Xác định thành phần và khối lượng của plutionium trong nguồn pube bằng phương pháp gamma

Sự hình thành sắc tố melanin trong quá trình phát triển của cá ngựa vằn ..... Để trả lời câu hỏi này, chúng tôi chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết hà thủ ô đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC -o0o -

Lê Thị Liên

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô

ĐỎ (POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG

SINH TỔNG HỢP MELANINE Ở MỨC ĐỘ

IN VITRO VÀ IN VIVO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

LÊ THỊ LIÊN

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA DỊCH CHIẾT HÀ THỦ Ô ĐỎ

(POLYGONUM MULTIFLORUM) LÊN KHẢ NĂNG SINH

Hoàn thành đề tài nghiên cứu này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc

tới TS Nguyễn Đình Thắng đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động

viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo thuộc chuyên ngành Sinh học thực nghiệm đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các cán bộ, sinh viên Phòng Sinh học Nano và Ứng dụng và phòng Ung thư thực nghiệm - thuộc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein những người đã giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới đề tài mang mã số KLEPT-14-02 vì đã hỗ trợ kinh phí cho các nghiên cứu trong luận văn này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người

đã tạo cho tôi điều kiện tốt nhất để hoàn thành đề tài nghiên cứu này

Hà Nội, ngày 29 tháng 8 năm 2016

Học viên

Lê Thị Liên

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Mô hình nghiên cứu 2

1.1.1 Mô hình nghiên cứu in vitro 2

1.1.2 Mô hình nghiên cứu in vivo 2

1.2 Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) 3

1.2.1 Đặc điểm chung 3

1.2.2 Tác dụng hà thủ ô đỏ trong y học 4

1.2.3 Một số nghiên cứu trên thế giới 5

1.3 Melanin 5

1.3.1 Giới thiệu về melanin 5

1.3.2 Melanocyte 6

1.3.3 Melanosome 7

1.3.4 Cơ sở hóa sinh của quá trình tổng hợp melanin 7

1.3.5 Cơ sở di truyền của quá trình tổng hợp melanin 8

1.3.6 Con đường tín hiệu điều hòa sinh tổng hợp melanin 9

1.3.7 Các chỉ thị phân tử xác định mức độ biểu hiện melanin 10

1.4 Sự hình thành sắc tố melanin trong sự sinh trưởng của cá ngựa vằn 11

1.4.1 Cá ngựa vằn 11

1.4.2 Sự hình thành sắc tố melanin trong quá trình phát triển của cá ngựa vằn 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Hóa chất 17

2.1.3 Thiết bị 18

2.1.4 Dụng cụ và vật tư tiêu hao 18

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Tách chiết hà thủ ô 18

melanin ở mức độ in vitro 20

2.2.3 Khảo sát tác dụng của các dịch chiết lên khả năng sinh tổng hợp melanin ở mức độ in vivo 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tách chiết hà thủ ô đỏ 29

3.2 Kết quả nghiên cứu in vitro 29

3.2.1 Kết quả hoạt hóa và nhân nuôi tế bào 29

3.2.2 Độc tính của cao dịch chiết hà thủ ô đỏ đối với sự sinh trưởng của tế bào SK-MEL-28 30

3.2.3 Ảnh hưởng của cao dịch chiết lên sự tăng sinh tổng hợp melanin của các tế bào SK-MEL-28 32

3.2.4 Con đường tác dụng của cao dịch chiết HTO lên sự tổng hợp melanin 34

3.3 Kết quả in vivo 41

3.3.1 Thử độc tính của methanol lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn 41

3.3.2 Thử độc tính của dịch chiết của hà thủ ô đỏ trong methanol lên sự phát triển của phôi cá ngựa vằn 45

3.3.3 Đánh giá khả năng tăng sinh tổng hợp melanin của dịch chiết hà thủ ô trong methanol lên cá ngựa vằn ở mức độ phiên mã 48

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

Bảng 1.1 Đặc điểm nổi bật của các thời kì phát triển của phôi cá ngựa vằn 13

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao trong nghiên cứu 18

Bảng 2.4 Các đoạn mồi đặc hiệu sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng 2.5 Các thành phần phản ứng PCR trong nghí nghiệm in vitro 24

Bảng 2.6 Các đặc điểm gây chết trong quá trình phơi nhiễm phôi 26

Bảng 2.7 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ef1α 26

Bảng 2.8 Các thành phần của phản ứng PCR trong thí nghiệm vi vitro 27

Bảng 2.9 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen mitf 27

Bảng 2.10 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen tyrosinase 28

Bảng 3.1 Khối lượng các cao dịch chiết thu được từ bột khô rễ HTO đỏ 29

Bảng 3.2 Kết quả đo nanodrop của RNA tổng số tách được từ tế bào 35

Bảng 3.3 Dải nồng độ methanol dùng để thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn 41

Bảng 3.4 Bảng thống kê dị dạng gây ra bởi methanol 42

Bảng 3.5 Dải nồng độ dịch chiết hà thủ ô trong methanol dùng để thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn 45

Bảng 3.6 Bảng thống kê dị dạng gây ra bởi dịch chiết hà thủ ô trong methanol 46

Bảng 3.7 Môi trường phơi nhiễm phôi cá ngựa vằn dùng cho thí nghiệm thử hoạt tính 48

Bảng 3.8 Kết quả tinh sạch ARN tổng số 48

Bảng 3.9 Kết quả tổng hợp cADN 49

Hình 1.1 Cây và củ hà thủ ô đỏ 3

Hình 1.2 Công thức hóa học của eumelanin và pheomelanin 6

Hình 1.3 Chuỗi phản ứng tổng hợp melanin 7

Hình 1.4 Con đường tín hiệu điều khiển quá trình sinh tổng hợp melanin 9

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi cá ngựa vằn 14

Hình 2.1 Hình ảnh tế bào SK-MEL-28 20

Hình 2.2 Chu trình nhiệt PCR 27

Hình 3.1 Tế bào SK-MEL-28 (sau 24h hoạt hóa) 30

Hình 3.2 Tế bào sau khi bổ sung cao dịch chiết HTO đỏ ở các nồng độ khác nhau 31

Hình 3.3 Biểu đồ đánh giá độc tính HTO đỏ 31

Hình 3.4 Tế bào sản sinh melanin nội bào và ngoại bào 33

Hình 3.5 Sự khác biệt về hàm lượng melanin sinh ra đối với các nồng độ dịch chiết HTO đỏ khác nhau 33

Hình 3.6 Biểu đồ đánh giá hàm lượng melanin tổng số 34

Hình 3.7 Mức độ biểu hiện của gene giữ nhà GAPDH của cDNA các mẫu tế bào melanoma 36

Hình 3.8 Mức độ biểu hiện của gene MC1R của cDNA các mẫu tế bào melanoma 37

Hình 3.9 Mức độ biểu hiện của gene MITF (A) và tyrosinase (B) của cDNA các mẫu tế bào melanoma 38

Hình 3.10 Mức độ biểu hiện của gene Nras (120bp) của cDNA các mẫu tế bào melanoma 39

