹ thuật chiết pha rắn (pha đảo) SPE - HLB để phát triển và tối ưu hóa phương pháp xác định sibutramine HCl trong sản phẩm thảo dược Mẫu sau khi được chiết qua cột SPE, dịch thu được sẽ được đem phân tích trên thiết bị HPLC, cột C18 với detector PDA Phương pháp đã được thẩm định và được sử dụng để phân tích xác định hàm lượng sibutramine HCl trong thực phẩm chức năng hỗ trợ giảm cân dạng thảo dược thu nhận trên thị trường Sibutramine HCl được detector thu nhận ở bước sóng 222 nm Khoảng tuyến tính nằm trong khoảng từ 0,10 đến 0,50 mg/mL, R2 = 0,9966 Giới hạn định lượng của phương pháp là 2,326 µg/g Độ đặc hiệu của phương pháp là khá tốt Độ phân giải các thành phần chất có trong mẫu:

diethylpropion là 2,415; sibutramine HCl là 2,877 và amphetamine sulfate là 5,673 [18]

Tác giả Nguyễn Tiến Luyện (2014) cũng đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA để xác định sibutramine trong TPBVSK dạng viên nang, sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm, cỡ hạt 5 μm ở nhiệt độ 30 độ C), tốc độ dòng 1 mL/phút, detector PDA ở bước sóng 225nm, pha động sau khi nghiên cứu tối ưu với kênh A là KH2PO4 0,05M pH = 4 và kênh B là ACN Nghiên cứu đã xác định được sibutramine trong một số mẫu TPBVSK với giới hạn phát hiện là 0,2 μg/mL và giới hạn định lượng là 0,5 μg/mL [2]

So với các phương pháp khác, phương pháp HPLC có ưu điểm là đơn giản, thời gian phân tích ngắn, khả năng ứng dụng tốt, tuy nhiên đối với một số nền mẫu phức tạp như nền mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe, việc định lượng các chất trở lên khó khăn Một số chất tương tự nhau, có thể không tách ra khỏi nhau, do đó không thể định lượng được Kết hợp ưu điểm của phương pháp GC-MS và HPLC, LC-MS/MS đã đem lại nhiều ứng dụng

Nhóm tác giả tại trường đại học Fudan, Thượng Hải đã thành công trong việc xây dựng phương pháp xác định chất chuyển hóa của sibutramine trong huyết tương

là DDSB bằng phương pháp sắc ký lỏng HPLC ghép nối khối phổ (MS/MS) Mẫu được chiết tách từ huyết tương bởi methyl tert-butyl ether, thêm nội chuẩn propranolol, điều chỉnh pH bằng dung dịch natri hydroxid, tiến hành bay hơi dung môi Phần cắn sẽ được hòa tan bởi dung môi pha động và được tiêm vào hệ thống LC-MS/MS Quá trình sắc ký được diễn ra trên cột ODS MS với pha động bao gồm acetonitrile (chứa 0,1% trifluoroacetic axit, v/v) (55:45, v/v), tốc độ dòng 0,3 mL/phút Khoảng tuyến tính: 0,328 - 32,8 ng/mL, độ chính xác thu được nhỏ hơn 19,90% trên nền mẫu huyết tương, trên toàn bộ khoảng nồng độ Phương pháp nhạy

và độ lặp tốt được sử dụng trong nghiên cứu dược động học [9] Cũng trong năm

đó, Ding et al cũng xây dựng phương pháp xác định SB và chất chuyển hóa của SB trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với việc sử dụng thêm nội chuẩn phenoprolamine hydro chloride Phương pháp xây dựng có đường chuẩn SB, DSB tuyến tính trong khoảng 0,05 – 20,0 ng/mL; đường chuẩn DDSB tuyến tính trong khoảng 0,1 – 30 ng/mL [12]

Helena và các cộng sự đã phát triển phương pháp LC-MS/MS để phân tích sibutramine, một thành phần được trộn trái phép trong thực phẩm bổ sung Mẫu

được chuẩn bị đơn giản Quá trình tách được thực hiện bởi cột pha đảo, pha động là hỗn hợp acetonitrile và nước (1:1, v/v), acid formic 0,1%, tốc độ dòng 0,4 mL/phút, nhờ đó có thể xác định hàm lượng của sibutramine Phương pháp được thực hiện có

độ đúng, độ chính xác, hiệu quả và độ nhạy cao Giới hạn định lượng là 4,0 ng/g, giới hạn phát hiện là 1,3 ng/g Khoảng tuyến tính là 5,0 - 30,0 ng/mL, trong khoảng nồng độ này, hệ số tương quan là 0,9984 Phương pháp được công bố có thể được

sử dụng để phân tích thường qui [41]

