Nghiên cứu tối ưu qui trình tách AND hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng trong nhận dạng cá thể người

Bảng 1.1 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được công bố Bảng 3.4 Kết quả phân tích ADN các locus STR trên các mẫu hài cốt được tách... Cho đến nay, chưa có một phương

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN

TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG

CÁ THỂ NGƯỜI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội - 2017

khách quan, chưa được công bố công khai bởi một ai khác

sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân –Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học

và Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV – Bộ công an đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình hoàn thành luận vặn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và lãnh đạo Khoa đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ cán bộ phòng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ - Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV –

Bộ công an, gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên tôi, quan tâm động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 06 tháng 01 năm 2017

Học viên

Trần Thị Hạnh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ……… 3

1.1 Các phương pháp nhận dạng cá thể người 3

1.1.1 Phương pháp hình thái học……… 3

1.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ thị phân tử……… 4

1.1.3 Một số chỉ thị ADN ứng dụng trong nhận dạng cá thể……… 6

1.1.3.1 Các locus STR……… 6

1.1.3.2 Mini-STRs……… 8

1.1.3.3 Vùng siêu biến HV1 và HV2 của ADN ti thể……… 10

1.1.3.4 Đa hình đơn nucleotide (SNPs)……… 11

1.2 Các nguồn ADN sử dụng trong phân tích mẫu hài cốt 12

1.2.1 Xương……… 12

1.2.1.1 Cấu trúc xương……… 12

1.2.1.2 Sự tồn tại của ADN trong xương ……… 14

1.2.2 Răng 14

1.2.2.1 Cấu trúc răng 14

1.2.2.2 Vị trí của ADN trong răng 15

1.2.3 Sự tồn tại và khả năng thu được ADN trong các bộ phận khác nhau của mẫu hài cốt……… 17

1.3 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm trên thế giới… 19

1.4 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam……… 23

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 25

2.1 Nguyên liệu……… 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……… 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 27

2.2.1 Phương pháp lựa chọn mẫu ……… 27

2.2.2 Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu và bố trí khu vực thí nghiệm sau khi thu mẫu 28

2.2.3 Xử lý mẫu – Loại canxi……… 29

2.2.4 Tách chiết ADN từ xương bằng phương pháp hữu cơ (Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol: PCI) 30

2.2.5 Tách chiết ADN từ xương bằng KIT QIAmp DNA Investigator (QiAgen) 31

2.2.6 Tách chiết ADN từ xương bằng KIT DNA IQTM System (Promega) 32

2.2.7 Định lượng ADN 33

2.2.8 PCR nhân bội sản phẩm 33

2.2.9 Điện di và đọc kết quả trên máy điện di mao quản……… 34

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN….……… 36

3.1 Kết quả nghiên cứu tối ưu bước xử lý mẫu ban đầu và loại canxi……… 36

3.2 Kết quả thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu tại điều kiện phòng thí nghiệm ……… 38

3.2.1 Kết quả phân tích, xác định kiểu gen……… 38

3.3.2 Kết quả đánh giá, lựa chọn phương pháp tách chiết……… 39

3.3 Kết quả tối ưu quy trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm……… 40

3.4 Kết quả phân tích ADN nhân các mẫu xương theo quy trình đã xây dựng……… 46

3.5 Thảo luận chung ……… 50

Kiến nghị……… 53

PHỤ LỤC………

-ADN :Deoxyribonucleic Acid

-mtADN :Mitochondrial DNA (ADN ti thể)

-PD :Power of discrimination (Khả năng phân biệt) -PCI :Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol

-RFLP :Restriction fragment length polymorphism

(Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)

-STR :Short Tandem Repeat (Đoạn lặp đa hình ngắn)

(Đa hình đơn nucleotide)

-Tm :Temperature melting (Nhiệt độ nóng chảy)

(Đoạn lặp có độ dài trung bình)

locus STR từ bố, mẹ cho con theo định luật Mendel 7

Hình 1.2 Hình minh họa vị trí thiết kế mồi Mini-STR và các bộ mồi

răng và ống tủy, nơi có quá trình biệt hóa hình thành lớp

Bảng 1.1 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được công bố

Bảng 3.4 Kết quả phân tích ADN các locus STR trên các mẫu hài cốt được tách

MỞ ĐẦU

Trước hậu quả của bất kỳ thảm họa hàng loạt nào, một trong những điều quan trọng cần đề cập đến đầu tiên là việc nhận diện nạn nhân Những thiên tai tàn phá như sóng thần, động đất, rơi máy bay, chiến tranh gây ra cái chết cho hàng nghìn nạn nhân Trong những trường hợp đó, các nhân viên pháp y buộc phải làm công việc định danh cho hàng trăm, hàng ngàn thi thể

Phương pháp thông thường để định danh bao gồm nhận dạng các đặc điểm ngoại hình, so sánh dấu vân tay, hồ sơ nhân chủng học (ước tính tuổi, giới tính, chủng tộc, tầm vóc, nha khoa, chấn thương và bệnh án) Các phương pháp xác định trên, mặc dù hữu ích và dễ thực hiện nhưng không phải lúc nào cũng thành công, đặc biệt là khi các đặc điểm ngoại hình, dấu vân tay đã bị mất, như trường hợp thi thể bị phân hủy mạnh, biến dạng do tác động của nhiệt, ngoại lực… hoặc thời gian chết đã quá dài, thi thể bị phân mảnh chỉ còn lại các mảnh hài cốt, hoặc khi hồ sơ nha khoa và y tế đối chứng không có Phân tích ADN sẽ được thực hiện khi các phương pháp nhận dạng khác không thành công hoặc cho kết quả không rõ ràng Mặc dù phân tích ADN có thể thực hiện từ tất cả các nguồn mô của người, tuy nhiên ở những trường hợp này, xương và răng của hài cốt người nhiều khi là nguồn cung cấp ADN duy nhất, dựa vào cấu trúc đặc biệt của xương mà ADN sẽ được bảo tồn tương đối tốt trong thời gian dài

Giống như các tế bào khác trong cơ thể người, nguồn ADN tách chiết từ xương thường được phân tích chủ yếu theo hệ gen ti thể và hệ gen nhân Đối với hệ gen ti thể, phương pháp được thực hiện là so sánh trình tự ADN thu được sau khi giải trình tự các mẫu Sự sai khác về trình tự của các mẫu so với nhau và so với trình tự chuẩn cho phép kết luận loại trừ hay không loại trừ mối quan hệ họ hàng theo dòng mẹ của các mẫu đó Phương pháp phân tích hệ gen ti thể đã thực hiện thành công ở nhiều nước trên thế giới [33] Với hệ gen nhân, phương pháp giám định ADN pháp y hiện nay sử dụng chủ yếu là thiết lập hồ sơ ADN cá thể dựa trên kiểu gen của 12 đến 24 trình tự STR (Short Tandem Repeat – Đoạn lặp lại ngắn kế tiếp) có chiều dài khoảng từ 100 – 350 bp [1],[3] Khác với hệ gen ty thể, một hồ sơ

với các mẫu xương, đặc biệt là những mẫu xương lâu năm, ADN của hệ gen nhân thường bị phân hủy mạnh hơn và có số lượng bản sao ít hơn so với hệ gen ti thể Do

đó, việc thực hiện phân tích ADN của hệ gen nhân thường khó khăn hơn

Cho đến nay, chưa có một phương pháp chung nào cho phép tách chiết được nguồn ADN tổng số có chất lượng đảm bảo sử dụng tốt cho việc phân tích ADN hệ gen nhân từ các mẫu xương lâu năm Tùy thuộc vào từng loại xương (xương đùi, răng, xương hàm, ) điều kiện môi trường, thời gian chôn cất và đặc điểm sinh học của xương mà các PTN sử dụng các phương pháp xử lý, các phương pháp tách chiết khác nhau và phải cải tiến để phù với điều kiện thực tế nhằm thu được ADN hiệu quả nhất [42]