Hình 3.11 Mức độ biểu hiện của gene ERK của cDNA các mẫu tế bào melanoma 40

Hình 3.12 Một số dị dạng quan sát được khi phơi nhiễm bằng methanol 43

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót và tỷ lệ dị dạng khi phơi nhiễm bằng methanol ở phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi 44

Hình 3.14 Một số dị dạng quan sát được khi phơi nhiễm bằng dịch chiết hà thủ ô trong methanol 46

Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ sống sót và tỷ lệ dị dạng khi phơi nhiễm bằng dịch chiết hà thủ ô trong methanol ở phôi (ấu thể) cá ngựa vằn bốn ngày tuổi 47

Hình 3.16 Kết quả điện di và phân tích hình ảnh điện di Chú thích: A – Gen ef1α

B – Gen mitf C – Gen tyrosinase 50

ARN : Acid ribonucleic

cADN : Complement acid deoxyribonucleic

cAMP : Cyclic adenosine monophosphate

dpf : Day post fertilisation (ngày sau thụ tinh)

ef1α : Elongation factor 1 alpha (nhân tố kéo dài 1 alpha)

ERK : extracellular -signal -regulated kinases

EtAc : Ethyl acetate

Fw : Forward Primer (Mồi xuôi)

HTO : Hà thủ ô

mc1r : Melanocortin 1 receptor

MC1R : Melanocortin-1-receptor

MeOH : Methanol

mitf : Microphthalmia-associated transcription factor

(nhân tố phiên mã liên kết với microphthalmia)

Rv : everse primer (Mồi ngược)

PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng nhân gen)

PKA : Protein kinase A

SDS : Sodium dodecyl sulphate

TRP1 : Tyrosinase-related protein 1

TRP2 : Tyrosinase-related protein 2

UV : Tia cực tím

α-MSH : α -Melanocyte-stimulating hormone

1

MỞ ĐẦU

Melanin là một loại sắc tố màu nâu hoặc đen, được tìm thấy trong rất nhiều các sinh vật sống, từ nấm, thực vật đến động vật có vú Nó có chức năng khác nhau trong tất cả các sinh vật [13] Ở người, melanin là yếu tố quyết định chính của màu

da, màu tóc Melanin cũng được tìm thấy trong các mô sắc tố nằm bên dưới tròng đen của mắt, tế bào thần kinh và sắc tố mang trong các khu vực của não, chẳng hạn như các locus coeruleus và chất đen [43] Rối loạn tổng hợp hoặc con đường truyền dẫn melanin được xem là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng tóc bị nhạt màu, nám, tàn nhang, đốm nâu và sạm da Sự rối loạn sắc tố melanin được gây ra bởi rất nhiều nguyên nhân, bao gồm: yếu tố nội sinh (do di truyền) và yếu tố ngoại sinh (chế độ dinh dưỡng không hợp lý, thường xuyên thức khuya, hút thuốc lá, bị stress, sốc tâm lý, tia UV ) [52] Ở thời điểm hiện tại, chưa có một số liệu thống kê cụ thể nào về tỷ lệ bệnh nhân bị bạc tóc sớm, nákm, tàn nhang, sạm da và cũng chưa có nhiều nghiên cứu chuyên sâu về melanin và cơ chế sinh tổng hợp melanin từ đó tìm

ra các phương pháp điều trị [52]

Ngày nay, việc chữa bệnh bằng các dược liệu có nguồn gốc tự nhiên đang được các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Từ lâu, nguồn dược liệu có sẵn trong tự nhiên này được dân gian sử dụng làm thuốc điều trị nhiều loại bệnh, chẳng hạn như bệnh tim, hen suyễn, ho, thấp khớp, tiểu đường, và cho thấy có những kết quả khả quan [3] Bên cạnh đó, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược ít có tác hại đối với sức khỏe con người, trong khi đó thuốc tổng hợp hóa học lại rất dễ gây các tác dụng phụ không mong muốn [3] Các nước phương Đông, đặc biệt là Việt Nam, nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nóng ẩm quanh năm, do vậy mà hệ thống thực vật tương đối đa dạng và phong phú, tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển thuốc chữa bệnh từ các loại thảo dược

Theo kinh nghiệm dân gian, ông cha ta đã biết dùng hà thủ ô để chữa bạc tóc sớm Hà thủ ô có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp melanin Để trả lời câu hỏi

này, chúng tôi chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) lên khả năng psinh tổng hợp melanin ở mức độ

in vitro và in vivo” với mục đích: Phân tích ảnh hưởng của các dịch chiết hà thủ ô

đỏ lên khả năng tăng sinh tổng hợp của melanin trên mô hình tế bào và mô hình phôi cá ngựa vằn

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Mô hình nghiên cứu

1.1.1 Mô hình nghiên cứu in vitro trong thử nghiệm trên tế bào

Phương pháp nghiên cứu trong sinh học thực nghiệm cho phép người nghiên cứu sử dụng thành phần, hay bộ phận của một sinh vật (thường ở quy mô tế bào hay

vi khuẩn) dưới dạng cô lập được khỏi môi trường thông thường của nó, để có thể nghiên cứu và phân tích chi tiết hơn trước khi thực hiện trên sinh vật sống Nói cách

khác, đây là thử nghiệm thường được gọi là "thí nghiệm trong ống nghiệm" [54]

Viê ̣c các tế bào đô ̣ng vâ ̣t có thể nuôi cấy , duy trì sự tăng sinh trong các chai , đĩa ngày càng dễ dàng hơn trong các phòng thí nghiê ̣m đã mở ra hướng đi mới quan trọng trong công cuô ̣c tìm kiếm các hoa ̣t chất có vai trò quan tr ọng trong lĩnh vực y học Có thể thấy được các ưu điểm của mô hình nghiên c ứu này là khả năng tự đô ̣ng hóa cao , rút ngắn được thời gian nghiên cứu và cho phép quan sát tr ực tiếp diễn biến tra ̣ng thái bê ̣nh lí của tế bào Đồng thời, nhà nghiên cứu có thể thao tác cùng lúc trên nhiều dòng tế bào khác nhau , nhiều hơ ̣p chất khác nhau với dải nồng đô ̣

rô ̣ng Tuy nhiên, mô hình này có nhược điểm là tương tác giữa các tế bào với hợp chất chỉ theo mô ̣t chiều, thiếu đi sự tương tác giữa các tế bào với hê ̣ miễn di ̣ch cũng như của hê ̣ miễn di ̣ch với chất thử nghiê ̣m ; điều kiê ̣n làm viê ̣c phải hoàn toàn vô trùng đòi hỏi kĩ thuâ ̣t và kinh nghiê ̣m cao của người làm thí nghiê ̣m , chi phí cho thí nghiê ̣m đắt tiền

