Nghiên cứu một số loài malassezia sp gây bệnh lang ben ở bệnh nhân đến khám tại bệnh viện da liễu trung ương

Tuy nhiên, nấm men Malassezia đã được công nhận trong hơn 150 năm qua, là thành viên của hệ vi sinh vật ở da người và là một trong các tác nhân gây bệnh ở các bệnh ngoài da [23].. Hoạt

=========

NGUYỄN THỊ THO

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOÀI MALASSEZIA SP

GÂY BỆNH LANG BEN Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƢƠNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2018

=========

NGUYỄN THỊ THO

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOÀI MALASSEZIA SP

GÂY BỆNH LANG BEN Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM TẠI BỆNH VIỆN DA LIỄU TRUNG ƢƠNG

rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, phòng Tổ chức cán bộ bệnh viện Da liễu Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thế Hải,

người thầy đã hướng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Trần Cẩm Vân

đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Hữu Sáu,

những kiến thức quý báu cùng sự giúp đỡ tuyệt vời của thầy giúp tôi thực hiện luận văn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng xét nghiệm Nấm, tập thể khoa Vi sinh, nấm, ký sinh trùng - Bệnh viện Da liễu Trung ương đã giúp

đỡ, động viên và khích lệ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã mang đến kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu tại trường

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân và bạn bè

đã luôn sát cánh động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quí báu đó!

Hà Nội, ngày tháng 8 năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Tho

KHV : Kính hiển vi

M caparae : Malassezia caparae

M cuniculi : Malassezia cuniculi

M dermatis : Malassezia dermatis

M equina : Malassezia equina

M furfur : Malassezia furfur

M globosa : Malassezia globosa

M japonica : Malassezia japonica

M nana : Malassezia nana

M pachydermatis : Malassezia pachydermatis

M restricta : Malassezia restricta

M slooffiae : Malassezia slooffiae

M sympodialis : Malassezia sympodialis

M yamatonensis : Malassezia yamatoensis Malassezia spp : Malassezia species plus

P orbiculair : Pityrosporum orbiculair

TB/VT : Tế bào/Vi trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Lịch sử nấm Malassezia và bệnh lang ben 3

1.2 Đặc điểm sinh học của Malassezia spp 4

1.3 Cơ chế gây bệnh 5

1.4 Một số yếu tố thuận lợi 7

1.5 Lang ben và một số biểu hiện bênh lý khác do nấm Malassezia 7

1.5.1 Bệnh lang ben do Malassezia 7

1.5.2 Một số bệnh lý khác do nấm Malassezia 10

1.6 Đặc điểm đa dạng về phân bố loài Malassezia gây bệnh lang ben 11

1.7 Các phương pháp chẩn đoán Malassezia trong bệnh lang ben 12

1.8 Tình hình bệnh lang ben và các nghiên cứu về nấm Malassezia gây bệnh lang ben trên thế giới và Việt Nam 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán 17

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn 17

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 17

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 17

2.3 Vật liệu nghiên cứu 18

2.3.1 Trang thiết bị, dụng cụ 18

2.3.2 Hóa chất 18

2.3.3 Môi trường 18

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 19

2.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu 19

2.5.1 Các chỉ tiêu đánh giá cho mục tiêu nghiên cứu 1 24

2.5.2 Các chỉ tiêu đánh giá cho mục tiêu nghiên cứu 2 25

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 25

2.7 Các biện pháp hạn chế sai số 26

2.8 Đạo đức trong nghiên cứu 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Tỷ lệ bệnh lang ben ở bệnh nhân đến khám 28

3.1.1 Tình hình chung nhiễm bệnh lang ben 28

3.1.2 Phân bố bệnh lang ben theo mùa 29

3.1.3 Phân bố bệnh lang ben theo lứa tuổi bệnh nhân 31

3.1.4 Phân bố bệnh lang ben theo giới tính bệnh nhân 32

3.1.5 Phân bố bệnh lang ben theo nghề nghiệp bệnh nhân 33

3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính đa dạng của các nấm men Malassezia spp gây bệnh lang ben phân lập được 34

3.2.1 Kết quả soi trực tiếp Malassezia trên kính hiển vi 34

3.2.2 Kết quả phân loại và đánh giá tính đa dạng của các chủng Malassezia spp phân lập được từ vẩy da của bệnh nhân lang ben 36

KẾT LUẬN 48

HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 3.1 Tình hình nhiễm bệnh lang ben của các bệnh nhân trong

nghiên cứu 28Bảng 3.2 Kết quả xét nghiệm soi trực tiếp từ vảy da 34Bảng 3.3 Kết quả nuôi cấy từ vảy da của bệnh nhân lang ben 36

Bảng 3.4 Đặc điểm các loài Malassezia trên môi trường SDA, mDixon 37 Bảng 3.5 Đặc điểm các loài Malassezia trên thạch nghiêng TE và

CHROMagar Malassezia 37 Bảng 3.6 Đặc điểm sinh hóa của các loài Malassezia 38 Bảng 3.7 Tổng hợp các kết quả định danh các chủng Malassezia theo loài 41 Bảng 3.8 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo giới 43 Bảng 3.9 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo địa dư 44 Bảng 3.10 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo màu sắc dát

thương tổn 45

bệnh trong một số bệnh da 6

Hình 1.2 Hình ảnh dát trắng (a) và dát nâu (b) của bệnh lang ben 8

Hình 1.3 Hình ảnh giả sợi nấm vả tế bào nấm men Malassezia soi trực tiếp bằng dung dịch NaOH 20% dưới kính hiển vi vật kính 40x 13

Hình 3.1 Phân bố bệnh theo mùa trong năm 29

Hình 3.2 Tình hình bệnh nhân đến khám bệnh theo tháng trong năm 30

Hình 3.3 Phân bố bệnh lang ben theo tuổi 31

Hình 3.4 Phân bố bệnh theo giới 32

Hình 3.5 Phân bố bệnh theo nghề nghiệp 33

Hình 3.6 Kết quả thống kê hình thái Malassezia qua soi trực tiếp 35

Hình 3.7 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo nhóm tuổi 42

Hình 3.8 Phân bố Malassezia gây bệnh lang ben theo vị trí thương tổn 46

Hình 3.9 Phân bố loài Malassezia theo hình thái trên kính hiển vi 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Malassezia spp là nấm men thuộc vi hệ da người và động vật máu

nóng Cho đến nay, đã phát hiện được 14 loài thuộc vi nấm này bao gồm:

M globosa, M furfur, M dermatis, M sympodialis, M restricta, M obtusa,

M slooffiae, M pachydermatis, M equina, M japonica, M cuniculi,

M yamatoensis, M nana và M caprae Các biểu hiện bệnh lý do Malassezia

bao gồm: lang ben, viêm da dầu, viêm da cơ địa, viêm nang lông, gàu da đầu… trong đó bệnh lang ben là thường gặp nhất Bệnh gây ảnh hưởng tới gần 1% dân số thế giới nói chung và có báo cáo cho thấy ở một số nước có khí hậu nhiệt đới tỷ lệ bệnh lên tới 50% dân số [23] Tại Việt Nam, bệnh lang ben được miêu tả từ lâu và đã có một số nghiên cứu đề cập Theo tác giả Trần Lan Anh, bệnh lang ben chiếm 3,1% số người được khám, khi điều tra về tỷ lệ mắc bệnh da tại xã Vĩnh Phúc, Thanh Trì, Hà Nội [9] Theo Phạm Văn Hiển và cộng sự năm 1995, khi nghiên cứu đặc điểm bệnh ngoài da tại công ty Thượng Đình, Hà Nội thì tỷ lệ bệnh là 3,5% [6] Tại Bệnh viện Da liễu Trung ương, theo Nguyễn Thị Tuyết Mai và cộng sự năm 1998, tỷ lệ bệnh là 1,76% tổng số bệnh nhân đến phòng khám [2]

Các phương pháp định danh nấm nói chung và Malassezia nói riêng chưa phổ biến tại Việt Nam Sở dĩ như vậy bởi vì Malassezia rất khó nuôi cấy

do chúng không mọc ở môi trường cấy nấm thông thường mà cần những điều kiện đặc biệt Tuy nhiên, việc xác định chính xác loài nấm gây bệnh rất quan trọng, là căn cứ để bác sỹ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp với từng bệnh

nhân Về mặt đại thể, các loài vi nấm Malassezia có đặc điểm khuẩn lạc

tương đối giống nhau, nhưng một số đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa

có sự khác biệt giữa các chủng Do đó, tìm hiểu về các đặc tính sinh học và

phân loại của vi nấm Malassezia, từ đó đưa ra các phương pháp định danh vi

nấm chính xác là hết sức cần thiết, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo Có

thể thấy, mặc dù đã có một số công trình nghiên cứu về bệnh lang ben ở Việt Nam, phần lớn các nghiên cứu còn mang tính đơn lẻ tại địa phương Vì vậy

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số loài Malassezia

sp gây bệnh lang ben ở bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung

ương” với 2 mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ bệnh lang ben ở bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện

Da liễu Trung ương từ 03/2017 đến tháng 02/2018

2 Tìm hiểu tính đa dạng các loài nấm men Malassezia gây bệnh lang ben tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ 03/2017 đến tháng 02/2018

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử nấm Malassezia và bệnh lang ben

Ngày nay, các chi Malassezia gồm 14 loài ưa lipid đã được phân lập từ

da người khỏe mạnh và động vật Tuy nhiên, nấm men Malassezia đã được

công nhận trong hơn 150 năm qua, là thành viên của hệ vi sinh vật ở da người

và là một trong các tác nhân gây bệnh ở các bệnh ngoài da [23]

Từ giữa thế kỷ 19, người ta đã phát hiện trên vảy da của bệnh nhân bị

bệnh lang ben, có một loại nấm tên là Micosporum furfur Sau đó,

Malassez (1842–1909), người đầu tiên mô tả tác nhân gây bệnh có tên

Malassezia furfur là những tế bào hình tròn, hình bầu dục, phát triển ở lớp

sừng của da ở bệnh nhân lang ben Tuy nhiên, đến tận giữa thế kỷ 20, Gordon

mới thành công trong việc nuôi cấy dạng hình cầu của Malassezia furfur (Pityrosporum orbiculare) trên môi trường thạch Sabouraud có phủ dầu oliu

hoặc acid béo no Sau đó 20 năm, năm 1974, Seidel cũng nuôi cấy được

Pityrosporum orbiculare trên môi trường tương tự ở nhiệt độ 37C, pH = 5,6 Năm 1977, Dorn và Rochnet thông báo có thể nuôi cấy được Pityrosporum orbiculare ở môi trường có chứa Glucine, và Nazzaro Porro cùng cộng sự cũng nuôi cấy thành công chủng nấm này ở môi trường khác

Năm 1925, một loài nấm khác, Pityrosporum pachydermatis phân lập từ

bệnh viêm da tróc vấy của tê giác, vi nấm có sự tương đồng về hình thái là

Pityrosporum canis cũng được phân lập từ bệnh viêm tai giữa của chó năm

1955 bởi Gutafsson [14] Cả hai loài nấm này không cần bổ sung lipid cho sự phát triển

Cuối cùng, bằng kỹ thuật quang phổ, nghiên cứu của Guého và cs (1996)

về hình thái, siêu cấu trúc, sinh lý học và các đặc điểm sinh học phân tử, đã

xác định chi Malassezia bao gồm 7 loài [24] Trong 7 loài này, có 3 loài cũ được biết từ trước: M furfur, M pachydermatis, và M sympodialis và 4 đơn

vị phân loại mới: M globosa, M obtusa, M restricta, và M slooffiae Sự phụ

thuộc lipid cho sự tăng trưởng vẫn là đặc điểm cơ bản cho vi nấm trừ

M pachydermatis [24]

Đến năm 2004, thêm một số loài mới được mô tả: M dermatis và

M japonica phân lập từ bệnh nhân bị viêm da cơ địa ở Nhật Bản, tiếp theo

là M yamatoensis, phân lập từ da người khỏe mạnh và từ một bệnh nhân với viêm da dầu [45],[44],[46] Một số loài mới phụ thuộc lipid như M nana, M caprae, M equina và gần đây là M cuniculi, từ da động vật cũng

đã được mô tả, nâng tổng số loài Malassezia được công nhận hiện nay là

14 loài [26],[16],[17]

1.2 Đặc điểm sinh học của Malassezia spp

Malassezia spp là các loài nấm men thuộc chi Malassezia tồn tại trên vi

hê ̣ da của người và động vật Hiện nay, nấm Malassezia là một trong những

căn nguyên quan tro ̣ng trong nhiều bê ̣nh lý về da như lang ben , viêm da dầu,

viêm da cơ đi ̣a, vảy nến, nấm móng, nhiễm khuẩn huyết…Nấm Malassezia có

các đặc điểm chính sau:

- Thuộc ngành Basidomycota, phân ngành Ustilaginomycotina, lớp Exobasidomycetes, bộ Malasseziales và họ Malasseziacae

- Tồn tại trạng thái đơn bào, có nhân chuẩn

- Hình dạng: Là nấm không màu, vách ngăn rộng, hình tròn hoặc hình bầu dục, đôi khi gặp dạng sợi hoặc vô định hình

- Kích thước dao động từ 3-10 m, thông thường lớn hơn gấp 10 lần so với vi khuẩn

- Sinh sản vô tính theo phương thức nảy chồi Khi bào tử chồi được sinh

ra theo dạng tuyến tính không phân cắt thì hình thành nên cấu trúc gọi là giả sợi nấm

- Khả năng thích nghi môi trường đường cao

- Tồn tại trong thiên nhiên, trong các môi trường chứa đường như hoa quả, rau dưa, mật mía…

- Có 14 loài Malassezia trên da người và đô ̣ng vâ ̣t , trong đó 3 loài chính

gă ̣p nhiều nhất là M globosa, M sympodialis, M furfur[50],[18],[49]