Thực tế tại Việt Nam, trong các vụ án hình sự, mẫu hiện trường thu được trong nhiều trường hợp chỉ là mẫu răng, xương tồn tại ở các điều kiện môi trường khác nhau Ngoài ra, do hậu quả chiến tranh để lại, nhu cầu giám định hài cốt rất lớn, số lượng mẫu cần giám định hàng năm lên tới hàng trăm nghìn mẫu Các mẫu hài cốt này thường được chôn dưới đất, do khí hậu nóng ẩm cộng với thời gian khoảng trên 40 năm Phần lớn các mẫu xương đều đã bị phân hủy mạnh, chất lượng xương kém, nguồn ADN tách chiết được thường có hàm lượng ADN tổng số thấp, lẫn nhiều chất ức chế, gây khó khăn cho việc phân tích ADN, đặc biệt là đối với hệ gen nhân Do vậy, để đạt được kết quả phân tích tốt, cần thiết phải có sự thử nghiệm, cải tiến và tối ưu phương pháp tách chiết ADN đối với các mẫu xương lâu năm

Trước tình hình thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tối

ưu qui trình tách ADN hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng trong nhận dạng cá thể người” với mục tiêu xây dựng được qui trình tối ưu để tách chiết và phân tích

ADN nhân từ mẫu xương lâu năm phù hợp với điều kiện tồn tại mẫu và năng lực phân tích của phòng thí nghiệm ở Việt Nam

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Các phương pháp nhận dạng cá thể người

Nhận dạng cá thể người là một trong những mục tiêu chính của lĩnh vực khoa học pháp y phục vụ cho thực thi pháp luật, giám định y khoa và các mục tiêu nhân đạo của xã hội Hàng năm, các cơ quan điều tra, các cơ sở giám định pháp y ghi lại hàng nghìn trường hợp, đó là hậu quả của thiên tai, thảm họa hàng loạt, chiến tranh…khiến cho số lượng thi thể, hài cốt cần nhận diện có thể lên tới hàng chục nghìn vụ mỗi năm

Về nguyên lý, công tác nhận dạng chính là việc so sánh các thuộc tính, các đặc điểm của mẫu sinh phẩm thu được với những tiêu chuẩn, những chỉ tiêu đã biết

để xác định cá thể Xác định độ tuổi, giới tính, chủng tộc hoặc so sánh giữa những thuộc tính, những đặc điểm của mẫu nghi ngờ với mẫu đối chứng để xem mức độ phù hợp hay không phù hợp hoặc chúng có cùng một nguồn gốc hay không Thông qua việc phân tích các đặc tính chúng ta sẽ phân nhóm được các mẫu giám định hoặc loại trừ được mẫu nghi ngờ trong nhóm đối tượng cần giám định đôi khi chỉ bằng các phương pháp đơn giản hoặc một vài đặc điểm nhận dạng Như vậy, chúng

ta sẽ giới hạn và khu trú dần số mẫu (đối tượng) cần giám định

Các phương pháp sử dụng trong nhận dạng cá thể người bao gồm phương pháp hình thái học và phương pháp phân tích các chỉ thị phân tử Trong nhận dạng

cá thể, thông thường nhận dạng bằng hình thái cũng được thực hiện trước trong trường hợp mẫu đủ nguyên vẹn [7],[47], sau đó việc sử dụng chỉ thị phân tử có được tiến hành hay không tùy thuộc vào kết quả giám định hình thái và chất lượng mẫu thu được Trong thực tế, rất nhiều trường hợp phải sử dụng đến phương pháp phân tích sâu hơn như phân tích nhóm máu, phân tích ADN [44]

Các nhà nhân chủng học đã phát triển một hệ thống phân tích nhân chủng học pháp y dựa trên phân tích đặc điểm hình thái Hồ sơ sinh học bao gồm các ước tính về độ tuổi, giới tính, chủng tộc, tầm vóc, nha khoa, chấn thương và bệnh án [44] Những đặc điểm này có thể được so sánh với báo cáo mất tích tại khu vực xung quanh để hỗ trợ điều tra Phương pháp xác định này mặc dù hữu ích và có giá trị pháp lý nhưng không phải lúc nào cũng thành công, đặc biệt là khi các đặc điểm nhận dạng và thông tin trước khi chết không rõ ràng, hồ sơ nha khoa và y tế không

có

1.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ thị phân tử

Chỉ thị di truyền dựa trên protein là hệ thống đầu tiên được sử dụng để nhận dạng trong giám định sinh học hơn 25 năm trước đây [10] Phương pháp tiên phong này ngay sau đó đã bộc lộ một số hạn chế như: tính kém ổn định của mẫu trước các yếu tố môi trường, lượng mẫu cần xét nghiệm phải đủ lớn, khả năng phân biệt cá thể thấp nên khó có thể truy nguyên cá thể Hơn nữa, đối với những mẫu vật sinh học đã bị phân hủy nặng nề do tác động của nhiệt độ cao, ngoại lực lớn hoặc thời gian lâu, mẫu đã phân hủy hoàn toàn thì phương pháp sử dụng các chỉ thị protein là không thể thực hiện được

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, cộng đồng pháp y sau đó

đã quan tâm tới chỉ thị di truyền khác tiềm năng hơn, đó là các chỉ thị ADN đa hình Cho đến nay nó đã được phát triển thành một công cụ không thể thiếu trong lĩnh vực nhận dạng cá thể người trong lĩnh vực hình sự [10]

Tế bào có chứa 2 loại ADN: ADN ti thể (mtDNA) và ADN nhân (nDNA) Mỗi loại có vị trí, số lượng bản sao, cấu trúc vật lý khác nhau trong tế bào Ti thể là những bào quan nằm trong tế bào chất, được di truyền theo dòng mẹ, do đó các trình tự mtADN giống nhau ở các cá nhân cùng mẫu hệ, (ví dụ: anh, chị em ruột,

mẹ, bà ngoại, bác - dì - cậu họ ngoại…) Tế bào người có thể chứa tới hàng trăm đến hàng ngàn ti thể cho nên số lượng bản sao trình tự mtADN lớn hơn so với nADN ADN trong nhân ở các tế bào sinh dưỡng (soma) có hai bản sao, một di truyền từ mẹ và một di truyền từ bố Những trình tự này là đặc trưng duy nhất cho

nADN được xác định là đặc điểm nhận dạng giúp truy nguyên đến từng cá thể [9]

Phân tích ADN được áp dụng lần đầu tiên trong pháp y vào cuối những năm

1980 sử dụng kĩ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt bằng enzyme giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật này được sử dụng

để xác định kiểu gen các locus VNTR (Variable Number of Tandem Repeat), hay còn gọi là các trình tự lặp lại liên tiếp với số lượng thay đổi [21] Chỉ thị này cung cấp khả năng phân biệt cao cho nhận dạng cá thể Tuy nhiên để phân tích thành công chỉ thị này, cần một lượng tương đối lớn ADN khuôn, khoảng 10 - 25ng, ADN cần phải nguyên vẹn và trình tự cần phân tích có chiều dài lên tới 10,000 bp Kỹ thuật phân tích này không thể áp dụng đối với những mẫu bằng chứng ít (mẫu dấu vết) hoặc mẫu đã bị thoái hóa

Kỹ thuật RFLP sau đó đã được thay thế bằng kỹ thuật phân tích dựa trên phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) trong khoảng 20 năm trước đây PCR là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại các vùng cụ thể của khuôn ADN tổng số tách chiết từ mô sinh học Nó được dùng để tái tạo và đồng thời nhân bội tạo ra hàng triệu bản sao của một trình tự ADN cụ thể trong bộ gene PCR cho phép thu lại được hồ sơ ADN hoàn chỉnh từ khuôn mẫu ban đầu thấp (> 100 pg) trong thời gian ngắn Các chỉ thị di truyền đầu tiên dựa trên nền tảng PCR được sử dụng trong nhận dạng cá thể là hệ đa hình đơn nucleotide (SNP) trên gen nhân, gồm có: trình tự

đa hình tại vị trí HLA-DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 và Gc Những xét nghiệm dựa trên hệ SNP này nhạy với mẫu kém nhưng lại không cung cấp được khả năng phân biệt như hệ VNTR/RFLP trước đó Hơn nữa, do tính chất mỗi locus chỉ

có hai alen nên khả năng nhận dạng cá thể trong các mẫu lẫn là rất khó giải quyết [8]

