Nghiên cứu phân loại xạ khuẩn biến sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển việt nam

Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý như: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HỒ VĂN HOÀN

NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN BIỂN SINH KHÁNG SINH PHÂN LẬP TỪ CÁC VÙNG

VEN BIỂN VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

TNTĐCNG Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gene

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài

Bảng 3.1 Hoạt tính đối kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn Bảng 3.2 Mầu sắc của các chủng xạ khuẩn trên các môi trường ISP khác nhau Bảng 3.3 Khả năng sử dụng nguồn nitơ của các chủng xạ khuẩn

Bảng 3.4 Khả năng sử dụng nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn

Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở nồng độ NaCl khác nhau

Bảng 3.6 Khả năng sinh trưởng của chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 ở các

điều kiện nhiệt độ khác nhau Bảng 3.7 Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn ở điều kiện pH khác nhau

Bảng 3.8 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA113 với chủng xạ

khuẩn S scabies ISP 5058

Bảng 3.9 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn NA115 với chủng

chuẩn S tendae ISP 5101

Bảng 3.10 Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA113

với gene tương ứng của các chủng vi khuẩn được đăng ký trên GenBank

Bảng 3.11 Kết quả so sánh trình tự gene mã hóa 16S-rRNA của chủng NA115

với gene tương ứng của các chủng vi khuẩn được đăng ký trên GenBank

Bảng 3.12 Khả năng sinh chất kháng sinh trên các môi trường lên men khác nhau

của các chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến hoạt tính kháng khuẩn của

chủng NA113 và NA115 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của pH ban đầu và độ thoáng khí đến hoạt tính kháng sinh Bảng 3.15 Phổ hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn NA113 và NA115

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin

Hình 1.2 Cấu trúc của Diazepinomicin

Hình 1.3 Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4) Hình 3.1 Tỉ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc của chủng NA113 trên môi trường ISP2, ISP3 Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc của chủng NA115 trên môi trường ISP2, ISP3 Hình 3.5 Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA113 Hình 3.6 Cuống sinh bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng NA115 Hình 3.7 Khả năng sinh trưởng của chủng NA113 trên môi trường có pH

khác nhau Hình 3.8 Khả năng sinh trưởng của chủng NA115 trên môi trường có pH

khác nhau Hình 3.9 Kết quả điện di DNA tổng số của hai chủng xạ khuẩn trên gel

agarose 1%

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%

Hình 3.11 Cây phân loại của chủng NA113 và một số chủng xạ khuẩn

Hình 3.12 Cây phân loại của chủng NA115 và một số chủng xạ khuẩn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iv

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH VẼ vii

MỤC LỤC viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn 3

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 3

1.1.3 Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn 6

1.2 Phân loại xạ khuẩn 7

1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 7

1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) 8

1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 8

1.2.4 Phân loại số (Numerical Taxonomy) 9

1.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rDNA 9

1.3 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 10

1.3.1 Nhóm chất kháng sinh polyketide 10

1.3.2 Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide 11

1.3.3 Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide 12

1.3.4 Nhóm kháng sinh isoprenoid 12

1.3.5 Các chất kháng sinh khác 13

1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15

1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn 15

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn 16

1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh 17

1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước 17

1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu 21

2.1.1 Vật liệu 21

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22

2.2.2 Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu 22

2.2.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh 23

2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 24

2.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn biển sinh kháng sinh 29

3.2 Đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn 32

3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 32

3.2.2 Đặc điểm hình thái 34

3.3 Đặc điểm sinh lí - sinh hóa 35

3.3.1 Khả năng sử dụng nguồn nitơ 35

3.3.2 Khả năng đồng hóa nguồn cacbon 36

3.3.3 Khả năng chịu muối NaCl 38

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng 38

3.3.5 Ảnh hưởng của độ pH 39

3.4 Kết quả phân loại chủng xạ khuẩn NA113 và NA115 40

3.4.1 Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sinh lí-sinh hóa 40

3.4.2 Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử 43

3.5.1 Lựa chọn môi trường lên men 48

3.5.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nguồn nitơ 49

3.5.3 Ảnh hưởng của pH môi trường và độ thoáng khí 51

3.6 Phổ hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu 52

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

KẾT LUẬN 53

ĐỀ NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 1: VỊ TRÍ LẤY MẪU VÙNG VEN BIỂN 58

PHỤ LỤC 2: CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG DÙNG TRONG ĐỀ TÀI 59

PHỤ LỤC 3: VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH 61

PHỤ LỤC 4: TRÌNH TỰ GENE MÃ HÓA 16S-rRNA 62

MỞ ĐẦU

Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 và 3.260 km bờ biển (không tính các đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nước ta tính đa dạng về cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật Với mong muốn khám phá, khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú của biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, nhất là công nghệ sản xuất sinh học đã chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng và đưa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ những vùng nước ngập mặn, biển xa bờ, thậm chí cả đáy biển sâu để sinh trưởng bền vững dựa trên cơ sở của các công nghệ mới

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều do có khả năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng Trong số hơn 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì có trên 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn chủ

yếu là từ các chi Streptomyces và Micromonospora Giai đoạn những năm 1980 trở

về trước các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá các chủng xạ khuẩn trên mặt đất Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng

xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý như: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thư… có ý nghĩa ứng dụng trong y học [1]

Cùng với sự sinh trưởng của công nghệ sinh học hiện đại, các nghiên cứu về ứng dụng xạ khuẩn biển đã thu được rất nhiều thành tựu to lớn trong sản xuất sinh khối, dược phẩm… được sử dụng trong các ngành công nghiệp, y dược học, nông nghiệp… Trong lĩnh vực y dược, sản xuất chất kháng sinh có ý nghĩa lớn trong đời sống, góp phần đẩy lùi bệnh tật và nâng cao sức khỏe cộng đồng Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh đã dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc làm ảnh hưởng đến kết quả điều trị bệnh Việc tìm ra các chất kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn cao từ các nguồn khác nhau, đặc biệt từ biển, trở thành nhu cầu cấp thiết hiện nay Bên cạnh đó, nghiên cứu phân loại các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh cũng rất

quan trọng, các nghiên cứu cơ bản này giúp định hướng sản xuất các sản phẩm hữu ích từ các chủng xạ khuẩn biển, góp phần đánh giá sự đa dạng của các vi sinh vật biển

