Nghiên cứu đa dạng thành phần loài nấm rễ nội cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất trồng ngô

29 3.3 Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái nghiên cứu và mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LƯU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN

LOÀI CỦA NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)

TRONG ĐẤT TRỒNG NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LƯU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG THÀNH PHẦN

LOÀI CỦA NẤM RỄ NỘI CỘNG SINH (ARBUSCULAR MYCORRHIZA)

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin phép được gửi những lời cảm ơn sâu sắc tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Vi sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành Luận án này

Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Đại học Quốc gia Hà Nội, là đơn vị hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu từ đề tài QG 16.35 để tôi thực hiện được nghiên cứu trong Luận văn này

Tôi xin phép được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, là đơn thị thực hiện nghiên cứu đã cung cấp cơ sở vật chất để tôi hoàn thành kết quả nghiên cứu được trình bày trong Luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Lê Thị Hoàng Yến, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, là giáo viên hướng dẫn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành Luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Mai Thị Đàm Linh, Bộ môn Vi sinh vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, là giáo viên hướng dẫn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành Luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn bộ cán bộ của Viện Vi Sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo của Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu

Tôi xin phép gửi lời cảm ơn tới Khoa Kiểm định Vắc xin Vi rút, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế, Bộ y tế, là nơi tôi công tác đã tạo mọi điều kiện cho tôi để tôi hoàn thành Luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên, hỗ trợ, dõi theo các bước tiến và chia sẻ với tôi mọi mặt trong cuộc sống và công việc

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới bố mẹ và gia đình đã luôn bên cạnh, ủng hộ và đồng hành cùng tôi và cho tôi ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 02 tháng 1 năm 2018 Học viên

Lưu Thị Dung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm rễ nội cộng sinh 3

1.2 Lịch sử nghiên cứu 3

1.3 Phương pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh 4

1.3.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh 4

1.3.2 Phân loại 5

1.4 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh đối với thực vật 10

1.4.1 Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng 10

1.4.2 Thu nhận hợp chất cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza 10

1.4.3 Tăng sức chống chịu của cây trồng trong điều kiện bất lợi của môi trường 11 1.4.4 Giúp cây chống chịu với bệnh hại 11

1.4.5 Hấp thu lân 12

1.5 Tình hình nghiên cứu AMF trên thế giới 12

1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 16

1.7 Đặc điểm tự nhiên của địa điểm nghiên cứu 18

1.7.1 Đặc điểm tự nhiên của Duy Tiên – Hà Nam 18

1.7.2 Đặc điểm tự nhiên của Thường Tín - Hà Nội 19

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.3 Vật liệu và trang thiết bị 21

2.3.1 Nguyên vật liệu 21

2.3.2 Dụng cụ 22

2.4 Phương pháp 22

2.4.1 Lấy mẫu đất 22

2.4.2 Phân lập AMF 22

2.4.3 Tiệt trùng các bào tử AMF 23

2.4.4 Phân loại nấm rễ nội cộng sinh 24

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28

3.1 Phân lập AMF từ mẫu đất thu thập 28

3.2 Phân loại AMF bằng phương pháp hình thái học 29

3.3 Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái nghiên cứu và mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô 45

3.3.1 Dựa vào thành phần loài 45

3.3.2 Dựa vào tần suất xuất hiện 46

3.3.3 Dựa vào mật độ loài 51

3.4 Lựa chọn một số AMF có độ đa dạng cao để phân loại chúng bằng kỹ thuật sinh học phân tử 52

KẾT LUẬN 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

- ADN (Acid deoxiribonucleic): Axit deoxiribonucleotit

- ARN (Acid ribonucleic): Axit ribonucleotit

- AMF(Arbuscular Mycorrhizal Fungi): Nấm rễ nội cộng sinh

- BP (Base pair): Cặp bazơ

- dNTP ( Deoxynucleotide Triphosphates): Nucleotide

- PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng khuếch đại

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại AMF về hình thái học 7

Bảng 2.1 Danh sánh mẫu đất trong nghiên cứu 21

Bảng 2.2.Thành phần của phản ứng PCR 25

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 26

Bảng 3.1 Số lƣợng bào tử AMF phân lập 28

Bảng 3.2 Tần suất xuất hiện của các chi AMF 47

Bảng 3.3 Tần suất xuất hiện của các loài AMF 49

Bảng 3.4 Sự phân bố của AMF trong đất theo mật độ loài (SR) 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Vị trí địa lý của Duy Tiên - Hà Nam trên bản đồ 19

Hình 1.2 Vị trí địa lý của Thường Tín-Hà Nội trên bản đồ 20

Hình 3.1 Biểu đồ mật độ bào tử AMF phân lập các mẫu ở Hà Nội và Hà Nam 29

Hình 3.2 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora gerdemanii (kích thước bar 100µm) 30

Hình 3.3 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora longula, kích thước bar 30 µm 31

Hình 3.4 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora mellea, kích thước bar 20 µm 31

Hình 3.5 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora morrowiae, kích thước bar 50 µm 32

Hình 3.6 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora rehmii phân lập, kích thước bar 50 µm 32

Hình 3.7 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora sp 1, kích thước bar 30 µm 33

Hình 3.8 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora sp.2, kích thước bar 20 µm 33

Hình 3.9 Hình ảnh bào tử loài Acaulospora sp.3, kích thước bar 50 µm 34

Hình 3.10 Hình ảnh bào tử loài Centraspora pellucida, kích thước bar 50µm 34

Hình 3.11 Hình ảnh bào tử loài Dentiscutata nigra, kích thước bar 50µm 35

Hình 3.12 Hình ảnh bào tử loài Dentiscutata reticulata, kích thước bar 50µm 35

Hình 3.13 Hình ảnh bào tử loài Dentiscutata sp., kích thước 50 µm 36

Hình 3.14 Hình ảnh bào tử loài Glomus ambisporum, kích thước bar 50 µm 37

Hình 3.15 Hình ảnh bào tử loài Glomus multicaule, kích thước bar 50 µm 37

Hình 3.16 Hình ảnh bào tử loài Glomus intraradice, kích thước bar 50µm 38

Hình 3.17 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora albida, kích thước 50µm 38

Hình 3.18 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora decipiens, kích thước bar 50µm 39

Hình 3.19 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora gigantean, kích thước 100 µm 39