Đầu những năm 1990, kỹ thuật nhân bội đa hình chiều dài đoạn (AmpFLP) được áp dụng trong nhận dạng cá thể Phương pháp này sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bội các locus VNTR như D1S80, ApoB, D17S30 (YNZ22) và COL2A1, sau

đó sản phẩm nhân bội được phân tách gel Polyacrylamide và đọc kết quả bằng kỹ thuật nhuộm bạc, mặc dù phương pháp này rút ngắn được thời gian hơn so với

Đến cuối những năm 1990, các locus trình tự lặp lại ngắn (STR) hoặc các locus tiểu vệ tinh (microsatellite: một phân lớp nhỏ của các VNTR) đã thay thế các chỉ thị di truyền thế hệ I trong các ứng dụng nhận dạng cá thể dựa trên kỹ thuật PCR STR cải thiện đáng kể những thiếu sót của VNTR do kích thước vùng nhân bội nhỏ (100-500 bp), mức độ đa hình cao và có thể tự động hóa qui trình phân tích [9] Hiện nay, phân tích STR đã trở thành tiêu chuẩn “vàng” của nhận dạng cá thể trong khoa học hình sự

1.1.3 Một số chỉ thị ADN ứng dụng trong nhận dạng cá thể

Các chỉ thị di truyền hiện đang được sử dụng phổ biến ở các phòng thí nghiệm khoa học hình sự hiện nay trong giám định truy nguyên cá thể bao gồm các locus STR, các SNP và ADN ti thể (mtADN)

1.1.3.1 Các locus STR

Khái niệm các đoạn lặp và STR

Đoạn lặp: Hệ gen (genome) của người chứa rất nhiều các trình tự lặp lại khác nhau Các trình tự ADN lặp lại này đa dạng về loại hình và kích thước Những đoạn lặp lại dài có thể chứa đến hàng trăm, thậm chí hàng ngàn nucleotide ở vùng lặp lại (còn gọi là nhân lặp) Những vùng này thông thường nằm gần vùng tâm động của NST

Locus STR: STR (trình tự ngắn lặp lại liên tiếp) là các trình tự chứa các đoạn ADN ngắn, thường từ 2 đến 7 nucleotide, lặp lại liên tiếp tại một vị trí xác định trong hệ gen nhân Số lần lặp lại của mỗi locus này được gọi là alen, mỗi cá nhân có kiểu gen 2 alen của mỗi locus STR, một alen nhận từ mẹ và một alen nhận từ bố

Cơ sở khoa học của phân tích STR trong nhận dạng cá thể người

Năm 1956, Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào (thể lưỡng bội) có 46 cặp NST được xếp thành 23 cặp tương đồng: 22 cặp NST thường và một cặp NST giới tính Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 NST (tế bào đơn bội) Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng NST trong tế bào thường là 46 Bộ NST được bảo tồn và di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Thế hệ con cái bao giờ cũng thừa hưởng các đặc tính di

23 NST từ bố được truyền cho con thông qua tinh trùng, 23 NST từ mẹ truyền cho con thông qua trứng Các locus STR nằm trên NST cũng theo đó mà được di truyền qua các thế hệ (hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc locus STR từ

bố, mẹ cho con theo định luật Mendel (8 - 12: một số alen thuộc một locus STR nào đó )

[10]

Vai trò các STR trong nhận dạng cá thể người

Các locus STR trở thành các chỉ thị ADN phổ biến trong nhận dạng cá thể bởi đặc tính dễ dàng nhân bội đồng thời nhờ kỹ thuật PCR, không phải thực hiện nhân bội riêng rẽ như đối với các locus VNTR Đặc điểm này là do các alen của locus STR nằm trong một khoảng kích thước tương đương, khoảng vài trăm bp, các đơn vị lặp lại có kích thước nhỏ Hơn nữa, số đơn vị lặp của các chỉ thị STR rất khác nhau giữa các cá thể, điều này làm cho chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhận dạng cá thể

Với mục đích sử dụng cho nhận dạng cá thể, điểm quan trọng đối với các

chỉ thị ADN là có tính đa hình càng cao càng tốt hoặc một số chỉ thị có tính đa hình thấp hơn có thể kết hợp với các chỉ thị khác để đạt được đủ độ tin cậy phân biệt giữa các cá thể

Bộ STR đầu tiên được nghiên cứu phát triển phục vụ cho ngành pháp lý là bộ STR 4 trình tự STR : TH01, FES/FPS, vWA và F13A Đây là bộ chỉ thị thế hệ thứ nhất Xác suất hai cá thể trùng nhau khi sử dụng bộ KIT bốn gen này khoảng 1/10.000 Bộ KIT thế hệ thứ hai gồm 6 locus là TH01, vWA, FGA, D8S1179,

D18S51 và D21S11 với xác suất hai cá thể trùng nhau 1/50.000.000 Những locus nêu trên đều sử dụng các phương pháp đọc tín hiệu huỳnh quang để phát hiện nên đòi hỏi kinh phí trang bị tương đối lớn và đồng bộ [9]

Từ năm 1996 phòng thí nghiệm của FBI đã hỗ trợ cho việc nghiên cứu và xây dựng cơ sở dữ liệu từ 13 đoạn FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, D18S51, CSF1PO, D8S1179 và D21S11 13 locus đánh dấu này được chia thành 4 nhóm chính:

- Nhóm thứ nhất: trình tự lặp lại chứa các trình tự giống nhau: TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539

- Nhóm thứ hai: Một vài trình tự có những alen không đồng nhất: TH01, D18S51, D7S820

- Nhóm thứ ba: Cấu trúc kép với các alen khác nhau:vWA, FGA, D3S1358, D8S1179

- Nhóm thứ tư: Cấu trúc dạng lặp dạng phức: D21S11

Cho đến nay, số lượng các locus trong bộ KIT nhận dạng cá thể thương mại

có thể lên tới 30 locus, phổ biến sử dụng là các bộ KIT 16 locus [10]

1.1.3.2 Mini-STR

Trong thực tế áp dụng, việc nhận dạng cá thể không phải lúc nào cũng được thực hiện đối với nguồn mẫu chuẩn (như: các mẫu được thu trực tiếp từ cơ thể, các mẫu sinh học còn giữ nguyên vẹn về cấu trúc và đủ hàm lượng ADN cho phân tích một hồ sơ STR đầy đủ) Rất nhiều trường hợp việc nhận dạng cá thể phải thực hiện với các mẫu sinh học đã biến tính một phần hoặc ở tình trạng phân hủy mạnh (mẫu dấu vết hình sự, mẫu hài cốt lâu năm….) Do đó, các nhà nghiên cứu đã đưa ra giải pháp: thiết kế các bộ mồi PCR nhằm nhân bội được các locus STR với kích thước sản phẩm PCR (amplicon) tạo ra rất ngắn, khoảng trên dưới 100 bp (hình 1.2) để phù hợp với việc phân tích các mẫu ADN biến tính [36]

Việc phân tích một số locus mini-STR này sẽ góp phần bổ sung thông tin về

hồ sơ ADN (kiểu gen) cá thể trong những trường hợp phân tích STR thông thường không thu được một hồ sơ kiều gen đầy đủ Tỉ lệ thành công của các hệ Mini-STR

minh: Mini-STR đã cung cấp một hồ sơ ADN với thông tin di truyền gấp 3 lần và đầy đủ hơn hệ STR tiêu chuẩn Các nghiên cứu trên mẫu bị phân hủy mạnh cho thấy rằng các locus mini-STR có kích thước dưới 120 bp đều cho kết quả tốt, các trình tự trên 150 bp thường khó thu được kết quả hơn [51]

Hình 1.2: Hình minh họa vị trí thiết kế mồi Mini-STR và các bộ mồi multiplex Mini-STR (A): Cặp mồi mini-STR được thiết kế lại nhằm tiếp cận gần sát đến vùng nhân lặp hơn các cặp mồi STR thông thường, do đó thu nhỏ kích thước đoạn được nhân bản, tạo điều kiện nhân bội những mẫu ADN bị thoái hóa (B): So sánh kích thước đoạn được nhân bản của hai bộ KIT: AmpFlSTR® MiniFiler™ và Identifiler® kit (Applied Biosystems) [6]