Một nghiên cứu khác của ZiqiangHuang, tác giả đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (HPLC-UV-ESI-MS) để xác định đồng thời các chất cấm sibutramine và sản phẩm chuyển hóa của nó là N-di-desmethylsibutramine trong thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân Cột tách được sử dụng là cột pha đảo C8 Spherisorb, pha động là hỗn hợp acetonitrile và axit focmic 0,2% chứa muối amoni acetat 20mM, chế độ gradient Detector được sử dụng cho định lượng được cài đặt

ở bước sóng 223 nm Mảnh định lượng của sibutramine là m/z 280 và desmethylsibutramine là m/z 252 Khoảng tuyến tính của đường chuẩn là 0,025-1,0 mg/mL đối với sibutramine và N-di-desmethylsibutramine Hệ số tương quan thu được lớn hơn 0,9990 Độ lặp lại và độ tái lặp đối với sibutramine và N-di-desmethylsibutramine nằm trong giới hạn cho phép Phương pháp được sử dụng thành công trong phân tích các mẫu thực phẩm bổ sung tự nhiên [16]

N-di-S.H Roh và cộng sự đã nghiên cứu cách xác định đồng thời ba chất ức chế PDE-5 (sildenafil, vardenafil và tadalafil), sibutramine và hai chất chuyển hóa chính của sibutramine là N-desmethylsibutramine và N-didesmethylsibutramine bằng phương pháp sắc ký lỏng UPLC ghép nối khối phổ tứ cực theo thời gian bay (Q-TOF MS) trong thực phẩm bổ sung Điều kiện pha động của LC là kênh A (acid formic 0,1%), kênh B (acid formic 0,1% trong Acetoniltril), tốc độ dòng 0,2 mL/ phút Phương pháp này đã sử dụng phổ khối có độ chính xác cao của 6 hợp chất để nhận dạng và có thời gian phân tích ngắn Độ thu hồi nằm trong khoảng từ 87% đến 113% Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thu được tương ứng 0,4 đến 2,0 mg/kg và 1,3 đến 6,0 mg/kg Đây là phương pháp phân tích nhanh, dễ thực hiện để phát hiện sự có mặt của các chất trộn trái phép trong thực phẩm bổ sung [35]

Mặc dù racemic sibutramine đã được sử dụng rộng rãi để điều trị béo phì, nhưng phương pháp phát hiện đối quang của nó vẫn chưa được làm sáng tỏ trong huyết tương người Trong nghiên cứu của W Kang và cộng sự, tác giả đã thẩm định phương pháp xác định sibutramine và 2 chất chuyển hóa có hoạt tính của SB bằng

LC-MS/MS, khoảng tuyến tính của đường chuẩn nằm trong dải nồng độ 0,1 – 0,8 ng/mL Các đồng phân R và S của những hợp chất đó trong huyết tương người được chiết bằng dietyl ete – hexan (4:1, v/v) có thêm NaOH Sau khi loại bỏ lớp hữu cơ, phần cặn được hòa tan trong pha động Cả hai đồng phân trong dịch chiết được tách

ra trên cột pha tĩnh Chiralcel AGP và được định lượng bằng phương pháp khối phổ Phương pháp nghiên cứu đã được sử dụng thành công để xác định nồng độ các đồng phân lập thể của SB và hai chất chuyển hóa có hoạt tính của SB trong huyết tương theo thời gian ở những người tình nguyện khỏe mạnh [11]

Như vậy, có rất nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng để xác định sibutramine và một số dẫn xuất trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe Bảng 1.2 là tóm tắt các kết quả xác định sibutramine và một số dẫn xuất bằng phương pháp GC-MS, HPLC và LC-MS/MS

Bảng 1.3 Tóm tắt kết quả xác định SB và một số dẫn xuất bằng phương pháp

GC-MS, HPLC và LC-MS/MS

Tác giả Nền mẫu

PP phân tích

DSB, DDSB và một số chất chuyển hóa của SB -

LOD nằm trong khoảng 10-50 ng/mg Zhou

Định

Tác giả Nền mẫu

PP phân tích

HPLC Sibutramine HCl

0,50 mg/mL

0,10-LOQ: 2,326 µg/g

LC-0,05 – 20,0 ng/mL với SB, SDB;