Xuất phát từ những định hướng trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu phân loại xạ khuẩn biển sinh kháng sinh phân lập từ các vùng ven biển Việt Nam”

Mục tiêu:

Tuyển chọn và phân loại các chủng xạ khuẩn biển có khả năng tổng hợp kháng sinh cao định hướng ứng dụng trong y dược

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh từ nước, bùn ở các vùng biển Bắc, Trung, Nam

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn lựa chọn

- Phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn theo phương pháp giải trình tự gene 16S-rRNA

- Nghiên cứu một số điều kiện thu nhận chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn trong phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về xạ khuẩn

1.1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố

rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trưởng được

Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu dinh dưỡng và lớp đất bề mặt thường có số lượng lớn xạ khuẩn Trong 1 gam đất canh tác có thể phân lập được 5 triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa chỉ có 10 – 100 nghìn mầm Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [7]

Xạ khuẩn cũng thường sống hoại sinh trên xác các sinh vật (cây chết, rơm rạ) nhưng cũng có thể kí sinh trên thân, củ hoặc rễ cây

Xạ khuẩn biển thường được phân lập từ cát biển, đất ngập mặn, trầm tích biển ở các độ sâu khác nhau hoặc ở trên các sinh vật khác như san hô, rong biển Trước đó, người ta tin rằng xạ khuẩn biển có nguồn gốc từ trên cạn Tuy nhiên, sau

đó có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển

Xạ khuẩn biển thường có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những chủng

Streptomyces ssp có thể sinh trưởng được ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốt khi ở nồng độ NaCl 10%, Micromonospora sp và Salinospora sp cũng có khả năng chịu mặn cao [24, 25]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes,

tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”) Mặt khuẩn lạc xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo [4] Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng

Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn bào, không có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn sinh trưởng thành 2 hướng tạo thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh Người ta gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn

ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp là loại khuẩn ti sinh trưởng từ các loại bào tử nảy mầm [4] Nhiều loại chỉ có khuẩn ti cơ chất mà không có khuẩn ti khí

sinh, nhưng cũng có loại như chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ti khí sinh Khi đó

khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản

Khuẩn ti của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1 m đến 2 – 3 m Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn Sau một thời gian sinh trưởng, ở đầu các khuẩn ti khí sinh thường hình thành các sợi bào tử Khuẩn ti không mang bào tử gọi chung là khuẩn ti dinh dưỡng

Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lưới dày khoảng 10 – 20 nm,

có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ti và bảo vệ tế bào Căn cứ vào kết cấu hóa học người ta chia thành tế bào thành 4 nhóm:

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP và glycin Thuộc nhóm này có

Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides

- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP và glycin Thuộc nhóm này có

Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella

- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP Gồm các chi Dermatophilus, Geodermatophilus, Frankia, Actinomadura, Nocardiopsis, Microbispora,

Thermoactinomyces, Thermomonospora, Planomonospora, Planobispora, Streptosporangium, Actinosynnema

- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose Gồm các chi

Nocaridia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Saccharomonospora, Saccharopopyspora, Actinopolyspora [4]

Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu gồm 3 lớp: lớp ngoài dầy 60 – 120 Å, khi già

có thể dầy tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50 Å và lớp trong dầy 50 Å Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptid gồm các gốc N-acetylglucozamin liên kết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glicozit Khi xử lí bằng lysozym, các liên kết này bị phát vỡ, thành tế bào bị phá hủy và màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lí bằng hỗn hợp ether và chloroform và các dung môi hòa tan lipit Điều đó chứng tỏ lớp ngoài thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose hay chitin [7]

Đối với xạ khuẩn phân lập từ các vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dầy

và độ bền cơ học cao, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (nồng

độ muối từ 3 - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC) Thành tế bào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều axit polyme như axit galacturonic, axit glutamic, axit aspartic và axit phosphoric Với điện tích

âm của các thành phần axit không thuộc peptidoglycan, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụ các ion Na+

, H+ trong khi đẩy các ion OH- Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp peptidoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhưng lại khác nhau về thành phần hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ưa kiềm chứa nhiều hesoamin và axit amin [20]

Màng sinh chất của xạ khuẩn dầy khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủ yếu là phospholipit và protein, chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như màng sinh chất của vi khuẩn Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các chất qua màng [4]

Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng sinh chất và có hình phiến, hình bọng hay hình ống Tác dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào và từ đó làm tăng cường hoạt tính của enzyme, tăng chuyển điện tử…[4]

Các thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt polyphosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III) và polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [4]

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinh vật nhân sơ khác là tỉ lệ G – C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 – 45%

Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về di truyền và thường xảy ra sự đột biến trong phân tử DNA Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng Hơn nữa, sự

tự nhân lên của các đoạn DNA còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở

xạ khuẩn [7]

1.1.3 Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn là dựa vào hình thái và kích thước của cuống sinh bào tử Sợi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau tùy theo loài: thẳng-lượn sóng (Retiflexibilis), xoắn (Spirales) hoặc có móc, vòng (Retinaculiaperti)… có loại mọc vòng đơn cấp, có loại mọc vòng hai cấp Một

số xạ khuẩn có sinh nang bào tử, bên trong có chứa các bào tử nang Bề mặt của bào

tử có thể nhẵn (smooth), gai (spiny), tóc (hairy), xù xì (warty), nếp nhăn (rugose)… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn [4, 5, 13]