Việc nhân bội ADN sử dụng các locus mini STR phù hợp với các mẫu đã

biến tính, tuy nhiên cũng có một số hạn chế nhất định Thứ nhất, khó có thể kết hợp

nhiều locus mini-STR trong cùng một phản ứng multiplex và phân tách đọc kết quả

tự động bằng điện di mao quản Do là khi mồi được thiết kế để tiếp cận gần hơn vùng nhân lặp, kích thước của các trình tự nhân bội đều bị giảm xuống cùng chung một phạm vi hẹp hơn (khoảng 100 – 150 bp) [10], vì vậy đọc kết quả trên thiết bị

điện di mao quản sẽ chỉ giới hạn được một số locus trong mỗi kênh màu Thứ hai,

theo nghiên cứu của Parsons và cộng sự, trên một mẫu đã bị phân hủy cao cho thấy,

Vùng nhân lặp của STR

Mồi mini STR

Mồi mini STR Mồi PCR

thông thường

Mồi PCR

thông thường

mặc dù hệ 16 locus STR thông thường bao gồm 6 locus STR kích thước lớn nhất bị mất alen khi phân tích thì thông tin di truyền của nó vẫn cung cấp khả năng truy nguyên cá thể có độ tin cậy cao hơn bộ mini-STR 6 locus với đầy đủ 100% thông tin di truyền Để có đủ lượng thông tin di truyền cho một phép tính truy nguyên cá thể tin cậy thì cần có hồ sơ hoàn chỉnh của bộ MiniFilerTM kết hợp với một phần kiểu gen của các locus trong bộ KIT Identifiler®[39]

1.1.3.3 Vùng siêu biến HV1 và HV2 của ADN ti thể

Nhận diện cá thể người dựa vào phân tích trình tự hai đoạn siêu biến đặc trưng (HV1 và HV2) trong vùng điều khiển Vùng siêu biến I có kích thước 342 bp

từ vị trí 16024 đến vị trí 16356, vùng siêu biến II có độ dài 268 bp từ vị trí 73 đến

340

Phân tích ADN ti thể được thực hiện dựa trên cơ sở đặc tính di truyền theo dòng mẹ của các phân tử ADN mạch vòng kép nằm trong tế bào chất Các phân tích mtADN được thực hiện để bổ sung thông tin di truyền cho hồ sơ ADN từ các mẫu khó khi mà các phân tích STR, mini-STR không cho kết quả đầy đủ hoặc không có kết quả

Ti thể là bào quan có số lượng có thể lên tới hàng trăm bản sao trong mỗi tế bào, cấu trúc vòng kép của phân tử mtADN cũng có thể khiến nó bền vững trước tác động của enzyme exonuclease nội bào hơn so với nADN Đồng thời, vị trí linh hoạt của mtADN trong tế bào chất dường như cũng bảo vệ nó tốt hơn trước các cơ chế thoái hóa ADN [17] Vì vậy tỉ lệ thành công của xét nghiệm mtADN trên các mẫu hài cốt sẽ cao hơn so với các phân tích nADN Mặc dù là một công cụ tin cậy

và hiện nay đang được tiến hành rộng rãi trong phân tích nhận dạng mẫu hài cốt lâu năm tại Việt Nam nhưng phân tích ADN ty thể chỉ cho phép xác định đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không xác định được cá thể như đối với nADN, do đó thường chỉ được sử dụng trong việc bổ sung thông tin trong công tác nhận dạng cá thể

1.1.3.4 Đa hình nucleotide đơn (SNP)

Một SNP được định nghĩa là một biến thể trình tự DNA xảy ra khi một nucleotide đơn A, T, C hay G trong hệ gen khác biệt so với các cá thể khác trong

thể tương đồng Ví dụ, hai đoạn trình tự tương ứng của hai cá thể khác nhau, AAGCCTA với AAGCTTA, chứa một sự khác biệt trong các nucleotide đó là hai alen C và T Sự phân bố của các SNP trong hệ gen không đồng nhất, SNP thường xảy ra trong các vùng không mã hóa hơn các vùng mã hóa và hầu hết các SNP đều

ở dạng hai alen

Các chỉ thị SNP có thể được phân loại theo bốn nhóm ứng dụng như sau [16],[18],[23]:

- Phát triển các hệ locus SNP trên NST thường phục vụ truy nguyên cá thể

và xét nghiệm huyết thống: là tập hợp các SNP có độ phân biệt cá thể cao, cho phép một xác suất rất thấp hai cá thể có cùng một kiểu gen

- Phục dựng ngoại hình: Sử dụng các chỉ thị SNP để phục dựng kiểu hình

cá thể như màu da, màu tóc, màu mắt sử dụng cho mục đích định hướng điều tra

- Phân tích phả hệ dựa trên các nhóm SNP nằm trên NST Y và các SNP ti thể: là hệ các SNP liên kết chặt chẽ do thiếu sự tái tổ hợp, có chức năng đánh dấu haplotype, có thể sử dụng để xác định danh tính người mất tích thông qua quan hệ

họ hàng, đặc biệt trong trường hợp các mẫu tham khảo và mẫu cần định danh bị ngăn cách bởi nhiều thế hệ

- Phân tích, xác định mối quan hệ gần gũi, xây dựng cây phát sinh tiến hóa quần thể giữa các quần thể người

Kỹ thuật phân tích SNP không phải là một kỹ thuật mới Trong thực tế, nó là những chỉ thị đầu tiên dựa trên nền tảng công nghệ PCR ứng dụng trong nhận dạng

cá thể Tuy nhiên do tính chất có hai alen của hầu hết các SNP, lượng thông tin di truyền của SNP ít hơn STR rất nhiều trong nhận dạng cá thể, thông thường phải sử dụng tổ hợp của 45-60 locus SNP mới cho lượng thông tin đủ độ tin cậy tương đương với khả năng phân biệt của 9-16 locus STR [45] Đối với các trường hợp thông thường thì STR có ưu thế tốt hơn SNP, chính vì thế hiện nay cơ sở dữ liệu ADN cấp quốc gia của các nước trên thế giới đều được xây dựng dựa trên các hệ STR Về mặt di truyền quần thể, các locus STR cũng được nghiên cứu rộng rãi, tần suất phân bố alen của các locus STR được xây dựng cho nhiều quần thể người khác

1.2 Các nguồn ADN sử dụng trong phân tích mẫu hài cốt

Không giống như dấu vân tay, chỉ thị protein hoặc đặc trưng nha khoa, các xét nghiệm dựa trên ADN không bị giới hạn ở bất kỳ phần/mô nào của cơ thể Tuy nhiên, trong các trường hợp khi phân tích ADN từ nguồn mẫu mô mềm trở nên khó khăn như đối với những mẫu sinh học đã phân hủy trong một thời gian dài thì nguồn mẫu cung cấp ADN chỉ còn là các mô cứng như xương và răng

Một thách thức trong phân tích ADN từ xương là hạn chế về thu hồi ADN từ các mẫu lâu năm, đã bị phân hủy mạnh Việc hiểu rõ đặc điểm của ADN tồn tại trong các mẫu hài cốt (xương, răng) lâu năm là cơ sở để thực hiện các kỹ thuật thu giữ, bảo quản, xử lý và tách chiết ADN để có được hiệu quả thu hồi ADN có hàm lượng và độ tinh sạch cao, đảm bảo cho phân tích, nhận dạng cá thể trong giám định pháp y

1.2.1 Xương

1.2.1.1 Cấu trúc xương

Xương là loại mô liên kết đặc biệt đã bị canxi hóa và có cấu trúc dạng lá Bằng mắt thường, cấu trúc một xương gồm 2 dạng cấu tạo đại thể: Xương dẹt và đầu khớp của xương dài: gồm có một lớp bên ngoài vững chắc (vỏ xương) bao quanh một mạng lưới chịu tải hình thành từ lá xương tạo thành một hệ thống vách mỏng không đều được gọi là bè xương, xếp theo nhiều hướng khác nhau và có thể nối với nhau gọi là mô xốp (trabeculae – còn gọi là cancellous) Giữa các bè có những hốc chứa tủy xương Trục xương dài: không có hốc, có các lá xương tạo thành những cấu trúc đặc biệt được gọi là hệ thống Havers Mỗi hệ thống có dạng hình trụ, gồm những lá xương xếp vòng, ở chính giữa khối trụ đó là ống Havers chứa mạch, mô liên kết