0,1 – 30 ng/mL với DDSB

LOD của SB, DSB và DDSB: 4.5 fg; 3,5 fg; 4,0 fg LOQ tương ứng: 31,95; 40,23; 44,12

fg Chen J

LOD: 0,082 ng/mg Helena

LOQ: 4,0 µg/kg Ziqiang

LC-SB và N-didesmethyl sibutramine

1,0 mg/mL

0,025-SB: 50 ng/mg;

ng/mg S.H

LC-Sildenafil, vardenafil và tadalafil, SB, DSB, DDSB

-

LOQ: 1,3 - 6,0 mg/kg

Tác giả Nền mẫu

PP phân tích

LC-Đồng phân của SB và DSB, DDSB

0,05-20

Qua bảng 1.3 cho thấy, phương pháp LC-MS/MS được ứng dụng nhiều trong phân tích xác định hàm lượng SB, DSB và DDSB trong nền mẫu thực phẩm bổ sung hỗ trợ giảm cân, giới hạn định lượng của phương pháp thấp hơn so với phương pháp khác Trong đề tài này, dựa trên điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, nhóm nghiên cứu tiếp tục phát triển phương pháp LC-MS/MS để xác định SB, DSB

và DDSB trong mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe hỗ trợ giảm cân, tiến hành tối ưu hóa quá trình xử lý mẫu, làm sạch mẫu, từ đó làm giảm giới hạn định lượng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

SB, DSB và DDSB có thể được trộn trái phép trong các mẫu TPBVSK hỗ trợ giảm cân Do đó, đối tượng nghiên cứu của đề tài là các mẫu TPBVSK hỗ trợ giảm cân Trong phạm vi của đề tài, nhóm nghiên cứu lựa chọn mẫu dạng viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc 30 mẫu được lấy ngẫu nhiên trên địa bàn thành phố Hà Nội (phụ lục 2.1)

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát các điều kiện LC-MS/MS

 Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp

 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: khảo sát thành phần pha động, tỉ lệ các dung môi trong pha động, chế độ gradient

2.2.2 Khảo sát dung môi chiết, điều kiện chiết và quy trình làm sạch mẫu

Do độ tan của các chất là khác nhau trong các dung môi khác nhau Dựa vào kết quả tham khảo các nghiên cứu [14, 23, 32] và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, 04 dung môi được chọn làm dung môi chiết là: Methanol (MeOH), Acetonitril (ACN), Ethanol (EtOH) và Acetone

03 nền mẫu được lựa chọn để khảo sát bao gồm:

phân tích cũng như tăng tuổi thọ cho cột sắc ký, việc loại tạp mẫu là rất cần thiết 04 cách loại tạp được nghiên cứu lựa chọn là:

 Lọc dung dịch chiết bằng giấy lọc và màng lọc có kích thước 0,22 µm

 Làm sạch qua cột SPE SCX

 Làm sạch qua cột SPE HLB

 Làm sạch bằng kỹ thuật chiết pha rắn d-SPE, sử dụng than hoạt tính

Quy trình làm sạch mẫu được chọn để phân tích mẫu thực tế là quy trình loại được tạp, tăng tuổi thọ cho cột phân tích và cho độ thu hồi, độ lặp lại của mẫu thêm chuẩn nằm trong khoảng cho phép của Hiệp hội các nhà hóa học phân tích truyền thống (AOAC)

 Lấy mẫu tại địa bàn Hà Nội

 Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá kết quả

2.3 Thiết bị phân tích

 Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ gồm hệ thống sắc ký lỏng LC20AD Shimadzu kết hợp với khối phổ 5500QQQ, AB SCIEX, USA (hình 2.1)

 Máy đồng nhất mẫu, Phillips

 Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo

 Máy lắc xoáy, IKA

 Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

2.4 Dụng cụ phân tích

 Micropipet có thể tích điều chỉnh được 20-200µL, 100-1000µL và 5000µL

 Cột chiết pha rắn SPE – HLB (Waters)

 Cột chiết pha rắn SPE – SCX (Waters)

 Than hoạt tính (GCB) (Agilent, US)

2.5 Dung môi, hóa chất

Hoá chất sử dụng đều thuộc cấp độ LC-MS

2.5.1 Dung môi

 Methanol (Merck)

 Acetonitrile (Merck)

 Acetone (Merck)

 Ammoni hydroxide (Merck)

 Ammoni acetate (Merck)

 Acid formic (Merck)

 Chloroform (Merck)

 Muối Magie sulfate (Merck)

 Muối natri clorua (Merck)

 Nước deion

2.5.2 Chất chuẩn

 Chuẩn Sibutramine hydrochloride (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 99,5%