1.3 Cơ chế gây bệnh

Vi nấm Malassezia vừa tồn tại trên vi hệ da người, vừa có khả năng gây một số bệnh da Nghiên cứu cho thấy Malassezia tương tác với tế bào da thông

qua miễn dịch tế bào là các tế bào đuôi gai có mặt ở lớp thượng bì của da

Trên làn da khỏe mạnh, nấm Malassezia tồn tại với số lượng không đủ

để gây bệnh Khi xâm nhập vào cơ thể, nấm này gây ra sự đáp ứng miễn dịch với cơ thể vật chủ và cơ thể sẽ có hai cơ chế bảo vệ: miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào [10]

Trong một số bệnh da, người ta thấy rằng có sự thay đổi về số lượng

cũng như hình thái của Malassezia Vi nấm này vốn là nấm men, tuy nhiên

khi soi trực tiếp trên kính hiển vi, người ta quan sát thấy cả hai dạng hình

thái là sợi nấm và tế bào nấm men Tuy nhiên, do Malassezia sinh sản vô

tính, thực tế hình thái sợi nấm quan sát được là giả sợi nấm Đặc biệt trong bệnh lang ben, hình thái điển hình là giả sợi nấm và tế bào nấm men giống như mì ống và thịt viên

Hình 1.1 Hoạt động của Malassezia trên vi hệ da người và cơ chế gây

bệnh trong một số bệnh da [49]

Vi nấm không thể tự tổng hợp được acid béo, cho nên có xu hướng tìm

kiếm vùng da có nhiều bã nhờn để sinh sản và phát triển Malassezia gây

bệnh thông qua hệ thống các enzyme trong đó chủ yếu là các enzyme phân

giải lipid M globosa hoạt động dựa trên hệ enzyme phân giải lipid bao gồm

Mglip1, MgMDL2, MgMDL3, MgLip2 và Mglip3; trong đó chủ yếu là

Mglip2 [43] M furfur cũng có hệ enzyme phân giải lipid, tuy nhiên, khác với M globosa, nấm gây bệnh thông qua hệ enzyme phân giải protein bao

gồm MfTam1 (Malassezia furfur tryptophan aminotransferase 1) Thực

nghiệm đã chứng minh được sự khác biệt này thông qua điều kiện hoạt động của vi nấm ở các vi nấm khác nhau Nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết Mai (1998), của Phạm Thu Hiền (2014) đã chứng minh được pH da bệnh nhân lang ben có xu hướng kiềm hơn so với vùng da lành Kết quả này là hợp lý vì

enzyme MfTam1 của M furfur, có phổ pH hoạt động từ 6,0-10,0 và tốt nhất ở

pH=8,0 [2], [5], [37] Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu khác người ta cho

rằng vi nấm Malassezia có thể hoạt động ở pH bình thường da người bởi vì enzyme Mglip2 của M globosa có pH hoạt động từ 4,0-8,0, tối ưu ở pH=6,0

(pH da người bình thường là 4,5-5,5) [43],[27]

1.4 Một số yếu tố thuận lợi

Các yếu tố thuận lợi khiến Malassezia phát triển quá mức gây bệnh như:

- Sinh lý: phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh

- Bệnh lý toàn thân: Nhiễm trùng cấp và mạn tính, bệnh chuyển hóa, béo phì…Các bệnh lý như bỏng, Cushing, ung thư, Hodking, nhiễm HIV/AIDS…

- Bệnh lý tại chỗ làm thay đổi tính chất da: Viêm da cơ địa, rụng tóc, bạch biến, loét do bỏng, …

- Sử dụng hóa chất: Dùng kháng sinh phổ rộng, corticoid kéo dài làm thay đổi sự cân bằng vi hệ…

1.5 Lang ben và một số biểu hiện bênh lý khác do nấm Malassezia

1.5.1 Bệnh lang ben do Malassezia

 Đặc điểm lâm sàng của bệnh lang ben

Với bệnh lang ben điển hình, triệu chứng lâm sàng rất dễ nhận biết Bệnh thường bắt đầu bằng những chấm hồng, nâu hoặc trắng ở trên da Các chấm lớn dần, lan rộng và liên kết với nhau thành mảng ranh giới rõ rệt với da lành Thương tổn có hình bầu dục hoặc đa cung Kích thước đám thương tổn có từ 1-3 cm đường kính Bề mặt có những vảy nhỏ, cạo bong ra dễ dàng được gọi

là dấu hiệu “vỏ bào” Thương tổn lang ben có thể gặp ở mọi vị trí trên cơ thể Thương tổn không đau, có thể không ngứa hoặc ngứa ít, ngứa tăng lên khi ra

+ Thể theo vị trí tổn thương: lưng, ngực, mặt, cẳng tay, cẳng chân

+ Thể theo hình thái tổn thương: hình vòng cung (circinate), thể teo (atrophic)

+ Thể theo tuổi

+ Thể đảo ngược

+ Thể viêm nang lông do pityrosporum

 Chẩn đoán xác định bệnh lang ben

+ Biểu hiện lâm sàng

- Thông thường thể điển hình dễ nhận biết hình thái lâm sàng: Đám vảy da ranh giới rõ từ trắng, hồng đến nâu hoặc hỗn hợp; thương tổn mất sắc tố;

- Vị trí: chủ yếu vùng cổ, ngực, lưng, liên bả cột sống, có thể lan ra vai, cánh tay, và vùng bụng, đùi Hiếm khi thấy cẳng tay, cẳng chân, hầu như không thấy lòng bàn tay, bàn chân

- Soi đèn Wood: Phát quang dưới ánh đèn wood màu vàng lưu huỳnh, kể cả thương tổn mắt thường không nhìn thấy

- Cơ năng: ngứa khi ra mồ hôi

+ Có tế bào nấm men tập trung thành từng đám

- Nuôi cấy, định danh loài Malassezia: Dựa vào đặc điểm hình thái, tính

chất sinh lý, sinh hóa để xác định loài

- PCR sequencing: bệnh phẩm có thể được sử dụng là vẩy da hoặc khuẩn

lạc, dùng kỹ thuật PCR với đoạn mồi đặc hiệu của Malassezia để khuếch

đại gen, sau đó giải trình tự gen sản phẩm thu được và so sánh với ngân

hàng gen quốc tế NCBI bank để xác định chính xác loài Malassezia

 Chẩn đoán phân biệt bệnh lang ben

Lang ben dễ bị nhầm lẫn và do đó cần được phân biệt với các bệnh sau:

- Chàm khô (Pityriasis alba)

- Giảm sắc tố sau viêm của các bệnh lý khác

- Giang mai II

- Vảy nến thể giọt

- Viêm nang lông

 Điều trị bệnh lang ben

Điều trị bệnh lang ben tuy không khó nhưng bệnh hay tái phát, có thể do việc dùng thuốc không đúng và đủ liều hoặc bệnh nhân thực hiện phòng bệnh chưa đúng cách Ngoài ra, bệnh còn tái phát do sự thay đổi các thành phần hóa học, tính chất da và một số yếu tố thuận lợi khiến bệnh phát sinh, phát triển [11] Phác đồ điều trị thường dùng thuốc chống nấm nhóm azole như ketoconazole, fluconazole, itraconazole [40]