Bào tử xạ khuẩn được hình thành theo 3 phương thức sau đây:

- Phương thức sinh trưởng toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ti hình thành ra thành bào tử

- Phương thức sinh trưởng trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa

màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ti Trường hợp này gặp ở Planomonospora

- Phương thức sinh trưởng bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ti không tham

gia vào quá trình hình thành bào tử Trường hợp này gặp ở Thermoactinomycetes

1.2 Phân loại xạ khuẩn

1.2.1 Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Trong phân loại người ta thường chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính dựa trên các dấu hiệu hình thái:

- Các nhóm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt Đặc trưng của nhóm này là sinh sản bằng bào tử và phân hóa thành KTKS và KTCC

- Nhóm xạ khuẩn có bào tử nang Đặc trưng của nhóm này là khuẩn ti phân chia theo hướng vuông góc với nhau, tạo ra cấu trúc tương tự nang bào tử

- Nhóm xạ khuẩn dạng Nocardia: sinh sản bằng cách phân đốt khuẩn ti

- Nhóm xạ khuẩn dạng tương tự Corynebacter và dạng cầu: tế bào có hình

chữ V, T hoặc dạng cầu, thông thường không có khuẩn ti

Trước kia, nhiều loại xạ khuẩn được phân chia tùy theo sự khác nhau về đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như màu của KTCC, KTKS, sắc tố tan; sự có mặt của KTCC, hình dạng và kết cấu mặt bào tử; đặc điểm cuống sinh bào tử và sự phân đốt của khuẩn ti Tuy nhiên, ngày nay chỉ tiêu này chỉ là bổ sung cho việc nghiên cứu phân loại bằng sinh lí, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử [7, 36]

1.2.2 Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong một vài thập kỉ trước và ngày nay vẫn còn là cơ sở quan trọng trong phân loại xạ khuẩn Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

- Typ thành tế bào: Dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptid và đường trong thành tế bào hay các polysaccarid gắn vào thành tế bào

- Typ peptidoglycan (PG): dựa trên các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptid của PG, của cầu nối peptid và cách liên kết giữa các mắt xích của PG

- Axit mycolic: là các phần tử có mạch dài hay phân nhánh thuộc chi

Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium và Corynebacter Đây là đặc điểm phân

loại cơ bản của các chi đó

- Axit béo: thường được sử dụng trong phân loại là các axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso- và enteiso- được methyl hóa ở phân tử cacbon thứ 10 Sự có mặt của axit 10-methyloctadecanoid là đặc điểm phân loại đến chi

- Menaquinon: Xạ khuẩn giống vi khuẩn Gram dương và khác vi khuẩn Gram âm ở chỗ tổng hợp menaquinon và dimethylmenaquinon, không tổng hợp ubiquinon Phần lớn các chi xạ khuẩn có thành phần menaquinon xác định

- Photpholipid: có 5 typ photpholipid (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng và có ý nghĩa trong phân loại xạ khuẩn [7]

1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Khi phân loại xạ khuẩn người ta thường sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cũng như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nguồn nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng Ngoài ra còn các chỉ tiêu khác cũng được xác định như pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối, tính chất đối kháng và mẫn cảm với chất kháng sinh,

khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất khác đặc trưng của xạ khuẩn

Tuy nhiên, do xạ khuẩn thường xuất hiện nhiều biến dị nên các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường có giá trị thấp về mặt phân loại Nhưng để phát hiện loài mới người ta thường sử dụng các đặc điểm này dựa trên phân loại số [7, 34]

1.2.4 Phân loại số (Numerical Taxonomy)

Phân loại số được Williams và cs, (1983) sử dụng để phân loại chi

Streptomyces và các chi có quan hệ gần gũi Phương pháp này dựa trên sự đánh giá

về số lượng, mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một số lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh các chủng với nhau từng đôi một, Sneath (1973) đề nghị tính hệ số giống nhau S (Similarity) theo phương trình sau:

100

S d

N x S





Ns: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của 2 chủng so sánh

Nd: Tổng số các đặc điểm (khác nhau) dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia

Kết quả phân tích được biểu diễn bằng sơ đồ nhánh mà trên đó các chủng tùy theo mức độ giống nhau được nhóm thành từng cụm (Cluster) Bằng phân loại số

người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 21 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13

cụm với những đại diện nhất định [7, 27, 31]

1.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rDNA

Từ cuối thế kỷ XX, đặc biệt là những năm 80 trở lại đây, với sự sinh trưởng mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có độ chính xác cao Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gene, hoặc các sản phẩm của gene Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính đó là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gene mã hóa 16S-rRNA

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rRNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật

Trong tế bào vi sinh vật nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rRNA và protein riêng rẽ Ribosome vi sinh vật nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rRNA 5S, rRNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rRNA 16S và 21 phân tử protein) [6]

Các gene mã hóa 5S-rRNA, 16S-rRNA và 23S-rRNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung Trong các loại rRNA, thì 16S-rRNA

là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn, vì gene mã hóa 16S-rRNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho các nghiên cứu phân loại; còn gene mã hóa 5S-rRNA có kích thước khoảng 120 bp, dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gene mã hóa 23S-rRNA cũng là một gene tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân sơ nhưng trình tự của gene này tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được

sử dụng hơn [16]

Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S-rRNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S-rRNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [21]

1.3 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển

1.3.1 Nhóm chất kháng sinh polyketide

Polyketide là một họ các chất chuyển hóa bậc hai được hình thành bởi sự xúc tác của enzyme polyketide synthase (PKSs) Khung cacbon của polyketide được khử và biến đổi bởi những domain khác nhau trong PKSs cùng với các enzyme

ketoreductase, dehydratase và enoylreductase Có 3 loại PKSs khác nhau đã được biết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức năng PKSs loại II là phức hợp của nhiều enzyme, cùng tạo nên cấu trúc của chuỗi polyketide và PKSs loại III [14, 24]