1.1.2 Mô hình nghiên cứu in vivo trong thử nghiệm trên cá ngựa vằn

Phương pháp in vivo được dùng để chỉ những thí nghiệm dùng các mô sống hay toàn bộ cơ thể còn sống làm đối tượng thử nghiệm Các phương pháp in vivo khác với in vitro (thí nghiệm ngoài cơ thể sống, thử nghiệm trong ống nghiệm) và các thí nghiệm trên các mô hay cơ thể đã chết Thông thường, khi nói đến in vivo,

người ta thường nghĩ đến các thí nghiệm, thử nghiệm trên đối tượng là sinh vật sống Các thí nghiệm sử dụng động vật hay các thử nghiệm lâm sàng trên người là

ví dụ của nghiên cứu in vivo [55]

Mô hình in vivo có ưu điểm nổi bật là đánh giá được chính xác tác động của

thuốc lên có thể sinh vâ ̣t do có đầy đủ sự tương tác của yếu tố : chất thử nghiê ̣m và

hê ̣ miễn di ̣ch của đối tượng thử nghiệm

3

Có nhiều loại động vật được sử dụng để xây dựng mô hình in vivo như thỏ,

cá, chuô ̣t, gà, Tuy nhiên, viê ̣c thử nghiê ̣m trên đô ̣ng vâ ̣t vấp phải vấn đề về đa ̣o đức sinh ho ̣c, hàng năm có hàng nghìn độn g vâ ̣t bi ̣ giết để phu ̣c vu ̣ cho mu ̣c đích thí nghiê ̣m của con người

Thử nghiê ̣m đô ̣c tính trên mô hình in vivo thường tốn nhiều thời gian và cần

theo dõi chă ̣t chẽ , thường xuyên của người làm thí nghiê ̣m , cần có khu vực thí nghiệm rô ̣ng rãi, có đầy đủ điều kiện phù hợp với động vật thí nghiệm

Như vâ ̣y , viê ̣c sử du ̣ng bất thể kì mô hình nào cũng có ưu điểm và nhược

điểm riêng Nếu như mô hình in vitro thể hiê ̣n rõ ưu điểm trong quá trình sàng lo ̣ c

nhanh với thời gian ngắn , khả năng tự động hóa cao , sàng lo ̣c được nhiều chất trên

quy mô lớn thì mô hình in vivo lại cho phép đánh giá chính xác tác động của thuốc

lên khối u của cơ thể Tùy vào mục đích thí nghiệm , người nghiên cứu phải lựa chọn mô hình nuôi cấy phù hợp , tránh lãng phí , đă ̣c biê ̣t là vấn đề đ ạo đức trong sinh ho ̣c

Dựa trên mục đích nghiên cứu của đề tài, chúng tôi xây dựng mô hình thử nghiệm trên phôi cá ngựa vằn

4

Đặc điểm thực vật: Dây leo nhỏ, sống dai, có rễ phình thành củ Thân quấn

mọc xoắn vào nhau, màu xanh tía Lá mọc so le, hình tim, có mũi nhọn ở đỉnh, dài 4 – 8 cm, rộng 2,5 – 5 cm Cuống lá có phủ lông, bẹ chìa mỏng, màu nâu nhạt Hoa hợp thành chùy ở nách lá hay ở ngọn, có nhiều nhánh Hoa nhiều, nhỏ, đường kính

2 mm mọc ở nách các lá bắc ngắn Bao hoa màu trắng ngà, nhị 8 trong đó có 3 nhị hơi dài Quả 3 góc nhẵn bóng nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài còn lại phát triển thành cánh rộng [2]

Phân bố: Cây mọc hoang ở vùng núi cao các tỉnh phía Bắc như Lào Cai, Sơn

La, Lai Châu, Yên Bái

Bộ phận dùng: Rễ củ tròn hoặc hình thoi, thường có những sống lồi dọc theo

củ Củ dài 6 – 16 cm, chỗ phình thường có đường kính 4 – 8 cm Có thể gặp những

củ dài đến 40 cm, đường kính trên 10 cm Mặt ngoài màu nâu đỏ, mặt cắt màu hồng, có bột Vị hơi đắng chát Thu hoạch vào mùa thu, đào lấy củ, rửa sạch, cắt bỏ

rễ con, cắt nhỏ rồi phơi hoặc sấy khô [2]

Thành phần hóa học: Thành phần tan trong nước của hà thủ ô có các

dẫn chất stilben glycosid như rhaponticosid; 2,3,5,4’-tetrahydroxystilben-2-O- β-D-glucosid Ngoài ra, hà thủ ô đỏ có nhiều tanin như: 3,3’-diOgalloylprocyanidin-B-2, 3-O-gallyol-l-catechin, 3-O-galloyl-l-epicatechin, 3-O-galloyl-procyanidin-B-

1, d-catechin, d-epicatechin và acid gallic Trong củ hà thủ ô đỏ có các dẫn chất anthranoid với hàm lượng thấp: acid chrysophanic, emodin, physcion, chrysophanol anthron, emodin-8-O-β Dglucosid Từ phần tan trong ethyl acetate, một dẫn chất naphtalen với nhóm chức amid cũng được phân lập và xác định cấu trúc với tên là polygonimitin A Trong thân hà thủ ô đỏ còn có chứa polygoacetophenoside, acid chrysophanic anthron, chrysophanol [2]

1.2.2 Tác dụng hà thủ ô đỏ trong y học

Hà thủ ô có rất nhiều công dụng, chẳng hạn như chống oxy hóa, bảo vệ cơ

tim ex vivo, giảm xơ cứng động mạch, tăng tạo hồng cầu, mà nổi bật trong số đó

là hoạt tính chống oxy hóa Cao dịch chiết hà thủ ô ở phân đoạn ethyl acetate có tác dụng chống oxy hóa mạnh, trong đó có các thành phần như anthraquinon, emodin,

5

2,3,5,4’-tetrahydroxystilben-2- O-β-D-glucosid, acid gallic và catechin được xem là một trong những chất có tác dụng chính

Hà thủ ô chưa chế biến có tác dụng nhuận tràng Y học cổ truyền dùng hà thủ

ô đỏ làm thuốc bổ gan thận, bổ máu, thuốc dùng cho những người có râu tóc bạc sớm, lưng gối đau mỏi, đại tiện huyết, ung nhọt, tràng nhạc, thần kinh suy nhược, sốt rét lâu ngày Ngoài ra, hà thủ ô cũng được sử dụng làm thuốc an thần, thuốc cầm

mồ hôi, dùng ngoài trị lở ngứa [1, 2]

1.2.3 Một số nghiên cứu trên thế giới về hà thủ ô đỏ

Dựa trên hiệu quả làm đen tóc của hà thủ ô mà các nhà khoa học đã bắt đầu có những nghiên cứu về cơ chế tác động của nó lên khả năng sinh tổng hợp của melanin:

Năm 2009, Jiang Z và cộng sự đã tìm ra 2, 3, 5, beta-D-glucoside (THSG), một thành phần hòa tan được trong nước chiết xuất từ rễ

4'-tetrahydroxystilbene-2-O-củ khô 4'-tetrahydroxystilbene-2-O-của Polygonum multiflorum, có hoạt tính làm tăng sắc tố trên dòng tế bào

