Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của một số chủng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp tây nguyên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Như Trang NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ SI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Như Trang

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY BỆNH CÔN TRÙNG Ở HỆ

SINH THÁI NÔNG NGHIỆP TÂY NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh

Hà Nội - 2014

i

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Ngọc Châu, PGS.TS Nguyễn Văn Vịnh, những người thầy đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo và cán bộ nghiên cứu Phòng Tuyến trùng học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể thực hiện được đề tài nghiên cứu luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS Lê Thị Mai Linh, Phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, làm việc tại phòng Tuyến Trùng học - Viện Sinh thái

và Tài nguyên sinh vật, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp về mặt kỹ thuật phân

tử và các ý kiến tư vấn hết sức hiệu quả trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm cùng tập thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, nói chung và Bộ môn động vật không xương sống nói riêng đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ

để tôi hoàn thành được chương trình khóa học

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè những người luôn bên cạnh giúp đỡ, là chỗ dựa tinh thần để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2014

Tác giả

Nguyễn Như Trang

ii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) 4

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu: 4

1.1.2 Đặc điểm hình thái 11

1.1.3 Đặc điểm sinh học 14

1.2 Khả năng ứng dụng của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại 16

1.2.1 Trên thế giới 16

1.2.2 Tại Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 22

2.2 Đối tượng nghiên cứu 22

2.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tuyến trùng 23

2.4.2 Phương pháp phân loại tuyến trùng dựa trên trình tự 18S – rDNA 25

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của EPN 29

2.4.4 Phương pháp xác định độc lực của EPN 30

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đặc điểm hình thái 32

3.2 Đặc điểm sinh học phân tử (đoạn 18S-rDNA và đoạn D2-D3, thuộc 28S-rDNA) 38

3.2.1 Kết quả PCR 38

3.2.2 Kết quả giải trình tự gen 39

iii

3.2.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của tuyến trùng 42

3.3 Một số đặc điểm sinh học của tuyến trùng 44

3.3.1 Thời gian sinh trưởng và phát triển của tuyến trùng trong G melonnella 44 3.3.2 Khả năng sinh sản của tuyến trùng trong ấu trùng G mellonella 45

3.3.3 Hiệu lực gây chết của tuyến trùng S-DL13 đối với ấu trùng BSL 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ: 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 58

Bướm sáp lớn (Galleria mellonella)

Phòng trừ sinh học

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Mối quan hệ họ hàng của các loài Steinernema phân lập ở Việt Nam

(Phan Ke Long, 2004) 10

Hình 1.2: Hình chụp từ kính hiển vi điện tử của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis (Theo Nguyễn Ngọc Châu, 2008) 12

Hình 1.3: Vòng đời của các loài Heterorhabditis and Steinernema trên bọ hung ( Gaugler, Brown, Shapiroilan & Atwa , 2002) 15

Hình 3.1: Ảnh chụp hiển vi của con đực Steinernema siamkayai thế hệ 1 33

Hình 3.2: Ảnh chụp hiển vi của con cái Steinernema siamkayai T 34

Hình 3.3: Ảnh chụp hiển vi của ấu trùng cảm nhiễm Steinernema siamkayai 35

Hình 3.4a: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 18S 38

Hình 3.4b: Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen D2D3 38

Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại gen 18S của mẫu nghiên cứu với các loài khác trên genbank theo phương pháp ME 43

Hình 3.6: Cây phát sinh chủng loại gen D2-D3 của mẫu nghiên cứu với các loài khác trên genbank theo phương pháp ME 44

Hình 3.7: Ấu trùng cảm nhiễm phát tán ra khỏi vật chủ 45

Hình 3.8: Đồ thị tương quan giữa sản lượng IJs và số lượng IJs gây nhiễm ban đầu của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL 47

Hình 3.9: Đồ thị tương quan giữa tỷ lệ ấu trùng BSL chết và số lượng gây nhiễm ban đầu của chủng S-DL13 49

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Danh sách các chế phẩm sinh học BIOSTAR 20

Bảng 1.2 Áp dụng phòng trừ sâu hại ở một số địa phương 20

Bảng 2.1 Các mồi đặc hiệu cho PCR 26

Bảng 2.2: Thành phần hỗn hợp cho PCR 26

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 26

Bảng 2.4: Thành phần hỗn hợp phản ứng xác định trình tự DNA 28

Bảng 2.5: Chu trình nhiệt của phản ứng xác định trình tự DNA 29

Bảng 3.1: Các chỉ số đo của loài S siamkayai ở Việt Nam 36

Bảng 3.2: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự đoạn gen 18S trên Genbank 40

Bảng 3.3: Bảng ma trận khoảng cách di truyền của mẫu nghiên cứu với các trình tự gen D2-D3 trên Genbank 41

Bảng 3.4: Khả năng sinh sản của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL 46

Bảng 3.5: Hiệu lực gây chết ấu trùng BSL của chủng S-DL13 48

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có sự đa dạng phong phú

về các loài thực vật, động vật và có nền nông nghiệp phát triển Tuy nhiên, điều kiện khí hậu trên cũng là điều kiện tốt để sâu bệnh hại phát sinh, phát triển quanh năm Có thể nói, đây là một trong những trở ngại lớn nhất trong sản xuất nông nghiệp của nước ta Hàng năm, các côn trùng gây hại làm giảm đến 40-50% sản

lượng của sản xuất nông nghiệp (Phạm Văn Lực et al, 1999)

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân đã sử dụng rất nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học khác nhau, mặc dù đem lại hiệu quả nhanh, dễ sử dụng, giá thành thấp, nhưng lại gây ra những hậu quả tiêu cực đối với môi trường sống, gây hại đến sức khỏe người và động vật nuôi, đồng thời tạo nên tính kháng thuốc của nhiều loài dịch hại Đặc biệt, thuốc hóa học còn tiêu diệt nhiều loài sinh vật có ích làm giảm tính đa dạng trong tự nhiên gây mất cân bằng sinh thái

Hướng đến phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, vật nuôi và các sinh vật có ích, đảm bảo được tính đa dạng sinh học và tính cân bằng sinh thái trong tự nhiên, việc nghiên cứu lựa chọn biện pháp phòng trừ tổng hợp trong đó có biện pháp sinh học đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm đặc biệt, được nghiên cứu, phát triển rộng rãi nhằm hạn chế sử dụng và tiến tới thay thế một phần thuốc hóa học trừ sâu được dùng trong nông nghiệp hiện nay Hiện nay, phương pháp phòng trừ sinh học, đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tế, một số kết quả đạt được như sử dụng thiên địch tự nhiên như ong mắt đỏ ký sinh, bọ rùa, bọ xít bắt mồi, nhện bắt mồi ăn thịt,… để không chế dịch hại Ngoài ra vi khuẩn, nấm và virut đa nhân cũng đã được nghiên cứu, ứng dụng cho phòng trừ sâu hại cây trồng Đặc biệt gần đây, các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng cũng được nhanh chóng nghiên cứu, áp dụng trong phòng trừ sâu hại Tuyến trùng ký sinh gây bệnh cho côn trùng (EPN) thực chất là những tổ hợp cộng sinh giữa các loài tuyến trùng ký sinh

thuộc giống Steinernema (Họ Steinermatidae) và Heterorhabditis (Họ Heterorhabditidae) và các loài vi khuẩn gây bệnh giống Xenorhabdus và