Hình 3.20 Hình ảnh bào tử loài Gigasspora margarita, kích thước bar 50 µm 40

Hình 3.21 Hình ảnh bào tử loài Racocetra gregari, kích thước bar 50µm 41

Hình 3.22 Hình ảnh bào tử loài Rhizophagus clarus, kích thước bar 50µm 41

Hình 3.23 Hình ảnh bào tử loài Rhizophagus sp., kích thước bar 50µm 42

Hình 3.24 Hình ảnh bào tử loài Septoglomus constrictum, kích thước bar 50 µm 42

Hình 3.25 Hình ảnh bào tử loài New Genus 1 sp., kích thước bar 50µm 43

Hình 3.26 Hình ảnh của bào tử loài New Genus 2 sp., kích thước bar 50µm 44

Hình 3.27 Hình ảnh bào tử loài New Genus 3 sp., kích thước bar 50µm 44

Hình 3.28 Tần số xuất hiện của các chi AMF 47

Hình 3.29 Tần suất xuất hiện của các loài AMF 50

Hình 3.30 Mật độ loài AMF 52

Hình 3.31 Cây chủng loại phát sinh của các chủng AMF nghiên cứu và các loài có mối quan hệ họ hàng gần dựa vào phân tích trình tự 18S 53

MỞ ĐẦU

Nấm rễ nội cộng sinh (AMF - Arbuscular Mycorrhizal Fungi) là một nhóm nấm có lợi trong đất và sống cộng sinh trong rễ của thực vật bậc cao Đây là quần hợp nấm - thực vật được biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng như hệ sinh thái AMF được phát hiện từ ít nhất 400 triệu năm trước, có vai trò rất quan trọng đối với sự phát triển, sinh sản của cả thực vật và nấm Đây được xem là nhóm vi sinh vật chủ yếu tồn tại ở rễ và đất của cây trồng, được tìm thấy trong hầu hết các sinh cảnh trên toàn thế giới và trong khoảng 90% các loài thực vật [74] Mặc dù là nội cộng sinh bắt buộc nhưng mối quan hệ giữa nấm và thực vật được được coi là mối quan hệ “Hội sinh”, do nó mang lại lợi ích cho cả vật chủ và nấm Trước hết, nấm nhận được các sản phẩm quang hợp từ thực vật bằng cách sống cố định trong rễ của chúng và sau đó phát triển mạng lưới

hệ sợi nấm trong vùng bầu rễ để tạo thuận lợi cho việc hấp thụ các chất dinh dưỡng

và cung cấp các chất có lợi khác cho vật chủ, cạnh tranh với các vi khuẩn trong đất khác, đồng thời giúp thực vật tăng khả năng lấy nước và chất dinh dưỡng như phốt pho, lưu huỳnh, nitơ và các vi chất dinh dưỡng từ các sợi nấm tạo ra ngoài vùng rễ Ngoài ra, sự cộng sinh của nấm đã được chứng minh là giúp cho cây trồng có khả năng chống chịu được sự khô hạn hay đề kháng với một số tác nhân gây bệnh [55,57]

Cây ngô là nhóm cây chủ lực của Việt Nam, đứng thứ hai sau cây lúa Tuy nhiên, sự đa dạng nấm AMF trong đất trồng ngô ở Việt Nam cũng như mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô còn chưa được nghiên cứu nhiều Việc nghiên cứ sự có mặt của AMF trong đất trồng ngô sẽ góp phần làm rõ hơn về sự đa dạng của nhóm nấm này trên cây ngô Đồng thời, từ kết quả nghiên cứu có thể lựa chọn được những loài ưu thế, tìm hiểu được vai trò và có những đặc tính của AMF trong việc ứng dụng nâng cao năng suất cây trồng

Xuất phát từ những lý do nếu trên, đề tài “Nghiên cứu đa dạng thành phần

loài nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng ngô” được tiến

hành với các mục tiêu nghiên cứu sau:

1 Phân lập, phân loại các chủng nấm rễ nội cộng sinh từ đất trồng ngô tại Hà

Nội và Hà Nam

2 Đánh giá đa dạng thành phần loài của AMF trong các vùng sinh thái

nghiên cứu và mối tương quan giữa điều kiện môi trường sống tới sự đa dạng thành

phần loài của các chủng nấm rễ nội cộng sinh trên đất trồng ngô

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Nấm rễ nội cộng sinh

Nấm rễ (Mycorrhizal) là một hình thức sinh trưởng cộng sinh giữa thực vật

và nấm Đây là quần hợp nấm - thực vật được biết nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật cũng như nhiều hệ sinh thái, với hơn 90% các loài thực vật có quan hệ với nấm theo hình thức nấm rễ và phụ thuộc vào mối quan hệ này để tồn tại [67] Có hai loại nấm rễ: nấm rễ nội sinh và nấm rễ ngoại sinh [63]

Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhizal Fungi, AMF) là nhóm cộng

sinh bắt buộc với thực vật và thuộc ngành Glomeromycota

Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhizal) là sợi nấm bao quanh rễ dinh dưỡng chưa hóa gỗ, không xuyên qua mô tế bào mà chỉ kéo dài giữa các vách tế bào

Để phát triển, đầu tiên bào tử nấm thâm nhập qua tế bào vỏ của rễ cây, sau

đó màng sinh chất của tế bào chủ bao quanh sợi nấm, tạo ra những vòng xoắn của sợi nấm ở bên trong tế bào Nấm rễ cộng sinh vào rễ thực vật, hình thành hệ sợi, mở rộng thành mạng lưới vào đất xung quanh rễ và hình thành một mối liên kế cơ bản

và quan trọng giữa thực vật và môi trường xung quanh nó Sự nội cộng sinh nấm và

rễ cây thực chất là hình thức hỗ sinh Cả hai bên sử dụng chất dinh dưỡng trong mối quan hệ tương hỗ, nấm rễ giúp thực vật lấy dinh dưỡng như photpho, sulfur, nitrogen và các vi lượng từ đất Sự cộng sinh của nấm làm cải thiện khả năng hấp thụ và tuổi đời rễ, tăng cường hấp thu các dinh dưỡng đặc biệt là phốt phát và giảm khả năng nhiễm bệnh của cây [55,57] Các nấm này đồng thời cũng giảm những ảnh hưởng gây ra bởi các vi sinh vật nhiễm vào rễ, đất mặn, hay bởi nước tù [46]

1.2 Lịch sử nghiên cứu

Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên được Frank - nhà bệnh cây lâm nghiệp người Đức đưa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ) Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội

cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng được gọi là

“Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc

cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae

Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V) Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thường được quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A) Do vậy, tên gọi “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) được hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi

“Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [26]

Những nghiên cứu sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nấm AMF, còn sự hình thành thể V không thấy có mặt ở tất cả nấm nội cộng sinh Do vậy, loại hình cộng sinh này còn có tên gọi là “Arbuscular Mycorrhiza” tuy nhiên tên này vẫn chưa hoàn toàn thống nhất

Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 được tổ chức tại Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này Do vậy, trong các tài liệu được công bố sau này, thuật ngữ

“Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã được thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular - Arbuscular Mycorrhiza” bắt đầu từ năm 2008 [30]

