Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ------ Phạm Thị Thùy NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT LUẬN VĂN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Lã Thị Huyền PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2016

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan: Luận văn là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,

được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS TS Nguyễn Quang Huy và

Phạm Thị Thùy

Lời cảm ơn

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới:

PGS TS Nguyễn Quang Huy – Trưởng khoa Sinh học - Trường đại học Khoa

học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội và TS Lã Thị Huyền – Phụ trách phòng

Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm và Khoa học Việt Nam đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn thạc sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh học – Trường đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội nói chung và thầy cô giáo chuyên ngành Sinh học thực nghiệm học nói riêng đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Hóa sinh, khoa Vi sinh và các khoa phòng liên quan của Bệnh viện Thanh Nhàn đã cung cấp mẫu thí nghiệm cho tôi

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các cô chú, anh chị và các bạn công tác tại phòng phòng Công nghệ Tế bào Động vật cùng toàn thể các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Khoa Hóa sinh – Bệnh viện 198 đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những người thân, bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nhiễm khuẩn huyết 3

1.1.1 Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết 7

1.2 Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp 7

1.2.1 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 8

1.2.2 Acinetobacter baumannii 9

1.2.3 Klebsiella pneumoniae 11

1.2.4 Pseudomonas aeruginosa 12

1.2.5 Escherichia coli 14

1.3 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết 15

1.3.1 Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phương pháp cấy máu 15

1.3.2 Lai huỳnh quang tại chỗ 15

1.3.3 Các kỹ thuật khuếch đại DNA 16

1.3.4 Giải trình tự 18

1.4 Multiplex PCR và ứng dụng 19

1.4.1 Giới thiệu chung về multiplex PCR 19

1.4.2 Các loại phản ứng multiplex PCR 19

1.4.3 Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR 20

1.4.4 Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR 21

1.4.5 Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR 22

1.4.6 Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR 24

1.4.7 Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm khuẩn huyết 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Hóa chất và sinh phẩm 27

2.1.2 Thiết bị 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thiết kế primer 29

2.2.2 Tách chiết DNA 29

2.2.3 Phương pháp làm giàu DNA vi khuẩn 30

2.2.4 Xác định nồng độ DNA 31

2.2.5 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 31

2.2.6 Phương pháp PCR 32

2.2.7 Phương pháp giải trình tự gen 33

2.2.8 Đạo đức trong nghiên cứu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích 35

3.2 Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm 38

3.2.1 Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn 38

3.2.2 Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích 39 3.2.3 Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa 40

3.2.4 Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi 43

3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR 45

3.3 Kết quả tối ưu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích 47

3.3.1 Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR 47

3.3.2 Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR 48

3.3.3 Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR 50

3.4 Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm khuẩn thuần 51

3.5 Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm 53

3.5.1 Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu 53

3.5.2 Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16] 4

Bảng 2.1 Trình tự Nucleotide của các cặp mồi 27

Bảng 3.1 Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR theo tính toán lý thuyết 37

Bảng 3.2 Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR 52

Bảng 3.3 So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu 55

với kết quả của phương pháp cấy máu 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng, vùng giao

nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56] 5

Hình 1.2 Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus 8

Hình 1.3 Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter baumannii 10

Hình 1.4 Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Klebsiella pneumonia 11

Hình 1.5 Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 13

Hình 1.6 Hình ảnh và phân loại vi khuẩn Escherichia coli 14

Hình 1.7 Mô hình mô tả phản ứng multiplex PCR 20

Hình 3.1 Điện di kiểm tra DNA tổng số của các chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa tách chiết từ các chủng chuẩn 38

Hình 3.2 Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tương ứng 40

Hình 3.3 Kiểm tra khả năng nhân bản đặc hiệu của các cặp mồi femA, gltA, oprL, mdh, phoA với các chủng Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae và Escherichia coli 43

Hình 3.4 Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR 45

Hình 3.5 Tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR 47

Hình 3.6 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR 49

Hình 3.7 Lựa chọn thành phần Mastermix trong phản ứng multiplex PCR 50

Hình 3.8 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy máu 53

Hình 3.9 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu lâm sàng 59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACCP American College of Chest Physicians

AW1 Wash buffer AW1

AW2 Wash buffer AW2

DNA Deoxyribonucleic acid (acid Deoxyribonucleic) dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EtBt Ethidium bromide

EtOH Ethanol

ICU Intensive care unit (Đơn vị chăm sóc đặc biệt ) MLST Multilocus sequence typing (Xác định trình tự nhiều

gen đặc trưng) MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (Tụ cầu

vàng kháng Methicillin) Mutiplex PCR Phản ứng khuếch đại nhiều DNA đích

NKH Nhiễm khuẩn huyết

NVYT Nhân viên y tế

PAF Platelet-activating factor

RNA Ribonucleic acid (Acid Ribonucleic)

SCCM Socity Critical Care Medicine

SDS Sodium dodecyl sulfate

SNP Single nucleotide polymorphism (Đa hình sợi đơn ) TAE Tris-EDTA-Acetic acid

Nhiều năm qua, NKH vẫn là một trong mười nguyên nhân chủ yếu gặp

ở bệnh nhân nhập viện Theo báo cáo của Trung tâm thống kê quốc gia chăm sóc sức khỏe của Mỹ cho thấy: Năm 2008, bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết nhập viện tăng gấp đôi so với năm 2000 (326.000 so với 727.000) Đặc biệt, nghiên cứu của Elixhauser A và tập thể (2009), nhiễm khuẩn huyết ngay lúc nhập viện là 836.000 ca Chi phí điều trị mỗi ca NKH dao động từ 10.000- 50.000 đô la và lên tới 17 tỷ đô la mỗi năm cho các trường hợp NKH và thời gian nằm viện trung bình tăng thêm 19,6 ngày Theo thống kê của Fleischmann C và tập thể (năm 2016) dựa trên 1553 báo cáo từ năm 1979 đến năm 2015 của các nước cho thấy: Đối với các nước thu nhập cao, cứ 100.000 người nhập viện mỗi năm có 437 trường hợp nhiễm khuẩn huyết (sepsis) và 270 trường hợp nhiễm trùng khuẩn nặng (severe sepsis) và tỉ lệ tử vong là 17% đối với nhiễm khuẩn huyết và 26% đối với các nhiễm khuẩn huyết nặng trong thời gian này Theo tính toán ngoại suy của các nhà khoa học này ước tính toàn cầu có khoảng 31,5 triệu ca nhiễm khuẩn huyết và 19,4 triệu trường hợp nhiễm khuẩn huyết nặng, và khoảng 5,3 triệu người chết mỗi năm

Bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết thường có tiến triển bệnh nhanh, đặc biệt là ở các đối tượng trẻ em và người già Vì vậy, việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh có ý nghĩa quan trọng để điều trị kịp thời và góp phần hạn chế