2

Photorhabdus Trong đó, tuyến trùng đóng vai trò vừa là ký sinh lại là những vector

mang truyền vi khuẩn gây bệnh Chính vì vậy mà nhóm tuyến trùng này trở thành tác nhân sinh học có nhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học sâu hại như: phổ diệt sâu hại rộng, khả năng diệt sâu nhanh, có khả năng tự sản sinh tăng số lượng sau khi đã giết chết sâu hại và có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ sinh học thích hợp

in vivo và in vitro

EPN đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi và thương mại hóa như những chế phẩm sinh học ở nhiều nước như Mỹ, Úc, Canada, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan [2] Mặc dù nghiên cứu EPN ở Việt Nam chỉ mới được triển khai vài thập niên gần đây, nhưng các kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn tài nguyên EPN phong phú và đa dạng, đồng thời đã đạt được một số kết quả quan trọng trong việc điều tra phân loại và nghiên cứu, tuyển chọn các chủng tuyến trùng có tiềm năng sinh học đưa vào sản xuất sinh khối và ứng dụng vào thực tiễn trong phòng trừ sinh học sâu hại [3, 5] Tuy nhiên, hầu hết các chủng EPN ở Việt Nam chỉ tồn tại ở các hệ sinh thái rừng tự nhiên, rất ít các chủng EPN được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Vì vậy, việc điều tra phân lập nhóm tuyến trùng này trong các hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên là rất cần thiết

Để có thêm dẫn liệu về tuyến trùng trong các hệ sinh thái nông nghiệp, chúng

tôi tiến hành đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân tử của

một số tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên ” với các mục đích sau:

Xác định đặc điểm hình thái và phân tử của EPN ở hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên

Đặc trưng sinh học và tiềm năng sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học

Do hạn chế về thời gian và phạm vi nghiên cứu rất rộng, nên chúng tôi tập trung nghiên cứu và xác định các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng – EPN trong hệ sinh thái cây công nghiệp trong hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên, cụ thể tập trung với 2 loại cây công nghiệp chủ lực là cà phê và hồ tiêu

3

Đề tài luận văn đã cung cấp dẫn liệu về đặc điểm hình thái và phân tử của

chủng tuyển trùng S-DL13 thuộc loài tuyến trùng Steinernema siamkayai được phân

lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên Một số dẫn liệu sinh học về sinh trưởng, phát triển và độc lực học cũng như khả năng sinh sản của tuyến trùng trên

côn trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) bước đầu cũng được cung cấp và thảo

luận

4

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát chung về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu:

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (Entomopathogenic nematode - EPN)

là những loài giun tròn có ích ký sinh ở những loài côn trùng, làm suy yếu hoặc giết chết những côn trùng vật chủ này, nhưng lại rất an toàn đối với người, động vật và

thực vật Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng thuộc 2 giống Steinernema và

Heterorhabditis, thuộc 2 họ khác nhau: giống Steinernema thuộc họ

Steinernematidae và Heterorhabditis thuộc họ Heterorhabditidae của ngành giun

tròn (Nematoda)

Hệ thống phân loại của nhóm tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng dựa trên

hệ thống phân loại của De Ley et al., 2002 [18], Hunt, 2007 [24], như sau:

Giống: Steinernema Travassos, 1927 Giống: Neosteinernema Nguyen & Smart, 1994

Phân bộ: Rhabditina Chitwood, 1933 Dưới phân bộ: Rhabditomorpha De Ley & Blaxter, 2002 Liên họ: Strongyloidea Baird, 1853

Họ: Heterorhabditidae Poinar, 1976

Giống Heterorhabditis Poinar, 1976

Trên thế giới, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng được biết đến từ những năm 1923 khi Steiner lần đầu tiên mô tả một giống và loài tuyến trùng mới

phát hiện ra một loài mới thuộc một giống mới có khả năng ký sinh gây bệnh trên

côn trùng là loài Heterorhabditis bacteriophora thuộc giống Heterorhabditis Sau

đó giống Neosteinernema Nguyen & Smart, 1994 [27] đã được mô tả thêm cho

nhóm EPN Năm 2000, Ganguly và Singh đã phân lập một loài tuyến trùng kí sinh

gây bệnh côn trùng mới, Steinernema thermophilum từ vùng nông thôn ở New Delhi, Ấn Độ Năm 2001, Steinernma pakistanense được Shahina et al., mô tả là

loài mới Loài này được tìm thấy trong các mẫu từ các vùng khác nhau của Pakistan Năm 2004 Mutsuhiro Yoshida đã nghiên cứu và mô tả 1 loài EPN mới,

Steinernema litorale đã được phân lập từ các mẫu đất cát ở Nhật bản Năm 2005

Qiu et al., đã nghiên cứu và mô tả một loài EPN mới là Steinernema akhursti được

thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Yunan, Trung Quốc Năm 2006 Khương B Nguyễn

đã nghiên cứu một loài EPN mới, Steinernema khoisanae được mô tả từ Nam Mỹ

Những chủng phân lập và mô tả của các loài EPN khác nhau được tăng lên nhanh chóng trên thế giới trong thập kỷ này nhờ sự trợ giúp của kỹ thuật phân tử Hunt

(2007) [24] đã tổng kết có 55 loài Steinernema, 11 loài Heterorhabditis và một loài

Neosteinernema có giá trị trong nhóm EPN Đến nay, ít nhất có thêm 20 loài Steinernema đã được mô tả thêm sau Hunt (2007) đó là: S australe Edgington et

cholashanense Nguyen et al., 2008 S colombiense López-Núñez et al., 2008 S costaricense Uribe-Lorío et al., 2007 S ichnusae Tarasco et al., 2008 S puntauvense Uribe-Lorío et al., 2007 S texanum Nguyen et al., 2007 S unicornum

Edgington et al., 2009 S xueshanense Mráček et al., 2009 S schliemanni

6

Spiridonov et al., 2010; S pui Qiu et al., 2011; S vulcanicum Clausi et al., 2011; S

Khatri-Chhetri et al., 2011

Năm loài thuộc giống Heterorhabditis được mô tả sau Hunt, 2007, bao gồm:

H georgiana Nguyen et al., 2008; H gerrardi Plichta et al., 2009; H safricana

Malan et al., 2008; H sonorensis Stock et al., 2009 và H atacamensis Edgington

et al., 2010

Trong phân loại tuyến trùng, phương pháp mô tả đặc điểm hình thái đã được các nhà khoa học sử dụng như một công cụ hữu ích trong việc phân loại các loài tuyến trùng [3] Tuy nhiên, do đặc thù các chủng EPN đa số là các loài đồng hình và các chỉ số phân loại chồng lấn với nhau giữa các loài gần gũi Vì vậy, những nhầm lẫn trong mô tả hình thái là khó tránh khỏi Do đó, đi đôi với việc mô tả các đặc điểm hình thái, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật phân tử trong phân loại tuyến trùng, giúp cho việc định loại đến loài chính xác hơn Những đặc trưng phân tử khác biệt sẽ làm sáng tỏ loài và các nhóm, tiếp theo có thể nghiên cứu các đặc điểm hình thái để phân biệt chúng Một số kỹ thuật phân tử đã được sử dụng trong định loại EPN như: isozyme, protein tổng số hay kỹ thuật miễn dịch và phương pháp nghiên cứu dựa trên PCR-RFLP được sử dụng rộng rãi cho định loại tuyến trùng Những kỹ thuật hiện đại hơn cũng đã được áp dụng như phương pháp RAPD có thể được sử dụng để định loại chủng Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự DNA là phương pháp tỏ ra ưu việt hơn cả về phương diện yếu tố kỹ thuật và phạm vi áp dụng trong hệ thống học cũng như phát sinh chủng loại Giải trình tự DNA vừa đạt được độ nhạy cao nhờ được nhân bản qua PCR, hơn nữa lại là phương pháp chính xác nhất nhờ khảo sát trực tiếp trình tự nucleotide của phân tử mang thông tin di

truyền Hominick et al., (1996) đã đề xuất kỹ thuật phân tử dựa trên các đặc điểm

phân tử của các loài giúp cho việc phân loại đến loài và nhóm loài chính xác hơn Phương pháp này sử dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng gen ITS-rADN của tuyến

7

trùng rồi sau đó giải trình tự và so sánh trình tự giữa các loài với nhau Cho đến nay, phương pháp này được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu về các loài tuyến trùng mới Dựa trên các dữ liệu về hình thái và phân tích vùng ITS của rDNA

Nguyen et al (2004) đã công bố hai loài tuyến trùng mới trong là Heterorhabditis

mexicana phân lập ở Mexico [28] và loài Steinernema yirgalemense phân lập từ

Yirgalem (Nguyen et al., 2004) [29]

Năm 2004, Spiridonov et al sau khi phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại vùng gen ITS1-5.8S-ITS2 của rADN của các loài tuyến trùng Steinernema đã

phân chúng ra thành 5 nhóm có mối liên hệ về hình thái ấu trùng cảm nhiễm: (i)

Nhóm „carpocapsae-scapterisci-tami‟ với chiều dài IJs nhỏ hơn 600μm, có 13 loài (ii) Nhóm „affine-intermedium’ với chiều dài cơ thể IJs từ 600-700μm, nhóm này

có 3 loài (iii) Nhóm „feltiae-kraussei-oregonense‟ với chiều dài cơ thể IJs từ 1000μm, nhóm này có 21 loài (iv) Nhóm „arenarium-glaseri-karii-

700-longicaudum‟ với chiều dài cơ thể IJs lớn hơn 1000μm, nhóm này có 11 loài (v)

Nhóm „bicornutum-ceratophorum-riobrave‟ có cấu trúc mấu đôi ở vùng môi IJs,

nhóm này có 7 loài

Bên cạnh đó việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn vùng ITS-rDNA (RFLP) cũng được sử dụng làm sáng tỏ sự khác nhau giữa các loài EPN với nhau cũng như

giảm thời gian tiến hành phân tích trình tự đoạn ITS-rDNA Năm 2001, Hussaini et

al đã sử dụng phương pháp RFLP khuếch đại PCR vùng trình tự ITS-rDNA với 17

enzym giới hạn để phân biệt 3 loài tuyến trùng Steinernema: Steinernema tami (Việt Nam), S abbasi (Oman) và 1 loài chưa được mô tả Steinernema sp SSL2 từ Sri Lanka [13] Sekcuk Hazir et al (2003) công bố loài mới, Steinernema anatoliense,

dựa trên sự khác biệt về hình thái cũng như phân tích lai chéo và phân tích RFLP

vùng ITS-rDNA của loài này với 50 loài Steinernema khác [36] Phan et al., 2001

và 2004 [10,32] cũng khẳng định dùng enzyme giới hạn cũng phân biệt rõ ràng giữa các loài gần gũi

Trong những năm gần đây, trình tự gen vùng D2/D3 của 28S rDNA cũng được cũng được kết hợp với vùng ITS rDNA làm sáng tỏ quan hệ phát sinh chủng

8

loại giữa các loài EPN Bên cạnh đó giúp cho việc so sánh di truyền giữa các loài

được dễ dàng hơn Năm 2005, bằng việc xác định trình tự của chuỗi 28S rDNA và

kết quả kiểm tra lai chéo [34] đã công bố loài mới là Steinernema akhursti được thu thập từ các mẫu đất tại tỉnh Yunan, Trung Quốc Nguyen et al (2006) đã nghiên cứu một loài EPN mới, Steinernema khoisanae được phân lập từ Nam Mỹ [31]

Steinernema khoisanae được mô tả về mặt di truyền bởi các trình tự của các vị trí

đệm và các vùng D2/D3 của 28S rDNA Cây phát sinh phả hệ cho thấy S khoisanae

và các thành viên khác của nhóm S glaseri thuộc một nhánh phát sinh Cutler và

Stock [17] cũng dựa trên trình tự gen 28S rDNA kết hợp với đặc điểm về hình thái

để công bố loài Steinernema websteri mới ở Trung Quốc, bên cạnh đó còn đưa dữ liệu phân tích RFLP vùng ITS với một số loài Steinernema khác

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng đã được Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh tiến hành từ năm 1997 [4] và đến nay đã đạt được một số thành tựu đáng kể trong việc phân lập, tuyển chọn các chủng tuyến trùng bản địa cho phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng [6] Các nhà khoa học đã điều tra, phân lập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, mô tả cơ chế xâm nhập và phát triển của EPN Một số loài EPN đã được nghiên cứu về khả năng diệt sâu hại để ứng dụng trong thực tiễn phòng trừ sinh học Đến nay, các nhà khoa học Việt Nam đã phân lập được hơn 70 chủng EPN từ các vùng sinh thái khác nhau [7] Kết quả phân loại đã xác định được 11 loài, trong đó có 9 loài thuộc

giống Steinernema là S tami, S sangi, S thanhi, S loci, S robustspiculum, S

cumgarense, S eapokense, S sasonense, S backanense, và 2 loài thuộc giống Heterorhabditis là H indica và H baujardi