1.3 Phương pháp phân loại nấm rễ nội cộng sinh

1.3.1 Phân lập bào tử nấm rễ nội cộng sinh

Nấm rễ nội cộng sinh có đặc điểm không thể nuôi cấy được trên các môi trường nuôi cấy thông thường mà chỉ có thể sinh trưởng phát triển trong rễ cây nên việc phân lập nấm rễ nội cộng sinh phải gián tiếp dựa vào sự có mặt của các bào tử trong đất xung quanh rễ thực vật Hay nói các khác, việc phân lập nấm rễ nội cộng sinh được thực hiện thông qua việc phân lập các bào tử của loài nấm này

Bào tử AMF phân bố rộng rãi trong lòng đất, từ bề mặt phía trên đến độ sâu 2,2m Tuy nhiên, 70-85% các bào tử là được tìm thấy ở lớp đất bề mặt 3-10 cm

[79] Do vậy, để phân lập AMF, lấy các mẫu đất đã được loại bỏ lớp bên ngoài (3

cm ở phía trên) để đảm bảo mật độ, cấu trúc quần thể nấm AMF không bị ảnh hưởng của các yếu tố (ánh sáng, nhiệt độ,…)

Để phân lập AMF, trước hết cần tách bào tử từ đất bằng phương pháp sàng ướt và lọc Phương pháp này được Gerdemann, 1963 đã cải biên cho phù hợp với nấm nội cộng sinh [38] Trên cơ sở đó, nhóm tác giả Daniel và Skipper, 1982 và tiếp sau đó tác giả Tommerup, 1992 đã cải tiến thành phương pháp sàng ướt (wet sieving) kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) [28,70]

Phương pháp tích cực và hiệu quả nhất thường được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu của Brundrett, 1996 là dùng sàng lọc với các kích cỡ màng khác nhau: 250µm, 100µm và 45µm đường kính lỗ sàng kết hợp với ly tâm ở các nồng

độ đường khác nhau [28] Bào tử AMF sau khi phân lập được phân loại dựa vào hình thái, kích thước theo khóa phân loại của Monton, 1988; Schenck và Pertez,

1990 [51,62]

1.3.2 Phân loại

1.3.2.1 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái học

Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trước hết phải kể đến việc hình

thành chi Endogone năm 1808 Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844 Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ

này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phương pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF

Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học) đã đưa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm tế bào chất [53] Tuy nhiên, khi áp dụng phương pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra

rằng nhóm Endogone có số lượng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh là Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong

đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) Với hệ thống phân loại của

Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Ấn Độ đã phân

lập từ đất vườn ươm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và

1 chi không cộng sinh (Endogone) [36]

Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đưa 5 loài AMF ra khỏi chi

Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [71], đến năm 1987 Walker cũng

đề xuất như trên [74] Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào

3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này được đặt trong bộ mới Glomales [52] Thông

thường, việc phân loại nấm rễ nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái

và cấu trúc của các loại bào tử Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton [51] Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang

áp dụng dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny đưa ra vào năm

1990 và được hoàn chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [52]

Năm 1998, Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan - ACT) đề nghị công nhận 2 chi

mới là Glomites và Jimtrappea Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT thường được

sử dụng ở các nước Châu Á

Năm 2008, Shipra Singh và cộng sự tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là

Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là Archacospora và Paraglomus [66]

Hiện nay, đặc điểm đặc trưng của nhóm nấm rễ nội cộng sinh đã được thống nhất là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lưới Hartig Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng ngăn (SEM) Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular)

Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại của Gerdemann, 1963) được thể hiện trong Bảng 1.1 [38]

Bảng 1.1 Phân loại AMF về hình thái học

ambisporum Hình cầu hoặc hình trứng Mầu nâu, nâu đậm 100-150 Thành bào tử mỏng

marcaropus Hình cầu hoặc hình

delicate có quả bào tử, hình cầu Có mầu nâu, nâu đậm 100-175 Thành bào tử dày

dilatata Hình cầu, có quả bào tử Có mầu nâu, đen 125-200 Thành bào tử dày,có nhiều lớp

myriocarpa Có quả bào tử, hình cầu hoặc gần

hình cầu

Có mầu nâu hoặc nâu

nhạt 120-175 Thành bào tử dày, có vách ngăn

bireticulata Hình cầu, dạng quả lê Có mầu nâu nhạt hoặc vàng nhạt 150-200 Thành bào tử dày, có 3-4 lớp

lacunose Hình cầu Có mầu nâu hoặc nâu

Thành bào tử mỏng,1-2 lớp

Entrophora colombiana

Hình cầu hoặc hình

trứng hoặc mầu vàng nhạt Có mầu nâu nhạt 120-200

Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 nhóm

schenckii Hình cầu ,hình tròn Có mầu nâu nhạt 150-200 Thành dày chia bào

Tên chi Tên loài Hình dạng Màu sắc Kích thước (µm) Đặc điểm

Glomites rhyniensis Hình cầu hoặc hình elip Có mầu nâu đậm 150-200

Thành bào tử có cấu trúc kiểu liên tiếp, gồm nhiều lớp

Gigaspora

candida

Bào tử thường có hình cầu và gần hình cầu, một số có hình elip

Có mầu nâu, nâu đậm, mầu nâu đỏ 120–160

Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 nhóm

albida Bào tử có dạng hình cầu, hoặc elip Có mầu vàng nhạt 120-150 cấu trúc nối tiếp, Thành bào tử có

gồm 3 - 5 lớp

9

1.3.2.2 Phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Các loài AMF khác nhau thường xuất hiện trong cùng một rễ Do vậy, việc phân loại bằng hình thái học trở nên cực kỳ khó khăn Khoảng 160 loài AMF đã được mô tả bằng các đặc điểm hình thái học của bào tử theo tạp trí Vesicular Arbuscular Mycorrhiza (INVAM) quốc tế [82] Tuy nhiên, trong tự nhiên, có sự khác biệt lớn về hình thái bào tử thậm chí trong một số loài AMF [75] và nhiều AMF chỉ có thể tái sinh sản mà không tạo ra bào tử [42] Phương pháp phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử là quá trình cần thiết trong việc phân loại và định danh nấm rễ nội cộng sinh mà không phụ thuộc vào các tiêu chí hình thái

Các chuỗi trình tự được sắp xếp bên trong (ITS) đã được sử dụng rộng rãi trong phân loại bằng kỹ thuật sinh học phân tử [56].Tuy vậy trình tự này có mức