2

biến tính, giảm tỷ lệ tử vong ở bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết Hiện nay, cấy máu kết hợp với xét nghiệm sinh hóa là phương pháp phổ biến nhất để phát hiện mầm bệnh Phương pháp này tiến hành đơn giản, dễ thao tác với chi phí thấp nhưng có nhược điểm là tốn nhiều thời gian, không loại trừ được trường hợp âm tính giả

Việc phát hiện DNA của vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được cho là một phương pháp có độ nhạy và chính xác cao Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn chưa có phương pháp phát hiện DNA của vi khuẩn nào được cho

là chuẩn để ứng dụng vào chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết Vì vậy, nghiên cứu xây dựng một phương pháp chẩn đoán nhanh, có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đang là nhu cầu bức thiết hiện nay Multiplex PCR có thể coi là giải pháp cho những vấn đề trên Phương pháp này sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng cho phép phát hiện nhiều loại tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết trong thời gian ngắn với độ chính xác cao

Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết” nhằm góp phần vào việc chẩn đoán và điều trị cho các

bệnh nhân nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam Nội dung chính của đề tài bao gồm:

 Lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết

 Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex PCR

 Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhiễm khuẩn huyết

1.1.1 Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt Nam

Trong lịch sử, nhiễm khuẩn huyết là một bệnh rất khó khăn để xác định

và chẩn đoán Từ 100 trước công nguyên, các học giả La Mã (116 TCN-27 TCN) đã mô tả về nhiễm khuẩn huyết như sau: “những sinh vật nhỏ, không thể nhìn thấy bằng mắt, có đầy trong không khí và qua hơi thở gây ra các bệnh nguy hiểm” Tiếp đó các nhà sử học, nhà triết học, nhân chủng học và tiêu biểu là một học giả thời kì phục hưng Niccolo Machiavelli (1469-1527) trong báo cáo của mình cũng đã lần lượt mô tả đầy đủ về nhiễm khuẩn huyết

Ngày nay, chúng ta đã biết rằng sốt lao phổi không phải nhiễm khuẩn huyết Tuy nhiên trong một thời gian dài, sốt lao phổi được cho là nhiễm khuẩn huyết bởi trong giai đoạn y học chưa phát triển, việc mô tả nhiễm khuẩn huyết rất khó để được chấp nhận cho đến khi triệu chứng bệnh trở nên

rõ ràng và khó khăn trong điều trị cùng với tính nghiêm trọng của bệnh thì người ta bắt đầu quan tâm hơn và nỗ lực tìm hiểu đưa ra khái niệm về nhiễm khuẩn huyết [8] Trong thực tế sự hiện diện của nhiều vi sinh vật gây bệnh hay độc tố của chúng trong máu hoặc mô dẫn tới sự phủ định của những khái niệm chung này đồng thời kéo theo vô số nỗ lực phát triển về dịch tễ học, các công cụ chẩn đoán và xét nghiệm để xác định nhiễm khuẩn huyết [9]

Vào năm 1992, American College of Chest Physicians (ACCP) và Socity Critical Care Medicine (SCCM) cùng công bố các khái niệm của nhiễm trùng huyết (Bảng 1, Hình 1) [16] Đây là một trong những khái niệm phổ biến nhất về nhiễm khuẩn huyết trong các đơn vị chăm sóc sức khỏe y tế đặc biệt, các trung tâm dịch vụ chăm sóc sức khỏe chuyên sâu khác nhau trên

4

khắp thế giới Việc mô tả biểu hiện của các phản ứng viêm toàn thân và đưa

ra định nghĩa cụ thể cho nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn huyết nặng, sốc nhiễm trùng và hội chứng rối loạn chức năng đa cơ quan là những vấn đề quan trọng trong lĩnh vực nhiễm khuẩn huyết [14, 16, 56]

Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16]

Tế bào bạch cầu ≥ 12,000 / µl hoặc ≤ 4000 / µl hoặc > 10%

chưa phát triển các triệu chứng

5

Hình 1.1 Mối quan hệ giữa các phản ứng viêm toàn thân và nhiễm trùng,

vùng giao nhau chỉ ra nhiễm khuẩn huyết [16, 56]

Nhiễm khuẩn huyết là một trong những nguyên nhân gây bệnh tật và tử vong hàng đầu ở các bệnh nhân phải nhập viện trên toàn thế giới Đây là một tình trạng bệnh lý do đáp ứng của cơ thể với sự có mặt của vi khuẩn hay các

vi sinh vật gây bệnh khác hoặc độc tố được tạo ra bởi sinh vật gây bệnh lưu hành trong máu và đi tới khắp các cơ quan trong cơ thể Nhiễm khuẩn huyết gây ra các triệu chứng lâm sàng đa dạng, suy đa tạng, sốc nhiễm khuẩn với tỉ

lệ tử vong rất cao (từ 20 – 50%), trong đó sốc nhiễm khuẩn là biểu hiện nặng của nhiễm khuẩn huyết [15]

Mặc dù tần suất mắc nhiễm khuẩn huyết khác nhau tùy theo quốc gia, bệnh viện, mùa trong năm, đường vào của vi khuẩn và đối tượng bệnh nhân, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ NKH chỉ chiếm 3 - 10% bệnh nhân (BN) nhập viện và có thể tăng tới 75% nếu BN nằm điều trị tại khoa Hồi sức tích cực (HSTC) Bệnh gây tỷ lệ tử vong cao, dao động 30 - 50% tùy theo nghiên cứu của các tác giả ở những bệnh viện (BV) khác nhau trên thế giới [12, 24] NKH trong các đơn vị chăm sóc đặc biệt là một thách thức lớn đối với các bác sĩ điều trị [68]

Tại Anh, nghiên cứu của Harrison và tập thể (2006) trên 92.673 BN nhập viện cho thấy, tình trạng NKH nặng xuất hiện trong vòng 24 giờ đầu tăng từ 23,5% (1996) lên đến 28,7% (2004) và tử vong cũng tăng từ 9.000 ca (48,3%) năm 1996 lên đến 14.000 ca (44,7%) năm 2004 [37]

Nghiên cứu của Jason và tập thể (2011), tại 150 khoa HSTC của 16 nước trong khu vực châu Á, tỷ lệ NKH trên BN nằm tại khoa HSTC tỷ lệ dao động từ 5 – 53% tùy theo quốc gia [40] Nghiên cứu của Divatia và tập thể (2012), ở Ấn độ trên BN nhập vào khoa HSTC cho thấy, tỷ lệ NKH là 26% và

tử vong là 38% [27]

Tại Việt nam, trong báo cáo của Nguyễn Văn Kính và Tập thể (2008), khi phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh tại Việt Nam cho thấy, tỷ lệ NKH nói chung là 8% [3] Mới đây, nghiên cứu của Vũ Đình Phú và tập thể (2013)