Ở mức độ hiển vi, xương cấu tạo từ vật liệu cứng, đồng nhất, bên trong hoặc xen lẫn giữa chúng là ba loại tế bào đặc trưng bao gồm: tạo cốt bào, cốt bào và hủy cốt bào Những tế bào này phân bố đều khắp các bề mặt của xương, tùy thuộc vào trạng thái sinh lý của mô xương (đang trong quá trình hình thành bè xương, khoáng hóa chất nền xương hay sửa chữa)

Hình 1.3: Hình ảnh chụp hiển vi của 03 loại tế bào xương

Tạo cốt bào (osteoblast – nguyên bào xương) là những tế bào đơn nhân chưa trưởng thành chịu trách nhiệm cho sự hình thành xương, về sau tự nằm trong ổ xương khi đã tạo ra chất nền xung quanh nó và trở thành cốt bào Nằm trên bề mặt của giá đỡ tạo xương, chúng tiết osteoid (một loại hỗn hợp các protein) mà sau này

bị canxi hóa bằng cách liên kết với hydroapatite (HA - một chất carbon chưa cân bằng hóa học) để hình thành các bè xương Tạo cốt bào cũng sản xuất enzyme tham gia vào quá trình canxi hóa, ví dụ như prostaglandin (ức chế hoạt động của hủy cốt bào) hoặc alkaline phosphate (tăng khả năng di động của hủy cốt bào làm tăng hủy xương) Nguồn gốc của chúng là từ một loại tế bào trung mô chưa biệt hóa gọi là tế bào sinh xương

Cốt bào (Osteocyte) là những tế bào xương trưởng thành hình ngôi sao nằm trong một hốc nhỏ của chất gian bào gọi là ổ xương (lacunae) Chúng có nguồn gốc

từ các tạo cốt bào

Hủy cốt bào (osteoclasts) là những tế bào đa nhân lớn, có thể từ 3 đến vài chục nhân, nằm trên vách xương trong một cấu trúc gọi là ổ Howship (hay hố tái hấp thu), trong bào tương có nhiều ti thể, các bào quan khác kém phát triển Chúng

là tế bào tiêu hủy xương và hủy sụn nhiễm can xi với cường độ cao, đóng vai trò quyết định trong việc tu sửa xương Các hủy cốt bào có nguồn gốc từ một dòng tế bào đơn nhân (mono bào) đặc biệt trong tủy xương [38]

1.2.1.2 Sự tồn tại của ADN trong xương

Thời gian tồn tại của mô xương sau khi cơ thể chết phụ thuộc điều kiện môi trường như chôn trong đất, phơi trực tiếp trong không khí hay ngâm trong nước

(mặn hoặc ngọt) Dưới tác động của các nhân tố hữu cơ hoặc vô cơ, quá trình phân hủy xương diễn ra theo một cơ chế xác định, ví dụ như trong đất thì xương phân hủy do nấm, vi khuẩn trong đất xâm nhập vào các khe hở màng xương và bắt đầu phân hủy ma trận khoáng, chất nền xương sau một vài năm, còn với môi trường nước thì vi khuẩn lam có vai trò quyết định, chúng đẩy nhanh sự phân hủy bằng cách tăng độ xốp của xương [41] Mặc dù cơ chế phân hủy của mô xương đã được nghiên cứu rõ ràng nhưng sự thoái hóa của ADN trong xương theo thời gian, đặc biệt là nguồn gốc và vị trí ADN nằm trong xương lại chưa được làm rõ, còn tồn tại nhiều câu hỏi và giả thuyết trái ngược Tuy nhiên, hầu hết các giả thuyết đều thống nhất rằng: ADN trong mô xương mới phần lớn có nguồn gốc từ các tế bào xương, còn với các xương lâu năm ADN có nguồn gốc từ ma trận khoáng Sự tồn tại ADN lâu dài trong xương là nhờ vào ma trận khoáng và quá trình canxi hóa đóng vai trò quan trọng trong việc “lưu trữ, bảo quản” ADN [40] Đây cũng là cơ sở khoa học của bước decanxi (khử khoáng) được áp dụng trong hầu hết các phương pháp tách chiết ADN từ xương

1.2.2 Răng

1.2.2.1 Cấu trúc răng

Răng là mô cứng nhất trong cơ thể người và đề kháng tốt với các điều kiện bất lợi của môi trường như độ ẩm, nhiệt độ cao và hoạt động của vi sinh vật [31] Răng được coi là một nguồn cung cấp ADN truyền thống khi các mẫu khác bị mất hoặc không cung cấp đủ ADN cho nhận dạng cá thể Vị trí của răng trong giải phẫu (nằm trong hốc xương) và cấu trúc hình thái học (lớp men răng cứng, chắc bao ngoài) khiến ADN nội sinh của răng được bảo vệ tốt trước các cơ chế thoái hóa sau khi chết

Một chiếc răng của con người điển hình bao gồm một lớp ngoài bao phủ bởi lớp men, một khoang tủy bọc bởi mô ngà và 1-4 rễ Mỗi gốc được lót bằng một lớp cementum và có một đỉnh ở mũi để giúp cho các dây thần kinh và mạch máu đi thông vào khoang tủy (Hình 1.5)

Hình 1.4: Cấu trúc điển hình của răng người [13].

1.2.2.2 Vị trí của ADN trong răng

Phần men răng cấu tạo từ các thành phần vô bào, không chứa ADN Tủy răng, ngà răng là những phần cung cấp ADN tốt cho các phân tích kiểu gen Đối với răng mới, chưa bị phân hủy thì tất cả các phần (tủy, ngà răng) đều cung cấp đủ số lượng nADN và mtADN, tuy nhiên số lượng của hai loại ADN trong các mô khác nhau của răng có sự khác biệt lớn sau khi chết Phân tích mô học và qADN răng bị phân hủy qua các khoảng thời gian sau chết khác nhau cho thấy sự toàn vẹn về cấu trúc và trình tự của nADN trong tủy và ngà răng suy giảm nhanh chóng Khoảng 8 tháng đối với tủy răng và 16 tháng đối với ngà răng, cả nADN và mtADN đều không thu được ở phần mô này [13] Ở lớp cementum, nhờ cấu trúc vững chắc, lượng nADN được bảo quản ở đây bền vững sau thời gian sau khi chết, lượng mtADN lại được bảo tồn tốt hơn ở phần cementum nằm ở chân răng Điều này được giải thích có thể do mật độ tế bào và các ma trận khoáng ở hai mô Ở tủy răng và ngà răng ADN được tách từ các tế bào, quá trình phân hủy các tế bào mô mềm trong tủy răng diễn ra nhanh chóng, thông thường sau khi chết một năm thì lượng tàn dư tủy trong răng đã phân hủy hết Phân tích mô học cũng cho thấy ngà răng có sự thay đổi cấu trúc rất lớn, xảy ra chủ yếu ở lớp bên ngoài, phía tiếp xúc với tủy răng (lớp pre-dentine), đến khoảng 2 năm sau chết thì lớp pre-dentine này hoàn toàn biến mất