1.5.2 Một số bệnh lý khác do nấm Malassezia

 Viêm da dầu

Viêm da dầu (Seborrheic Dermatitis) là bệnh da mạn tính thường gặp Bệnh chủ yếu ở trẻ sơ sinh, tuổi dậy thì và độ tuổi ngoài 50, ở nam gặp nhiều hơn ở nữ Bệnh thường xảy ra trên cơ địa những người tăng tiết chất nhờn kết

hợp nhiễm nấm Malassezia spp [15]

 Gầu da đầu

Các biểu hiện trên da đầu mà thường được gọi là "gàu" gây ra bởi nhiều

yếu tố của cơ thể kết hợp với hệ vi nấm Malassezia spp Theo Flakes những

người da khô thường tiết ít dầu hơn so với những người da bình thường nên

dễ bị kích thích tăng tiết nhiều bã nhờn ngứa, bong vẩy gàu ở đầu trên da Khi da tăng tiết bã là tức là bệnh ảnh hưởng không chỉ đến da đầu mà còn xuất hiện trên các bộ phận khác của cơ thể, chẳng hạn như lông mày, hai bên mũi và lưng, xương ức, vùng nách, vùng háng đôi khi gặp ở cánh tay và chân Nếu không gội đầu thường xuyên thì dầu và các tế bào da từ da đầu có thể phát triển ở các vùng da khác của cơ thể [15],[19]

 Viêm nang lông

Vi nấm Malassezia gây viêm nang lông với biểu hiện thương tổn thường

lành tính thường gặp như ngứa, mụn mủ, sẩn đỏ nang lông phân bố chủ yếu ở thân mình, lứa tuổi hay gặp là người trung niên và trẻ tuổi Bệnh tuy không

nguy hiểm nhưng gây nên tình trạng rất khó chịu cho người bệnh [23]

 Nấm móng do Malassezia spp

Chowdhary đã phân lập M furfur từ vẩy móng tay thu được ở tổn

thương nấm móng tăng sừng trên bàn tay và bàn chân của nam bệnh nhân 13

tuổi [21] Crespo-Erchiga đã báo cáo rằng họ đã từng phát hiện Malassezia spp và Candida spp gây bệnh ở móng [20] Nhưng tỷ lệ nhiễm Malassezia

spp là rất thấp trong các mẫu bệnh phẩm

 Một số biểu hiện khác do nhiễm nấm Malassezia spp

- Malassezia thuộc vi hệ nên vi nấm này có mặt khắp nơi và gây bệnh nhiều

vị trí với các biểu hiện triệu chứng đa dạng trong rất nhiều bệnh cảnh lâm

sàng Malassezia có thể gặp trong viêm da cơ địa và thông thường làm

trầm trọng thêm tình trạng bệnh Ngoài ra, trong một số bệnh lý khác: Trứng cá thông thường, U nhú thể mảng, Gaiden, Bạch biến [40]

- Xâm nhập cơ quan, hệ thống: Đã có những báo cáo về bệnh nhân nằm điều

trị hồi sức tích cực bị nhiễm Malassezia spp huyết Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác đã nhận định Malassezia spp là tác nhân gây bệnh ở

phổi, viêm màng bụng, nhiễm khuẩn huyết qua đặt Catheter [33]

1.6 Đặc điểm đa dạng về phân bố loài Malassezia gây bệnh lang ben

Nghiên cứu của Krisanty tại Indonesia (2008) xác định các loài

Malassezia từ bệnh nhân lang ben và mối quan hệ với đặc điểm lâm sàng cho thấy loài thường gặp nhất trong bệnh lang ben là M furfur (42,9%), xếp thứ hai là M sympodialis (27,5%) Các loài còn lại là M globosa (13,3%), M obtusa (7,7%), M slooffiae (7,7%), và M restricta (2,2%) [31]

Tại Brazil năm 2011, báo cáo của Petry cho thấy, loài thường gặp nhất là

M sympodialis 30%, tiếp đó là M furfur 25,7%, M globosa 22,7%,

M restricta 12,1%, M obtusa 7,6% và M slooffiae 1,5% Nhóm độ tuổi

thường gặp là 16-46 [36]

Tại Iran năm 2012, theo Afshar, nấm Malassezia thường được gặp trên bệnh nhân lang ben, trong đó loài phân lập được phổ biến nhất là M globosa 51%, tiếp theo là M furfur 30%, M symbodialis 10%, M obtusa 6% và

M restricta 3% [34]

Tại Việt Nam, theo Nguyễn Đinh Nga, loài thường gặp nhất là M furfur, chiếm 48,64%, tiếp theo là M sympodialis (35,13%) Một loài thường gặp trong các nghiên cứu trên thế giới là M globosa, chỉ chiếm 5,4% [1]

Như vậy, sự phân bố các chủng Malassezia có sự khác biệt giữa các

nghiên cứu và khu vực địa lý khác nhau chứng tỏ sự đa dạng trong phân bố loài của vi nấm

1.7 Các phương pháp chẩn đoán Malassezia trong bệnh lang ben

Dưới kính hiển vi có thể quan sát thấy Malassezia tồn tại ở cả 2 dạng:

dạng tế bào đơn lẻ và dạng giả sợi, trong đó dạng tế bào đơn lẻ chủ yếu gặp trên da bình thường, dạng bao gồm cả giả sợi và tế bào đơn lẻ hay gặp trong bệnh lang ben, một phần nhỏ là dạng giả sợi hoặc dạng tế bào đơn lẻ

Soi trực tiếp: dưới kính hiển vi, trong các vảy da của thương tổn sẽ thấy bào

tử nấm hình tròn hoặc hình ovan có đường kính khoảng 3-6 micromet Các bào

tử này có viền kép sắp xếp thành đám từ 20-30 cái Xung quanh đám bào tử là các sợi nấm ngắn và thuôn trông như những sợi miến vụn

Hình 1.3 Hình ảnh giả sợi nấm vả tế bào nấm men Malassezia soi trực

tiếp bằng dung dịch NaOH 20% dưới kính hiển vi vật kính 40x

(Nguyễn Thị Tho, 2018)

Nuôi cấy: Malassezia khó mọc ở môi trường nuôi cấy bình thường

nhưng dễ dàng mọc ở môi trường Sabouraud có thêm dầu olive vô khuẩn với

tỷ lệ 2% và 0,2% Để ức chế vi khuẩn phát triển cần cho thêm Chloramphenicol 0,5% vào môi trường hoặc 20 đơn vị penicilin và 40 đơn vị streptomycin/1ml vào môi trường nuôi cấy Nấm có thể mọc tốt ở nhiệt độ 32-37oC, nhưng điều kiện tối ưu cho nấm mọc là nhiệt độ 37oC và pH 5,6 Sau 3 ngày, khuẩn lạc sẽ xuất hiện Khuẩn lạc hình tròn, đồng đều, màu kem, đường kính từ 4-6 mm Khi quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy những tế bào hình cầu, đường kính 3-6 micromet, có thành dầy và có rất nhiều tế bào nảy chồi Nấm mọc tốt không chỉ ở môi trường ái khí mà còn có thể mọc ở môi

trường kỵ khí Ở lần nuôi cấy nấm Malassezia furfur ban đầu, thường thấy tế

bào dạng ống Khi nuôi cấy chuyển tiếp ở môi trường thông thường, nấm mọc dưới dạng tế bào nấm men hoại sinh Ở môi trường nuôi cấy đặc biệt, dưới những điều kiện nhất định, nấm mọc dưới dạng sợi