ở các khoa HSTC của 15 bệnh viện trong toàn quốc cho thấy tỷ lệ NKH chiếm 10,4% [4]

7

1.1.2 Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết

 Các dấu hiệu và triệu chứng chung: Sốt cao (đôi khi hạ thân nhiệt), thở nhanh hoặc nhiễm kiềm hô hấp, tràn dịch, phù nề

 Dấu hiệu chung về phản ứng gây viêm: Tăng hoặc giảm số lượng tế bào bạch cầu, tăng dấu hiệu viêm (C-reactive protein, procalcitonin, interleukin-6)

 Thay đổi huyết áp động mạch: Hạ huyết áp động mạch, nhịp tim nhanh không rõ nguyên nhân, áp lực mạch máu thấp, tràn dịch dưới da, lượng nước tiểu giảm

 Các dấu hiệu của rối loạn chức năng nội tạng: thiếu oxy máu (tổn thương phổi cấp tính), tình trạng thần kinh bị ảnh hưởng, không giải thích được thay đổi chức năng thận, tăng đường huyết, giảm tiểu cầu hoặc đông máu nội mạch rải rác, không rõ nguyên nhân thay đổi trong các thử nghiệm chức năng gan (bilirubin), không dung nạp thức ăn (thay đổi nhu động ruột) [21]

1.2 Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp

Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn xâm nhập trực tiếp vào máu hoặc từ các ổ nhiễm khuẩn ở mô và cơ quan như: Da, mô mềm, cơ, xương khớp, hô hấp, tiêu hóa Ban đầu, bệnh được mô tả gắn liền với các vi khuẩn Gram âm Nguyên nhân là do nhiễm khuẩn huyết được coi là một phản ứng của cơ thể với nội độc tố (endotoxin) một phân tử tương đối đặc hiệu cho các vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên trong giai đoạn 1979-2000, nguyên nhân gây nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram dương lại chiếm ưu thế [17]

Trong các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết, Staphylococcus

aureus là chủng Gram dương phổ biến nhất, còn Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa chiếm

ưu thế trong các chủng Gram âm [38]

Tác nhân gây NKH nổi lên hiện nay là vi khuẩn Gram âm và Gram dương bởi bệnh cảnh lâm sàng thường nặng và hay kèm theo có sốc nhiễm

8

khuẩn Tử vong ở bệnh nhân có sốc nhiễm khuẩn, có thể lên tới 80% Hơn nữa, việc điều trị mầm bệnh là vi khuẩn rất khó khăn do khả năng đề kháng với kháng sinh cao của chúng [79] Do đó phương pháp xác định nhanh tác nhân gây nhiễm khuẩn là hết sức quan trọng Phương pháp multiplex PCR hiện nay là phương pháp có khả năng đáp ứng được yêu cầu của thực tế Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát hiện 5 chủng vi sinh vật gây nhiễm

trùng huyết phổ biến (Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa) sử

dụng phương pháp multiplex PCR với mong muốn góp phần vào việc phát hiện sớm nhiễm khuẩn huyết và góp phần điều trị hiệu quả

1.2.1 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus là vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều

bệnh khác nhau, từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng mô mềm tới ảnh hưởng đời sống bệnh nhân như nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và hội

chứng sốc độc tố Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) và

Staphylococcus aureus mẫn cảm với Methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây

tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó khăn [65]

Hình 1.2 Hình ảnh và cấu trúc gen vi khuẩn Staphylococcus aureus

http://www.jenner.ac.uk/staphylococcus-aureus

https://www.pinterest.com/pin/519462138241501307/

9

Theo nghiên cứu của Anthony và tập thể (2016), trong số 71 bệnh nhân được chăm sóc đặc biệt thì số bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết chiếm 49%,

nguyên nhân do Staphylococcus aureus chiếm tỉ lệ cao nhất (18,2%) và 8%

Staphylococcus aureus được phân lập kháng Methicillin [11]

Trong thập kỷ qua, các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tủy xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [39] MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a, một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin

(78 kDa) Protein này có ái lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam Gen femA

mã hóa cho protein PBP2a kháng methicillin, do đó gen này được sử dụng như một marker phân tử phát hiện MRSA [40, 42]

Staphylococcus aureus kháng Methicillin được phát hiện trong một

nghiên cứu của Hassanain và tập thể (2009) Trong nghiên cứu này các tác giả

sử dụng phương pháp nhân bản gen đa mồi 5 gen được nhân bản bao gồm:

16S rRNA của chi Staphylococcus, MecA của Staphylococcus aureus, gen

MecA mã hóa cho kháng methicillin, gen Luks mã hóa sản xuất của

Panton-Valentine leukocidin (PVL) cytotoxin hoại tử và một gen nội chuẩn để tránh hiện tượng âm tính giả Thử nghiệm trên 230 chủng phân lập lâm sàng, cho thấy phương pháp có độ nhạy 97,6% và độ đặc hiệu lên tới 99,3% [38, 75]

1.2.2 Acinetobacter baumannii

Acinetobacter baumannii là cầu trực khuẩn, gram âm, hiếu khí, không

lên men glucose Nhu cầu sinh trưởng đơn giản và khả năng chống chịu các

điều kiện môi trường rất cao do vậy Acinetobacter baumannii xuất hiện phổ

biến trong môi trường và là một phần của hệ vi khuẩn trong cơ thể người [44] Trong những nghiên cứu gần đây, chúng ngày càng được chỉ ra là một vi sinh vật quan trọng trong các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnh viện bao gồm

10

nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiết niệu,

nhiễm trùng vết thương và viêm màng não [45] Acinetobacter baumannii có

khả năng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt cùng với khả năng tiếp nhận và tích lũy các gen kháng kháng sinh cao cấp dẫn tới sự kháng thuốc hàng loạt [22, 48]

Hình 1.3 Hình ảnh và cơ chế xâm nhập của vi khuẩn Acinetobacter

baumannii

http://acinetobacterbaumannii.com/

http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fcimb.2013.00095/full

Nguyễn Thị Thanh Hà đã tiến hành nghiên cứu lâm sàng trên 287 bệnh

nhân NKH do Acinetobacter baumannii và nhận thấy: NKH gặp nhiều ở trẻ

em, tử vong cao (33,1%), lâm sàng thường nặng và diễn tiến nặng gặp ở người lớn nhiều hơn trẻ em với tỷ lệ tử vong cao hơn (50,8% so với 20,4%), hôn mê nhiều hơn (26,6% và 13,7%), phải hô hấp hỗ trợ nhiều (40% và 22,1%), tỷ lệ sốc nhiễm khuẩn cao (45,8% và 26,3%), suy đa tạng nhiều hơn (45,8% và 31,7%), phải sử dụng thủ thuật xâm lấn nhiều hơn và người lớn có nguy cơ tử vong cao hơn trẻ em [2] Bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Multiplex-PCR đã phát hiện gen OXA trên 62 chủng Acinetobacter

baumannii từ những BN được chẩn đoán NKH: 62 chủng đều mang gen

11

OXA_51 (100%); 36 chủng mang gen OXA_23 rải rác ở cả 6 bệnh viện của 3 miền Bắc, Trung và Nam, 7 chủng mang gen OXA_58 chỉ gặp ở miền Bắc và