Hình 1.1 Cấu trúc của Abyssomicin C và Trioxacacin [14, 24]

Abyssomicin C là kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển Verrucosispora

sp Abyssomicin C có khả năng kháng lại các vi khuẩn G+, bao gồm cả những vi

khuẩn gây bệnh đã kháng vancomycin như Staphylococcus aureus [14, 22]

Daryamide là polyketide gây độc cho tế bào được phân lập từ dịch nuôi cấy

của xạ khuẩn Streptomyces sp chủng CNQ-085 Chất này có khả năng gây độc cho

tế bào ung thư biểu mô ở người, dòng HCT-116 và có khả năng kháng nấm C albicans [14, 17]

Trioxacarcin lần đầu tiên được phân lập vào năm 1981 từ S bottropensis

DO-45 Chúng có khả năng chống lại các tế bào ung thư khác nhau, có hoạt tính kháng vi khuẩn G- và G+ và kháng trùng sốt rét Trioxacarcin A có khả năng tạo liên kết cộng hóa trị với đoạn DNA sợi kép d(AACCGGTT) [14]

1.3.2 Nhóm kháng sinh Non-ribosomal peptide

Proximicin là kháng sinh được tạo ra bởi xạ khuẩn Verrucosispora sp MG37

và V maris AB-18-032 chúng được phân lập từ các mẫu trầm tích dưới độ sâu

250m ở Raune Fjord, Na-uy và ở biển Nhật Bản ở độ sâu 289 m Proximicin (A, B, C) có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào ung thư biểu mô dạ dày và ung thư biểu mô gan [14]

Mechercharmycin được sản xuất bởi xạ khuẩn Thermoactinomyces sp

YM3-251; được phân lập từ bùn ở Macherchar nước cộng hòa Palau (bắc Thái bình dương) Mechercharmycin A có khả năng gây độc cho tế bào ung thư tuyến biểu mô phổi dòng A549 và tế bào ung thư bạch cầu [14]

1.3.3 Nhóm kháng sinh phức hợp Polyketide-Nonribosomal peptide

Salinosporamide A (NPI-0052) là kháng sinh mới có cấu trúc lactam (C15H20O4NCl) tách từ dịch lên men của xạ khuẩn biển Salinispora tropica

β-lactone-γ-được phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở độ sâu 1m tại biển Chab Cay, Bahamas NPI-0025 là chất ức chế proteasome 20S gây ra hiện tượng appoptosis trong tế bào

u tủy và kháng lại tế bào ung thư ruột kết NPI-0025 đã được thử nghiệm lâm sàng bởi hãng dược phẩm Nereus Pharmaceuticals vào năm 2006 và có tiềm năng là một

chất kháng ung thư có giá trị trong tương lai [14, 22, 26]

Lajollamycin là kháng sinh được tạo thành từ xạ khuẩn S nodosus chủng

NPS007994 phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở Scripps Canyon, La Jolla, California Lajollamycin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào u melanin dòng B16-F10 ở chuột; ngoài ra chất này còn được Manam và cộng sự (2005) xác định là có khả năng tiêu diệt nhiều tế bào vi khuẩn [14]

1.3.4 Nhóm kháng sinh isoprenoid

Altemicidin là kháng sinh có bộ khung vòng đơn terpen-alkaloid, được hình

thành từ xạ khuẩn biển S sioyaensis chủng SA1758 được phân lập từ mẫu bùn ở

Gamo, Miyagi Prefecture, Nhật Bản Chất này có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào ung thư bạch cầu Lympho L1210 và ung thư biểu mô dòng IMC [14]

Marinone có cấu trúc một vòng rưỡi terpen Marinone và nhiều chất có hoạt tính khác được tạo ra từ xạ khuẩn chủng CNH099 phân lập từ độ sâu 1 m ở

Batiquitos Lagoon, Bắc San Diego, Califorlia Những chất này có khả năng gây độc

tế bào ung thư ruột kết ở người dòng HCT116 trong điều kiện in vitro [14]

Glaciapyrrole (A, B, C) là kháng sinh được hình thành từ xạ khuẩn

Streptomyces sp chủng NPS008187 Nhóm kháng sinh này đã được Macherla

(2005) tìm ra có khả năng kháng khuẩn [17]

1.3.5 Các chất kháng sinh khác

Diazepinomicin (ECO-4601) được phát hiện vào năm 2004 bởi Charan và

cộng sự ECO-4601 có nguồn gốc từ Micromonospora sp., có hoạt tính kháng

khuẩn, kháng viêm và kháng tế bào ung thư ECO-4601 có phổ kháng rộng chống lại tế bào u vú, u thần kinh đệm và u tiền liệt tuyến Đã được thử nghiệm lâm sàng tại Canada vào năm 2006 [18, 22]

Hình 1.2 Cấu trúc của Diazepinomicin [22]

Chandrananimycin được hình thành từ xạ khuẩn Actinomadura sp chủng

M048 được phân lập từ vịnh Giao Châu, Trung Quốc Chandrananimycin có khả năng chống lại tế bào khối u ruột kết, u melanin, u phổi, u vú, u tuyến tiền liệt và u tuyến thận Ngoài ra chất kháng sinh này còn có khả năng kháng khuẩn và nấm [14]

Helquinoline (C12H15O3N) là kháng sinh hình thành từ Janibacter limosus Chất kháng sinh này có khả năng kháng Bacillus subtilis, S virdochromogenes Tu57 và Staphylococcus aureus [17, 22]

Bảng 1.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển [14, 18, 22, 24]