1.8 Tình hình bệnh lang ben và các nghiên cứu về nấm Malassezia gây

bệnh lang ben trên thế giới và Việt Nam

Bệnh xuất hiện ở khắp trên thế giới và lên tới 30 – 40% dân số người ở vùng nhiệt đới đã từng bị Bệnh xuất hiện ở vùng nhiệt đới hơn vùng ôn đới

Khí hậu ấm và ẩm là điều kiện tốt cho nấm phát triển Lang ben hay gặp ở tuổi thiếu niên và người trẻ Do sự phát triển của nấm ưa mỡ, nên bệnh hiếm khi gặp ở trẻ nhỏ và người già (độ tuổi mà tuyến bã hoạt động ít) Ở vùng ôn đới, các yếu tố khác nhau liên quan gồm da dầu, mồ hôi quá nhiều, suy giảm miễn dịch, dinh dưỡng kém, mang thai và sử dụng corticosteroid Bởi vì nấm men này là ưa mỡ, việc sử dụng các loại dầu tắm và dầu bôi trơn da có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh Các yếu tố nguy cơ đối với viêm nang lông do

Malassezia bao gồm sử dụng kháng sinh kéo dài, suy giảm miễn dịch và băng

bịt tại chỗ [23]

 Trên thế giới

Bệnh phổ biến ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới Có nơi bệnh chiếm tới 40% dân số Tại Mexico, Samoa, Fiji, Trung và Nam Mỹ, một số vùng Châu Phi, Cuba, Tây Ấn Độ và Địa trung Hải tỷ lệ bệnh lên đến 50%, còn tỷ lệ 30%

là thường gặp ở các vùng nhiệt đới Ở vùng ôn đới bệnh thường phát vào mùa

hè và mùa thu Ở vùng hàn đới, mặc dù không có số liệu chính xác nhưng tỷ

lệ bệnh dưới 1% dân số

Theo Glemm S Bulmer, nhìn chung tỷ lệ bệnh lang ben dao động trong khoảng từ 5 - 50% dân số tuỳ theo từng quốc gia khác nhau

Ở Mỹ, tỷ lệ gặp phụ thuộc vào phương pháp và cách lẫy mẫu Bệnh

thường gặp ở những nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao Malassezia có thể tìm thấy

18% ở trẻ em và từ 90 – 100% ở người lớn Tỷ lệ bệnh chung trong dân số ở

Mỹ từ 2 – 8%

Báo cáo của Levin NA năm 2009 cho thấy, các loài Malassezia được báo cáo là M globosa chiếm 77% -90% ở Tây Ban Nha, 55% ở Nhật, 25% ở Canada, M sympodialis chiếm 32% -42% ở Tây Ban Nha, 9% ở Nhật, 59 % ở

Canadavà M furfur là 11% ở Canada [32]

Theo một nghiên cứu ở Ấn độ, trong số 100 trường hợp lang ben, 73%

là nam giới, 26% là nữ giới và nhóm tuổi chủ yếu là 21-30 tuổi Trong số

100 mẫu, 70 mẫu nuôi cấy có Malassezia Loài phân lập được phổ biến nhất là M sympodialis (50%), tiếp theo là M furfur (32,86%), M globosa (14,28%) và M slooffiae (2,86%) Trong số 100 trường hợp, 74% thương tổn là giảm sắc tố da và 26% có thương tổn là tăng sắc tố da M sympodialis và M furur chủ yếu được phân lập từ các thương tổn giảm sắc

tố, trong khi M globosa và M slooffiae lại được tìm thấy phổ biến hơn

trong các thương tổn tăng sắc tố da [12]

 Tại Việt Nam

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới nên bệnh khá phổ biến Cho đến nay, đã có một số công trình nghiên cứu nhỏ lẻ về bênh lang ben ở một số địa phương

Theo Trần Lan Anh và tập thể Bộ môn Da liễu trường Đại học Y Hà Nội khi điều tra bệnh da của xã Vĩnh Phúc -Thanh Trì - Hà Nội, thấy bệnh lang ben chiếm tỷ lệ 3,1% trong tổng số 513 người được khám [9]

Một tỷ lệ tương tự là 3,5% cũng được Phạm Văn Hiển và cộng sự đưa ra khi nghiên cứu bệnh ngoài da tại khu công nghiệp Thượng Đình tháng 12/1994 [6]

Một nghiên cứu khác trong quân đội khi khám một số đơn vị hải quân ở ven biển miền Nam đã cho thấy tỷ lệ bệnh lang ben chiếm 18,94%

Theo báo cáo của Nguyễn Văn Hoàn, từ 1/9/2014 –31/8/2015, tại Bệnh viện Da liễu Trung ương, có 3213 bệnh nhân lang ben trong tổng số 208 643 lượt bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương, chiếm tỷ lệ 1,54% Có 16848 lượt bệnh nhân được chẩn đoán nấm trong 208 643 lượt bệnh nhân đến khám, chiếm tỷ lệ 8,08% bệnh nhân Trong số 16 848 bệnh

nhân chẩn đoán nấm có 3213 bệnh nhân lang ben chiếm tỷ lệ 19,07% Bệnh lang ben gặp ở nam giới (57,6%) nhiều hơn nữ (42,4%) Nhóm học sinh, sinh viên có tỷ lệ lang ben cao nhất (32,5%), sau đó là nhóm lao động tự do (23,7%) Tuy nhiên, nhóm trẻ < 6 tuổi, tỷ lệ bị lang ben khá cao (16,9%), thấp nhất là nông dân (3,9%) Số bệnh nhân lang ben biểu hiện bằng dát trắng chiếm đa số (80%) Số trường hợp có các dát hồng chiếm tỷ lệ thấp hơn (17,5%) và dát nâu chiếm tỷ lệ rất thấp (2,5%) [4]

Tại Việt Nam, chưa có một nghiên cứu tổng thể nào về tỷ lệ bệnh nói chung trên quy mô lớn và đặc biệt chưa có nghiên cứu sâu về tác nhân gây

bệnh, nấm Malassezia, cũng như tính đa dạng của tác nhân này trên các bệnh nhân lang ben Các phương pháp xác định Malassezia chủ yếu bằng kỹ thuật

soi trực tiếp, thời gian trả kết quả nhanh Tuy nhiên chưa xác định chính xác

loài Malassezia gây bệnh Nuôi cấy, định danh Malassezia được sử dụng như

một “tiêu chuẩn vàng” để khẳng định căn nguyên gây bệnh lang ben và cần thiết để xác định được độ nhạy của từng chủng nấm với kháng sinh chống nấm nhằm giúp bác sĩ lựa chọn thuốc điều trị phù hợp, nhằm phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