Nam Đặc biệt, các chủng Acinetobacter baumannii mang gen OXA_58

kháng kháng sinh lên đến 100% với nhóm carbapenem, 100% với ceftazidin Các chủng mang gen OXA_23 có mức kháng thấp hơn với imipenem (66,7%), meropenem (55,6%) và kháng rất cao với ceftazidine (91,6%) và thấp nhất với cefepim (30,5%) [2]

1.2.3 Klebsiella pneumoniae

Klebsiella pneumoniae là vi khuẩn gram âm và là mầm bệnh cơ hội

chiếm tới 10% tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện, là nguyên nhân phổ biến của bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, đồng thời là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với bệnh

nhiễm trùng cộng đồng [49] Tầm quan trọng của Klebsiella pneumoniae trong cơ sở y tế đang gia tăng do khả năng kháng kháng sinh phổ rộng β-

lactamase của chúng Các nghiên cứu chỉ ra rằng sinh vật kháng kháng sinh

phổ rộng có xu hướng đa kháng thuốc dẫn tới khả năng thất bại trong điều trị

Do vậy mà chúng ngày càng đóng vai trò quan trọng trong nhiễm trùng bệnh viện và nhiễm trùng cộng đồng [50]

Hình 1.4 Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Klebsiella pneumonia

https://www.pinterest.com/pin/383087512037727953/

12

Một số phương pháp sinh học phân tử đã được sử dụng cho việc phát

hiện Klebsiella pneumoniae như phân tích đa hình nhân bản ngẫu nhiên

DNA (RAP-PCR), điện di trường xung đẩy hoặc đa hình khuếch đại các đoạn dài (AFLP) [51] Tuy nhiên, các phương pháp này dựa trên các băng điện

di vì vậy kết quả có thể không rõ ràng, nhưng nhìn chung các phương pháp này rất thích hợp để điều tra khu trú dịch tễ học Tuy nhiên, rất khó để so sánh kết quả do phòng thí nghiệm khác nhau công bố cho thực hiện một phân tích dịch tễ học trên toàn thế giới Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp trên, phương pháp xác định trình tự nhiều gen đặc trưng (MLST) đã được phát triển, đó là một phương pháp giải trình tự nucleotide các đoạn trình

tự điển hình của vi khuẩn hoặc nấm [52] Phương pháp này dễ dàng được chuẩn hóa, lưu trữ và trao đổi thông tin điện tử Nó được áp dụng thành công cho việc khu trú dịch tễ học của một loạt các vi khuẩn gây bệnh quan trọng ở

mức lâm sàng như Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus,

Enterococcus faecium, Neisseria meningitidis và Campylobacter jejuni Gần

đây, phương pháp MLST nhằm phát hiện Klebsiella pneumoniae sử dụng 7 gen quản gia bao gồm rpoB, GAPA, MDH, PGI, phoE, infB, và tonB đã được

phát triển [53]

1.2.4 Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn, Gram âm được tìm thấy phổ

biến trong môi trường tự nhiên, con người và động vật Chúng sinh trưởng

mạnh trong điều kiện ẩm ướt và có thể sử dụng một loạt các hợp chất hữu cơ

Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng nghiêm trọng dẫn tới tỷ lệ tử vong

cao ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch và là một trong các nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện [54, 55]

13

Hình 1.5 Hình ảnh và tác động của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

https://www.pinterest.com/pin/96897829458108615/

Pseudomonas aeruginosa là sinh vật phổ biến nhất được phân lập từ

phổi của 80% bệnh nhân trưởng thành với chứng xơ nang phổi Sự có mặt của chủng vi sinh vật này tương quan với sự suy giảm chức năng phổi và các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân Tại bệnh viện, các loại thiết bị y tế hoặc dụng

cụ có liên quan đóng vai trò như một nguồn cung cấp Pseudomonas

aeruginosa và những nguồn này trở thành tiêu điểm cho việc bùng phát lây

lan vi sinh vật [16]

Kích thước hệ gen của Pseudomonas aeruginosa khoảng từ 5,2 - 7,1

Mbp Mức độ dao động kích thước có ý nghĩa quan trọng đối với các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sự tiến hóa và dịch tễ học của vi sinh vật này Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hơn 80% trình tự hệ gen của các chủng (chủng PAO1) được công bố (chỉ với 0,5% nucleotide bị phân tán) Trong khi đó, hiện nay hàng loạt các phương pháp di truyền phân tử được sử dụng để nghiên cứu dịch tễ học và phân tích di truyền quần thể Lomholt và tập thể (2001), Pirnay và tập thể (2002) sử dụng kỹ thuật giải trình tự của gen mã lipoprotein màng ngoài kết hợp với huyết thanh đặc trưng và pyoverdine để nghiên cứu di truyền khảm nhiễm thể mở rộng, đặc biệt là ở

gen oprD [53, 66]

14

1.2.5 Escherichia coli

Escherichia coli là vi khuẩn phổ biến nhất gây nhiễm trùng bệnh viện

và chúng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm trùng đường hô hấp và

nhiễm trùng đường tiết niệu Cả hai chủng Escherichia coli và Pseudomonas

aeruginosa đều là các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở

các đơn vị chăm sóc y tế đặc biệt và gây ra nhiễm khuẩn y tế và nhiễm khuẩn cộng đồng [57]

Hình 1.6 Hình ảnh và phân loại vi khuẩn Escherichia coli

http://www.wikilinks.fr/escherichia-coli-en-photo/?lang=en

http://www.slideshare.net/shrekym/detection-of-stx-gene-of-ecoli-o157

Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, thường có liên quan nhiều đến

nhiễm khuẩn bệnh viện và phổ biến trên bệnh nhân nhiễm trùng phổi Họ vi

khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) thường cư trú trên đường tiêu hoá của

người và động vật, đang là mối quan tâm lớn trong nhiễm khuẩn bệnh viện do

có khả năng kháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactamase

và có khả năng truyền tính kháng qua plasmid Nhiều nghiên cứu trong nước

và quốc tế đã kh ng định, Escherichia coli gây nhiễm trùng chủ yếu trên

đường tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm trùng vết mổ [59]