Nhóm Chất kháng sinh Xạ khuẩn Hoạt tính

Abyssomicin Verrucosispora sp Kháng khuẩn

CNQ140

Kháng khuẩn, kháng ung thư

Polyketide

KORDI3238

Kháng tế bào ung thƣ Daryamide Streptomyces sp CNQ-

085

Kháng nấm, kháng tế bào ung thƣ

Lucentamycin N lucentensis CNR712 Kháng tế bào ung thƣ

Arenamide S arenicola CNT088 Kháng tế bào ung thƣ

S tropica Kháng tế bào ung thƣ

Lajollamycin S nodosus NPS007994 Kháng tế bào ung thƣ,

(ECO-Micromonospora sp Kháng khuẩn, kháng

viêm, kháng ung thƣ

Helquinoline Janibacter limosus Kháng khuẩn

1.4 Sự tạo thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

1.4.1 Cơ chế hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi

khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng

Trong quá trình tiến hóa, tính đối kháng là cơ chế bảo vệ trong đấu tranh sinh tồn của loài Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt Xạ khuẩn thường tạo ra các sản phẩm trao đổi chất của mình để ức chế hoặc tạo điều kiện không thuận lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật khác Thông thường các chất kháng sinh có thể hình thành theo các cơ chế sau:

- Đối với các CKS tương tự như các sản phẩm chuyển hóa bậc một (axit amin, nucleotid…) thì sự sinh tổng hợp các CKS này tương tự như sinh tổng hợp các chất chuyển hóa bậc một

- Đối với kháng sinh được tạo ra bằng con đường polime hóa bao gồm: + Các chất là dẫn xuất của polipeptid, được tạo thành bằng cách trùng hợp các axit amin Mạch polipeptid được tạo thành có thể được biến đổi trong các phản ứng tiếp theo

+ Các chất được tạo thành từ đơn vị acetat và propionat thì theo con đường tổng hợp axit béo

+ Các chất terpen được tạo thành từ các đơn vị isopren

+ Đối với các chất aminoglucozid thì tạo thành bằng con đường trùng hợp các phân tử đường, axit amin và các rượu amin mạch vòng

Chức năng của các sản phẩm trao đổi bậc hai đối với cơ thể sản sinh ra vẫn chưa được xác định chính xác và còn nhiều điều chưa thể lí giải Có thể nói, chúng không có một chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tế bào vì tế bào vẫn có khả

năng sinh trưởng và sinh trưởng bình thường khi không có các hợp chất này Do đó, vai trò đối với tế bào của các sản phẩm này cần được nghiên cứu kỹ lưỡng hơn [11]

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp CKS ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như pH, nhiệt độ, thành phần môi trường lên men… Để xạ khuẩn sinh trưởng tốt và hình thành các sản phẩm tối ưu, cần đảm bảo trong môi trường lên men có đầy đủ các nguồn cacbon, nitơ, các nguyên tố vi lượng và các thông số về điều kiện nuôi cấy thích hợp

1.4.2.1 Điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ: Phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt ở 28 – 30oC Nhiệt độ tối ưu cho tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng 18 – 28o

C [7]

- pH môi trường: Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường

pH thích hợp cho tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit thường ức chế quá trình sinh tổng hợp CKS Tuy nhiên dải pH cho chủng vi sinh vật sinh

trưởng thường dài hơn pH tối ưu cho sinh tổng hợp kháng sinh Ví dụ ở S aureofaciens, pH thích hợp cho sinh trưởng là 4,2 – 8,0 và cho sinh kháng sinh là

5,5 – 6,5 [7]

- Độ thông khí: Xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh vật khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ 6 – 12 giờ nuôi) Do vậy, để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường thêm vào môi trường lên men benzylthioxyanat làm tăng khả năng hòa tan của oxi Nồng độ thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2-8% O2 trong dịch lên men [2]

- Lượng giống và tuổi giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môi trường lên men để hiệu quả nhất là từ 2 – 10%, tuổi giống thường là 24 giờ [15]

1.4.2.2 Thành phần môi trường lên men

- Nguồn cacbon: Các hợp chất cacbon có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp CKS Đối với nhiều chủng xạ khuẩn có hoạt tính amylase,

nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng chủng mà chọn nguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn glucose, fructose, galactose hay các loại đường đôi như maltose, saccarose, lactose…; các loại đường đa như tinh bột, destrose…; các loại thành phần không xác định như rỉ đường, đại mạch…; cũng có thể là các axit hữu cơ và chất béo làm nguồn cacbon [7]

- Nguồn nitơ: Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ Trong đó, nguồn nitơ vô cơ thường cho khả năng sinh CKS không cao Nguồn nitơ hữu hiệu nhất thường là các sản phẩm từ thực vật như bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngô… Trong đó, cao ngô là nguồn cung cấp cả nitơ vô

cơ và hữu cơ; tuy nhiên cao ngô có hạn chế về chất lượng do có lượng photphat vô

cơ cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS [33]

- Nguồn photphat vô cơ: Vai trò của photphat vô cơ như yếu tố điều chỉnh sinh tổng hợp CKS được nhiều tác giả đề cập Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn CKS không quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic trong khuẩn ti, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng quá trình sinh tổng hợp CKS Sự thừa photphat cũng ức chế tổng hợp các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp làm giảm khả năng tổng hợp CKS [7]

1.5 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh

1.5.1 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh ở trong nước

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi sinh vật biển có khả năng sinh các chất có hoạt tính đối kháng còn hạn chế, hầu như chưa có công trình khoa học có quy mô lớn nghiên cứu các vi sinh vật và tách chiết các chất kháng sinh từ vi sinh vật biển

Tác giả Lê Gia Hy và cs, Viện Công nghệ sinh học đã phân lập và nghiên cứu được đặc điểm của chủng vi khuẩn biển HT0523 có nhiều đặc điểm quý có thể khai thác trong nuôi trồng thủy sản Chủng vi khuẩn biển HT0523 chính là vi khuẩn