độ biến đổi cao trong các loài AMF và ngay cả trong các bào tử đơn lẻ [47] Do

đó, sẽ rất khó để tìm ra các ITS đặc trưng cho tất cả AMF

Ngày nay, trong một số ít nghiên cứu đoạn 18S, 28S đoạn D1D2 và ITS được sử dụng để phân loại AMF, trong đó trình tự 18S vẫn là trình tự được dùng phổ biến cho nhóm nấm này [63] rRNA là công cụ thích hợp cho việc nhận dạng

và nghiên cứu phát sinh loài trong Các gen rRNA đã được sử dụng trong phần lớn các nghiên cứu về sinh học phân tử của AMF và cho kết quả tương đồng với cách phân loại về hình thái bào tử [65] Phản ứng khuếch đại PCR chọn lọc phụ thuộc nhiều vào tính đặc hiệu của mồi do vậy đã có nhiều nỗ lực nghiên cứu để thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho AMF Tuy nhiên, rất khó để có thể khuếch đại chính xác các trình tự từ một số nhóm AMF đã được mô tả gần đây và do đôi khi chúng khuếch đại nhầm sang DNA của các sinh vật khác Các mồi PCR cho các phân nhóm nhỏ hoặc các gen mục tiêu của AMF tương đối dễ thiết kế và đã được sử dụng thành công trong một số nghiên cứu [33] Vì vậy để nghiên cứu toàn diện về cấu trúc của toàn bộ hệ gen AMF và đa dạng sinh học đòi hỏi các mồi PCR phải đặc hiệu cho tất

cả AMF, và vẫn còn đang trong quá trình hoàn thiện Việc thiết kế mồi đòi hỏi một trình tự mới khi các thông tin của các trình tự AMF mới được cập nhật vào ngân hàng gen Nghiên cứu của Jaikoo Lee và cộng sự, cặp mồi AML1 và AML2 khuếch

10

đại gen 18S của rARN được công bố dùng để phát hiện và nhận dạng AMF Trình

tự mồi PCR đã được chứng minh có độ đặc hiệu tốt hơn và bao phủ được tất cả các loài AMF đã được biết đến [43]

1.4 Vai trò của nấm rễ nội cộng sinh đối với thực vật

1.4.1 Khả năng huy động nước và các chất dinh dưỡng

Hệ sợi nấm cộng sinh phát triển xung quanh vùng rễ giúp làm tăng diện tích

bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng của cây trồng Đối với các chất dinh dưỡng kém di động (như ion phốt phát, đồng, kẽm…), cây trồng hút các ion này nhanh hơn khả năng khuyếch tán của chúng trong dung dịch đất nên thường hình thành vùng hẹp cạn kiệt xung quanh rễ Khi đó, hệ sợi nấm nhanh chóng dài ra, vượt qua vùng cạn kiệt để đến với nơi có dinh dưỡng dễ phân giải Do

có đường kính nhỏ hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trong đất, kể cả các lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua được để thu nhận chất dinh dưỡng cung cấp cho cây Ví dụ, như trong trường hợp phốt pho bị cố định chặt, sợi nấm cộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các axít hữu cơ để sau đó có thể đổi chỗ cho phốt pho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại) bằng phản ứng trao đổi, hoà tan oxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung dịch, do vậy ngăn chặn được sự kết tủa của phốt phát kim loại Nấm cộng sinh Mycorrhiza còn giải phóng phốt pho vô cơ thông qua khoáng hoá chất hữu cơ (thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ) Các hình thức cộng sinh ở Ericoid Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quan trọng trong việc khoáng hoá nitơ Chỉ cần một lượng nhỏ AMF có thể huy động dinh dưỡng từ khối lượng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lượng lignin và tannin cao) [29,38,57,67]

1.4.2 Thu nhận hợp chất cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza

Dòng cacbon có thể theo một chiều từ cây xuống AMF hoặc theo chiều ngược lại do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất Dòng chảy cacbon từ cây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF xâm nhiễm vào rễ cây sẽ kích thích quá trình quang hợp hoạt động mạnh lên nhiều lần (trừ trường hợp ánh sáng quá yếu) Trong hệ sinh thái, dòng chảy cacbon xuống nấm và đất mang

độ phì nhiêu của đất [67]

1.4.3 Tăng sức chống chịu của cây trồng trong điều kiện bất lợi của môi trường

Ở cây nho, nước đóng vai trò rất quan trọng, nên việc thiếu hụt nước tưới gây ảnh hưởng rất lớn lên chất lượng của quả nho [46] Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chủng nấm rễ lên cây nho trồng trong điều kiện thiếu nước cho thấy, việc bổ sung nấm rễ giúp nho cải thiện tình trạng hút nước và chất dinh dưỡng Thêm vào

đó, khi môi trường đất bị nhiễm mặn và bị nhiễm kim loại nặng, nấm rễ sẽ hấp thu các kim loại năng hoặc muối và tích trữ chúng trong các túi vesicles bên trong rễ cây và có thể lưu trữ các ion muối như natri, clorua và các kim loại nặng [67] Trong môi trường đất khô nấm rễ giúp cây hấp thu nước bằng cách tăng cường tốc

độ thoát hơi nước so với những cây không có nấm rễ cộng sinh Allerm cho rằng tác dụng của nấm trong vùng khô hạn biểu hiện chủ yếu là làm tăng tính chịu hạn của cây và tăng nhanh tốc độ truyền nước trong cây Trước đó, vào năm 1982, Berea và cộng sự lại cho rằng tác dụng của nấm rễ là cải thiện kết cấu đất và nâng cao lượng nước trong đất từ đó làm tăng khả năng hấp thu nước cho cây [23]

1.4.4 Giúp cây chống chịu với bệnh hại

Nấm cộng sinh ở rễ cây có tác dụng bảo vệ cây chống lại một số vi sinh vật

cây bệnh như Phytophthora infestans (một loài tảo tương tự nấm), do Phytophthora infestans không thể xâm nhập qua hệ sợi nấm để lọt vào rễ [13] Ngoài ra, nấm còn

giúp ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi đan xen trong

rễ cây, sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic), cạnh tranh dinh dưỡng với vi sinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức đề kháng cho cây chủ Nấm rễ giúp cây trồng kháng được một số nguồn bệnh trong đất, tiết ra hệ thống đối kháng (induce plant systemic resistance) ngăn cản sự tấn công do một số vi khuẩn và nấm gây hại

12

từ trong đất, giúp chống lại bệnh bạc lá sớm trên cây cà chua do Alternaria solani

gây ra thông qua kích thích hoạt động của β-1,3-glucanase, chitinase, phenylalanine ammonia-lyase (PAL) và lipoxygenase (LOX) có trong lá cà chua [55,67] Năm

2003, Salem đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của nấm rễ và vi khuẩn vùng rễ cà chua lên sự ức chế với bệnh đốm lá của cây Kết quả cho thấy, khi chủng nấm rễ kết hợp

với vi khuẩn Pseudomonas làm tăng khả năng ức chế sự phát triển của bệnh và tăng

năng suất cà chua [59] Song và cs, 2010 đã kết luận rằng, sự cộng sinh của nấm rễ đối với cây bắp giúp cho cây tiết ra hợp chất 2,4-dihydroxy-7-methoxy-2 H-1,4-

benzoxazin-3(4 H)-one (Hx) đối kháng với bệnh cháy bìa lá do nấm Rhizoctonia solani và giúp cây bắp tăng trưởng [68]