Phan Ke Long et al., (2001) đã nghiên cứu và mô tả 2 loài tuyến trùng mới thuộc giống Steinernema (Rhabditida): Steinernema loci và S thanhi được phân lập

từ các mẫu đất bãi biển ở 2 tỉnh Thanh hóa và Hà Tĩnh Sự kết hợp các nghiên cứu

về hình thái học và dữ liệu phân tích rDNA-RFLP cho thấy sự khác biệt của 2 loài

này với các loài Steinernema khác Các đặc điểm hình thái ấu trùng cảm nhiễm tuổi

3 của Steinernema loci gồm: chiều dài cơ thể từ 896 - 1072 μm, khoảng cách từ đầu

9

đến lỗ bài tiết từ 71 - 86 μm, chiều dài đuôi từ 66 - 83 μm, 9 đường bên riêng biệt

Các đặc điểm hình thái ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema thanhi gồm: chiều dài

cơ thể 720-960 μm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết 68-84 μm, chiều dài đuôi

52-72 μm, 9 đường bên Phân tích RFLP cho thấy Steinernema thanhi có thể phân biệt

từ loài S arenarium bởi 9 enzym giới hạn, từ loài S glaseri bởi 11 enzym, và 4 enzym từ loài S loci

Bằng việc mô tả các đặc trưng về sinh thái và phân tích RFLP vùng trình tự

ITS r-DNA, Phan Ke Long et al., (2001) đã đưa ra 1 loài tuyến trùng Steinernema mới được thu thập tại tỉnh Thanh hóa, S sangi Loài mới này có một đặc điểm tương đồng với loài S kraussei là ấu trùng cảm nhiễm cùng có 8 đường bên, nhưng

chiều dài cơ thể lại ngắn hơn (753 và 951 μm), khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết ngắn hơn (51 và 63 μm), chiều dài gai giao cấu dài hơn (63 và 49 μm) Việc phân tích RFLP cũng cho thấy sự khác biệt giữa 2 loài này bởi 9 enzym giới hạn

Phan Ke Long et al., (2003) đã nghiên cứu sự phân bố của các chủng tuyến

trùng thu được Xác xuất bắt gặp tuyến trùng trong các mẫu đất thu được là không cao (44 mẫu có 1 chủng EPN trong tổng số 910 mẫu đất)

Trong đó giống Heterorhabditis bắt gặp ít hơn so với giống Steinernema (12

và 32 loài) H indica là loài phổ biến nhất ở Việt Nam Trong số 32 loài của

Steinernema ở Việt Nam thì có 4 loài mới cho khoa học (S tami, S sangi, S thanhi

và S loci) Cũng trong năm 2003 Phan Kế Long và cộng sự đã dựa trên những đặc

điểm sinh học và phân tích RFLP vùng trình tự ITS để công bố loài mới

Heterorhabditis baujardi Loài mới này có quan hệ gần gũi với H indica

Phan Ke Long (2004) đã sử dụng phương pháp Maximum parsimony để xây

dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên các kết quả nghiên cứu về hình thái và giải

mã vùng ITS-rADN của 29 loài thuộc chủng Steinernema thu được tại Việt Nam

Các loài này được chia thành 5 nhóm (Hình 1)

10

Hình 1.1: Mối quan hệ họ hàng của các loài Steinernema phân lập ở Việt

Nam (Phan Ke Long, 2004) Nguyễn Ngọc Châu, 2008 mô tả đặc điểm sinh học của các loài tuyến trùng ở Việt Nam Tác giả cũng đã xây dựng khóa định loại các loài tuyến trùng của Việt Nam [3]

11

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Giống Steinernema Travassos, 1927

Theo Adam & Nguyen (2002) [19] và Hunt, 2007 [24] giống Steinernema có

đặc điểm hình thái như sau:

Con cái: Kích thước cơ thể con cái thế hệ 1 lớn và cong về phía bụng khi xử lý

bằng nhiệt Lớp vỏ cutin nhẵn Đường bên không có Đầu tròn và ngắn, hiếm khi tách biệt với đường viền cơ thể Đỉnh đầu có 6 môi, các môi này có thể tách biệt hoặc đôi khi chúng có thể hợp với nhau ở phần gốc Tương ứng với mỗi môi là một nhú môi Trên đỉnh đầu có 4 nhú đầu Hai cơ quan thụ cảm hóa học (amphids) nhỏ, nằm đối xứng và lùi về phía sau nhú môi Xoang miệng ngắn và rộng, hình phễu, vách xoang miệng được kitin hóa tương đối mạnh, lỗ miệng hình tam giác Thực quản rõ ràng, phần trước thực quản thường có dạng hình trụ, diều giữa thực quản hơi phồng, phần eo thắt không điển hình, phần gốc thực quản hình quả lê, van thực quan tiêu giảm Vòng thần kinh rõ và thường nằm ở phần eo thắt hoặc phía trước gốc thực quản Lỗ bài tiết rõ ràng nằm trước vòng thần kinh Âm hộ (vulva) hình khe, nằm ở giữa cơ thể, mép âm hộ thường lồi lên và thường có cấu tạo màng vulva Đuôi ngắn, chiều dài đuôi thường ngắn hơn chiều rộng cơ thể tại hậu môn

Con đực: Kích thước cơ thể nhỏ hơn con cái Cơ thể cong về phía bụng hình

chữ J khi xử lý nhiệt Vùng đầu luôn có 6 nhú môi và 4 nhú đầu, tạo thành vòng tròn bao quanh miệng Cấu tạo phần thực quản, lỗ bài tiết, vòng thần kinh giống như ở con cái Tinh hoàn dạng đơn, gấp khúc về phía bụng Có một đôi gai giao cấu

và một đôi gai đệm Gai đệm ngắn hơn gai giao cấu Vùng đuôi thường có 1 nhú đơn lớn và 10 đến 14 cặp nhú sinh dục, không có cánh đuôi Tận cùng mút đuôi tròn, hình chóp hoặc nhọn

Ấu trùng cảm nhiễm: Ấu trùng cảm nhiễm là ấu trùng tuổi 3 nhưng luôn được

bao bọc bởi lớp vỏ của ấu trùng tuổi 2 Cơ thể cong về phía bụng và thon nhỏ về hai đầu Đường bên thường có từ 1- 9 đường, tùy thuộc vào từng loài Thực quản và ruột thường tiêu giảm Lỗ bài tiết rõ ràng nằm trước vòng thần kinh Vòng thần kinh điển hình, thường nằm ở phần eo thắt của thực quản Vi khuẩn cộng sinh nằm phía