15

1.3 Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết

1.3.1 Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phương pháp cấy máu

Phương pháp được dựa trên cơ sở một mẫu máu được nuôi cấy trong môi trường giàu dinh dưỡng sau đó được nhận diện và kiểm tra các tác nhân gây bệnh bằng cách sử dụng xét nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn Phương pháp cấy máu được thực hiện với các thiết bị tự động phát hiện sự tăng trưởng của vi sinh vật bằng cách phân tích sự giải phóng CO2 bởi huỳnh quang hoặc cảm biến hoặc cách khác là thay đổi áp suất trong bình nuôi cấy do sự tiêu thụ và sản xuất khí này dùng để chỉ thị sự phát triển của vi sinh vật [30] Mặc dù có những ưu điểm nhất định nhưng thời gian thực hiện của phương pháp là quá dài dẫn tới khó khăn để đưa ra quyết định điều trị nhanh chóng trong những trường hợp cần thiết [60] Trong khi đó độ nhạy của phương pháp còn bị ảnh hưởng bởi khoảng thời gian từ lấy máu đến nạp vào bình nuôi cấy [30, 61]; mầm bệnh dễ bị suy yếu trong thời gian chờ kết quả Hơn nữa để có kết quả, cần thêm một thời gian phát triển của sinh vật gây bệnh khoảng 24 đến 72 giờ

và việc nhuộm Gram cần thêm thời gian ủ qua đêm để thu được khuẩn lạc riêng rẽ cho xét nghiệm Hơn nữa, kết quả âm tính chỉ có thể được kết luận sau 5-7 ngày Ngoài ra, hiệu ứng ức chế của các loại thuốc kháng sinh hoặc mầm bệnh khó nuôi cấy cũng làm hạn chế độ nhạy của phương pháp [62]

1.3.2 Lai huỳnh quang tại chỗ

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một trong những phương pháp được nghiên cứu nhiều nhất trong các kỹ thuật thương mại Phương pháp này phù hợp cho việc phát hiện tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy máu dương tính Trong khoảng 2,5- 3 giờ, FISH có thể xác định hơn 95% vi khuẩn và nấm men thường được tìm thấy trong máu [63, 64] Kết quả cấy máu dương tính được chuẩn bị, lai với mẫu dò oligonucleotide gắn huỳnh quang hướng tới đích là rRNA và quan sát bằng kính hiển vi [64] Tuy nhiên phương pháp này

16

có nhược điểm là một số vi khuẩn chỉ có thể được phát hiện ở cấp độ chi bởi

vì không sẵn có mẫu dò cho đặc hiệu cấp độ loài

1.3.3 Các kỹ thuật khuếch đại DNA

1.3.3.1 Kỹ thuật PCR

PCR là kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các phát hiện của mầm bệnh từ cấy máu dương tính Sử dụng xét nghiệm thương mại có sẵn hoặc broad-range PCR hoặc multiplex PCR

Trong kỹ thuật PCR, phối hợp khả năng lai đặc hiệu của các đoạn DNA

có trình tự bổ sung với gen đích cùng khả năng kéo dài chuỗi của DNA

polymerase để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng triệu lần so với

ban đầu Do DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn-mồi, trong môi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn Vì vậy để nhân bản được đoạn DNA đích, người ta cần thiết kế các mồi (primer) đặc hiệu Kỹ thuật PCR rất nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ DNA khuôn (ở mức nanogam) là phản ứng đã có thể cho kết quả dương tính Phương pháp này có độ nhạy cao, chính xác, phát hiện được nhiều tác nhân gây bệnh trong khoảng thời gian ngắn

1.3.3.2 Kỹ thuật Mutiplex PCR

Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng tác nhân gây bệnh trực tiếp từ máu Mutiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích trong cùng một mẫu trong cùng một thời điểm sử dụng một hỗn hợp mồi Kỹ thuật này thường được dựa trên sự khuếch đại DNA trong vùng sao chép của

vi sinh vật Đây là vùng không mã hóa của DNA có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệt giữa các loài vi khuẩn, nấm và các loài sinh vật khác Phương pháp có mức độ nhạy cao hơn khi sử dụng mồi thoái hóa [30]

17

Mặc dù kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh, nhạy các tác nhân gây bệnh so với cấy máu thông thường và có thể hỗ trợ rất lớn trong chẩn đoán nhưng không thể thay thế hoàn toàn phương pháp cấy máu Trong nhiều nghiên cứu, tỷ lệ phát hiện bệnh do kết hợp của cả hai phương pháp cao hơn

h n so với chỉ thực hiện PCR hoặc nuôi cấy máu riêng lẻ Toàn bộ quá trình xét nghiệm bằng PCR đến khi cho kết quả có thể được hoàn thành trong khoảng 5 giờ Phương pháp này rút ngắn thời gian cần thiết cho xác định kiểu hình và kháng sinh đồ đồng thời có ưu điểm là độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao [70]

1.3.3.3 Kỹ thuật Broad-range PCR

Broad-range PCR cho phép phát hiện vi khuẩn hoặc nấm trong máu dựa trên gen mã cho 16S rRNA hoặc gen 23S rRNA của vi khuẩn và gen 18S rRNA của nấm Sau phản ứng, các sản phẩm khuếch đại có thể được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau như phân tích giải trình tự, pyrosequencing, hoặc lai với mẫu dò đặc hiệu [32]

1.3.3.4 Kỹ thuật Real-time PCR

Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ Tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) của các mẫu là khác nhau Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn đã biết rõ số lượng DNA đích ban đầu

Real-time PCR là phương pháp nhanh hơn so với PCR truyền thống và không cần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn Áp dụng các

18

phương pháp phân tử này đến nay đã được dùng trong việc phát hiện các loài

vi khuẩn cụ thể từ các mô hoặc nhiễm trùng, như viêm màng não do vi khuẩn Đối với các vi khuẩn nhiễm trùng bệnh viện, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng realtime PCR để xác định các đối tượng này [67, 69]

1.3.4 Giải trình tự

Một số phương pháp giải trình tự DNA được nghiên cứu nhằm xác định

vi khuẩn, nấm gây bệnh được lấy trực tiếp từ mẫu máu dương tính trong môi trường cấy máu Một số tác giả đã sử dụng MicroSeq 500 kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems, CA), một phương pháp về trình tự đầu tiên để xác định