Gram dương, sinh bào tử có khả năng ức chế mạnh cả 2 chủng vi sinh vật Vibrio gây bệnh cho tôm là V parahaemolyticus và V furnisii Chủng HT0523 có sức sống

cao, có khả năng thích ứng rất tốt với điều kiện môi trường dao động nhiều, sinh

trưởng tốt ở nồng độ NaCl 1-3%, pH thích hợp từ 7 - 9, nhiệt độ từ 25 - 37oC Chủng này sinh trưởng tốt trên nguồn cacbon lactose và nguồn nitơ vô cơ là KNO3đặc biệt là khi kết hợp với nguồn nitơ hữu cơ (pepton) thì mật độ tế bào cao xấp xỉ hai lần [8]

Các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

đã tách được chất Fucoidan từ một số loài rong ở vùng biển Nha Trang-Khánh Hòa

như Sargassum polysystum, S Oligosystum, S mcclurei, S swartzii, S denticarpum Bằng các phương pháp phân tích hóa học và phổ cho thấy những phân

đoạn Fucoidan tách được là Fucogalactam có chứa nhóm este sulfat, uronic axit và các gốc đường fructose, galactose… Các phân đoạn đều đem thử hoạt tính và kết quả là tất cả các phân đoạn đều có hoạt tính chống ung thư Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng sự có mặt của nhóm sulfat và uronic làm tăng hoạt tính của Fucoidan [9, 12]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật biển sinh kháng sinh trên thế giới

Trong những năm gần đây, vi sinh vật biển là đề tài quan trọng trong nhiều nghiên cứu mới về vi sinh vật ở nhiều nước trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển như các chất kháng khuẩn, kháng virus, kháng tế bào ung thư, kháng nấm, chống đông máu hoặc là kháng trùng sốt rét… Những hợp chất này sẽ trở thành nguồn dược phẩm quan trọng để chữa bệnh trong tương lai

G Vijaya Baskara Sethubathi và V Ashok Prabu (Đại học Annamalai) đã phân lập được 12 chủng tảo biển ở bờ biển Adirampattinam, tây nam vịnh Palk

Dựa trên đặc điểm sinh trưởng có 3 chủng được phân loại đó là Oscillatoria sp., Phirmidium sp và Lyngbya majuscule Ba loài này đều có khả năng kháng một số loài vi khuẩn gây bệnh ở người như S mutants, S aureus, Pseudomonas aeruginosa, B subtilis và Klebsiella pneumoniae Trong đó Oscillatoria sp có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất và Lyngbya majuscule có hoạt tính yếu nhất [35]

M Krishnaraj và N Mathivanan (Ấn Độ - 2009) đã phân lập được 137 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ 40 địa điểm khác nhau ở vịnh

Bengal Trong tất cả 137 chủng xạ khuẩn đều có khả năng kháng các vi khuẩn gây

bệnh ở người như S aureus, P aeruginosa, Bacillus spp và 10 chủng có khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani và Fuzarium oxysporum gây bệnh ở thực vật [23]

Năm 2010, Rofiq Sunaryanto và Bambang Marwoto đã phân lập ở Anyer, Banten (Indonesia) được 29 chủng vi khuẩn trong đó có một chủng A11 có đặc tính kháng được các chủng vi khuẩn G- và G+ (E coli, S aureus, P aeruginosa, B subtilis) Bằng phương pháp giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh trình tự với dữ liệu của Genbank đã xác định được chủng A11 chính là xạ khuẩn Streptomyces sp

Bằng phương pháp sắc ký đã tách được một hợp chất kháng sinh có khả năng kháng khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu thấp hơn nhiều so với chất kháng sinh tetracyline (đối chứng) [28]

Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinith Kumar P và Reena

A (trường ĐH Khoa học công nghệ Mohamed Sathak-Ấn Độ) phân lập được 20 chủng xạ khuẩn từ bờ biển Royapuram, Muttukadu, Mahabalipuram và ở cửa biển Adyar vào năm 2011 Trong đó có 2 chủng xạ khuẩn (ký hiệu C11 và C12) có khả năng kháng khuẩn Chủng C11 có chuỗi bào tử dài, bề mặt khuẩn lạc trắng và là vi khuẩn G+, chúng kháng được Staphylococcus, Pseudomonas, V harveyi Chủng

C12 cũng là vi khuẩn G+, có chuỗi bào tử hình cầu, bề khuẩn lạc mầu kem và C12

ngoài kháng được 3 loài vi khuẩn gây bệnh trên còn kháng cả B subtilis Bằng

phương pháp phân loại phân tử giải trình tự gene 16S-rRNA và so sánh với cơ sở dữ liệu ở Genbank đã phân loại được 2 chủng C11 và C12 đều là xạ khuẩn

Streptomyces [34]

Năm 2011, Sumei Li và cộng sự đã phân lập được một chủng xạ khuẩn (SCSIO-01299) từ biển Đông (Việt Nam) ở độ sâu 3258 m Bằng phương pháp quan sát hình thái học và giải trình tự gene 16S-rRNA, chủng SCSIO-01299 được

phân loại là Pseudonocardia sp SCSIO-01299 Các nhà khoa học này đã tách được

4 hợp chất có hoạt tính sinh học cao đó là deoxynyboquinone và Pseudonocardian

A-C Deoxynyboquinone và Pseudonocardian A và B có khả năng kháng khuẩn (S aureus, E faecalis, B thuringensis) và kháng tế bào ung thư phổi, ung thư vú và

ung thư não Bằng phương pháp khối phổ đã phân tích được deoxynyboquinone có công thức phân tử C15H12O4N2; pseudonocardian A có thành phần C18H18O5N2; pseudonocardian B công thức là C19H20O5N2; pseudonocardian C công thức là

C21H24O8N2 [32]

Hình 1.3 Cấu trúc của deoxynyboquinone (1) và pseudonocardian A-C (2-4) [32]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất dùng trong nghiên cứu