120 bệnh nhân lang ben đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương từ tháng 03/2017 đến tháng 02/2018

2.1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng bệnh lang ben [7]:

+ Trên da có dát thay đổi màu sắc (trắng, nâu, hồng hoặc hỗn hợp) + Vị trí chủ yếu: lưng, ngực, bụng, tay, vai, cổ

+ Bề mặt thương tổn phủ lớp vảy da ẩm, mỏng và dễ bong

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn

- Bệnh nhân được chẩn đoán bệnh lang ben

- Bệnh nhân không giới hạn độ tuổi

- Không dùng thuốc kháng nấm, bong sừng bạt vảy trước đó 7 ngày

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ

- Không đồng ý tham gia nghiên cứu

- Bệnh nhân mắc bệnh nội khoa mạn tính và bệnh da khác (có bệnh chứng lâm sàng và cận lâm sàng qua khám bệnh)

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Trang thiết bị, dụng cụ

- Tủ ấm Heraeus (Đức)

- Tủ An toàn sinh học cấp II Airstream (Singapore)

- Tủ lạnh thường

- Đầu côn tiệt trùng: 100ul

- Ngoài ra, còn có các dụng cụ khác phục vụ cho nghiên cứu: lam kính, lamen, dao cùn, que cấy, punch, pipet (Biohit – Phần Lan), cân Shinko (Nhật)

- Cremophor EL (Sigma Aldrich – Mỹ)

- Chloramphenicol (Pharbaco – Việt Nam)

- Cycloheximide (Biosic – Canada)

2.3.3 Môi trường

- Part B (India)

- Part A (India)

- Sabouraud dextrose agar (Italy)

- Ox bile power (India)

- Malt extract (Oxoid – Anh)

- Bacteriological peptone (Oxoid – Anh)

- CHROMOagar Malassezia (Pháp)

- Tween Esculin agar (TE)

- Ammonium iron (III) citrate (Đức)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Mô tả cắt ngang, tiến cứu

2.4.2 Cỡ mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu được tính theo công thức tính cỡ mẫu mô tả tỷ lệ:

n= Z21-α/2 x

2)(

p: tỷ lệ nuôi cấy nấm dương tính, p=0,8

ε: giá trị tương đối (=0,09)

Kết quả tính cỡ mẫu là n= 119 bệnh nhân

Trên thực tế vì một số lý do khách quan và để đảm bảo cỡ mẫu nghiên cứu, chúng tôi chọn 120 bệnh nhân

2.4.3 Các kỹ thuật nghiên cứu

2.4.3.1 Kỹ thuật soi trực tiếp

- Chọn thương tổn điển hình:

Thương tổn da mới xuất hiện, chưa điều trị bằng các phương pháp khác, hình thái lâm sàng điển hình

- Các bước tiến hành:

+ Sát khuẩn thương tổn bằng Ete

+ Lấy vảy da bằng băng dính trong hoặc dao cùn

+ Xử lý bệnh phẩm: nhỏ 1-2 giọt NaOH 20%, đậy lamen

+ Giữ lam kính trong tủ ấm trong khoảng 30 phút-1h

- Nhận định kết quả: Quan sát sơ bộ vi nấm ở vật kính 10x và khẳng đinh

vật kính 40x:

+ Tế bào và sợi nấm đứng tập trung thành đám, giống hình ảnh “mì ống” và “thịt viên”: kết luận “sợi và tế bào nấm men”

+ Sợi nấm thô ngắn : kết luận “có sợi nấm”

+ Tế bào nấm men đứng thành đám hình tròn hoặc bầu dục Kết luận:

o Hình thái và mật độ vi nấm: “có tế bào nấm men đứng tập trung thành đám”

o Đồng thời đánh giá số lượng theo tiêu chuẩn V Silva 1996 [42]:

Âm tính (0 - 3 TB/VT); 1+ (4-9 TB/VT); 2+ (10- 19 TB/VT); 3+ (20- 39 TB/VT); 4+ (≥ 40 TB/VT)

2.4.3.2 Kỹ thuật nuôi cấy nấm

 Kỹ thuật nuôi cấy nấm

- Vị trí lấy bệnh phẩm: Chọn thương tổn da mới xuất hiện, chưa điều trị

bằng các phương pháp khác, hình thái lâm sàng điển hình

- Cách lấy và xử lý bệnh phẩm

+ Sát khuẩn thương tổn

+ Chọn thương tổn điển hình:

+ Sát khuẩn bằng Ete, cạo vẩy da bằng dao cùn vô khuẩn (thương tổn không

có vảy da thì dùng băng dính để lấy bệnh phẩm)

+ Kỹ thuật viên đặt dao vuông góc với bề mặt thương tổn, đặt lam kính song song phía dưới dao

+ Tiến hành cạo nhẹ nhàng ở rià thương tổn để vẩy da tập trung vào lam kính, tránh làm chảy máu

+ Đối với trẻ nhỏ và người lớn thương tổn không có vẩy da Tiến hành dùng băng dính để lấy bệnh phẩm

+ Sau đó, cấy bệnh phẩm vào môi trường: Thạch SDA có chứa 0,5g chloramphenicol hoặc 50mg cycloheximide; thạch mDixon

+ Thạch SDA gồm 65g Sabouraud dextrose agar hòa tan vào 1000ml nước

cất, thêm vào 0,5g chloramphenicol, đun tan thạch Đem hấp ướt ở

1210C/15 phút Để nguội 45-500C, thêm 50mg cycloheximide Lắc đều

- Quan sát đặc điểm hình thái [48]:

Chọn khuẩn lạc thuần mang đặc điểm hình thái nấm men mọc trên môi trường mDixon (sau 07 ngày nuôi cấy): Kích thước của khuẩn lạc trên mDixon được xác định bằng cách đo các khuẩn lạc riêng rẽ và được đánh giá

là nhỏ (ĐK 1-2 mm), trung bình (ĐK: 3-5 mm) và lớn (ĐK: 6-8 mm) Hình thái của khuẩn lạc được quan sát (có thể là màu kem, đục hoặc vàng, lồi, nhẵn

và trơn bóng …) để làm căn cứ xác định tên loài Cụ thể việc phân loại dựa trên hình thái khuẩn lạc như sau:

o M furfur khuẩn lạc tròn, lồi, đục, đường kính khoảng 4-5 mm trên mDx

o M globosa khuẩn lạc bờ không đều, nhăn, vàng nhạt, đường kính 3-4

6-o M obtusa khuẩn lạc trắng đục,bờ đều, lồi, bóng, đường kính 1,5-2mm

trên mDX

o M pachydermatis khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, bóng, màu vàng kem, đường kính 4-5 mm

o M restricta khuẩn lạc lồi, bờ không đều, màu vàng nâu, ĐK 1-2 mm

- Quan sát vi thể trên kính hiển vi:

Tế bào nấm hình cầu hoặc bầu dục đôi khi hình trụ hay hình đa giác, nảy chồi 1 cực hoặc nhiều cực, kích thước khoảng 2,0- 6,0 µm x 1,5-4,5 µm