 Chuẩn Desmethyl sibutramine (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 99,5%

 Chuẩn Didesmethyl sibutramine (Sigma Aldrich), độ tinh khiết 99,5%

2.5.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

* Dung dịch chuẩn gốc: 500 µg/mL

Cân chính xác khoảng 0,0125g ± 0,0001 từng chuẩn gốc SB, DSB và DDSB vào cốc cân có mỏ riêng biệt Thêm 5 mL MeOH, hòa tan chuẩn, chuyển lần lượt vào các bình định mức 25mL, tráng rửa cốc cân đựng chuẩn nhiều lần, gộp dịch và định mức đến vạch bằng methanol, dung dịch các chuẩn gốc thu được có nồng độ

500 µg/mL Bảo quản 12 tháng ở nhiệt độ 4oC

* Dung dịch chuẩn trung gian 5 µg/mL

Hút chính xác 0,1 mL từng dung dịch chuẩn gốc 500 µg/mL bằng pipet, lần lượt cho vào các bình định mức 10 mL, thêm methanol, lắc đều, định mức tới vạch Dung dịch chuẩn trung gian của từng chuẩn có nồng độ 5 µg/mL Bảo quản ở 4oC,

sử dụng trong 1 tháng

* Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc

Dung dịch chuẩn làm việc hỗn hợp được pha chế từ các chuẩn đơn trung gian Hút chính xác 1 mL lần lượt từng chuẩn đơn trung gian vào bình định mức 50

mL, thêm 10 mL MeOH, lắc đều, định mức tới vạch Hỗn hợp chuẩn làm việc thu được có nồng độ 100 ng/mL Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc sẽ được pha mới vào mỗi ngày phân tích mẫu

* Xây dựng dãy chuẩn

Dãy chuẩn SB, DSB và DDSB có nồng độ nằm trong khoảng từ 5 ng/mL đến

100 ng/mL Dãy chuẩn gồm 5 điểm chuẩn có nồng độ lần lượt là 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL và 100 ng/mL

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ được sử dụng là hệ thống khối phổ 5500QQQ ghép nối với hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC20AD của Shimadzu được thể hiện trong hình 2.1, đây là thiết bị có độ nhạy cao, phù hợp với đối tượng mẫu phân tích là mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nền mẫu phức tạp Do đó, nhóm nghiên cứu đã chọn để định lượng SB, DSB và DDSB

Hình 2.1 Thiết bị LC-MS/MS 5500QQQ được lựa chọn sử dụng

* Điều kiện LC

Cột sắc ký C18 (100mm x 2,1mm, 3,5µm) và tiền cột tương ứng của hãng Waters, Mỹ được lựa chọn trong đề tài này Loại dung môi, tỉ lệ các thành phần dung môi, tốc độ rửa giải của pha động ảnh hưởng đến hiệu quả tách các chất Đây

là lí do cần phải khảo sát thành phần hệ pha động, tốc độ rửa giải trong quá trình phân tích SB, DSB và DDSB Dựa trên một số tham khảo [9, 10, 16, 20, 32] và các dung môi, hóa chất của phòng thí nghiệm, 05 hệ pha động được lựa chọn trong nghiên cứu bao gồm:

 Hệ pha động 1: kênh A: ACN, kênh B: ammoni acetate 2mM;

 Hệ pha động 2: kênh A: MeOH, kênh B: ammoni acetate 2mM;

 Hệ pha động 3: kênh A: ACN, kênh B: ammoni formate 2mM;

 Hệ pha động 4: kênh A: ACN, kênh B: ammoni formate 2mM+ acid formic 0,1%;

 Hệ pha động 5: kênh A: ACN, kênh B: ammoni acetate 2mM + acid formic 0,1%/H2O

* Điều kiện MS

Sau khi được phân tách bởi hệ thống LC, chất phân tích sẽ được hóa hơi tạo thành các ion Các ion được chuyển đến lối vào của hệ thống phân tích khối phổ MS loại dung môi chuyển vào bộ phận MS của máy khối phổ thông qua bộ phận ghép nối LC-MS

Điều kiện phân mảnh, điều kiện của nguồn và khí được tự động tối ưu trên

hệ thống MS Bơm trực tiếp dung dịch mỗi chuẩn đơn vào đầu dò khối phổ với chế

độ ion dương (ESI+), chế dộ ghi phổ MRM Lựa chọn 1 ion mẹ và 2 ion con đối với mỗi chất phân tích, ion có cường độ cao hơn được sử dụng để định lượng, ion có cường độ thấp hơn sử dụng để khẳng định