12

trước ruột, sau thực quản Lỗ miệng và hậu môn khép kín Đuôi dạng chóp hoặc dạng chỉ Phasmids nằm ở khoảng giữa của đuôi, hơi nhô lên hoặc khó quan sát

Hình 1.2: Hình chụp từ kính hiển vi điện tử của tuyến trùng Steinernema và

Heterorhabditis A và C: Đầu của tuyến trùng gây nhiễm, và tuyến trùng cái

thế hệ một của Steinernema B và D: Đầu của tuyến trùng gây nhiễm và tuyến trùng cái thế hệ hai của Heterorhabditis (Theo Nguyễn Ngọc Châu,

2008)

Giống Heterorhabditis Poinar, 1976

Giống Heterorhabditis là giống duy nhất thuộc họ Heterorhabditidae được

Poinar xác lập năm 1976 và có đặc điểm hình thái như sau:

Con cái lưỡng tính (thế hệ 1): Kích thước cơ thể lớn và cong về phía bụng khi

xử lý bằng nhiệt Lớp vỏ cutin nhẵn Phần đầu hơi tròn hoặc bằng Vùng môi gồm 6 môi bao quanh lỗ miệng, mỗi môi tạo thành một nhú môi Lỗ amphids không rõ Lỗ miệng có dạng cái phễu hoặc dạng cái cốc Xoang miệng nông Phần trước và phần giữa thực quản hình ống trụ, phần thắt điển hình, phần gốc thực quản có cấu trúc dạng diều với van rõ ràng bên trong Van thực quản ruột lồi rõ và nhô về phía ruột

13

Vulva có dạng khe ngang và nằm ở gần giữ cơ thể, mép vulva hơi lồi lên bề mặt cơ thể Vagina ngắn, thẳng, thành có cấu trúc cơ hệ sinh dục kép, phần gấp khúc của buồng trứng thường kéo dài qua vulva Ở con cái lưỡng tính có tinh trùng nằm ở phần gốc của tinh hoàn cái và có vulva ở dạng hoạt động Đuôi dạng chóp, chiều dài lớn hơn chiều rộng Phasmids không rõ

Con cái phân tính (thế hệ 2) : Giống con cái lưỡng tính chỉ khác bởi kích

thước nhỏ hơn nhiều so với con cái lưỡng tính, đuôi cũng ngắn và tù hơn Tinh trùng nằm ở phần gốc của ống dẫn trứng và vulva không hoạt động đẻ trứng (chỉ cho giao phối)

Con đực : Được tạo thành ở thế hệ 2, phân tính Cơ thể thon, cong về mặt

bụng khi xử lý bằng nhiệt Lớp vỏ cutin nhẵn khi quan sát dưới kính hiển vi quang học Phần đầu hơi tròn hoặc bằng Amphids không rõ Lỗ miệng có dạng phễu hoặc dạng cốc phần trước thực quản hình ống, phần giữa hơi phình rộng, phần sau thực quản dạng diều và có van rõ ràng Vòng thần kinh bao quanh isthmus, ngay phía trước gốc thực quản Lỗ bài tiết nằm ở phần giữa thực quản, ống bài tiết được kitin hóa Tinh hoàn dạng nhánh đơn và gấp khúc ở phần ngọn Gai giao cấu đôi, tách biệt nhau, hầu như thẳng hoặc chỉ hơi cong về phía bụng Gai đệm có chiều dài bằng 50% gai giao cấu, hơi cong về phía bụng, phần gốc không tạo thành núm gốc Cánh đuôi dạng mở peloderan hoặc hơi leptoderan, tức là cánh đuôi không kéo dài đến tận cùng đuôi Trên mỗi cánh đuôi bên có 9 nhú sinh dục dạng nan quạt Phasmids không rõ Đuôi hình chop, tận cùng đuôi không có mucro

Ấu trùng cảm nhiễm (infective juveniles) : Giai đoạn này ứng với ấu trùng tuổi

3 và chúng thường nằm lại bên trong vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2 Cơ thể rất thon dài so với ấu trùng cùng tuổi của nhóm khác Vùng bên của vỏ cutin có các đường đôi dọc cơ thể Miệng và hậu môn khép kín Phần đầu tròn và phía lưng miệng có cấu trúc kitin hóa dạng rang, sừng, gai hoặc kitin dày lên nằm về phía lưng hoặc trong một số trường hợp nằm gần bên Cấu trức này giúp tuyến trùng đục thủng vỏ cutin của côn trùng vật chủ để xâm nhập Thực quản dài, hẹp, phần sau thực quản

có dạng diều và có van bên trong Vòng thần kinh nằm bao quanh isthmus Vị trí lỗ

Theo Kaya & Gaugler (1923) [26], vòng đời của các loài tuyến trùng giống

Steinernema và Heterorhabditis bao gồm các giai đoạn: trứng, 4 giai đoạn ấu trùng

và trưởng thành Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm là ấu trùng tuổi 3 tồn tại ở trong đất Các ấu trùng cảm nhiễm đều chứa vi khuẩn cộng sinh ở bên trong ruột và mang vi khuẩn từ vật chủ này đến vật chủ khác Khi phát hiện ra vật chủ chúng sẽ tiến hành

xâm nhập vào vật chủ Các loài thuộc giống Steinernema có tập tính xâm nhập vào

cơ thể vật chủ qua các lỗ mở tự nhiên của côn trùng như miệng, hậu môn và lỗ thở

Còn các loài thuộc giống Heterorhabditis ngoài con đường xâm nhập thụ động qua

các lỗ mở tự nhiên, chúng còn xâm nhập vào cơ thể côn trùng một cách chủ động nhờ vào cấu trúc đặc biệt là một cái móc lưng Cấu trúc đặc biệt này chỉ có ở ấu trùng cảm nhiễm chúng giúp cho tuyến trùng có thể xâm nhập trực tiếp qua lớp vỏ cutin của vật chủ ở những vùng màng mỏng giữa các khớp nối

Khi đã vào trong cơ thể vật chủ, chúng xâm nhập chủ động qua vách ruột giữa hoặc ống khí vào trong xoang máu Tại đây, vi khuẩn cộng sinh được giải phóng qua lỗ hậu môn của ấu trùng cảm nhiễm và bắt đầu sinh sản rất nhanh đồng thời sản sinh độc tố giết chết côn trùng vật chủ Côn trùng vật chủ sẽ bị nhiễm trùng máu và nhanh chóng chết trong vòng 24 - 48h Trong giai đoạn này ấu trùng cảm nhiễm sử dụng các túi vi khuẩn làm nguồn dinh dưỡng và nhanh chóng phát triển thành dạng

trưởng thành thế hệ 1 trong vòng 2 - 3 ngày (đối với côn trùng vật chủ là ấu trùng BSL) (Elawad et al, 1999) [20]