- Các phản ứng sinh hóa định danh Malassezia

o Nhiệt độ ảnh hưởng tới sự phát triển nấm: Ở 320C tất cả các loài đều mọc

Ở 400C; có 4 loài mọc: M furfur, M pachydermatis, M sympodialis và

M dermatis

o Sự có mặt của Catalase trên thạch ở môi trường nuôi cấy: test dương tính khi phản ứng tạo bọt khí Thử nghiệm với catalase là không đặc hiệu và mang tính sàng lọc: hầu hết các loài đều dương tính, duy nhất loài

M restricta âm tính

Nguyên lý: Dùng oxi già để phát hiện chủng nấm men có enzyme Catalase

Nhỏ 1 giọt H2O2 3% lên lam kính sạch Dùng ăng nhựa vô trùng lấy khuẩn lạc Hòa chủng nấm vào giọt H2O2 Nếu chủng nấm có enzyme Catalase sẽ tạo thành bọt khí là phản ứng dương tính Phản ứng âm tính không tạo thành bọt khí (huyền dịch vi nấm đục) Phản ứng xác định với

M restricta là âm tính Các Malassezia spp còn lại có phản ứng dương tính:

4 H2O2 Catalase 4H2O + 2O2

o Tween và CremophorEL: Đánh giá dựa theo khả năng hấp thu Tween

và CremophorEL trên môi trường thạch Sabouraud dextrose 18ml; Tween

20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 và CremophorEL, cho thấy hình ảnh

đặc trưng mỗi loài Malassezia khác nhau

Nguyên lý test thử: Các loại Tween 20 (C58H114O2), Tween 40, Tween

60, Tween 80 (C64H124O26) và CremophorEL (CrEL) là các acid béo Tạo huyền dịch vi nấm với một nồng độ nhất định, được hòa tan trong thạch

cơ sở SDA có chứa 0,5g chloramphenicol hoặc 50mg cycloheximide trong 1 lít ở nhiệt độ thích hợp Sau khi thạch đông cứng, đục lỗ 4 lỗ xung quanh đĩa thạch, 1 lỗ ở trung tâm đĩa thạch tạo các giếng, sau đó nhỏ mỗi loại Tween vào 1 giếng theo chiều kim đồng hồ Giếng ở giữa nhỏ CrEL Tùy vào khả năng hấp thu từng loại Tween 20, Tween 40, Tween 60,

Tween 80 trên môi trường thạch Sabouraud dextrose, mỗi loài Malassezia cho hình ảnh khuẩn lạc đặc trưng:

+ Hấp thu cả 4 loại Tween có M furfur, M sympodialis

+ Không hấp thu cả 4 loại Tween: M globosa, M obtusa

+ Hấp thu yếu hoặc không hấp thu Tween 80: M dermatis

Tiến hành: Pha chế môi trường cơ sở (SDA): Cân 65g thạch bột

Sabouraud dextrose Đong chính xác 1000ml nước cất bằng cốc đong Tất

cả được cho vào bình cầu Cho 2 viên chloramphenicol 0,5g Lắc đều và đun tan thạch Hấp 1200C/15p Khi nhiệt độ bình thạch khoảng 45-500C, thêm 50mg cycloheximide Lắc đều Điều chỉnh pH= 6,0 Đong vào ống vô trùng 16ml Đổ đĩa petri vô trùng (1) Pha 3ml huyền dịch vi dịch chủng nấm (được nuôi cấy thuẩn trên môi trường mDixon’s agar sau 4-5 ngày) bằng nước cất vô trùng pha tiêm để đạt độ đục 105CFU/ml (2) dùng độ đục

108 để ước lượng pha Đổ vào đĩa petri (1) rồi lắc đều, để thạch đông lại Dùng Punch vô trùng đục 4 lỗ xung quanh đĩa thạch, 1 lỗ trung tâm đĩa thạch đường kính 2mm trên 1 đĩa thạch, các lỗ cách thành 1,5cm và cách nhau 2,5cm và 1 lỗ ở giữa đĩa thạch (CrEL) Đánh dấu các loại Tween lần lượt là Tween 20, Tween 40, Tween 60 và Tween 80 (xếp ngược chiều kim đồng hồ) trên cùng bên phải là Tween 20, CrEL ở giữa đĩa thạch Nhỏ 15µl

từng loại Tween và CrEL tương ứng Để tủ ấm 320C Theo dõi kết quả 2-4 ngày Đọc kết quả: Dương tính: Có nấm mọc xung quanh giếng được nhỏ Tween và CrEL tương ứng; Âm tính: Không có nấm mọc

- Thử nghiệm với CremophorEL: Để phân biệt M furfur với các loài

Malassezia khác chúng ta cần sử dụng các kỹ thuật sinh hóa như:

CremophorEL làm nguồn chất béo cần thiết [29] Có 2 loài M furfur và

M pachydermatis phát triển, khả năng phát triển của M sympodialis và

M dermatis còn tùy vào từng trường hợp

o Xác định hình thái, tính chất trên CHROMagar Malassezia

Cân chính xác 56,3g CHROMagar Malassezia, thêm 10g Tween 40,2g

Glycerol và 1000ml nước cất cho vào bình cầu vô trùng Khuấy đều đến khi thạch nở ra Đun sôi ở 1000C, đến khi sôi tạo bọt Làm nguội đến

45-50oC, điều chỉnh về pH: 6,3± 0,3 bằng dung dịch HCl 0,1N Đổ vào đĩa petri vô trùng Để đông Ria cấy chủng nấm thuần vào môi trường

CHROMagar Malassezia Để tủ ấm 320C Theo dõi hình thái, kích thước

và mầu sắc khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch M furfur, khuẩn lạc màu hồng

nhạt và nếp nhăn đặc trưng có thể dễ dàng phân biệt với các

loài Malassezia khác trên CHROMagar Malassezia Kích thước của khuẩn lạc trên CHROMagar Malassezia được đo từ các khuẩn lạc riêng rẽ

và được chia thành ba nhóm: nhỏ (M obtusa và M restricta), trung bình (M globosa) và lớn (M pachydermatis, M sympodialis, M dermatis,

M furfur) M pachydermatis, M sympodialis, M globosa và M dermatis

có tủa trên thạch CHROMagar Malassezia

2.5 Các chỉ tiêu nghiên cứu

2.5.1 Các chỉ tiêu đánh giá cho mục tiêu nghiên cứu 1

- Lấy số liệu từ phòng khám và phòng xét nghiệm Nấm Bệnh viện Da

liễu Trung ương từ 03/2017-02/2018

- Số lượng bệnh nhân đến khám

- Số lượng bệnh nhân được chẩn đoán nấm da nói chung

- Số bệnh nhân được chẩn đoán nấm lang ben nói riêng

- Phân bố bệnh theo mùa: mùa xuân, mùa hè, mùa thu, mùa đông

- Phân bố bệnh theo tháng trong năm: tháng 1, tháng 2, tháng 3, tháng 4, tháng 5, tháng 6, tháng 7, tháng 8, tháng 9, tháng 10, tháng 11, tháng 12