B16 THSG làm tăng hàm lượng melanin và hoạt động của enzyme tyrosinase ở nồng độ thích hợp Xử lý tế bào B16 với 10μg/ml THSG thấy rằng có sự tăng biểu hiện của tyrosinase theo thời gian Sau đó, nhóm nghiên cứu tiếp tục phân tích ảnh hưởng của THSG lên MITF và nhận thấy có sự tăng biểu hiện MITF đồng thời với việc kích hoạt CREB, điều này dẫn đến dự đoán rằng sự hoạt hóa MITF thông qua THSG có thể phụ thuộc vào cAMP [25]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Park H J chứng minh được rằng dịch chiết

Polygonum multiflorum có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng của lông (tóc) từ giai đoạn

Telogen (giai đoạn nghỉ) sang giai đoạn Anagen (giai đoạn tăng trưởng) trên chuột C57BL6/N [41]

1.3 Melanin

1.3.1 Giới thiệu về melanin

Melanin là một protein màu (chromoprotein) được tổng hợp từ tế bào hắc tố

Từ những năm 1916-1921, Bruno-Bloch tìm thấy một chất không màu là DOPA có khả năng bị oxy hóa thành hắc tố dưới ảnh hưởng của DOPA oxidase [9] Năm 1953-1954 Fitzpatrick và Lerner đã xác nhận quá trình trên và phát hiện ra một chất

6

khác là tyrosine cũng tham gia vào quá trình tạo hắc tố của da [20] Quá trình này được tóm tắt như sau: tyrosine (trong máu) + tyrosinase (được hoạt hóa bởi protein-đồng) + tia tử ngoại  tiền hắc tố DOPA + DOPA oxidase + oxy DOPA-quinone

và các quinone khác + tyrosine + oxy  melanin Tyrosinase (tyrosinase, tyrosinase-related protein 1-Tyrp 1 và DCT) có liên quan đến quá trình tạo thành hạt hắc tố, sản xuất eumelanin (hắc tố nâu đen) và pheomelanin (hắc tố vàng đỏ)

Hình 1.2 Công thức hóa học của eumelanin và pheomelanin [12]

Eumelanin là hợp chất cao phân tử có tính kiềm, màu nâu, không tan Eumelanin có thể bị oxy hóa khi có các ion kim loại và tạo thành hắc tố sáng màu hơn [11,12] Eumelanin hấp thu và phân tán tia cực tím, giảm mức độ xâm nhập và tác hại của ánh nắng vào da [14] Pheomelanin là hắc tố có tính kiềm, vàng nhạt Pheomelanin có thể bị oxy hóa và tạo ra các gốc tự do dưới tác động của UVR, gây hại cho DNA Điều này giải thích lý do vì sao người da sáng màu (nhiều pheomelanin) dễ bị bỏng nắng và có nguy cơ cao bị tổn thương DNA tế bào da do UVR, bao gồm cả u tân sinh (neoplasm) [12, 35]

1.3.2 Melanocyte

Tế bào hắc tố tổng hợp hắc tố nâu (melanin), quy định màu sắc của da và tóc, đồng thời bảo vệ da chống lại tác hại của tia tử ngoại (UVR – ultraviolet ray) Về cấu trúc, tế bào hắc tố có dạng cành cây, được biệt hóa từ nguyên bào hắc tố (melanoblast), có nguồn gốc từ mào thần kinh [10, 48] Ngay sau khi ống thần kinh đóng lại, các tế bào hắc tố phát triển thành tế bào hoàn chỉnh và di chuyển đến nhiều nơi khác nhau trong cơ thể như mắt (biểu mô hắc tố võng mạc, mống mắt, màng

7

mạch), tai (dải mạch trong ốc tai), hệ thần kinh trung ương (màng mềm), chất nền của tóc, niêm mạc, da [36] Tín hiệu nào tác động trực tiếp đến quá trình này vẫn đang được nghiên cứu [10, 53]

1.3.3 Melanosome

Trong bào tương của tế bào hắc tố có chứa các “túi hắc tố” đa phân tử được gọi

là melanosome Túi hắc tố là bào quan đặc biệt hình elip, nơi tổng hợp và dự trữ hắc

tố, dự trữ men tyrosinase và xảy ra các hiện tượng sinh hóa hình thành hạt hắc tố melanin [31]

1.3.4 Cơ sở hóa sinh của quá trình tổng hợp melanin

Cả 2 loại eumelanin và pheomelanin đều xuất phát từ hợp chất ban đầu là dopaquinone (DQ) DQ có nguồn gốc từ sự oxy hóa acid amin tyrosine nhờ enzyme tyrosinase DQ là hợp chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin

Hình 1.3 Chuỗi phản ứng tổng hợp melanin [17]

Bước đầu tiên của quá trình này là sự oxy hóa tyrosine thành DOPAquinone nhờ sự xúc tác của enzyme tyrosinase Đây là bước duy nhất trong quá trình tổng hợp melanin bị hạn chế tốc độ, các phản ứng sau này có thể diễn ra một cách tự phát

ở giá trị pH sinh lý [22] Tiếp theo, DOPAquinone tự động oxy hóa tạo nên hai phân tử DOPA và DOPAchrome DOPA hoạt động như là chất nền cho tyrosinase

và bị oxy hóa một lần nữa thành DOPAquinone bởi enzyme này Cuối cùng,

8

eumelanin được tạo thành sau một chuỗi phản ứng oxy hóa từ dihydroxyindole (DHI) và dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA), là các sản phẩm của phản ứng từ DOPAchrome Nếu có mặt cystein (hay glutathione), DOPAquinone tạo thành cysteinylDOPA (hay glutathionylDOPA) và sau đó hình thành nên sắc tố pheomelanin Mặc dù ba enzyme tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 và 2 – TRP

1 và TRP2 đều liên quan đến con đường tổng hợp melanin nhưng chỉ có tyrosinase

là enzyme không thể thiếu được cho quá trình này [30] Tyrosinase là enzyme chỉ được sản xuất duy nhất tại các tế bào melanocyte

Sau khi được tổng hợp và trải qua quá trình chế biến ở lưới nội chất và thể Golgi,

nó được vận chuyển tới melanosome, xúc tác cho các phản ứng tạo melanin [15]

1.3.5 Cơ sở di truyền của quá trình tổng hợp melanin

Sự điều hòa tổng hợp hắc tố ở động vật có vú được kiểm soát ở nhiều mức

độ khác nhau và bởi nhiều phức hệ ở mỗi mức độ [4] Trong quá trình phát triển phôi, melanocyte ban đầu được phát sinh từ mào thần kinh và di chuyển tới các vị trí đích trên khắp phôi Quá trình này bị kiểm soát một cách chặt chẽ và đây chính là mức độ kiểm soát đầu tiên trong điều hòa tổng hợp hắc tố Quá trình sinh sắc tố (melanogenesis) cũng được điều hòa ở mức độ tế bào thông qua điều khiển sự hình thành melanosome – các hạt được sản xuất với kích thước, số lượng và mật độ khác nhau phụ thuộc vào lượng melanin