Chóp răng Mạch máu + Dây thần kinh = tủy răng

Xương hàm Cementum

[13] Ở lớp cementum thì nguồn cung cấp nADN nằm ở các tế bào cementoblast và cementocytes Chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như các các tế bào tạo cốt bào và cốt bào ở mô xương Cũng tương tự như quá trình tạo xương, sự tạo thành của lớp cementum là quá trình canxi hóa của các cementocytes, và các phân tử ADN của cementocytes sẽ được bảo quản lâu dài trong các tinh thể khoáng Sự tồn tại của mtADN trong phần chân răng lại có thể được giải thích bằng quá trình biệt hóa của các tế bào odontoblast (tế bào của thần kinh mào gốc phân bố trên bề mặt ngoài của tủy răng) trong quá trình hình thành ngà răng (dentinogenesis) và các lớp dưới men răng và cementum xảy ra ở chân răng (hình 1.6) Ngà răng bao gồm các ống được liên kết chặt chẽ, phần chân răng nơi diễn ra sự biệt hóa mạnh mẽ các ống này có chứa các tế bào ondotoblast cùng các ti thể sợi thần kinh phong phú Sau khi chết, trong quá trình phân hủy các mtADN trong ty thể có khả năng bị mắc kẹt lại trong ống ngà và được bảo vệ bởi các ma trận khoáng của cementum [13]

Hình 1.5: Lớp tế bào odontoblast (mũi tên) xếp thành lớp trên bề mặt khoang tủy răng và

ống tủy, nơi có quá trình biệt hóa hình thành lớp phức hợp ngà-tủy răng

Điều này cho thấy mtADN và nADN rõ ràng không phân bố đều khắp các

mô răng Các phương pháp tách chiết ADN từ răng thường nghiền toàn bộ răng thành bột để có thể tiếp cận được phần tủy và ngà răng, cũng có phương pháp ngâm răng trong đệm phân hủy qua đêm để loại bỏ lớp men răng bao ngoài Thực tế thí nghiệm với răng lâu năm cho thấy lượng ADN thu được tốt nhất là từ các mẫu bột răng nghiền, tuy nhiên phương pháp này cũng đồng thời gia tăng đáng kể lượng các chất ức chế PCR trong khuôn ADN sau tách chiết Vấn đề này có thể khắc phục

Men răng

Buồng tủy

Ngà răng

Cementum Phức hợp Ngà - Tủy răng

Odontoblast

bằng cách chỉ lấy mẫu ở những phần của răng mà cung cấp ADN phong phú, đủ chất lượng cho mục đích phân tích di truyền tiếp theo

1.2.3 Sự tồn tại và khả năng thu được ADN trong các bộ phận khác nhau của mẫu hài cốt

Các dữ liệu thực nghiệm cho thấy, trong trường hợp có thể, việc lựa chọn mẫu thí nghiệm cẩn thận sẽ giảm bớt số lần lặp lại thí nghiệm, tiết kiệm thời gian và công sức Từ năm 1994 đến 2004, phòng thí nghiệm AFDIL (Armed Forces DNA Identification Laboratory - USA) đã xử lý hơn 2000 mẫu xương cổ có nguồn gốc từ thế chiến II, chiến tranh Triều Tiên và chiến tranh Việt Nam Nghiên cứu này cho thấy các xương chịu lực (có cấu trúc xương đặc) như xương đùi, xương chày là các loại mẫu cung cấp lượng ADN tốt nhất Xương bàn chân, mặc dù cũng là xương chịu lực nhưng cấu tạo từ các xương nhỏ, dễ bị phân mảnh cho nên khó thu đủ một mảnh xương có khối lượng mẫu cần thiết, mặc dù với mẫu xương này thì tỉ lệ thành công khá lớn, khoảng 80% thí nghiệm cho kết quả phân tích tốt Xương sườn cũng cho kết quả phân tích thành công, mặc dù khá khó để thu mẫu hoàn chỉnh Các mẫu xương sọ, xương đốt sống là những mẫu cho kết quả kém (do cấu trúc xốp, dễ bị tác động xấu bởi các yếu tố môi trường) Hình 1.6 mô tả các khu vực mẫu xương và kết quả phân tích di truyền thành công tương ứng.

Hình 1.6: Sơ đồ các khu vực mẫu xương và mức độ thành công của các phân tích ADN

tương ứng [15]

Nhìn chung, các xương có phần vỏ xương dày đặc (xương dài) nên là các mẫu ưu tiên khi thu mẫu, có lẽ do ở phần xương này có lớp ma trận khoáng - protein dày đặc nên phần ADN được bảo quản tốt hơn so với những phần xương xốp Ngoài các mẫu xương dài, các mẫu răng nhờ cấu trúc cứng, chắc đặc biệt của mình là một trong những mẫu tốt cho các phân tích ADN

Mặc dù mẫu răng hàm dễ thu hơn mẫu xương dài nhưng có một số đối tượng

mà răng không thể sử dụng cho các xét nghiệm ADN, ví dụ như trong các trường

nghiên cứu cho thấy tuổi khi chết của hài cốt lâu năm có ảnh hưởng đến lượng nADN thu được từ răng, nguyên nhân có thể do răng trưởng thành có nhiều khoáng,

ít xốp đồng thời lỗ tủy ở chân răng cũng hẹp hơn răng người trẻ tuổi [13], vì vậy răng người trưởng thành có khả năng chống lại sự xâm nhập của độ ẩm, vi khuẩn qua bề mặt và lỗ chân răng, giảm những ảnh hưởng tiêu cực của môi trường lên sự suy thoái ADN bên trong răng

1.3 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm trên thế giới

Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp Thu nhận hồ sơ ADN (cả mtADN và nADN) từ xương thường gặp nhiều khó khăn do nguồn ADN tách chiết thường đã bị thoái hóa mạnh, số lượng ít và sự hiện diện của nhiều chất ức chế PCR Một phương pháp tách chiết ADN từ xương tối ưu

sẽ đồng thời phục hồi lượng ADN lớn nhất và loại bỏ tốt nhất các yếu tố ức chế PCR

Các qui trình tách chiết ADN còn lại từ xương rất khác nhau, có hai phương pháp thông thường thường được sử dụng gồm có: tách hữu cơ (sử dụng phenol/chloroform) và tách vô cơ (silica hoặc hạt từ) Phương pháp hữu cơ có hiệu quả trong việc loại bỏ các protein và chất béo từ dịch chiết ADN, tuy nhiên nó lại không hiệu quả đối với việc loại bỏ các chất ức chế PCR như acid humic đồng thời

nó tốn thời gian, thao tác phức tạp và các dung môi sử dụng độc hại Vì vậy, nhiều nhóm nghiên cứu và các hãng thương mại đã nỗ lực phát triển các phương pháp khai thác vô cơ Đa số các phương pháp này sử dụng các khả năng hấp thụ thuận nghịch của silica hoặc hạt lõi từ đối với các phân tử ADN dựa trên nồng độ muối

Từ lâu, tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được nhiều tác giả quan tâm và nghiên cứu Bảng 1.1 trình bày tổng hợp các qui trình tách chiết ADN từ xương lâu năm và xương cổ đại đã được công bố

Bảng 1.1: Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được công bố trên

thế giới

Tác giả Mẫu hài

cốt

Phương pháp tách chiết ADN

Tinh sạch bằng cột silica

Trình tự lặp lại ngắn (Short-VNTR)

Thu được kiểu gen VNTR của mỗi cá thể Khi nhân bội ADN từ xương thất bại thì kiểu gen sẽ được xác định bằng cách lấy từ một chiếc răng hoặc lấy thêm xương

Dùng Phenol/chloroform để tách chiết, tủa ADN bằng ethanol

Nhân bội nADN

Không nhân bội đuợc một số xương khi dùng phenol/chloroform để tách chiết và tủa ADN bằng ethanol

Nhân bội thành công khi tủa protein bằng muối sodium acetate và tủa ADN bằng isopropanol