1.4.5 Hấp thu lân

Deressa và Schenk (2008) nghiên cứu về cây hành tím Allium CepaL và báo

cáo rằng cây hành tím là loài thực vật có hệ thống rễ ngắn, không phân nhánh và mọc cạn trên bề mặt đất do đó bộ rễ của cây hành tím không thể hút được đầy đủ nguồn dưỡng chất trong đất đặc biệt là lân (P) và kết quả là năng suất của hành bị giảm [29] Nhờ có mối quan hệ cộng sinh với nấm rễ, cây hành có thể chống chịu được với điều kiện bất lợi của môi trường và gia tăng năng suất củ [24,38,44] Trong canh tác hành tím theo truyền thống thì năng suất của củ hành tím có tương quan rất lớn với sự cộng sinh của nấm rễ [34]

1.5 Tình hình nghiên cứu AMF trên thế giới

Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng như một cách lây nhiễm AMF và đã chứng minh được rằng cây trồng sẽ phát triển nhanh khi có mặt AMF [37] Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã chỉ ra rằng, việc nhiễm AMF làm tăng sinh trưởng của cây táo con từ chồi [53] Cho đến năm 1968, Gerdemann tiến hành thí nghiệm trên cây ngô và yến mạch cũng cho kết quả tương

tự [35] Tuy nhiên, những nghiên cứu về AMF này mới chỉ tập trung vào vấn đề ảnh hưởng của chúng đối với sinh trưởng cây trồng mà chưa đề cập nhiều đến giá trị AMF đã mang lại cho cây chủ

độ đất cao và nhiều nguyên nhân khác

Khi nghiên cứu số lượng AMF trong đất, Schuybert và cộng sự đã nhận thấy rằng: có sự thay đổi về số lượng bào tử AMF trên các loại đất khác nhau [64] Đồng thời với những nghiên cứu về phân loại, tách bào tử, cấu trúc AMF thì ảnh hưởng của AMF đối với sự sinh trưởng của cây cũng được quan tâm từ rất sớm Khi nhiễm

3 loài Gigaspora margarita, Glomus macrocarpum và Glomus caledonium cho cây

dâu tây, đã làm tăng đáng kể sinh khối và hàm lượng phốt pho trong cây, trong đó,

Gigaspora margarita có hiệu quả kích thích mạnh hơn 2 loài còn lại Năm 1982,

Dehne cũng phát hiện tác dụng kích thích sinh trưởng của AMF trên cây hành và cây ngô [28]

Đến năm 1989, nghiên cứu khác còn phát hiện thêm bên cạnh khả năng tăng sinh khối, tăng tỷ lệ thân/rễ thì việc nhiễm AMF còn làm tăng hoạt động của enzyme nitrogenase và tăng mức độ đồng hoá phốtpho của các cây họ đậu [73] Ngoài ra, Schonbeck và cs còn cho thấy: Thông qua hoạt động trao đổi chất của mình, AMF có ảnh hưởng đến Pyrophotphat (PPi) trong cây chủ, điều này cho thấy tác dụng rất lớn của AMF đối với toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển của cây chủ [61]

Năm 1983, Hayman đưa ra kết luận số lượng bào tử AMF trong đất là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ ưu thế của loài Trong đó ở đất canh tác, số lượng loài và số lượng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên [47] Mặt khác theo Friese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để xác định

số lượng bào tử [41]

14

Năm 1989, Schonbeck đã phân lập được 15 loài thuộc 3 chi khác nhau là: Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7 loài thuộc chi Glomus trong đất vùng rễ của cây táo Trong đất trồng trọt thường xuyên (đất trồng lúa nước, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác) luôn có số lượng bào tử AMF cao hơn nhưng thành phần loài của AMF lại thấp hơn so với trong đất tự nhiên Về khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF, Schonbeck và Dehne, 1989 đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là đậu, lúa mạch, lúa mì, cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dưa chuột, rau diếp, hồ tiêu đã nhận thấy, chúng làm giảm 40% các bệnh ở rễ thường gặp trên các loại cây chủ này Kết quả nghiên cứu về mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy

sự có mặt AMF đã làm tăng đáng kể lượng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm

Pseudomonas) [61]

Năm 1991, tác giả Friese và Koske cho rằng tất cả bào tử của AMF đều được phán tán một cách thụ động với những nhân tố tích cực là gió và động vật [32] Nhưng theo MacMahon và Warner thì ở những vùng khô hạn, gió là nhân tố quan trọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF [49] Còn với những nơi ẩm ướt, động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu [32]

Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả tương tự khi nghiên cứu khả năng chống bệnh ở các cây nhiệt đới có AMF (giảm 30 - 45% các tác nhân gây bệnh) [69]

Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và cộng sự, đã chứng minh hiệu quả của

AMF đối với bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra Đối với bệnh ở rễ gây ra

bởi tuyến trùng, AMF có thể cải thiện sức sống của cây chủ, từ đó hạn chế những thiệt hại về sản lượng, đặc biệt với những vùng đất có hàm lượng P2O5 thấp và cây được nhiễm AMF trước khi bị nhiễm tuyến trùng Như vậy, AMF có thể làm giảm nguồn bệnh hoặc giảm ảnh hưởng của bệnh ở rễ có nguyên nhân do nấm và tuyến trùng gây ra Tuy nhiên, tác dụng của AMF không thể hiện rõ đối với bệnh ở lá và bệnh do virus [21]

Trong nhiều năm qua, nấm nội cộng sinh AMF đã được nghiên cứu phổ biến rộng rãi ở khắp mợi nơi trên thế giới vì rằng việc sử dụng AMF trong nông nghiệp

P tốt hơn, việc sử dụng MAF, đặc biệt là AMF bản địa giúp chúng thâm nhập vào

hệ rễ tốt hơn Phương thức, cách thức bổ sung AMF cũng đã được các nhà khoa học nghiên cứu và công bố cho rằng bổ sung AMF trong giai đoạn phát triển trong giai đoạn sớm của ngô giúp việc hấp thu P sớm hơn, tăng cao năng suất cây trồng Hơn nữa, MAF có thể giúp cây hấp thu P và Zn ở khoảng < 15cm [45]

Việc bổ sung AMF vào đất chuyên canh ngô đóng vai trò quan trọng cho sự bền vững hệ sinh thái đất cũng như năng suất cây trồng Nếu trong vùng đất chuyên canh ngô, không bổ sung AMF trong một khoảng thời gian dài mà chỉ bổ sung phân bón hóa học NP sẽ làm giảm số lượng bào tử cũng như thành phần AMF bản địa [20,60] Năm 2013, Mobasser và Tavassoli đã nghiên cứu ảnh hưởng của nấm AMF tồn tại trong đất trồng ngô trong điều kiện khô hạn ở vùng Goharkouh - Iran cho thấy khi xử lý đất trồng ngô với 140kg AMF/ha và không xảy ra khô hạn (điều kiện

lý tưởng) thì số lượng hạt, năng suất sinh học, năng suất hạt và chỉ số thu hoạch là cao nhất Tuy nhiên, hàm lượng protein sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi bón 80kg AMF/ha và gây hạn hán tại thời điểm hoa cái nở được 20 ngày [50] Vamerali và cs, (2003) đã chỉ ra rằng, nếu ủ hạt ngô cùng AMF trước khi trồng sẽ tăng năng suất ngô bởi vì AMF giúp vận chuyển nước và chất dinh dưỡng tốt hơn sẽ giúp quá trình quang hợp tốt hơn và làm tăng năng suất cây trồng [72] Sajedi và Madani, (2006) cho rằng, trồng ngô có sử dụng AMF tăng năng suất cây trồng trong cả điều kiện đầy đủ nước và điều kiện khô hạn [58] Hajilau và cs, 2010 cho thấy, sử dụng AMF