Cuối cùng, melanogenesis được điều hòa bởi mức độ dưới tế bào, tức là điều hòa sự biểu hiện của các gen mã cho các enzyme tham gia tổng hợp hắc tố, bao gồm tyrosinase, TRP1 và TRP2 được điều hòa bởi các con đường nội bào Các con đường điều hòa được kích hoạt bởi một loạt các hormone (interleukin, interferon, nhân tố phát triển và prostaglandin) quy định số lượng cũng như chất lượng melanin được tạo thành Các hormone này còn điều khiển các phức hợp tín hiệu đáp ứng lại tác động của tia UV hay tác động của môi trường Có 3 con đường tín hiệu phổ biến điều hòa quá trình sinh hắc tố: con đường α-MSH/MC1R/MITF (hình 1.4), con đường Wnt (β catenin/ MITF), con đường Ras/ERK/MITF (hình 1.4) Trong đó, dù là con đường điều hòa nào cũng phải thông qua MITF MITF liên quan đến sự tồn tại, tăng sinh và biệt hóa melanocyte, nó là nhân tố chính điều hòa quá trình tổng hợp hắc tố ở melanocyte

9

thông qua việc gắn vào hộp M của vùng promoter và điều tiết biểu hiện các gen mã cho tyrosinase, TRP1, TRP2 [20,49] Do vậy, sự tăng cường hoạt động của MITF kích thích biểu hiện các enzyme này, thúc đẩy quá trình tổng hợp sắc tố

1.3.6 Con đường tín hiệu điều hòa sinh tổng hợp melanin

Hình 1.4 Con đường tín hiệu điều khiển quá trình sinh tổng hợp melanin [47]

Ức chế

1.3.6.1 Con đường α-MSH/MC1R/MITF

Con đường cổ điển được coi là con đường chính thống nhất, khởi đầu bằng

sự kích hoạt phân tử MC1R và cuối cùng dẫn đến biểu hiện phiên mã của gene tyrosinase MC1R đóng vai trò trung gian trong một con đường truyền tín hiệu cổ điển ở màng melanocyte

10

Khi MC1R được gắn vào thụ thể Gαs của nó ở trên màng tế bào melanocytes, các hoóc môn kích hoạt adenylate cyclase (AC) để sản xuất cAMP cAMP được sản xuất ra sẽ kích hoạt PKA, sau đó kích hoạt MITF phiên mã thông qua việc phosphoryl hóa các protein CREB Sự phiên mã của các tyrosinase, TYRP1 và TYRP2 được quy định bởi các yếu tố phiên mã MITF Nhờ đó, khi MC1R trong melanocyte được kích hoạt sẽ làm kích thích sự tổng hợp melanin, đặc biệt là eumelanin thông qua việc thúc đẩy phiên mã của tyrosinase [18]

Khi α-MSH liên kết với MC1R có thể làm tăng đến 100 lần sự tổng hợp melanin Ngoài α-MSH thì β-MSH và hormone vỏ thượng thận (ACTH), cũng có khả năng kích thích quá trình sinh tổng hợp melanin theo cùng con đường đó [28]

1.3.6.2 Con đường Ras/ERK/MITF

 Quá trình tổng hợp melanin theo con đường ERK

- Con đường thứ hai đi từ cAMP là con đường Ras/ERK

- cAMP kích hoạt Ras, dẫn đến kích hoạt B-Raf, MEK và ERK Ras/ERK kích hoạt trong các tế bào này có hai tác dụng: Ban đầu, phosphoryl hóa MITF dẫn đến tăng cường hoạt động phiên mã của promoter tyrosinase, cuối cùng làm tăng sự tổng hợp melanin [32]

1.3.7 Các chỉ thị phân tử xác định mức độ biểu hiện melanin

1.3.7.1 Tyrosinase

Tyrosinase là một enzyme có hai hoạt tính hydroxylase và DOPA oxidase được mã hóa bởi gen tyrosinase tham gia xúc tác cho hai bước đầu tiên của quá trình chuyển hóa tyrosine thành melanin

Tyrosinase gắn vào màng ngoài của hạt melanosome, cấu trúc gồm có ba phần: một phần nằm trong melanosome có hoạt tính xúc tác của enzyme, phần thứ hai ngắn nằm xuyên màng và cuối cùng là phần cho phép tyrosinase gắn chính xác vào các hạt melanosome [6]

Như đã nhắc đến ở trên tyrosinase là enzyme không thể vắng mặt trong chuỗi phản ứng tạo melanin, do đó đây chính là một chỉ thị phân tử cho phép xác định gián tiếp mức độ biểu hiện của sắc tố melanin

2001, tạp chí Nature), MITF-M có thể được tăng cường biểu hiện bởi các yếu tố hoạt động ở dạng cis như CREB, PAX3, SOX10 hay protein Wnt (là các glycoprotein giàu cystein) Hoạt động cụ thể của MITF-M chính là nhân tố phiên

mã đóng vai trò chìa khóa cho tyrosinase Nó tăng cường điều hòa và thúc đẩy sự biểu hiện của tyrosinase Ngoài ra, MITF còn liên hệ hết sức mật thiết đối với sự tồn tại của tế bào melanocyte [41] Vì những lý do trên mà MITF được coi là một chỉ thị có giá trị trong đánh giá biểu hiện melanin ở tế bào melanocyte

1.4 Sự hình thành sắc tố melanin trong sự sinh trưởng của cá ngựa vằn

1.4.1 Cá ngựa vằn

Cá ngựa vằn Danio rerio còn được biết đến với tên gọi Brachydanio rerio là một loài cá nhỏ nước ngọt nhiệt đới Cá ngựa vằn thuộc chi Danio, họ Cá chép Cyprinidae, bộ Cá chép Cypriniformes, lớp Cá xương Actinopterygii, ngành có dây sống Chodarta, giới Animalia (theo Hamilton, 1822) Loài cá này phân bố chủ yếu

ở Nam Á, đặc biệt là vùng Bắc Ấn Độ, Pakistan, Nepal và Bhutan Cá ngựa vằn có thân mỏng, hơi dẹp bên, lưng màu oliu nâu, bụng màu trắng, có bốn sọc màu chạy

12

dọc cơ thể Chiều dài thân của cá trưởng thành khoảng 3 – 5 cm Con cái lớn hơn con đực, bụng tròn hơn Vòng đời của chúng ngắn, sau khoảng 3 tháng có thể thành thục sinh sản Trong tự nhiên, cá sinh sản theo mùa, tuy nhiên trong phòng thí nghiệm, có thể cho cá sinh sản theo chu kì sáng tối với 14 giờ chiếu sáng và 10 giờ tối Chúng sinh sản tốt nhất trong điều kiện nhiệt độ môi trường nước khoảng 27 – 28˚C [16]