Nhân bội nADN

Nhân bội được khi tách chiết bằng

K được thêm vào cột cô mẫu và/ hoặc cột silica

Dùng sodium acetate và ethanol

để tủa ADN từ dịch nổi của dịch phân giải bột xương

Dùng EDTA loại khoáng trong xương, tách chiết bằng

phenol/chloroform, tủa ADN bởi isopropanol

Giải trình

tự mtADN

Thu được trình tự hoàn thiện của ADN ty thể khi

sử dụng sodium acetate/ethanol để tủa ADN

Không nhân bội được khi tách chiết bằng

phenol/chloroform và tủa bằng isopropanol

Chạy qPCR đối với ADN

Từ các mẫu hài cốt bị mủn, kém chất lượng thì

sự hòa tan hoàn toàn bột

100 năm phenol/chloroform/isoamyl

alcohol dùng cho tách chiết, cột

cô mẫu

Nhân bội STR

được thu hồi tăng lên đáng kể và số lượng allen thu được của STR cũng tăng lên

Thất bại khi tách chiết ADN từ những xương bị cháy

Những trường hợp lịch

sử ít có khả năng cho trình tự ADN ty thể đầy

Dùng EDTA loại khoáng trong xương, tách chiết bằng silica;

ngoài ra còn tối ưu hóa phương pháp này

Chạy qPCR đối với ADN

ty thể

Không có sự khác biệt đáng kể về lượng ADN thu được giữa phương pháp có khả năng thu hồi ADN cao nhất (kit dựa trên hạt silica có từ tính)

và các phương pháp khác Tối ưu hóa loại khoáng/ tách chiết bằng silica làm tăng chất lượng ADN lên gấp 2 lần

Bổ sung thêm các chất tẩy rửa không cải thiện được chất lượng ADN

Bổ sung EDTA và protein K làm tăng chất lượng ADN

Nhân bội ADN ty thể Nhân bội nADN ( locus giới tính)

Đa số các xương nhân bội thành công ADN ty thể, 4 trong 9 xương nhân bội được locus giới tính khi sử dụng silica tách chiết

Khi tách chiết với silica

và cột trao đổi ion thì tất

cả các xương đều nhân bội thành công ADN ty thể và locus giới tính

Nhân bội STR (người) Nhân bội

Tách chiết ADN thành công khi sử dụng song siêu âm để xử lý mẫu Lên đầy đủ NADN ở các

của STR (lợn)

Tỉ lệ khôi phục ADN genomic thấp(< 51%) Nồng độ mùn cao làm ảnh hưởng đến chất lượng ADN

Hòa tan hoàn toàn bột xương làm tăng số lượng allen của STR

số thay đổi, cột cô mẫu

Chạy qPCR đối với nADN Nhân bội STR

Hòa tan hoàn toàn bột xương đã cải thiện được chất lượng của STR và

số lượng ADN được hồi phục

Protocol bao gồm cả quá trình hòa tan được tiến hành tự động trên hệ thống QIAcube

Định lượng nADN Nhân bội STR

Với việc tối ưu hóa phương pháp đã thu được đầy đủ hồ sơ STR từ xương được tách chiết; một phần hồ sơ STR khi trước đây sử dụng protocol này đã được tác giả công bố

Định lượng nADN Nhân bội STR

Tách chiết với phenol/chloroform giúp ADN phục hồi tốt hơn Tách chiết bằng phenol/chloroform cho đầy đủ hồ sơ STR; sử dụng Kit tách chiết Silica thì số allen nhân bội được ít hơn

Có thể thấy rằng không có sự đồng thuận về một phương pháp tách chiết ADN tối ưu cho xương lâu năm Không chỉ bất đồng về phương pháp tách chiết, từng bước trong mỗi qui trình tách chiết cũng khác nhau tùy theo mỗi nhóm tác giả

Ví dụ như bước loại can xi có nhóm tác giả cho rằng cần thiết phải tiến hành trong thời gian dài nhưng cũng có ý kiến cho rằng bước này sẽ làm mất lượng lớn ADN,

nếu kéo dài sẽ làm tăng khả năng mất hoặc phân hủy ADN, giảm hiệu suất tách chiết…

1.5 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ thuật phân tích ADN để xác định cá thể người đã được bắt đầu vào cuối những năm 90 của thế kỷ 20 và đã có những bước phát triển nhất định

* Năm 2003, Viện Pháp Y quân đội phối hợp với Viện Công nghệ sinh học

thực hiện đề tài khoa học cấp nhà nước "Nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN trong việc xác định hài cốt liệt sĩ" có mã số KC.04.23 Hiện nay, công nghệ giám

định gen trên ADN ti thể đã được ứng dụng trong thực tiễn tại Việt Nam, với hàng trăm trường hợp được xác định thành công [2]

* Mô ̣t số trung tâm, công ty có di ̣ch vu ̣ phân tı́ch di truyền cũng có thể đáp ứng những yêu cầu phân tı́ch giám định ADN ti thể từ xương lâu năm

Như vậy, việc giám định các mẫu xương sử dụng hệ gen ti thể đã được tiến hành từ lâu và thu được nhiều kết quả Tuy nhiên, đến thời điểm hiện tại, chưa có

mô ̣t cơ sở nghiên cứu nào tiến hành các phân tı́ch ADN đối với hệ gen nhân trên mẫu xương lâu năm Phương pháp phân tı́ch ADN ti thể, mă ̣c dù có nhiều kết quả khả quan, nhưng chı̉ cho phép xác định được quan hệ di truyền theo dòng mẹ mà không có khả năng truy nguyên đến cá thể Trong khi đó, viê ̣c phân tı́ch nADN từ xương lâu năm có thể cho phép truy nguyên tới tâ ̣n cá thể với mức độ chính xác cao khi có thêm các mẫu liên quan như mẫu có quan hệ huyết thống trực tiếp, mẫu của anh em trai theo dòng cha hoặc khi có cơ sở dữ liệu ADN để đối chiếu so sánh trực tiếp Đây là một yêu cầu thiết yếu trong giám định hình sự Hơn nữa, tại Việt Nam, nhu cầu giám định hài cốt rất lớn, số lượng mẫu cần giám định hàng năm lên tới hàng trăm mẫu

Tìm hiểu về tình hình giám định ADN phục vụ mục đích truy nguyên cá thể

từ các mẫu đã bị phân hủy mạnh, đặc biệt là các hài cốt, chúng tôi nhận thấy có một

số điểm cần lưu ý sau:

1 Có một nhu cầu lớn về phân tích, giám định ADN nhằm định danh, truy nguyên cá thể Đó có thể là những trường hợp nhận dạng cá nhân đơn lẻ trong các mẫu hình sự hoặc nhu cầu truy tìm nhân thân, cũng có khi là các trường hợp cần phân tích số lượng lớn như mẫu hài cốt liệt sĩ trong chiến tranh hoặc mẫu nạn nhân

4 Ở Việt Nam, phân tích ADN xương lâu năm đã được tiến hành từ lâu nhưng chủ yếu sử dụng phân tích mtADN

Từ phân tích trên, chúng tôi xác định mục tiêu đặt ra của đề tài luận văn là:

Tối ưu được qui trình tách ADN tổng số từ xương lâu năm phục vụ nhận dạng cá thể người phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam

Nội dung nghiên cứu bao gồm:

- Tối ưu các bước xử lý mẫu, loại can xi

- Thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu tại điều kiện phòng thí nghiệm

- Tối ưu qui trình tách chiết, phân tích nADN từ xương lâu năm; thực hiện phân tích với các mẫu thu thập theo qui trình đã xây dựng

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Năm mươi mẫu hài cốt có tuổi xương từ 40 năm trở lên thu tại nghĩa trang liệt sỹ huyện Mộc Hóa, tỉnh Long An (Phụ lục 1)

Đánh giá về hình thái ban đầu, có 30/50 mẫu có độ cứng chắc cao và 20/50 mẫu có mức độ phân hủy nhẹ Danh sách mẫu và các đặc điểm phân loại dựa trên hình thái ban đầu khi thu mẫu được trình bày tại phụ lục 1

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất dùng cho nghiên cứu

5 Bone Incubation Buffer – Đệm ủ xương Promega - USA

®Magnetic Technology Stand

9 PowerPlex®16HS System (Cat.#DC2101) Promega - USA

13 GoTaq®Hot Start Polymerase (Cat.# M5132) Promega - USA

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị cơ bản dùng cho nghiên cứu

1 Máy nghiền xương Cyber Mill và cối nghiền đi kèm Restch

2 Máy định lượng ADN Nanodrop Thermo Scientific - Mỹ

3 Máy ly tâm falcon 15ml, 50ml, 1.5ml Hettich – Đức

5 Hệ thống máy 3130 Genetic Analyzer Applied Biosystems -

USA

8 Hệ thống lọc nước khử ion Milli-Q (Integral 3) Millipore - Anh

9 Máy ly tâm (tốc độ 13.000 vòng/phút) Sorvall - USA

USA

11 Box chuẩn bị PCR vô trùng (Class 2) TelStar-Tây Ba Nha

Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng Sinh học nghiệp

vụ, Viện kỹ thuật Hóa học – Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ (P3-H57), Bộ công an