16

có thể làm tăng năng suất hạt 5% [39] Đa dạng AMF trong đất trồng ngô cũng được nghiên cứu rộng rãi, chẳng hạn như: Ở Trung Quốc, năm 2008 Wang và cs đã nghiên cứu đa dạng AMF từ 90 mẫu đất nông nghiệp (trồng ngô, lúa mì hoặc cam ngọt) ở vùng tìm được 30 loài AMF [77]

1.6 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam AMF đã được nghiên cứu từ những năm 1976 đến nay và đã đạt

được một số kết quả nghiên cứu quan trọng

Nghiên cứu đầu tiên của Nguyễn Sỹ Giao (1976) là về sự có mặt của nấm ngoại cộng sinh ở rễ cây thông Nghiên cứu sử dụng nấm cộng sinh thuần chủng để tạo rễ nấm cho cây thông con, kết quả cho thấy sự vượt trội về chiều cao và đường kính của những cây được nhiễm nấm so với công thức đối chứng là 20 - 30%, đồng thời đã sử dụng nấm nội cộng sinh để phòng bệnh vàng còi ở thông con và cũng đạt được những kết quả nhất định [1, 2, 3]

Năm 1998, Phạm Quang Thu và cộng sự tiếp tục nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, trong đó được 37 loài nấm (thuộc 9 họ và 7 bộ) cộng sinh với 3

loài thực vật (thông nhựa Pinus merkussi, thông đuôi ngựa Pinus massoniana và thông caribe Pinus caribaea) Công trình này được coi như sự khởi đầu lại cho

những nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, đặc biệt trên đối tượng cây lâm nghiệp Kết quả không chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần loài nấm mà còn đi sâu hơn trong việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm nấm cộng sinh, ứng dụng rộng rãi trong gieo ươm cây con ở keo và bạch đàn Đây là một mốc quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh vì đã chủ động được nguồn nấm lây nhiễm thông qua các chế phẩm sinh học Giá trị của nghiên cứu này còn được thể hiện trong thực tiễn sản xuất tại tỉnh Vĩnh Phúc, sử dụng chế phẩm nấm cộng sinh đã cải thiện đáng kể tình hình sinh trưởng của cây trồng ở nhiều vùng đất đồi Về mối quan hệ giữa AMF với cây dược liệu, nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở việc thu thập mẫu bào tử nấm cộng sinh [15,16,17]

Năm 2004, Trần Văn Mão đã nghiên cứu hiệu quả của nấm VA - Mycorrhiza chủ yếu là nấm Glomus, về khả năng hấp thu dinh dưỡng P Hàm lượng P trong tế

17

bào rễ cây bắp có sự cộng sinh của nấm VA - Mycorrhiza tăng 35% đối với các loài

nấm Glomus mosseae và 98% đối với loài nấm Glomus fasciculatum Hàm lượng P

được tích luỹ trong rễ bắp ở dạng hỗn hợp phân tử P hữu cơ và acid hoà tan Hàng ngày P được di chuyển đến các bộ phận của cây bắp theo phương pháp động lực học, và phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng của cây [8]

Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức và cộng sự, khi tiến hành

nghiên cứu “Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) và quần thể vi

sinh vật trong đất trồng bưởi đặc sản Đoan Hùng, Phú Thọ” đã phát hiện sự có mặt của AMF trong tất cả các mẫu thu thập được nhưng tỷ lệ xâm nhiễm thấp chỉ đạt mức 3/5, khả năng nảy mầm của các bào tử nấm rễ bưởi thấp (chỉ đạt 16%) Trong một nghiên cứu khác, các tác giả đã sử dụng 3 loại cây ký chủ (ngô, cao lương, lúa mạch) và 3 chủng AMF để nhân bào tử và đưa ra kết luận: Khi nhân bào tử nhờ cây

ký chủ, mỗi loài cây ký chủ thích hợp cho một chủng nấm, riêng cao lương không thích hợp dùng làm cây ký chủ để nhân nhanh bào tử AMF, thời gian thu bào tử tốt nhất là 25 - 40 ngày sau khi cây ký chủ mọc [12,13,14] Các kết quả nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007) trên cây họ đậu cũng cho một số kết quả khả quan ban đầu [9,10] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu còn cho thấy AMF có thể cộng sinh vào các thực vật dược liệu [4], trên đất trồng chè [6], đất trồng bưởi Đoan Hùng [12,13]

Nghiên cứu mới đây của Phạm Quang Thu và Lê Quốc Huy về ảnh hưởng của chế phẩm AMF dùng cho cây trồng rừng cho thấy: sau 1 năm bón nhiễm chế phẩm AM đã làm tăng trưởng Keo tai tượng , Keo lá tràm từ 16,29 - 34,14% tùy từng loài và tùy từng địa điểm Bên cạnh đó , sau một năm bón nhiễm chế phẩm

AM, môi trường đất có xu hướng cải thiện về số lượng vi sinh vật đất tổng số , đặc biệt số lươ ̣ng bào tử AM trong đất tại hiện trường Đoàn Hùng tăng ma ̣nh đa ̣t 492 bào tử /100 gam đất, cao hơn đối chứng 112% [13]

Năm 2012, Trần Thị Như Hằng và cộng sự đã nghiên cứu đa dạng AMF trên cây lúa và cây cà chua và đã tìm thấy 5 chi: Scutellospora, Glomus, Acaulospora, Gigaspora, và Entrophospora [5] Trong đất và rễ cam tại Quỳ Hợp - Nghệ An,

18

Nguyễn Thị Kim Liên và CS (2012) đã điều tra từ từ 60 mẫu đất và rễ cam và đã phân lập được 16 loài AMF thuộc 6 chi: Acaulospora, Entrophospora, Glomus, Sclerocystis, Glomites và Gigaspora Sự phân bố của AMF ở các tầng đất khác nhau từ 0-20cm, 20-40cm, 40-60cm cho thấy có sự khác biệt rất lớn về sự phân bố của AMF giữa các giống cam và giữa các tầng phẫu diện Nghiên cứu còn cho thấy

có sự xâm nhiễm trở lại của AMF trên cây cam con, cây cam con được bổ sung bào

tử AMF có chiều dài rễ và số lượng rễ lớn hơn so với cây đối chứng [7]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu trên chủ yếu tập trung vào phân lập, phân loại và đánh giá thành phần các loài nấm rễ trên các cây nghiên cứu Tuy nhiên, trong các nghiên cứu của nhóm nghiên cứu Phạm Quang Thu và Lê Quốc Huy thì