2.6.2 Phương pháp xử lý mẫu

* Chuẩn bị mẫu sơ bộ

 Mẫu dạng viên nang cứng: lấy khoảng 20 viên, bỏ vỏ, xay trộn đều

 Mẫu dạng viên nang mềm: lấy khoảng 20 viên, bỏ vỏ, xay trộn đều

 Mẫu dạng trà túi lọc: lấy 20 túi lọc, bỏ túi, xay trộn đều khoảng 20 – 50 g

* Quy trình chiết

 Khảo sát dung môi chiết

Để chọn được dung môi chiết mẫu thích hợp, mẫu được chiết bằng 04 loại dung môi khác nhau: MeOH, ACN, EtOH, Acetone (như phần 2.2.2) Mẫu thêm chuẩn được chiết bằng 4 dung môi, dung môi được lựa chọn là dung môi cho độ thu hồi mẫu thêm chuẩn cao hơn Mẫu thêm chuẩn là mẫu có nền là TPBVSK hỗ trợ giảm cân không chứa chất phân tích, sau đó được thêm các chuẩn SB, DSB và DDSB

 Khảo sát thời gian chiết

Sau khi chọn được dung môi chiết phù hợp, tiến hành khảo sát thời gian chiết mẫu Cân mẫu, thêm dung môi, rung, siêu âm và chiết trong 10 phút, 30 phút, 60 phút So sánh hiệu suất thu hồi của chất phân tích để chọn thời gian chiết thích hợp

 Khảo sát số lần chiết

Chất phân tích tan trong dung môi chiết, để chiết được tối đa chất phân tích khỏi nền mẫu, thông thường sẽ chiết nhiều lần Chất phân tích được tiến hành chiết 1 lần, 2 lần, 3 lần trên cả 3 nền mẫu: viên nang cứng, viên nang mềm và trà túi lọc Đánh giá hiệu suất thu hồi để chọn lựa số lần chiết phù hợp

 Khảo sát quy trình làm sạch mẫu

Sau khi lựa chọn được dung môi chiết, do mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe thường

có chứa các tạp màu, để loại tạp và tăng tuổi thọ cho thiết bị LC-MS/MS, nhóm

nghiên cứu tiến hành khảo sát 4 quy trình làm sạch mẫu khác nhau Mẫu sau khi chiết và định mức, sẽ được tiến hành làm sạch theo các qui trình như trong bảng 2.1

Quy trình 3

Làm sạch qua cột SPE HLB (mẫu được hòa tan trong dung dịch acid

H3PO4)

Quy trình 4

Làm sạch bằng kỹ thuật d-SPE sử dụng các bon hoạt tính (mẫu sau khi chiết bằng MeOH, thêm 4,0 gam MgSO4, 1,5 gam NaCl lắc mạnh 1 phút, rung siêu âm 30 phút và định mức) Lọc mẫu qua

- Rửa giải: 4 mL MeOH : NH4OH (95:5, v/v)

- Hoạt hóa cột: 3 mL MeOH, 3 mL H2O

- Nạp mẫu: 4 mL

- Rửa tạp: 3 mL H2O

- Rửa giải: 3 mL MeOH

- Hút 10 mL dịch chiết vào ống d-SPE có chứa sẵn 25 mg GCB

- Lắc khoảng 30 giây –

1 phút

- Ly tâm khoảng 1 phút, hút ra vial (không

để lâu trong ống chứa bột làm sạch, tránh ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi)

Mẫu sau khi được làm sạch ở các điều kiện khác nhau sẽ được tiến hành phân tích trên thiết bị LC-MS/MS Đánh giá độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn theo 4 quy trình trên là căn cứ để chọn lựa quy trình làm sạch mẫu tối ưu

2.6.3 Phương pháp thẩm định

2.6.3.1 Tính chọn lọc

Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá bằng cách so sánh phổ của mẫu chuẩn SB, DSB, DDSB trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn Mẫu trắng không được lên tín hiệu của chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải

có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng IP, yêu cầu có tối thiểu 4 điểm IP và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC657/20002 của Châu Âu

2.6.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) [1]

Trong đó: S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu đường nền (S/N = 3)

LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N = 10)

2.6.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó

có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích, tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính

Để xác định khoảng tuyến tính chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn

có nồng độ thay đổi từ 5 đến 100 ng/mL và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được và nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng được có hệ số tương quan R nằm trong khoảng từ 0,995 đến 1 Sử dụng đường chuẩn để định lượng SB, DSB và DDSB