15

Hình 1.3: Vòng đời của các loài Heterorhabditis and Steinernema trên bọ

hung ( Gaugler, Brown, Shapiroilan & Atwa , 2002)

Đối với các loài thuộc giống Steinernema, ấu trùng cảm nhiễm phát triển thành

con trưởng thành dạng phân tính con đực và con cái riêng biệt Đối với các loài thuộc giống Heterorhabditis, ở thế hệ thứ nhất thì ấu trùng cảm nhiễm lại phát triển thành con cái lưỡng tính, đến thế hệ thứ hai thì chúng mới phát triển thành dạng phân tính Từ thế hệ thứ 2 tuyến trùng sử dụng mô vật chủ làm nguồn dinh dưỡng

để tiếp tục phát triển thêm 2 hoặc 3 thế hệ bên trong xác chết của côn trùng cho đến khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt Lúc này, tuyến trùng bên trong xác chết côn trùng là thế hệ ấu trùng cảm nhiễm mới sẽ chui ra khỏi cơ thể côn trùng và có thể sống một thời gian khá dài trong đất để chờ xâm nhập vào côn trùng vật chủ mới Thời gian

để tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng hoàn thành chu kỳ phát triển của mình trong ấu trùng BSL tính từ khi ấu trùng cảm nhiễm xâm nhập vào cơ thể cho đến khi ấu trùng cảm nhiễm phát tán ra ngoài thường từ 4 – 14 ngày, phụ thuộc vào từng loài, điều kiện môi trường

16

Sinh sản trong vật chủ của tuyến trùng: Sau khi xâm nhập vào xoang máu vật

chủ, tuyến trùng sẽ giải phóng vi khuẩn cộng sinh (VKCS) Lúc này, VKCS nhân lên nhanh chóng trong cơ thể vật chủ, giải phóng độc tố và gây chết vật chủ Tuyến trùng ăn vi khuẩn, phát triển và sản sinh ra các thế hệ tuyến trùng Khả năng sinh sản của tuyến trùng là một trong những đặc điểm quan trọng để tuyến trùng sống sót

và tồn tại ngoài tự nhiên Khả năng sinh sản của tuyến trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: khả năng sinh sản của từng chủng tuyến trùng, số lượng ấu trùng cảm nhiễm gây nhiễm ban đầu, vào sự mẫn cảm của vật chủ và sinh khối của vật chủ Theo nghiêm cứu của Wang & Bedding (1996) [40] chỉ với 2 ấu trùng cảm nhiễm

của loài S carpocapsae trên một ấu trùng BSL đã thu được khoảng 150.000 ấu trùng cảm nhiễm Thí nghiệm của Hazir et al (2001) trên 5 chủng khác nhau của loài S feltiae đã xác định sản lượng ấu trùng cảm nhiễm thu được trên một ấu trùng BSL là từ 45 x 103 đến 72 x 103 với số lượng gây nhiễm là 50 ấu trùng cảm nhiễm/

ấu trùng BSL [23] Một chủng tuyến có khả năng sinh sản tốt sẽ góp phần duy trì

mật độ cao của ấu trùng cảm nhiễm trên đồng ruộng sau khi phun và kéo dài khả năng phòng trừ sâu hại của chủng tuyến trùng đó trong thời gian dài [3]

1.2 Khả năng ứng dụng của tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại

1.2.1 Trên thế giới

Vai trò ký sinh gây bệnh ở côn trùng của một số loài tuyến trùng được tìm ra

từ những năm 1930s và tiềm năng phòng trừ sâu hại của chúng cũng được biết đến khá sớm Năm 1932, Glaser là người đầu tiên công bố tiềm năng phòng trừ sâu hại của tuyến trùng họ Steinernematidae ở Mỹ Trong một thử nghiệm ngoài đồng

ruộng ở New Jersey, ông quan sát thấy tuyến trùng S glaseri đã tiêu diệt một số lượng lớn bọ cánh cứng Nhật Bản (Popillia japonica Newn) [22] Mặc dù vậy, do

sự phát triển bùng nổ của thuốc hóa học bảo vệ thực vật nên những nghiên cứu về EPN và những ứng dụng của nó chưa được quan tâm phát triển Việc nghiên cứu sử dụng chúng như những tác nhân sinh học trong phòng trờ sâu hại mới chỉ được tiến hành mạnh mẽ từ những năm 1970 trở lại đây, khi việc sử dụng thuốc hóa học bảo

17

vệ thực vật bắt đầu gây ra các hậu quả sinh học, sinh thái, gây ô nhiễm môi trường

và ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Ngày nay, thuốc sinh học tuyến trùng được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi ở

Mỹ, Úc, Nhật Bản, Canada, Châu Âu, Ấn Độ, Trung Quốc và một số nước khác Đã

có hàng chục loài EPN đã được nghiên cứu và ứng dụng trong phòng trừ sinh học

Theo số liệu thống kê đến năm 2000 đã có 7 loài thuộc hai giống Steinernema và

Heterorhabditis được thương mại hóa: S carpocapsae, H bacteriophora, H megidis, S scapterisci, S glaseri, S feltiae, S riobravave (Nguyễn Ngọc Châu,

2008) [3] Cho đến nay, các thuốc sinh học tuyến trùng đều có lợi và vô hại nên được miễn đăng ký sử dụng ở Mỹ và nhiều nước khác Tại Mỹ đã có hàng chục công ty công nghệ sinh học sản xuất thuốc sinh học tuyến trùng để phòng trừ hàng trăm loại sâu hại khác nhau thuộc các bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh phần (Lepidoptera) và côn trùng gây hại bộ hai cánh (Diptera) Đây là các sâu hại chính ở các nhóm cây trồng quan trọng như cây lương thực, cây ăn quả, cây rau màu, cây công nghiệp,… vv Thực tế, tiềm năng phòng trừ sinh học của EPN là rất lớn, các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng đã xác định tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng có khả năng ký sinh gây bệnh cho hơn 200 loài côn trùng, trong đó hầu hết các loài sâu hại có một phần vòng đời trong đất đều là mục tiêu ký sinh của EPN

Năm 1982, nhiều nghiên cứu về phòng trừ bọ hung Alissonotum impressicolle

được tiến hành Các nghiên cứu được thực hiện trong phòng thí nghiệm, thử nghiệm trên nhiều loài EPN khác nhau Kết quả, có 9 loài tuyến trùng có thể xâm nhiễm và giết chết bọ hung với các tỷ lệ khác nhau Ở số lượng khoảng 2.500 ấu trùng cảm nhiễm/ấu trùng bọ hung, sau 1 tuần tỷ lệ bọ hung chết là: 100% đối với loài