đã nghiên cứu phát triển chế phẩm AMF cho cây lâm nghiệp, trong đó chú trọng đến cây thông và cây bạch đàn [17]

Mặc dù, AMF có quá nhiều lợi ích, song sản phẩm thương mại từ chúng chưa được phổ biến rộng rãi trên thị trường bởi vì có quá nhiều khó khăn trong các

kỹ thuật nuôi cấy nhân giống bào tử AMF Đặc biệt là phương pháp phân lập bào tử AMF Do vậy việc nghiên cứu tìm kiếm phương pháp phân lập bào tử để thu nhận nấm AMF, đồng thời đánh giá thành phần loài, mối tương quan và sự đa dạng về nấm AMF ở các khu vực là cần thiết và có ý nghĩa khoa học

1.7 Đặc điểm tự nhiên của địa điểm nghiên cứu

1.7.1 Đặc điểm tự nhiên của Duy Tiên – Hà Nam

Duy tiên Hà Nam là huyện nằm ở phía bắc của tỉnh Hà Nam, phía bắc giáp

Hà Nội Huyện có địa hình đặc trưng của vùng đồng bằng thuộc khu vực châu thổ Sông Hồng Nhìn chung địa hình của huyện khá thuận lợi cho phát triển sản xuất nông nghiệp, đặc biệt là trồng lúa và cây vụ đông (cây ngô, cây khoai tây và cây đậu tương…)

Mùa mưa: Bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10 với đặc trưng là nóng,

ẩm và mưa nhiều Hướng gió thịnh hành là gió Đông - Nam với tốc độ m/s Nhiệt

độ trung bình cao nhất 38ºC, lượng mưa từ 1.100-1.500 mm, chiếm 80% lượng mưa

cả năm

19

Mùa khô: Bắt đầu từ giữa tháng 11 cho đến cuối tháng 3 năm sau, có khí hậu lạnh, ít mưa Hướng gió thịnh hành là Đông – Bắc, thường gây lạnh đột ngột Nhiệt

độ trung bình thấp nhất là 15ºC

Lượng mưa: Lượng mưa hàng năm từ 1.800-2.000 mm, tập trung vào tháng

7, 8, 9 (chiếm 80% tổng lượng mưa trong năm)

Hình 1.1 Vị trí địa lý của Duy Tiên - Hà Nam trên bản đồ Duy Tiên có diện tích tự nhiên 12.100,35 ha Đất đai trong huyện chủ yếu được hình thành do quá trình bồi lắng của phù sa hệ thống sống Hồng và sông Châu Giang Theo nguồn gốc phát sinh có thể chia đất đai của huyện thành 3 nhóm chính: Nhóm Đất phù sa, với 6.679,0 ha (48,55% diện tích tự nhiên) đóng vai trò chính trong sản xuất nông nghiệp Đây là loại đất phân bố hầu hết ở các xã trong huyện, được sử dụng với nhiều cơ cấu cây trồng cũng như chế độ canh tác khác nhau

1.7.2 Đặc điểm tự nhiên của Thường Tín - Hà Nội

Thường Tín - Hà Nội là huyện nằm phía Nam của thành phố Hà Nội, trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa đặc trưng bởi mùa hè nóng, ẩm ướt, mưa to, mùa đông lạnh và ít mưa với diện tích là 2.193 km², lượng mưa trung bình hàng năm là

20

1.900 mm, nhiệt độ trung bình là 23.5°C Sự khác biệt khá cao giữa các vùng, mùa

hè ở đồng bằng đến 36-37°C, độ ẩm không khí trung bình hàng năm là 82 %

Hình 1.2 Vị trí địa lý của Thường Tín-Hà Nội trên bản đồ

Về thổ nhưỡng của huyện Thường Tín chủ yếu được bồi đặp bởi 2 con sông chính là sông Nhuệ và sông Hồng, được chia làm 5 loại chính:

Đất cát trắng: có diện tích khoảng 122,22 ha chiếm 0,96% tổng diện tích đất tự nhiên của huyện Đất phù sa trung tính gley: có diện tích khoảng 171,56 ha chiếm 1,34% Đất phù sa chua: có diện tích 6,059,48 ha chiếm 57,45% Đât phù sa trung tính gley: có diện tích 1.711.06 ha, chiếm 13.04% Đất phù sa gley chua: có diện tích khoảng 386,92 ha chiếm 3,03%

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nấm rễ nội cộng sinh được phân lập từ các mẫu đất đã trồng ngô được thu thập tại khu vực Duy Tiên - Hà Nam và Thường Tín - Hà Nội

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học

Thời gian nghiên cứu: 01/2016- 11/2017

2.3 Vật liệu và trang thiết bị

2.3.1 Nguyên vật liệu

30 mẫu đất đã được thu thập từ các cánh đồng ngô của Duy Tiên - Hà Nam (15 mẫu) và Thường Tín - Hà Nội (15 mẫu)

Bảng 2.1 Danh sánh mẫu đất trong nghiên cứu

Tính chất đất

N01 Đất cứng, giàu dinh dưỡng Đất cát, khô

N02 Đất cứng, giàu dinh dưỡng Đất cứng, ướt, giàu dinh dưỡng N03 Đất xốp, giàu dinh dưỡng Đất cát, khô

N04 Đất xốp, giàu dinh dưỡng Đất cát, khô

N05 Đất xốp, giàu dinh dưỡng Đất cứng, ướt, giàu dinh dưỡng N06 Đất cát, khô Đất xốp, ướt, giàu dinh dưỡng N07 Đất cát, ướt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N08 Đất cát, ướt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N09 Đất cát, ướt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N10 Đất cát, ướt Đất phù sa pha cát, tơi xốp N11 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N12 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N13 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N14 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt N15 Đất phù sa pha cát, khô Đất thịt, tơi xốp, vàng nhạt

2.3.2 Dụng cụ

- Nồi khử trùng - Lequex (France)

- Kính hiển vi - Olympus (Japan)

- Máy ly tâm (Germany)

Bước 2: Dùng xẻng (đã được vô trùng bằng cồn) đào lấy phần bầu đất quanh

rễ cây (ở độ sâu 3 - 20 cm) mỗi mẫu đất trồng ngô khoảng 500 gam Đào lấy rễ và đất từ từ để hạn chế đứt phần rễ non Mẫu đất sau khi được thu thập về phòng thí nghiệm được để khô tự nhiên trong bóng mát, sau đó được đựng trong hộp nhựa kín, bảo quản ở nhiệt độ thấp (2-5ºC) tối thiểu 4 ngày trước khi sử dụng cho phân tích hoặc nuôi cấy [37]