- Tuổi: theo nhóm tuổi: 0-9 ,10-19, 20-29, 30-39, 40-49, trên 50

- Giới: Nam, nữ

- Địa dư: Thành thị, nông thôn

- Phân bố bệnh theo nghề nghiệp: trẻ dưới 6 tuổi, học sinh sinh viên, cán

bộ văn phòng, công nhân, nông dân, lao động tự do, nghề khác

- Đặc điểm lâm sàng: màu sắc dát, vị trí thương tổn

2.5.2 Các chỉ tiêu đánh giá cho mục tiêu nghiên cứu 2

- Tỷ lệ xét nghiệm soi trực tiếp: dương tính, âm tính

- Hình thái Malassezia qua soi trực tiếp: sợi nấm và tế bào nấm men, sợi

nấm, tế bào nấm men

- Kết quả nuôi cấy: có mọc, không mọc

- Kết quả định danh: M globosa, M furfur, M dermatis, M sympodialis,

M restricta, M obtusa và M pachydermatis

- Tính chất sinh vật hóa học: khả năng phát triển trên SDA, mDixon,

CHROMagar Malassezia, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, test

Catalase, test Cremophor EL, TE agar

- Phân bố loài Malassezia theo tuổi, giới, địa dư, màu sắc dát, vị trí

thương tổn

2.6 Phương pháp xử lý số liệu

- Dữ liệu về mẫu nghiên cứu sẽ được lập thành file Epidata, xử lý bằng phần mềm SPSS 23.0

- Thống kê mô tả: được tính theo tần số tỷ lệ %, và được trình bày dưới dạng bảng biểu

- Thống kê phân tích:

+ Dùng phép kiểm định Khi bình phương và RR ở mức ý nghĩa 5%, khoảng tin cậy (KTC) 95% để đo lường sự khác biệt trong các mối liên hệ của kết quả nghiên cứu

+ Sử dụng test Fisher với các giá trị nhỏ hơn 5

- Các thuật toán thống kê thường dùng trong y học đã đư ợc sử dụng tối

đa để loại trừ các sai số ngẫu nhiên

2.8 Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu không vi phạm y đức vì tất cả người bệnh và người khỏe mạnh đều được hỏi ý kiến và đồng ý tham gia nghiên cứu, các thủ thuật khám,

lấy bệnh phẩm đều không xâm hại

SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Khám lâm sàng + làm bệnh án

Cấy vào MT Sabouraud, mDixon

soi trực tiếp NaOH

20%

Định loại xác định loài bằng các phương pháp hóa sinh

Lấy bệnh phẩm tổn thương vảy da

BN nghi ngờ bị lang ben

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tỷ lệ bệnh lang ben ở bệnh nhân đến khám

3.1.1 Tình hình chung nhiễm bệnh lang ben

Bảng 3.1 Tình hình nhiễm bệnh lang ben của các bệnh nhân trong

lượt bệnh nhân đến khám và chữa bệnh tại bệnh viện Da liễu Trung Ương Tỷ

lệ bệnh nhân được chẩn đoán nấm chiếm 4,7% và chẩn đoán lang ben chiếm 1,0% trong tổng số bệnh nhân đến khám và chiếm 21,6% trong số bệnh nhân được chẩn đoán nấm

Kết quả này thấp hơn so với Nguyễn Văn Hoàn (2015), tỷ lệ bệnh nhân lang ben là 1,54% trong số các bệnh da [4] Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Tuyết Mai (1998) cũng thực hiện tại phòng khám Bệnh viện Da liễu Trung ương tương tự chúng tôi, công bố tỷ lệ này là 1,76% [2] Chúng tôi cho rằng tỷ lệ trong nghiên cứu là phù hợp, phản ánh đúng tình hình dịch tễ của bệnh Tỷ lệ bệnh lang ben có xu hướng giảm dần qua các năm có lẽ là do sự phát triển của môi trường xã hội cùng với điều kiện sống ngày càng một cải thiện làm giảm tỷ lệ mắc các bệnh ngoài da trong đó có bệnh nấm Hơn nữa,

do chỉ là một bệnh ngoài da không gây nguy hiểm đến tính mạng cho nên có

Tuy nhiên, trên thực tế, tỷ lệ bệnh lang ben trong tổng số bệnh nấm da là 21,6% cao hơn tỷ lệ 3,9% của Nguyễn Văn Hoàn (2015) [4] Lý giải cho sự

khác biệt lớn này, chúng tôi cho rằng nấm Malassezia gây bệnh lang ben chủ

yếu ngoài da, gây ra các dát loang lổ trên da, ảnh hưởng lớn đến thẩm mỹ của người bệnh là vấn đề ngày càng được quan tâm trong xã hội hiện đại; điều đó làm cho bệnh nhân đến khám bệnh nhiều hơn so với các bệnh nấm da khác như nấm bẹn, nấm thân mình Mặt khác, bệnh lang ben nếu không điều trị hoặc điều trị không đúng, bệnh hay tái đi tái lại, gây khó chịu rất lớn cho người bệnh

Nhìn chung, tỷ lệ bệnh lang ben trong nghiên cứu là phản ánh đúng thực trạng nước ta với điều kiện nhiệt đới nóng ẩm, phù hợp cho các loài nấm gây

bệnh phát triển trong đó có Malassezia spp

3.1.2 Phân bố bệnh lang ben theo mùa

Hình 3.1 Phân bố bệnh theo mùa trong năm

Nhận xét: Bệnh nhân đến khám bệnh lang ben vào mùa thu nhiều nhất

chiếm 38,2%, đứng thứ 2 là mùa hè với 35,9% Mùa đông có tỷ lệ bệnh nhân đến khám bệnh thấp nhất với 7,1%

Kết quả trong Hình 3.1 cho thấy, bệnh nhân có xu hướng đền khám bệnh chủ yếu vào mùa hè thu, ít hơn vào mùa đông xuân Việt Nam là nước nhiệt đới nóng ẩm, có điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm trong

đó có nấm Malassezia Mùa hè thu là lúc con người vận động nhiều, tăng tiết mồ hôi và tuyến bã, tạo điều kiện cho vi nấm Malassezia phát triển

mạnh và gây bệnh Kết quả này là phù hợp với Nguyễn Văn Hoàn (2015), Nguyễn Văn Hiếu (2016) [4], [3] Tuy nhiên, có đôi chút khác biệt với 2 nghiên cứu trên khi tỷ lệ bệnh nhân của chúng tôi đến khám vào mùa thu cao hơn so với mùa hè

Hình 3.2 Tình hình bệnh nhân đến khám bệnh theo tháng trong năm

Nhận xét: bệnh nhân chủ yếu đến khám bệnh vào các tháng 7,8,9 Bệnh

nhân đến khám ít nhất vào các tháng 12,1,2

Xét theo tháng đến khám bệnh trong năm, chúng tôi nhận thấy tháng 9

có tỷ lệ bệnh nhân đến khám bệnh cao nhất với 16,6% Kết quả này phù hợp