Heterorhabditis sp (strain 8406) và loài S glaseri; loài H heliothidis đạt 82,6%;

65,3% là hiệu lực của loài S bibionis; thấp nhất là loài Heterorhabditis sp (strain

8401) chỉ đạt 4,3%

Bong & Sikorowski (1983) đã thử nghiệm hiệu quả của loài S carpocapsae trong phòng trừ ấu trùng sâu xanh hại ngô Helicopverpa zea Kết quả cho thấy, hiệu

18

quả đạt 88% so với lô đối chứng Yang et al (1993) đã tiến hành bơm dung dịch

tuyến trùng S carpocapsae vào các lỗ đục của sâu Holcocerus insularis trên các

loại cây xanh trồng trong thành phố ở phía Bắc Trung Quốc Sau một vài ngày tuyến trùng đã tiêu diệt được khá nhiều sâu hại Sau đó, tuyến trùng tiếp tục sinh sản trong xác chết vật chủ và các thế hệ ấu trùng cảm nhiễm sinh ra sẽ tiếp tục tiêu

diệt số sâu còn lại Ekanayake et al (2001) đã đánh giá hiệu lực của hai loài H

megidis và S feltiae trên bọ hà hại khoai lang, Cylas formicarius ở Sri Lanka

Trong phòng thí nghiệm loài H megidis đã diệt 80 - 90% ấu trùng, nhộng và con trưởng thành C formicarius còn loài S feltiae gây chết 70 - 80%

Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng được nghiên cứu và ứng dụng rộng

rãi vì các loài tuyến trùng thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis cộng sinh bắt buộc với vi khuẩn (Xenorhabdus và Photorhabdus) tạo nên một tổ hợp sinh

học tuyến trùng-vi khuẩn vừa có khả năng ký sinh vừa có khả năng gây bệnh cho côn trùng Tổ hợp sinh học này có nhiều có được nhiều ưu thế: Có khả năng kháng sinh và gây bệnh cho nhiều sâu hại khác nhau; an toàn cho người, động vật, thực vật, các sinh vật có ích cho môi trường; sâu hại không có khả năng kháng thuốc với

tổ hợp tuyến trùng; có thể sản xuất sinh khối lớn bằng công nghệ nhân nuôi invivo

và invitro; dễ dàng áp dụng trong phòng trừ sâu hại bằng các thiết bị phun thuốc

đang được sử dụng cho thuốc hóa học; có khả năng tìm và tiêu diệt sâu hại nhanh chóng trong vòng 24 - 48h Với hàng loạt các đặc tính ưu việt như vậy, nhiều chuyên gia cho rằng thuốc sinh học tuyến trùng có thể đáp ứng được tiêu chuẩn của một thuốc sinh học lý tưởng dùng trong phòng trừ sâu hại (Nguyễn Ngọc Châu, 2008) [3]

Ở Trung Quốc đã sản xuất và sử dụng thành công thuốc sinh học tuyến trùng

để phòng trừ sâu hại Carposina niponesia ở đào, táo và cây xanh trong nhiều thành

phố với diện tích lớn Ở Indonesia đã sản xuất sinh khối lớn EPN để phòng trừ sâu đục thân lúa Ở Malaysia dùng EPN để diệt sâu tơ Tại Thái Lan, các chế phẩm sinh học EPN đã được sản xuất thương mại và sử dụng rộng rãi cho các vùng trồng rau sạch ở Bangkok [3] Tiềm năng ký sinh và gây bệnh là rất lớn Do đó, việc nghiên

19

cứu và ứng dụng EPN đang tiếp tục phát triển, lan rộng trên nhiều nước với quy mô

và phạm vi ứng dụng rất lớn

1.2.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng dù mới được bắt đầu triển khai nghiên cứu từ năm 1997 nhưng cũng đạt được nhiều kết quả tốt Các nghiên cứu bước đầu tập trung chủ yếu vào khảo sát, thu mẫu và phân lập các chủng EPN từ tự nhiên, ở nhiều vùng sinh thái khác nhau để phân loại và nghiên cứu tuyển chọn các chủng có đủ tiêu chuẩn sử dụng trong đấu tranh sinh học Cùng với việc điều tra phân lập nguồn EPN, các thử nghiệm về hiệu lực gây chết của các chủng EPN cũng được thí nghiệm trên ấu trùng BSL và trên một số sâu

hại phổ biến ở cây trồng Việt Nam như: bọ hung đen (Alissonotum impressicolle), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu cuốn lá đậu tương (Omiodes indicate, sâu xám (Agrotis ypsilon), sâu keo da láng (Spodoptera exigua), sâu xanh bướm trắng (Pienis rapae), sâu tơ (Plutella xylostella) [3] đã nghiên cứu hiệu lực gây chết của các chủng tuyến trùng Steinernema sp TK10 và Heterorhabditis sp TK3 trên một

số sâu hại ở cây trồng Việt Nam cho thấy phổ gây chết sâu hại của 2 chủng tuyến

trùng này khá rộng, trong đó chủng Steinernema sp TK10 có phổ ký sinh gây

bệnh lớn hơn Hiệu lực gây chết qua chỉ số LC50 của 2 chủng tuyến trùng trên 7 loại sâu hại đều ở mức tương đối thấp (13 - 95 IJs) cho thấy đây là 2 chủng có hiệu lực gây chết cao đối với một số chủng khác của thế giới và có thể đáp ứng tiêu chuẩn tác nhân phòng trừ sinh học

Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm về khả năng gây chết của các

chủng EPN trên bướm sáp lớn (G mellonella) và trên 30 loại sâu hại phổ biến ở

Việt Nam, đã xác định được hàng chục chủng EPN có đủ tiêu chuẩn của một tác nhân sinh học có thể đưa vào sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cho phòng trừ sinh học một số loại sâu hại chính ở Việt Nam Trên cơ sở tuyển chọn đã triển khai sản xuất 7 chế phẩm sinh học tuyến trùng được đặt tên là BIOSTAR, từ BIOSTAR-

1 đến BIOSTAR-7 ở quy mô pilot và (Bảng 1.1) áp dụng phòng trừ sâu hại ở một số địa phương (Bảng 1.2)