527 base của gene 16S rRNA nhằm xác định các chủng sinh vật gây bệnh [67, 71] Turenne và tập thể (2000) đã sử dụng phân tích đa hình sợi đơn kết hợp với PCR để phân biệt giữa các sinh vật [78] Một số nghiên cứu đã sử dụng pyrosequencing để nhận dạng nhiều vi khuẩn, nấm men và nấm [72, 73] Ưu điểm chính của pyrosequencing là nhanh chóng và giá cả thấp hơn so với giải trình tự thông thường đồng thời cung cấp nhanh chóng trình tự các đoạn ngắn khoảng 30 bp trong khoảng 30 phút Phương pháp này đã được sử dụng để phân loại, xác định nhiều loài vi khuẩn [74] Tuy nhiên giải trình tự và giải trình tự thế hệ mới đòi hỏi thiết bị phức tạp, tốn kém do đó không phải dễ dàng chuyển sang thực hành lâm sàng

Ngoài ra, còn nhiều phương pháp phân tử khác như: Khối phổ hay DNA chip (microarray)… được ứng dụng để phát hiện và chẩn đoán tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết Ưu điểm của các phương pháp này là có độ nhạy, chính xác cao và tiết kiệm thời gian Tuy nhiên, do đòi hỏi về chi phí vận hành và yêu cầu trình độ kỹ thuật nên các phương pháp này không được sử dụng phổ biến

19

1.4 Multiplex PCR và ứng dụng

1.4.1 Giới thiệu chung về multiplex PCR

Multiplex PCR là một phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhằm khuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCR Trong quá trình phân tích PCR đa mồi, nhiều trình tự sẽ được khuếch đại cùng lúc sử dụng nhiều cặp mồi, tất cả các thành phần được bổ sung vào cùng một ống phản ứng Như một phương pháp cải tiến của phản ứng PCR thông thường, phương pháp này giúp rút ngắn thời gian thực hiện mà lại không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm

1.4.2 Các loại phản ứng multiplex PCR

1.4.2.1 Phản ứng multiplex PCR dùng một khuôn

Phương pháp này sử dụng một loại khuôn, thường là ADN hệ gen, cùng với các cặp mồi (các mồi xuôi và mồi ngược) để khuếch đại một số vùng gen khác nhau có chứa trong sợi khuôn

1.4.2.2 Phản ứng multiplex PCR dùng nhiều khuôn

Có thể thực hiện duy nhất một phản ứng với nhiều loại khuôn và nhiều cặp mồi Tuy nhiên sự có mặt của nhiều cặp mồi có thể dẫn đến việc liên kết chéo giữa các mồi với nhau và có thể có sự bắt cặp nhầm giữa mồi này và khuôn kia Do đó việc thiết kế mồi là rất quan trọng

20

Hình 1.7 Mô hình mô tả phản ứng multiplex PCR

(http://www.premierbiosoft.com)

1.4.3 Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR

Thiết kế mồi đặc hiệu là một trong những yếu tố quyết định đến sự thành công của phản ứng multiplex PCR Các lưu ý quan trọng khi thiết kế mồi cho phản ứng này được liệt kê bên dưới Đây có thể coi là chìa khóa quyết định sự chính xác của quá trình khuếch đại các trình tự ADN với hàm lượng sản phẩm cao nhất

* Chiều dài mồi

Phản ứng multiplex PCR chứa nhiều cặp mồi khác nhau, vì vậy nó đòi hỏi các mồi được thiết kế phải có chiều dài thích hợp Thông thường các mồi

có chiều dài khoảng từ 18 đến 22 nucleotide

* Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm)

Các mồi nên có nhiệt độ nóng chảy tương đương nhau, tốt nhất là nằm trong khoảng từ 55°C - 60°C Với những trình tự có tỷ lệ GC cao, Tm của mồi có thể cao hơn (khoảng 75°C - 80°C) Độ dao động về Tm giữa các mồi nên nằm trong khoảng 3°- 5°C

21

* Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu là vấn đề cần được quan tâm hàng đầu trong quá trình thiết

kế mồi Với phản ứng multiplex PCR nó càng trở nên quan trọng, đặc biệt là trong các phản ứng có xảy ra cạnh tranh về mồi và khuôn

* Tránh hình thành dimer primer

Các mồi được thiết kế nên được kiểm tra xem chúng có hình thành dimer không Dimer primer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau) có thể dẫn đến việc khuếch đại không đặc hiệu

Tất cả các chỉ số cần lưu ý khi thiết kế mồi gần giống với thiết kế mồi cho 1 phản ứng PCR thông thường Thông thường, khi tỷ lệ Mồi/Khuôn quá cao cũng có thể dẫn đến việc hình thành primer dimer, do đó phải chú ý chỉ số của các thành phần trong phản ứng

* Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex

PrimerPlex là 1 công cụ hữu ích cho quá trình thiết kế mồi đối với phản ứng multiplex PCR Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng có phản ứng chéo với nhau hay không, đồng thời tăng sự thích ứng giữa các mồi Quá trình này phân tích hàng triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đó chương trình đưa ra danh sách các mồi để người thiết kế lựa chọn

1.4.4 Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR

* Đối chứng nội kiểm (Internal control)

Vấn đề thường gặp trong phản ứng PCR đơn lẻ (Single PCR) là hiện tượng âm tính giả do sai về các thành phần hay chu trình nhiệt, cũng có khi lại

là hiện tượng dương tính giả do bị nhiễm Phương pháp multiplex PCR đã khắc phục được hiện tượng âm tính giả do mỗi sản phẩm khuếch đại sẽ cung cấp một giá trị giúp kiểm tra các phân đoạn được khuếch đại khác

* Hiệu quả cao

Chi phí về hóa chất và thời gian tiến hành multiplex PCR giảm đáng kể

22

so với một phản ứng PCR đơn lẻ Các phản ứng multiplex PCR cũng bảo đảm được độ bền của enzyme polymerase và khuôn

* Xác định được chất lượng khuôn

Phản ứng multiplex PCR có thể xác định được chất lượng mẫu (khuôn) hiệu quả hơn phản ứng PCR thông thường

* Xác định được hàm lượng khuôn

Lũy thừa các số lượng bản sao và các tiêu chuẩn của phản ứng multiplex PCR có thể được sử dụng để ước lượng hàm lượng khuôn có trong mẫu Để xác định được hàm lượng khuôn chính xác bằng phản ứng multiplex PCR cần phải có mẫu đối chiếu, số chu kỳ phản ứng và lượng tối thiểu chất

ức chế phải được xác định sau mỗi mỗi chu kỳ khuếch đại

Phản ứng multiplex PCR có thể ứng dụng trên cả khuôn là ARN sau khi chuỗi này được chuyển thành dạng cADN Sợi cADN sẽ đóng vai trò làm khuôn cho phản ứng

1.4.5 Tối ƣu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR

* Nồng độ mồi

Nồng độ mồi ban đầu cho phản ứng có nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM

Có thể điều chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ, người ta có thể tăng hàm lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm nồng độ mồi với các locus “mạnh” Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi trong phản ứng nên nằm trong khoảng từ 0.04 µM đến 0.5 µM Với số lượng bản sao thấp hay ADN phức tạp, nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.3 µM đến 0.5 µM Ngược lại nếu số lượng bản sao lớn hay ADN khuôn ít phức tạp thì nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.04 µM đến 0.4 µM