E coli ATCC 11105, Alcaligenes faecallis, Pseudomonas auroginosa nhận từ bộ

sưu tập giống của phòng Công nghệ lên men, viện Công nghệ sinh học

Các hóa chất khác dùng trong nuôi cấy và lên men: CaCO3; K2HPO4.3H2O;

KH2PO4; FeSO4.7H2O; (NH4)2SO4; NH4Cl; NaCl; bột đậu tương; trypton; pepton; cao ngô; casein thủy phân; agar và một số hóa chất cần thiết khác… là sản phẩm của Việt Nam hoặc nước ngoài có độ tinh khiết cao, đáp ứng yêu cầu nghiên cứu

Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử gồm: Tris-base, EDTA, axit acetic, CTAB, NaCl, propanol, chloroform, phenol, isoamin alcohol, etanol, bromophenol blue, Ethidium bromide, glycerol, dNTP các loại, MgCl2, cặp mồi FC27/RC1492, kít PureLinkTM - DNA Purification (Invitrogen), DNA Marker (Fermentas), agarose…

2.1.2.2 Thiết bị

Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong đề tài

Tên thiết bị Nơi sản xuất Tên thiết bị Nơi sản xuất

Cân phân tích

ADNHR- 20000

Nồi hấp thanh trùng Nhật Bản Kính hiển vi quang học

Olympus CHD -2

Nhật Bản

Tủ cấy vô trùng Pháp Máy đo pH 320 Toledo Anh

Tủ ấm Trung Quốc Tủ khử trùng khô dụng cụ Trung Quốc

lăng Chủ tịch HCM Cân điện tử

Startorius

system 9700

Mĩ Máy điện di DNA

Mupid

Nhật Bản Máy xác định trình tự tự

động ABI PRISM®Avant Genetic

3100-Mĩ

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu phụ thuộc vào tính chất của mẫu (đất mùn, bùn, nước ) mà có phương pháp thu thập mẫu thích hợp Dụng cụ dùng lấy mẫu phải

vô trùng để tránh nhiễm chéo Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi

xử lí và phân tích

Mẫu nước

Dụng cụ lấy mẫu như gáo có tay cầm hoặc các ống nghiệm, chai nhựa đã được khử trùng bằng cồn Lấy nước cách bề mặt 0,2 – 5,0 m mẫu nước được đựng trong các ống nghiệm nút cao su, chai nhựa có ghi rõ đặc điểm và địa điểm lấy mẫu

Mẫu đất, bùn

Dùng dao hay xẻng sạch đã lau cồn để lấy mẫu đất Đầu tiên loại bỏ lớp đất dày 2-5 cm trên bề mặt, sau đó lấy phần đất tiếp theo cho vào túi đã được khử trùng, gài cẩn thận Túi được dán nhãn ghi rõ đặc điểm, địa điểm lấy mẫu

2.2.2 Phương pháp xác định thành phần và số lượng vi sinh vật trong mẫu

Để xác định thành phần và số lượng nhóm vi sinh vật có trong các mẫu, sử dụng phương pháp pha loãng tới hạn và nuôi trên các môi trường đặc trưng cho

từng nhóm vi sinh vật

Các mẫu được pha loãng bằng nước muối sinh lý 0,85% trong điều kiện vô trùng, nồng độ pha loãng theo cơ số 10 Quá trình thực hiện như sau:

Đối với mẫu bùn: Chuẩn bị các ống nghiệm, mỗi ống chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,85% Cân chính xác 1 gam mẫu bùn hoặc đất chuyển vào bình thủy tinh đã chứa 100 ml nước cất khử trùng, lắc trên máy lắc khoảng 1 giờ với tốc độ 150-200 vòng/phút, sau đó để lắng trong 30 phút Dịch thu được đã có độ pha loãng 10-2

(1:100) Hút 1 ml dịch này chuyển vào ống nghiệm sạch, được độ pha loãng 10-3

Các đĩa thạch sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 24-96 giờ tùy theo từng nhóm vi sinh vật

Tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch và tính toán số lượng vi sinh vật có trong 1ml mẫu theo công thức:

CFU/ml (g) = a x 1/K x 1/V

a: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên đĩa petri có cùng độ pha loãng

V: Thể tích dịch pha loãng trang trên mỗi đĩa (ml)

K: Độ pha loãng của dịch được cấy

2.2.3 Tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh kháng sinh

Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập được kiểm tra khả năng sinh kháng sinh bằng các phương pháp sau:

2.2.3.1 Phương pháp thỏi thạch

Vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp trong đĩa petri Sau 7-14 ngày, khi mọc tốt, dùng ống đục lỗ thạch, lấy các thỏi thạch đặt lên đĩa petri đã cấy

vi sinh vật kiểm định Để các đĩa cấy ở nhiệt độ 4-8oC trong khoảng 4-8 giờ để chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường thạch, sau đó nuôi cấy ở 37oC với vi sinh vật kiểm định và đọc kết quả sau 24 giờ [3]

Khả năng đối kháng được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn

Môi trường thạch dinh dưỡng sau khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt dộ

40 - 45oC Hút dịch vi khuẩn kiểm định cho vào bình môi trường, trộn đều và đổ vào các khay hoặc đĩa petri Sau khi thạch nguội dùng dụng cụ đục lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra Vi sinh vật sau khi nuôi lắc đem ly tâm ở 6000

- 8000 vòng/phút, lấy dịch nhỏ vào lỗ thạch Sau đó cho vào tủ lạnh 6-8 giờ để dịch

tế bào khuếch tán vào môi trường rồi chuyển ra nuôi ở 28 - 30oC sau 14 - 18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn [3]

Chọn và giữ các chủng có vòng kháng khuẩn để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại

2.2.4 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn

Nghiên cứu định tên các chủng xạ khuẩn đã chọn theo đặc điểm phân loại của Waskman, 1961; Krasilnikov, 1970; Gause, 1983; Sổ tay phân loại vi sinh vật của Bergey, 1989 và tham khảo các bản mô tả xạ khuẩn của chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP), 1966 và 1970 [27, 30, 31]

Để quan sát các đặc điểm hình thái như hình dáng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn

ti khí sinh, khuẩn ti cơ chất, sắc tố tan, sự hình thành melanin, cuống sinh bào tử, bề mặt bảo tử các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gause 1, ISP 1, ISP 2, ISP 3, ISP 4, ISP 5, ISP 6, ISP 7, môi trường Bennet và khoai tây ở nhiệt độ

28-30oC Sau 7, 14 và 21 ngày quan sát màu sắc khuẩn ti khí sinh, khuẩn ti cơ chất

và sắc tố tan trên môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb và sử dụng bảng màu của Tresner và Barkus (1963)

Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của chủng được mô tả dựa vào khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nitơ, khả năng ức chế các vi sinh vật, khả năng mẫn cảm với các chất kháng sinh và sự sinh trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau (pH, nhiệt độ, sự có mặt các chất ức chế)

2.2.4.1 Đặc điểm hình thái

2.2.4.1.1 Các đặc điểm nuôi cấy

Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ti khí sinh): Màu sắc của khuẩn ti khí sinh được

so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus (1963): xanh da trời, sẫm, xám, xanh lá,

đỏ, tím, trắng, vàng

Màu sắc của khuẩn ti cơ chất: chia vào 5 nhóm vàng- nâu (gồm cả các loại không tiết sắc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi

trường ISP2-5 Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ti khí sinh và

khuẩn ti cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin,

nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ

vàng nhạt sang nâu, đen [30]

2.2.4.1.2 Các đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP3 và ISP 4 có đặt lamen trên mặt đĩa Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28 - 30oC xạ khuẩn sinh trưởng tốt lấy

ra quan sát hình dạng chuỗi bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét

Hình dạng chuỗi bào tử được kí hiệu: RF: thẳng hay hơi lượn sóng; RA: hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn; S: dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn; SRF: dạng xoắn lượn sóng; SRA: dạng xoắn có móc câu

Bề mặt bào tử: Bề mặt của khuẩn ti khí sinh có bào tử được phủ platin trong

30 giây sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quét (Viện 69-Bộ tư lệnh Bảo

vệ Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh) để xác định đặc điểm bề mặt bào tử:

+ Bào tử hình tròn, ovan, hình que

+ Bề mặt bào tử được ký hiệu: sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ha (tóc)

2.2.4.2 Các đặc điểm sinh lí, sinh hoá

2.2.4.2.1 Khả năng sử dụng nguồn đường

Quan sát khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn trên môi trường ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đường glucose, fructose, sacarose, arabinose, xenlobiose, myo-inositol, manitol, xylose, raffinose, rhamnose, tinh bột, dextrose Các ống thạch đã cấy được ủ 5 - 7 ngày ở nhiệt độ thích hợp, so sánh với đối chứng dương là môi trường ISP9 bổ sung glucose, đối chứng âm là môi trường ISP9 cơ sở (môi trường khoáng) [30]

2.2.4.2.2 Khả năng sử dụng nguồn nitơ

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP8 bổ sung nguồn nitơ (0,1% w/v) Kết quả sinh trưởng được xác định sau 15 ngày, so sánh với ống đối chứng âm và đối chứng dương (môi trường có L-Asparagine monohydrate) [30]

2.2.5 Phân loại xạ khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử

2.2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ xạ khuẩn bằng đệm CTAB

Nguyên tắc:

Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn bằng lysozym sau đó loại bỏ protein khỏi DNA nhờ protease K Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ bằng phức hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Sau đó dịch có chứa DNA được tủa bằng Isopropanol và rửa bằng etanol Cặn DNA được hòa tan trong đệm TE Bảo quản ở -20o

C [29]

Quy trình:

Lấy 2 ml dịch nuôi cấy đem li tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút

để thu cặn tế bào Hòa tan cặn trong 510 µl TE, pH = 8 Đảo đều bằng voltex Bổ sung thêm 60 µl EDTA (nồng độ cuối 45mM) Sau đó thêm 60 µl lysozym (50

mg/ml), ủ trong 2 giờ ở 65OC Bổ sung thêm 5 µl protease K, 30 µl SDS 10% Đảo nhẹ, ủ 1 giờ ở 37O

C Thêm 110 µl NaCl 5M, 90 µl CTAB, đảo nhẹ Bổ sung thêm

700 µl Chloroform : Isoamin alcohol (24:1), đảo đều sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút

Chuyển dịch pha trên sang ống eppendorf mới Bổ sung thêm 700 µl hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), đảo nhẹ sau đó li tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi chuyển sang ống eppendorf mới (lặp lại 3 lần)

Kết tủa DNA với propanol, để qua đêm ở -20oC

Li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút, loại dịch

Rửa tủa 2 lần với 500 µl cồn tuyệt đối

Làm khô ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Thêm 1 µl TE/RNase, sau đó ủ ở 37oC trong 2 giờ

Hòa tan lại tủa với 40 µl TE, pH 8

Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Bảo quản ở 4oC

* Tinh sạch DNA bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260 và 280 nm

Tính hệ số A = 260/280 Nếu hệ số chỉ từ 1,8 – 2,0 là đạt yêu cầu

Hỗn hợp phản ứng được chạy PCR với chương trình như sau:

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra trên gel agarose 1% Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang DNA chuẩn (Fermentas) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purification (Invitrogen) và giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA,

USA) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Sản phẩm sau khi giải trình tự được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank bằng công cụ BLAST trên NCBI Cây phát sinh chủng loại được thiết lập trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Kimura, bằng việc sử dụng phương pháp Neighbor-joining Phân tích Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với

1000 mẫu thử [10, 19]