Cá ngựa vằn được đưa vào với quy mô lớn từ những năm cuối thập niên 70, đầu thập niên 80 và nhanh chóng trở thành sinh vật mô hình lý tưởng cho nghiên cứu sinh học phát triển cũng như các quá trình sinh học của tế bào Cá ngựa vằn có kích thước nhỏ, sống thành đàn, dễ chăm sóc, dễ dàng nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm Cá đẻ trứng với số lượng lớn (khoảng 200 trứng/1 tuần/1con cái), quá trình sinh sản có thể được điều khiển bằng chu kì sáng tối nên có thể chủ động về nguồn phôi cá trong quá trình nghiên cứu So với các động vật có xương sống khác thì sự phát triển của phôi cá ngựa vằn là vô cùng nhanh, chỉ mất khoảng 2 ngày, ấu trùng nở vào ngày thứ 3, đến ngày thứ 5 hầu hết các loại tế bào đã biệt hóa và cá con

có đủ chức năng của chúng Quá trình phát triển phôi cá ngựa vằn về cơ bản cũng tương tự như các động vật có xương sống, bao gồm cả người và động vật có vú khác Tuy nhiên, sự phát triển của phôi cá ngựa vằn lại xảy ra ở ngoài cơ thể mẹ, điều này cho phép thao tác dễ dàng với phôi mà không làm ảnh hưởng tới cá mẹ Hơn nữa, không giống như chim và bò sát, chúng có lớp vỏ trứng trong suốt và trứng tương đối nhỏ nên có thể quan sát trực tiếp qua từng giai đoạn nhờ kính hiển vi quang học mà không cần bất cứ sự can thiệp nào (như mổ và cắt phôi) hay các kỹ thuật hiện đại [16, 32] Ngoài ra, hệ genome của cá ngựa vằn có mức độ tương đồng cao với các động vật có xương sống bậc cao hơn, bao gồm cả người [24]

Thêm vào đó, cá ngựa vằn thu hút ngành công nghệ dược vì phôi cá ngựa vằn có thể được sử dụng để sàng lọc các phân tử có hoạt tính sinh học từ nhiều nguồn khác nhau Cá ngựa vằn còn có thể được sử dụng trong các nghiên cứu về độc tố học mà các đột biến được coi là nguyên nhân gây bệnh điển hình ở người hay

để thử thuốc và ứng dụng trong sinh học phát triển [15, 19]

13

Các giai đoạn phát triển của phôi cá ngựa vằn

Theo mô tả của Kimmel và cộng sự (năm 1995), quá trình phát triển sớm của

cá ngựa vằn trải qua bốn thời kì chính, bao gồm: Thời kỳ 0 – 10 giờ 10 –24 giờ, 24 – 48 giờ và 48 – 72 giờ Những đặc điểm phát triển nổi bật của các thời kì được mô

tả ở bảng 1.1 và hình 1.5

Bảng 1.1 Đặc điểm nổi bật của các thời kì phát triển của phôi cá ngựa vằn [29]

0-10 giờ + Giai đoạn hợp tử: Trứng mới được thụ tinh, vừa phải qua chu kỳ

phân cắt đầu tiên của tế bào

+ Giai đoạn phân cắt: 2-7 chu kỳ phân cắt đầu tiên của tế bào diễn ra nhanh chóng và đồng bộ

+ Giai đoạn phôi nang: Chu kì phân cắt thứ 8,9 diễn ra nhanh chóng và các tế bào bắt đầu lan phủ khắp noãn hoàng

+ Giai đoạn phôi vị: Những chuyển động hình thái như sự co cụm, hội

tụ và mở rộng của ngoại bì, nội bì và trục phôi, quá trình lan tỏa của các tế bào kết thúc

10-24 giờ Hình thành các đốt cơ, phát sinh hình thái các cơ quan chính, đuôi dài

ra và xuất hiện những chuyển động đầu tiên của cơ thể

24-48 giờ Trục cơ thể duỗi thẳng về túi noãn hoàng, sự lưu thông của dòng vật

chất trong cơ thể, sự xuất hiện sắc tố đen và vây cá bắt đầu phát triển

48-72 giờ Hoàn thiện nhanh chóng hệ thống các cơ quan chính, sự phát triển sụn

ở đầu và vây ngực, túi khí xuất hiện và phôi cá nở một cách đồng bộ

14

Hình 1.5 Các giai đoạn phát triển của phôi cá ngựa vằn [29]

1.4.2 Sự hình thành sắc tố melanin trong quá trình phát triển của cá ngựa vằn

Trong quá trình phát triển phôi ở động vật có xương sống, các tế bào mào thần kinh được phát sinh dọc theo ống thần kinh lưng, phân tán khắp cơ thể và biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm các tế bào thần kinh cảm giác và thần kinh giao cảm, các tế bào Schwann và các tế bào sắc

tố [12, 44]

Ở cá ngựa vằn có 3 loại tế bào sắc tố chính: xanthophore, iridophore, melanophore (thường dùng ở động vật biến nhiệt, hay còn gọi là melanocyte

ở các động vật hằng nhiệt) Quá trình biệt hóa các tế bào mào thần kinh thường xảy

ra trước khi các tế bào di cư Điều này chứng tỏ rằng các tín hiệu thúc đẩy sự hình thành và phát triển melanocyte xảy ra rất sớm trong quá trình phát triển Sau khi thụ tinh khoảng 24 giờ, tiền melanocyte (melanoblast) bắt đầu biểu hiện sắc tố melanin [44]

15

Mô hình melanocyte ở phôi tiếp tục được phát triển và hoàn thiện trong vòng

48 giờ sau khi thụ tinh, chúng chỉ bổ sung một lượng tối thiểu melanocyte và giảm dần số lượng tế bào này ở 12 ngày tiếp theo của quá trình phát triển ấu trùng [34, 45] Số lượng và sự phân bố các tế bào sắc tố ở cá ngựa vằn là tương đối khác nhau giữa giai đoạn ấu trùng và giai đoạn trưởng thành Trước khi biến thái, sắc tố xanthophore bao phủ hai bên sườn và melanophore tập hợp thành bốn dải sọc riêng biệt: một dải ở phần lưng kéo dài từ đầu tới đuôi dọc theo đỉnh của các đốt cơ, một dải ở phần bên nằm ngang các vách cơ, một dải ở mặt bụng xuất phát từ mắt kéo qua phần lưng noãn hoàng và tới tận chóp đuôi, dải cuối cùng chạy qua phần bụng noãn hoàng [29, 34]

Trong quá trình biến thái, bốn dải melanophore của phôi dần dần biến thành các dải sắc tố của con trưởng thành [27, 40] Lúc bắt đầu biến thái (khoảng 2 tuần sau thụ tinh), xuất hiện các melanophore mới phân tán ở hai bên sườn và các tế bào này dần dần tăng số lượng Khoảng một tuần sau, số lượng các tế bào melanophore tăng nhanh đột ngột, các sọc tối và sáng của con trưởng thành trở nên rõ rệt Ban đầu, hai sọc tối sơ cấp tạo thành hai sọc nằm ngang vách cơ ở mặt lưng và mặt bụng với một sọc sáng nằm giữa, các sọc tối bao gồm melanophore và iridophore, các sọc sáng chứa xanthophore và iridophore Trong quá trình phát triển sau này, khoảng vài tuần và vài tháng, các sọc sáng tối thứ cấp được thêm vào ở mặt lưng và mặt bụng theo sự phát triển của cá, với 4-5 sọc tối ở mỗi con cá trưởng thành