* Nồng độ dNTP và MgCl2

Nồng độ MgCl2 nên giữ cố định ở mức 2 mM Nồng độ dNTP có thể dao động từ 0.5 mM đến 1.6 mM Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP

23

là từ 0.2 mM đến 0.4 mM Quá ngưỡng này sẽ làm giảm tốc độ phản ứng Nồng độ mỗi loại dNTP thấp hơn 0.1 mM sẽ vẫn giữ được tốc độ phản ứng nhưng lại làm giảm số lượng sản phẩm dNTP gốc (stock) nhạy cảm với quá trình rã đông, do đó làm hiệu quả phản ứng multiplex PCR có thể giảm Để khắc phục nhược điểm này, dNTP nên được chia thành từng lượng nhỏ trước khi bảo quản ở -20ºC

Do MgCl2 ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả hoạt động của enzyme Taq ADN polymerase nên nồng độ Mg2+ phải được kiểm tra chặt chẽ Enzyme Taq polymerase, khuôn, dNTP và các mồi đều liên kết với MgCl2 nên nồng độ MgCl2 phụ thuộc vào nồng độ các thành phần này Hơn nữa, nếu khuôn hoặc mồi có chứa EDTA hay EGTA thì nồng độ MgCl2 cũng sẽ được điều chỉnh Mg2+ giúp ổn định cấu trúc sợi đôi, bảo vệ ADN khỏi bị biến tính Nồng độ

Mg2+ cao có thể dẫn đến việc làm tăng lượng sản phẩm không đặc hiệu do nó tác động đến quá trình gắn mồi lên sợi khuôn Tuy nhiên nếu hàm lượng Mg2+không đủ cũng sẽ làm giảm lượng sản phẩm cần thiết

* Sự cân bằng dNTP/ MgCl 2

Để làm việc hiệu quả, Taq ADN polymerase cần Mg tự do (bên cạnh

Mg liên kết với dNTP và ADN) Đây là lí do tại sao khi tăng nồng độ dNTP thì tốc độ phản ứng PCR lại giảm trong khi đó tăng nồng độ Mg lại cho kết quả ngược lại 0.2 mM dNTP kết hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2 là hợp lí

* Nồng độ dung dịch đệm (buffer)

Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phản ứng multiplex PCR Nó hiệu quả hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol, BSA) Các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN có chiều dài lớn sẽ hoạt động tốt hơn ở nồng độ muối thấp trong khi các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN ngắn hơn yêu cầu nồng độ muối cao hơn

* Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase

24

Khi lượng khuôn ADN thấp, hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu của phản ứng có thể tăng lên nếu hạ thấp nhiệt độ gắn mồi Người ta tiến hành thử nghiệm ở các nồng độ Taq ADN polymerase khác nhau, sau đó đưa ra được nồng độ tối ưu đối với enzyme này 2.5U/50µl dịch phản ứng Nếu quá nhiều enzyme, nồng độ glycerol dùng để bảo quản enzyme có thể làm mất cân bằng quá trình khuếch đại làm tăng sự nhiễu Tỷ lệ mồi đặc hiệu và hỗn hợp phụ thuộc vào hoạt tính của enzyme, các thành phần thiết yếu trong phản ứng như MgCl2, dNTPs và bản chất của ADN đích Vì vậy, một loạt các cải tiến được thực hiện nhằm cải thiện quá trình PCR chủ yếu định hướng trực tiếp vào các yếu tố tác động đến việc gắn mồi và kéo dài chuỗi

* Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA

Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗ trợ bởi các chất phụ gia như DMSO, glycerol, formamide và betaine Những phụ gia này giúp làm lỏng chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằng nhiệt nhanh hơn Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO và glycerol lại gây ra sự cạnh tranh Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nên được xem xét kiểm tra chặt chẽ Nồng độ BSA đạt tới 0.8 µg/µl sẽ làm tăng hiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc bổ sung DMSO và glycerol

1.4.6 Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR

Multiplex PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặt cùng lúc nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâm nhiễm khác Đồng thời, phản ứng multiplex PCR cũng được dùng để xác định các thành phần có trong một hỗn hợp mẫu hoặc cũng có thể dùng để xác định

sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ gen

Phản ứng multiplex PCR đƣợc sử dụng vào các mục đích: Xác định tác

nhân gây bệnh; Hiệu suất SNP genotyping cao; Phát hiện đột biến; Phát hiện đột biến mất đoạn trong gen; Định lượng mẫu; Phân tích các liên kết; Phát

25

hiện ARN; Nghiên cứu pháp y…

1.4.7 Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm khuẩn huyết

Hiện nay, khá nhiều các nhà khoa học đã tập trung phát triển kỹ thuật PCR, multiplex PCR, multiplex realtime PCR trong kiểm soát các tác nhân

gây nhiễm khuẩn

Anbazhagan D và tập thể (2011) phát triển các xét nghiệm PCR thông thường và multiplex realtime PCR để phát hiện mầm bệnh bệnh viện [7] Gadsby NJ và tập thể (2016) dùng các kỹ thuật PCR xác định tác nhân gây bệnh đường hô hấp trong cộng đồng viêm phổi mắc phải [32] Aydemir O và tập thể (2014) xác định vai trò của multiplex PCR xác định các vi khuẩn gây bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới [13] Ở Thổ Nhĩ Kỳ, Kurutepe S và tập thể (2012) điều tra nguyên nhân do vi khuẩn bằng phương pháp PCR thông thường và multiplex ở bệnh nhân người lớn bị viêm phổi cộng đồng [46] Eser O.K và tập thể (2012) so sánh phương pháp nuôi cấy và phương pháp

realtime PCR trong việc phát hiện vi khuẩn Streptococcus pneumoniae và

Haemophilus influenzae trong viêm tai giữa cấp mẫu vật tràn dịch [29] Jbara

I và tập thể (2007) So sánh phương pháp nuôi cấy và các phương pháp PCR

cho các phát hiện của Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae và

Moraxella catarrhalis trong dịch não tủy và tràn dịch tai giữa [41] Thong

K.L và tập thể (2011) đã xây dựng phản ứng multiplex PCR phát hiện đồng

thời Staphylococcus aureus kháng methicillin, Acinetobacter baumannii,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa Kết

quả khảo sát trên 50 mẫu kết quả dương tính và âm tính tương đồng 100% so với kết quả xác định bằng phương pháp nuôi cấy

Ở Việt Nam, có một số nghiên cứu cũng như các nhà khoa học sử dụng

kỹ thuật PCR trong chẩn đoán các tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết cũng như