Bước 3: Khuấy đảo nhẹ nhàng các hạt trong chất lỏng đã đi qua sàng thô và cho phép các hạt nặng hơn lắng xuống trong vài giây

Bước 4: Tiếp tục lọc qua sàng 250μm

Bước 5: Rửa vật liệu giữ lại trên sàng để đảm bảo rằng tất cả các vật liệu có kích cỡ nhỏ hơn 250μm đã đi qua sàng

Lưu ý: có thể sử dụng sàng có kích thước khác nhau (100μm, 50μm) để sàng

và lặp lại các bước như ở trên để lấy bào tử có kích thước mong muốn

Bước 6: Chuyển phần vật chất dư lại trên sàng ở các kích cỡ khác nhau phía trên vào dung dịch đường nồng độ 30-50%

2.4.4 Phân loại nấm rễ nội cộng sinh

2.4.4.1 Phân loại AMF bằng phương pháp hình thái học

Chuẩn bị dung dịch Melzer [51,52]

Bước 1: Hoà tan 1,5g KI đến 20ml nước cất

Bước 2: Hòa tan 0,5g I2 trong dung dịch từ bước 1

Bước 3: Hoà tan 20g clorrat hydrat trong dung dịch từ bước 2

Bào tử được nhuộm bằng dung dịch thuốc thử Melzer Từng bào tử đơn độc

đã được quan sát, phân tích trước và sau khi nhuộm chất thử của Melzer dưới kính hiển vi Nhận biết bào tử dựa vào màu sắc bào tử, kích thước, bề mặt và cấu trúc vách, đối chiếu các mô tả và hình ảnh trong khóa phân loại của Bảo tàng nấm Mycorhiza Quốc tế của Đại học West Verginia (https://invam.wvu.edu/) và Schenck, Pertez, 1990 [62]

2.4.4.2 Lựa chọn các chủng nấm rễ nội cộng sinh có khả năng xâm nhiễm cao

Qua phân tích hình thái học, tiến hành lựa chọn các bào tử AMF có tần xuất bắt gặp cao nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo [37]

2.4.4.3 Phân loại AMF bằng kỹ thuật sinh học phân tử

a Tách ADN

- Hút từng bào tử đơn độc vào ống eppendorf, dùng đầu côn phá vỡ bào tử

- Bổ sung 70µl đệm phá vỡ tế bào (100mM Tris-HCl (pH=8.0), 20mM

Na2EDTA, 0.5 M NaCl và 1% sodium dodecylsµlfat)

- Sau đó thêm 70µl CI (hỗn hợp chloroform: isoamylacohol = 24:1); li tâm thường 15000 vòng/ 5 phút Lặp lại 2 lần bước này

- Hút ra 70µl dịch phía trên lớp huyền phù ra 1 ống eppendorf mới Thêm 70µl isopropanol và 7µl sodium acetate 3M rồi bảo quản mẫu ở -20°C trong 2 giờ Sau đó tiến hành li tâm lạnh 15000 vòng/15 phút để thu lấy kết tủa

- Thêm 500µl ethanol 70%, li tâm lạnh 15000 vòng/15 phút (lặp lại bước này

2 lần) Loại bỏ cồn, để khô tự nhiên

- Thêm 50µl MQ để trong tủ -20oC dùng cho các bước thí nghiệm tiếp theo

b Khuếch đại ADN

Nhân đoạn ARN 18S dùng cặp mồi NS1 (5‟-GTA GTCATA TGC TTG TCT C-3‟) và NS4 (5‟-CTT CCG TCAATT CCT TTA AG-3‟) (White và cs, 1990) Tiếp

theo đó chúng tôi tiến hành PCR lồng (nested RCR) bằng mồi AML1 (5‟-ATC

AAC TTTCGA TGG TAGGAT AGA-3‟) và AML2 (5‟-GAACCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3‟) đặc hiệu cho AMF để nhân đoạn gen AML của chúng (Jaikoo Lee

và cs, 2008) DNAr đƣợc khuếch đại trên máy GeneAmo PCR System 9700 (Appiled Biosystems), với các chu trình nhiệt nhƣ sau: đầu tiên ADN bị biến tính thành sợi đơn ở 94oC trong 3 phút, sau đó ADN đƣợc nhân đoạn ở 35 vòng, chu trình nhiệt nhƣ sau: (1) giai đoạn biến tính ADN thành sợi đơn ở 94oC trong vòng

30 giây, (2) giai đoạn bắt cặp - các cặp mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào 2 đầu của ADN đích: 50oC trong 60 giây, (3) cuối cùng nhiệt độ đƣợc nâng lên ở 72oC trong 1 phút nhiệt độ thích hợp cho enzyme Taq polymerase hoạt động; kết thúc nhân đoạn ADN: nâng nhiệt độ lên 72oC trong 5 phút, sau đó giảm xuống 4oC, giữ mẫu ở nhiệt độ

này Thành phần và chu kỳ của phản ứng PCR đƣợc thể hiện ở Bảng 2.2 và Bảng 2.3

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR

Mẫu được chuyển sang ống eppendoft 1,5ml Thêm 5µl EDTA 1,25M, thêm

60µl ethanol 100% Trộn nhẹ nhàng Giữ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ly tâm

15000 vòng/phút trong 10 phút Đổ bỏ dịch phía trên Rửa bằng 10µl ethanol 70%

Ly tâm 15000 vòng/phút trong 10 phút Làm khô mẫu bằng máy cô quay chân không trong 3-5 phút

d Điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Quá trình điện di các sản phẩm của phản ứng PCR được thực hiện trên thạch agarose trong đệm TAE Đun tan 0,8 % agarose trong dịch TAE (1x) (dung dịch 50x TAE: 2ml; nước cất: 98ml; agarose: 0,8g) để ấm, đổ vào khuôn đã cắm lược, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di Lấy 1µl dung dịch dye, trộn đều với 3µl mẫu, nhỏ vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch ethidium bromua (nồng độ 0,5µl/ml) trong 20 phút, vớt ra quan sát Quan sát trên

máy soi gel

e Phân tích trình tự gen

Trình tự ADNr của AML được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động (3100 Avant, ABI, Mĩ) Kết quả đọc trình tự được so sánh với các trình tự của các loài đã được xác định trong ngân hàng gen bằng chương trình BLAST

(www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây phả hệ đƣợc xây dựng bằng phần mềm Clustal X phiên bản 1.8 và NJ-tree [78]

2.4.4.4 Phương pháp phân tích số liệu thống kê

Tần suất xuất hiện (TSXH) của chi/loài đƣợc tính theo công thức [37]:

TSXH % = (số lƣợng mẫu xuất hiện chi/loài nấm nghiên cứu/tổng số mẫu nghiên