Cuối cùng, mặc dù sự xuất hiện các sọc sáng tối là kết quả của sự hình thành các tế bào sắc tố nằm sâu trong lớp hạ bì, kề các đốt cơ nhưng sắc tố đen vẫn phổ biến ở bề mặt lưng do các tế bào melanophore liên kết với các vảy da [23]

Quá trình phát triển của melanocyte ở cá ngựa vằn về cơ bản là tương tự các động vật có vú, tuy nhiên vẫn có một số điểm khác biệt Trong khi động vật có vú chỉ có duy nhất một loại tế bào sắc tố là melanocyte thì ở cá lại có nhiều loại như đã nhắc đến ở trên Bắt nguồn từ mào thần kinh, các nguyên bào hắc tố (melanoblast) ở phôi động vật có vú di chuyển qua màng đáy tới lớp biểu bì, tại đây, một số tế bào

bị phân tán và nhiều tế bào còn lại tập trung vào nang tóc Ngược lại, ở cá, các melanocyte lại nằm dưới màng đáy, trừ trường hợp chúng bị đẩy qua da trong quá

16

trình apotosis của tế bào [40, 50] Các melanoblast ở động vật có vú không biểu hiện sắc tố melanin cho tới khi sự di cư của các tế bào xảy ra, còn đối với cá ngựa vằn, loại tế bào này đã biểu hiện melanin từ rất sớm (24h sau khi thụ tinh) [38, 49]

Ngoài ra, ở động vật có vú, melanin được đóng gói trong các hạt melanosome và được vận chuyển từ các tế bào melanocyte sang các tế bào khác như keratinocyte trong quá trình phát triển của tóc hay các tế bào thuộc lớp biểu bì lân cận Trong khi đó, các hạt melanosome được các tế bào melanocyte của cá giữ lại

và chúng có thể được tái phân bố khắp tế bào nhờ mạng lưới vi ống [26]

Sự điều hòa sinh tổng hợp melanin trong tế bào melanocyte ở cá ngựa vằn về

cơ bản cũng giống như ở động vật có vú, đều thông qua các con đường tín hiệu MSH/Mc1r/Mitf, Wnt (β-catenin/Mitf), Ras/Erk/Mitf Quá trình melanogenesis cho

α-dù được điều khiển bởi con đường nào cũng đều thông qua hai phân tử mấu chốt, đó

là mitf và tyrosinase [45] Do đó, có thể phân tích sự biểu hiện phân tử này để từ đó đánh giá gián tiếp mức độ biểu hiện melanin ở cá ngựa vằn

17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thực vật: rễ cây Hà thủ ô đỏ (dạng khô) được cung cấp từ Viện Dược liệu Sau đó được nghiền nhỏ thành bột mịn để dễ dàng sử dụng

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tím tinh thể

18

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40 CFL Đức

Máy siêu âm

Máy PCR

Bể điện di

Máy soi gel

2.1.4 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Bảng 2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao trong nghiên cứu

Đĩa nuôi cấy đa giếng: 96 giếng, 24 giếng Corning Mỹ

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết hợp chất hữu cơ từ rễ cây hà thủ ô đỏ

 Phương pháp:

Ly trích (chiết) là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy môt chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu [10]

19

 Nguyên tắc

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm chất ta có thể dự đoán

sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn li trích

Quy tắc chung: Các dung môi phân cực hoà tan các hợp chất phân cực tốt nhất

và các dung môi không phân cực hòa tan các hợp chất không phân cực tốt nhất Các hợp chất phân cực mạnh như các loại đường (ví dụ như đường mía) hoặc các hợp chất ion, như các muối vô cơ (ví dụ như muối ăn) chỉ hòa tan trong các dung môi phân cực mạnh như nước, trong khi các hợp chất không phân cực mạnh như dầu hoặc sáp chỉ tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực mạnh như hexane [7, 25]

Quy trình tách chiết bột hà thủ ô bằng các dung môi hữu cơ được trình bày ở sơ đồ dưới đây:

20

Các bước tiến hành

- Rễ hà thủ ô phơi khô, nghiền thành dạng bột mịn

- Lấy 5g mẫu bột, thêm 100ml dung môi n-hexan sau đó siêu âm phá vỡ tế bào trong 15 phút rồi khuấy từ trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Sau 1 giờ, thu hỗn hợp đem li tâm với tốc độ 6000rpm trong 5 phút ở 250C, lọc và thu dịch chiết n-hexane lần một cùng với cặn

- Cặn thu được sẽ thêm 100ml n-hexan vào, tiếp tục khuấy từ và li tâm tương tự như trên, thu được dịch chiết n-hexan lần hai và cặn

- Cặn sẽ được làm bay hơi dung môi n-hexan hoàn toàn và tiếp tục khuấy từ trong dung môi ethylacetate Quá trình lặp lại như với dung môi n-hexan để thu được dịch chiết ethylacetate

- Cặn sẽ được tiếp tục khuấy từ trong methanol ở ngày tiếp theo để thu được dịch chiết methanol

- Các dịch chiết được thu lại trong các bình thủy tinh và đem cô quay thu cao khô bằng máy cô quay chân không Mỗi dịch chiết thu được các cao khô tương ứng Cao dịch chiết được bảo quản lạnh để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2 Khảo sát tác dụng của các dịch chiết lên khả năng sinh tổng hợp melanin

ở mức độ in vitro

2.2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tế bào Sk-mel-28 là dòng tế bào ung thư da được phân lập từ một hạch bạch huyết ở nách của một nam giới 51 tuổi không rõ chủng tộc Dòng Sk-mel-28 có chu

kì phân chia là 28h, được nhân nuôi trong trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) ở điều kiện 37oC trong 5% CO2, 95% không khí

Hình 2.1 Hình ảnh tế bào Sk-mel-28

21

Nuôi cấy tế bào

- Pha môi trường nuôi cấy theo tỉ lệ: 90-10-1 (90% DMEM, 10% FBS và 1% Peniciline/Streptomicin)

- Tế bào được bảo quản trong bình nitơ lỏng hoặc tủ -80º C, lấy đem rã đông trong tủ ổn nhiệt 37º C

- Đổ dung dịch chứa tế bào vào 5-7 ml môi trường nuôi cấy, sục đều sau đó cho vào đĩa peptri 100mm ủ trong tủ ấm 37º C, 5% CO2

- Kiểm tra hằng ngày, thay môi trường 2 ngày/lần, khi tế bào mọc kín 90% bề mặt đĩa thì thu hoặc cấy chuyển tế bào sang đĩa mới

75 Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy bằng cách ủ với dung dịch trypsine 1X trong 175 2 phút ở 37º C, 5% CO2, sau đó bất họat trypsine bằng cách bổ sung môi trường nuôi cấy theo tỷ lệ 1:1, hút dịch vào ống ly tâm, ly tâm 1300 rpm trong 5 phút

- Kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào bằng cách nhuộm với thuốc nhuộm blue trypan tỷ lệ 1:1 trong 3-5 phút rồi đem đếm số lượng bằng buồng đếm tế bào