26

nhiễm khuẩn bệnh viện: Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Lê Hữu Song, nhóm các bác sỹ ở Viện truyền nhiễm Trung ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Nhi Trung Ương, nhóm nghiên cứu thuộc bệnh viện Việt Đức, Bạch Mai, Thanh Nhàn,… Đa số các nghiên cứu sử dụng các Kit ngoại nhập hoặc các cặp mồi tham khảo trên tạp chí quốc tế ví dụ một nghiên cứu đăng trên tạp chí Y học thực hành của tác giả Phùng Thị Bích Thủy và tập thể đã sử dụng bộ Kit Real Time PCR đa mồi SeptiFast (Roche) trong chẩn đoán căn nguyên gây nhiễm trùng huyết ở trẻ em tại Bệnh viện Nhi Trung ương [5] Nhóm nghiên cứu phát hiện được 43,3% dương tính trong khi phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiện được 3,3% tác nhân gây bệnh nhiễm trùng

huyết Các tác nhân nhiễm trùng huyết thường gặp nhất là Klebsiella

pneumonia/oxytoca có tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp

sau là Enterobacter cloacae/aerogenes với 2 trường hợp (6,6%), thêm vào đó

là các vi khuẩn và nấm khác như: Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Candida parapsilosis, Aspergillus fumigatu, Candida albicans, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia

27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Hóa chất và sinh phẩm

 Các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Acinetobacter

baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa phân lập từ máu bệnh nhân do bệnh

viện Thanh Nhàn cung cấp

 Các chủng nhiễm khuẩn huyết (nuôi cấy thuần)

 Mẫu bệnh phẩm được lấy từ bình cấy máu của 68 bệnh nhân người Việt Nam nghi ngờ bị nhiễm khuẩn huyết được lấy từ Bệnh viện Thanh Nhàn

 Mẫu máu được lấy trực tiếp từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết do bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp

 Các cặp mồi được tổng hợp bởi Proligo (Sigma-Aldrich, Corporation, USA) (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Trình tự Nucleotide của các cặp mồi

28

 Hóa chất: Mastermix, Tris-base, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr, Agarose và các hóa chất khác do hãng Merck, Invitrogen, Promega, Bioline… cung cấp Kit tách chiết DNA tổng số của hãng QIAgen (Đức)

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Tế bào Động vật và Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng nổi tiếng khác nhau Các thiết bị thường sử dụng như:

 Máy Nanodrop 1000

 Bộ điện di DNA của Bio- Rad, Hoa Kỳ

 Bộ nguồn điện di PowerPac 300 (Bio-Rad, Hoa Kỳ)

 Máy soi DNA (Mini -transllumminator Bio-Rad, Hoa Kỳ)

 Máy ly tâm lạnh (Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ)

 Máy PCR (PCR system 9700, Applied Biosystem, Mỹ)

 Tủ lạnh 4oC, tủ lạnh sâu -20oC, -75oC (Sanyo, Nhật Bản)

 Máy ủ ổn nhiệt (Memmert, Đức)

 Máy vortex (RotoLab, OSI)

 Máy khuấy từ (RotoLab, OSI)

 Lò vi sóng (Samsung)

 Một số thiết bị khác như cân phân tích tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), pipetman, nồi khử trùng,…

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Để tiến hành đề tài này chúng tôi sử dụng hầu hết các kĩ thuật theo Sambrook và tập thể kèm theo các hướng dẫn của nhà sản xuất các bộ Kit, bên cạnh đó có cải biến cho phù hợp

29

2.2.1 Thiết kế primer

Các gen đích gltA của chủng Acinetobacter baumannii, gen phoA của chủng Escherichia coli, gen femA của chủng Staphylococcus aureus, gen mdh của chủng Klebsiella pneumoniae, gen oprL của chủng Pseudomonas

aeruginosa được lựa chọn là gen đích trong nghiên cứu Các primer được

thiết kế mới bằng phần mềm primer 3 plus, PrimerPlex, kiểm tra bằng công

cụ BLAST (http://www.ncbi.nih.gov) Sau đó các cặp mồi đã được lựa chọn

đó được kiểm tra bằng chương trình phần mềm insilico PCR (http://insilico.ehu.es/PCR/) dự đoán sản phẩm PCR (amplicon); kiểm tra bằng các phần mềm online (protocol-online.org)

2.2.2 Tách chiết DNA

2.2.2.1 Tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy bằng Kit QIAgen

Các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa được

nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu, thu tế bào và tiến hành tách chiết theo protocol của bộ Kit tách DNA tổng số từ vi khuẩn của QIAgen, thu lại DNA tổng số của vi khuẩn trong 50 µl nước khử ion vô trùng Sản phẩm được điện

di kiểm tra trên gel agarose và xác định hàm lượng bằng máy nanodrop 1000

2.2.2.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương pháp đun sôi

Bổ sung lysozyme nồng độ 1 mg/ml vào 1 ml mẫu bệnh phẩm cấy máu,

ủ ở 37o trong 30 phút Sau đó đun sôi mẫu ở 100oC trong 10 phút rồi làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút để lấy dịch nổi (chứa DNA)

2.2.2.3 Tách chiết DNA từ mẫu máu của bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyết bằng kit tách DNA từ máu của QIAgen

DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được tách theo chỉ dẫn của kit Qiagen theo thứ tự các bước như sau:

- Bổ sung 200 µl EtOH (96-100%), đảo đều

- Hút dịch lên cột, ly tâm cột 8000 vòng/phút, 1 phút, bỏ dịch qua cột

- Bổ dung 500 µl dung dịch AW1 lên cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch qua cột

- Bổ sung 500 µl dung dịch AW2 lên cột, ly tâm 12 000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch qua cột

- Bổ sung 100 µl nước khử ion vô trùng lên cột, để khoảng 1 phút, sau đó ly tâm 8000 vòng/phút để thu DNA

2.2.3 Phương pháp làm giàu DNA vi khuẩn

DNA vi khuẩn được làm giàu bằng cách xử lý DNA người sau đó tăng sinh bằng các primer và chu trình nhiệt phù hợp

DNA vi khuẩn được làm giàu bằng cách nhân bản DNA với mồi random hexamer trong số chu kì ngắn để tạo ra sản phẩm là các đoạn DNA có kích thước khác nhau với số lượng lớn Thành phần phản ứng bao gồm Master mix : 12,5 µl , DNA khuôn: 5 µl , mồi random hexamer: 1 µl (10 pmol) và bổ sung nước khử trùng sao cho thể tích cuối cùng bằng 25 µl Đặt hỗn hợp trên vào máy PCR và chạy với bước biến tính đầu tiên là 93oC trong 3 phút và 20 chu kì tiếp theo với

93oC trong 45 giây, 50oC trong 45 giây và 72oC trong 1 phút 30 giây