14 5X Colorless GoTaqđ Flexi Buffer Promega - USA

15 Internal Lane Standard (ILS 600) Promega - USA

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lựa chọn mẫu

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng răng hàm, các xương chịu lực hay còn gọi xương dài (xương đùi, xương chày, xương trụ, xương mác…) thường là mẫu ưu tiên trong quá trình thu mẫu giám định ADN Tuy nhiên các mẫu răng hàm

sẽ bền vững hơn về mặt cấu trúc so với các mẫu xương dài nên thường được lựa chọn nhiều cho phân tích Với mục tiêu thu mẫu để phân tích ADN hệ gen nhân trong xương lâu năm, chúng tôi xác định các mẫu thu thập ngoài điều kiện về thời gian tồn tại sau khi chết (từ 20 – 50 năm), các mẫu thu thập phải là những mẫu có chất lượng tốt hoặc có mức độ phân hủy nhẹ

Các tiêu chí lựa chọn mẫu được chúng tôi đặt ra dựa trên đánh giá sơ bộ về

tiêu chuẩn hình thái như sau:

(1) Ưu tiên lựa chọn các mẫu răng hàm, xương dài

(2) Lựa chọn mẫu có độ cứng chắc cao, giữ nguyên được hình thái ban đầu hoặc có mức độ phân hủy nhẹ (mẫu tồn tại ở dạng mảnh xương, không bị vỡ vụn, không bị mủn)

Các tiêu chí lựa chọn được đưa ra với định hướng nhằm đảm bảo khả năng thành công tối đa cho phân tích các locus STR trên ADN nhân

Căn cứ các tiêu chí đặt ra, chúng tôi đã phối hợp với Cục người có công - Bộ LĐTB & XH tiến hành thu thập các mẫu xương lâu năm sử dụng cho nghiên cứu đề tài Các mẫu được thu tại Nghĩa trang liệt sĩ Mộc Hóa - Tỉnh Long An, thuộc thị xã Kiến Xương, Tỉnh Long An Điều kiện tự nhiên của vùng nằm trong khu vực Đồng Tháp Mười, đất chủ yếu là đất trũng phèn, ngập nước hàng năm Khí hậu nhiệt đới gió mùa, chia làm 2 mùa mưa nắng rõ rệt Nhiệt độ trung bình hàng năm từ 27,4 - 27,90C Số giờ nắng trung bình hàng năm từ 2.454 - 2.669 giờ Lượng mưa trung bình hàng năm 1.347 - 2.464 mm Độ ẩm tương đối trung bình hàng năm 79,4 - 80,9%

2.2.2 Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu và bố trí khu vực thí nghiệm sau khi thu mẫu

Các cán bộ thu mẫu phải mặc áo bảo hộ, đi găng tay và sử dụng khẩu trang

để ngăn ngừa nhiễm mẫu Các mẫu sau khi thu tại hiện trường được bảo quản trong các túi thu mẫu chuyên dụng, mỗi mẫu được đánh mã số riêng

Trong quá trình khai quật và giám định ban đầu, chúng tôi phải tiến hành đánh giá rất cẩn thận để bảo đảm mẫu xương thu được đủ tốt cho các bước phân tích về sau, đồng thời, các mẫu sau khi chuyển về phòng thí nghiệm đều được bảo quản ở tủ lạnh âm sâu (-20oC) để đảm bảo ADN trong mẫu được giữ lại ở điều kiện tốt nhất

Khu vực sử dụng cho các xét nghiệm phân tích ADN đối với mẫu hài cốt được chúng tôi phân thành 05 khu riêng biệt cho các bước xử lý, tách mẫu, chuẩn bị PCR, chạy PCR, điện di sản phẩm nhân bội và phân tích kết quả

Những người thực hiện phải có đầy đủ kiến thức để tránh việc nhiễm ADN ngoại lai vào mẫu do lỗi thao tác kĩ thuật chưa thành thạo có thể xảy ra ở bất cứ bước nào trong khi làm thí nghiệm, ví dụ như đưa tay ngang qua tube đang mở hoặc chạm vào bên trong nắp ống khi mở hoặc đóng ống… Để đảm bảo giảm tối đa khả năng nhiễm, những người thực hiện cần được trang bị kiến thức và thực hành thành thạo các thao tác về các vấn đề liên quan và các hướng dẫn phòng ngừa Mỗi cá nhân có liên quan đến khu vực PTN phân tích ADN đều phải được lập hồ sơ ADN

cá nhân

Việc tách các mẫu ADN hiện đại từ các sinh phẩm khác như máu, tóc, niêm mạc miệng cần cách ly với khu vực xử lý và tách mẫu hài cốt để tránh tuyệt đối việc lây nhiễm mẫu ADN vào các mẫu hài cốt

Các vật dụng cần trang bị và sử dụng ở tất cả các bước để ngăn ngừa nhiễm: khẩu trang phẫu thuật, găng tay, mũ trùm tóc, tay áo dùng một lần, quần áo phòng thí nghiệm chuyên dụng, giày (hoặc bao giày) Bộ quần áo bảo hộ cá nhân không được mang ra khỏi khu vực làm việc

Tất cả các khay đựng, pipet… phải được lau rửa sạch bằng thuốc tẩy và chiếu tia UV (ngừa crosslinker trong tối đa 30p ở bước sóng 254nm) sau mỗi thao tác

2.2.3 Xử lý mẫu – Loại canxi

Xử lý mẫu

Một trong những bước quan trọng của quy trình phân tích đối với mẫu xương lâu năm là khâu xử lý mẫu ban đầu Việc xử lý mẫu ban đầu cũng như việc thực

hiện các bước tách chiết sau này được thực hiện theo nguyên tắc chung đối với tất

cả các phòng thí nghiệm: (1) đảm bảo làm sạch mẫu nhưng không ảnh hưởng lớn tới sự nguyên vẹn và hàm lượng ADN có trong mẫu; (2) đảm bảo tuyệt đối không nhiễm ADN ngoại lai và không nhiễm chéo giữa các mẫu

Tiến hành cọ rửa mẫu dưới vòi nước (để loại bỏ chất bẩn bên ngoài) sử dụng giấy ráp hoặc bàn chải dùng một lần để loại bỏ bụi, mô mềm và những chất bẩn bên ngoài Loại bỏ 1-3 mm (tùy thuộc vào từng loại mẫu) lớp bề mặt ngoài của xương Sau đó cắt xương thành mảnh nhỏ, đặc biệt cần thiết đối với các mẫu xương đã bị rạn

và cong Siêu âm mẫu trong nước gia ven (NaClO) 5% trong 1 - 2 phút Lặp lại bước rửa siêu âm 2-3 lần Súc rửa mẫu với nước khử ion (ddH2O) trong 5 phút Mẫu được

ngâm chìm và lắc mạnh trong 30 giây Siêu âm trong ddH2O trong 1-2 phút Sau đó rửa một lần với ethanol 100% Để mẫu trong ống falcon mở nắp, để khô qua đêm trong tủ hốt ở nhiệt độ phòng Chuyển mẫu sang ống falcon mới có ghi mã số mẫu tương ứng Chiếu tia UV khử trùng bề mặt xương trong 10 phút Chuyển mẫu sang cối nghiền Chạy máy nghiền không quá 2 phút, sau đó kiểm tra độ mịn của mẫu Chuyển bột mẫu đã nghiền mịn đĩa cân, lấy khoảng 1 gam sang ống 50 ml mới có đánh dấu kí hiệu mẫu Rửa sạch toàn bộ các bề mặt, cối nghiền, cốc, tủ, dụng cụ khác bằng chất tẩy rửa sau khi xử lý xong mẫu

Loại canxi

Các ma trận khoáng và các mối liên kết hóa học giữa các phân tử có tác dụng bảo vệ tốt ADN trong xương trước các yếu tố bất lợi từ môi trường nhưng