2.2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết hà thủ ô đỏ trong methanol đối với sự phát triển của tế bào

- Nuôi cấy tế bào trên đĩa petri, với thành phần môi trường chuẩn bị trước

- Hút dịch, thêm 2ml trypsin 0,25% và ủ trong 37º C từ 1-5 phút cho tới khi

các tế bào nổi trên mặt đĩa

- Hút tất cả vào ống falcon thể tích 15ml Ly tâm 1300rpm trong 5 phút

- Thu các tế bào sau ly tâm Đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu,

xác định mật độ tế bào

22

 Tra tế bào lên đĩa

- Chuẩn bị 2 đĩa 24 giếng

- Tiến hành tra tế bào vào trong các giếng 24 giếng sao cho mỗi giếng có

2.104 tế bào trong 1ml môi trường nuôi cấy

- Nuôi tế bào trên đĩa 24 giếng ở 37º C, 5% CO2 trong 24h để tế bào ổn định

Sau đó ủ với thuốc

ô trong methanol lên khả năng tăng sinh tổng hợp melanin

Dụng cụ thí nghiệm, hóa chất và các bước tiến hành tương tự như thí nghiệm 2.2.2.3

2.2.2.5 Khảo sát tác động cao dịch chiết hà thủ ô đỏ lên con đường sinh tổng hợp melanin

Để có thể xác định được tác động của cao dịch chiết hà thủ ô đỏ là đi theo con đường nào, chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào SK-MEL-28, khi tế bào ổn định

và đạt đủ yêu cầu về số lượng, chúng tôi tra các tế bào với mật độ cần thiết vào các giếng như sau:

 Giếng 1: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện bình thường

23

 Giếng 2: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường được bổ sung ASP

(agouti – là chất ức chế phân tử MC1R)

 Giếng 3: Tế bào nuôi cấy trong điều kiện môi trường vừa được bổ sung

ASP vừa được bổ sung cao dịch chiết Hà thủ ô đỏ

Tiến hành thu tế bào và dịch tế bào vào các ống khác nhau sau đó sử dụng các dòng kit thương mại để tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA

2.2.2.6 PCR với mồi đặc hiệu với các gen GAPDH, MC1R, MITF, Tyrosinase, ERK, BRAF và NRAS

 Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA

khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của DNA-polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung [3]

 Thành phần tham gia

Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:

- Sợi khuôn DNA, ở đây chúng tôi sử dụng khuôn là cDNA

- Mồi xuôi và mồi ngược của các gene GAPDH, MC1R, MITF, Tyrosinase, ERK, BRAF và NRAS có trình tự như sau:

24

Bảng 2.4 Các đoạn mồi đặc hiệu sử dụng trong thí nghiệm

GAPDH

Mồi xuôi: 5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’

Mồi ngược: 5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’

Tm = 58.9ºC

Tm = 60.8ºC

MC1R

Mồi xuôi: 5’- ACTCCGTCTGCTCCAATG-3’

Mồi ngược: 5’-GCTGTGGGAGTAGCTCTTGG-5’

Tm = 57ºC

Tm = 57.6ºC

MITF

Mồi xuôi: 5’- CCGTCTCTCACTGGATTGGT-3’

Mồi ngược: 5’-TGGGCTTGCTGTATGTGGTA-3’ Tm = 56.5oC

Tyrosinase

Mồi xuôi: 5’- TTGCCTGAGTTTGACCCAAT-3’

Mồi ngược: 5’-GCATCCGCTATCCCAGTAAG-3’

Tm = 54.8oC

Tm = 56.2 oC

Nras

Mồi xuôi: 5’-CACACCCCCAGGATTCTTAC- 3’

Mồi ngược: 5’- GGCAAATACACAGAGGAAGC- 3’

Tm = 55.1ºC

Tm = 55.3ºC

ERK

Mồi xuôi: 5’- CCTAAGGAAAAGCTCAAAGA-3’

Mồi ngược: 5’-AAGTGGATAAGCCAAGAC-3’ Tm= 49.8ºC

- Các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP

- Môi trường đệm cung cấp ion Mg (Taq Buffer) và nước tinh khiết không

có enzyme RNase và DNase

- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq Pol)

Tổng thể tích cho một phản ứng PCR là 25μl

Thể tích và nồng độ các yếu tố của phản ứng PCR như sau:

Bảng 2.5 Các thành phần phản ứng PCR trong nghí nghiệm in vitro

Yếu tố Thể tích (µl) Nồng độ cuối cùng trong phản ứng

Chu trình nhiệt được thực hiện tương ứng với từng loại mồi khác nhau

25

2.2.3 Khảo sát tác dụng của các dịch chiết lên khả năng sinh tổng hợp melanin ở mức độ in vivo

2.2.3.1 Thử độc tính lên phôi cá ngựa vằn

 Nuôi, ghép cá và thu phôi

Cá ngựa vằn trưởng thành được nuôi ở điều kiện chu kỳ sáng tối là 14:10 giờ

ở 28˚C tại Phòng Thí nghiệm động vật – Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Ghép cá: Trước khi cho cá đẻ một ngày, cá đực và cá cái được đặt vào chung

một bể có sẵn lưới ngăn cách tránh việc cá sinh sản quá sớm Buổi sáng ngày hôm sau, lưới được rút ra tạo điều kiện cho cá đẻ trứng và trứng được thụ tinh Phôi cá được thu sau khoảng hai tiếng và đặt trong môi trường E3 (5mM NaCl; 0,17 mM KCl; 0,4 mM CaCl2; 0,16 mM MgSO4) có chứa 0,01‰ Methylene Blue

Chọn phôi: Sau 3-4 giờ ngay sau khi thụ tinh, phôi được chọn dưới kính hiển

vi quang học, loại bỏ các phôi không được thụ tinh hoặc các phôi khác thường Lượng phôi bình thường thu được chia vào đĩa 6 giếng (25 phôi mỗi giếng) cho các thí nghiệm tiếp theo

 Thử độc tính của dung môi và dịch chiết hà thủ ô lên sự sinh trưởng của phôi cá ngựa vằn

Thử độc tính của các dung môi dùng để chiết hà thủ ô đỏ lên sự phát triển của cá ngựa vằn thông qua đánh giá tỷ lệ chết, tỷ lệ dị dạng của phôi Sau khi chọn phôi, môi trường E3 ở mỗi giếng được thay thế bởi các dung môi với các nồng độ khác nhau, phôi được giữ ở 28˚C, thử độc tính và quan sát liên tục trong 4 ngày sau thụ tinh Dị dạng được đánh giá bằng cách xác định tỷ lệ phôi/ ấu thể với bất kì khiếm khuyết nào về hình thái trên tổng số các phôi sống sót Các đặc điểm hình thái được so sánh với các giai đoạn tương ứng như đã mô tả trước đây của Kimmel

và cộng sự năm 1995 [1, 29] Các đặc điểm gây chết trong quá trình phơi nhiễm phôi với dung dịch thử được đánh giá theo tiêu chuẩn OECD [46] được cho dưới bảng 2.6