20

Bảng 1.1: Danh sách các chế phẩm sinh học BIOSTAR

TT Chủng EPN Loài tuyến trùng Tên chế phẩm Nồng độ (IJs/lit)

nghệ in vivo và in vitro, có khả năng bảo quản lâu (từ 2-6 tháng) Đây là một trong

những ưu thế của các chủng EPN bản địa của Việt Nam

Kết quả cho thấy hiệu lực phòng trừ của EPN có thấp hơn so với hiệu lực của thuốc hóc học Tuy nhiên, EPN lại có tác dụng lâu dài hơn và nếu xét về tác dụng phòng trừ thì EPN vẫn có hiệu quả phòng trừ tốt hơn so với thuốc hóa học Nhìn chung, hầu hết các loài EPN bản địa Việt Nam đều có khả năng phòng trừ sâu hại Tuy nhiên, hiệu lực tiêu diệt sâu hại của chúng là khác nhau

Hiện nay, các thử nghiệm vẫn đang tiếp tục được mở rộng trên các loài sâu hại khác nhau để đánh giá, tuyển chọn các chủng tuyến trùng có khả năng phòng trừ tốt sâu hại đưa vào sản xuất và sử dụng trong phòng trừ sinh học

Bảng 1.2 Áp dụng phòng trừ sâu hại ở một số địa phương

TT Chế phẩm EPN Đối tượng sâu hại phòng trừ Địa điểm

1 BIOSTAR-1

BIOSTAR-2

BIOSTAR-4

BIOSTAR-7

Sâu hại rau, màu như sâu keo

(Spodoptera litura), sâu xám (Agrotis segetum), sâu cuốn lá đầu đen (Archippus breviplicanus), sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae

Đông Anh (Hà Nội), Tiên Lãng (Hải Phòng),

Thủ Đức (Tp Hồ Chí Minh)

21

crucinova), bọ nhảy (Phyllotresta striolata)

2 BIOSTAR-5 Sâu keo da láng (Spodoptera

exigua) hại nho

Ninh Thuận

3 BIOSTAR-2,

BIOSTAR-6

BIOSTAR-7

Sâu xám (Agrotis ypsilon) hại thuốc

lá, ngô, đậu tương

Ba Vì, Sóc Sơn (Hà Nội)

4 BIOSTAR-3 Bọ hung (Alissonotum

impressicolle) hại mía

Thạch Thành (Thanh Hóa)

5 BIOSTAR-2 Sâu đục thân cam chanh (Ceresium

22

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Địa điểm: tiến hành điều tra, thu mẫu tại một số vùng trồng cà phê, hồ tiêu

chính ở các tỉnh Tây Nguyên :

- Kon Tum ( xã Đắk Na, huyện Tu Mơ Rông; xã Đăk Mar, huyện Đăk Hà;

xã Mô Rai, huyện Sa Thầy)

- Gia Lai ( xã Ayun, huyện Chư Sê; xã Chư Gu, huyện Krông Pa; xã Ia Tô, huyện Ia Grai )

- Đắk Lắk (xã Ea Sin, huyện Krông Búk; xã Ea Tar, huyện Cư M'Gar; xã

Cư Êwi, huyện Cư Kuin )

- Đắk Nông (xã Ea Pô, huyện CưJút; xã Long Sơn, huyện Đăk Mil; xã Nâm N'Đir, huyện Krông Nô )

- Lâm Đồng (xã Gung Ré, huyện Di Linh; thị trấn D'ran, huyện Đơn Dương; xã Đa Quyn, huyện Đức Trọng )

Thời gian: Quá trình khảo sát thu mẫu được chia làm 2 đợt: đợt 1 từ 3/3/2012

đến 29/3/2012 và đợt 2 từ tháng 5/11/2012 đến 01/12/2012 với sự hỗ trợ của đề tài:

“Đa dạng hình thái và phân tử của tuyến trùng ký sinh thực vật ở các hệ sinh thái nhiệt đới Việt Nam” (Mã số: 106.12.40.09) do Quỹ Phát triển khoa học và Công nghệ quốc gia (NAFOSTED) tài trợ kinh phí Thời gian nghiên cứu mẫu tại phòng thí nghiệm từ 09/04/2012 đến 03/04/2014 tại Phòng Tuyến trùng học - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Tuyến trùng: chủng EPN được sử dụng trong nghiên cứu là: S-DL13 Đây là

chủng tuyến trùng được phân lập tại các vùng trồng cà phê ở Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông và Lâm Đồng Chủng tuyến trùng này được lưu trữ tại Phòng Tuyến trùng

học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh học và được duy trì nhân nuôi in vivo

Côn trùng: Bướm sáp lớn (Galleria mellonelle) (họ Pyralidae, bộ Lepidoptera)

được nhân nuôi tại phòng Tuyến trùng học Bướm sáp lớn được nhân nuôi trong

23

phòng thí nghiệm bằng thức ăn nhân tạo Ấu trùng BSL được sử dụng trong các thí nghiệm là ấu trùng tuổi cuối (tuổi 4) trước khi hóa nhộng Khối lượng trung bình của các ấu trùng này là 2.1g ± 0.3 / 10 cá thể

2.3 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ: Đĩa petri, giấy lọc, cốc đong, kính lúp, kính hiển vi soi nổi

OLYMPUS SZ10, kính hiển vi quang học OLYMPUS CH40 có gắn máy vẽ, kính hiển vi giao thoa OLYMPUS BX51 gắn máy ảnh, tủ định ôn, đĩa đếm tuyến trùng, cốc thủy tinh, pipetman, panh kẹp, kim gắp, lam kính, lamen, parafilm, bộ điện di DNA, cân phân tích 10-4g, máy ly tâm, máy khuấy trộn Vortex, máy soi chụp ảnh gel, máy ly tâm lạnh, máy xác định trình tự DNA tự động, tủ lạnh sâu -20o

C, - 80oC

Hóa chất: Cồn tuyệt đối, glycerin, formandehyde, triethnolamine, dung dịch

đệm điện di TBE, dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0,05 μg/ml (EtBr), đệm tra mẫu (Loading Dye), dung dịch WLB (Worm Lysis Buffer), nước cất, các hóa chất phân tử cho PCR và đọc trình tự vùng gien 18S-rDNA

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái tuyến trùng

Điều tra,thu mẫu, phân lập tuyến trùng: theo quy trình mô tả của Hominick et

al (1997) và Nguyễn Ngọc Châu (2008) [3]

Tiến hành gây nhiễm ấu trùng cảm nhiễm của chủng tuyến trùng phân lập

được trên ấu trùng BSL:

Dùng pipet hút 1ml dung dịch có chứa 100 ấu trùng cảm nhiễm (IJs) cho vào

đĩa petri có lót giấy lọc Thêm vào mỗi đĩa petri một ấu trùng BSL Sau khi gây

nhiễm, đặt các đĩa petri vào tủ định ôn ở nhiệt độ 27 oC để theo dõi Hàng ngày, bổ sung vào mỗi đĩa petri 1 - 2 giọt nước để duy trì độ ẩm và kiểm tra sâu chết Sau khi sâu chết, tiến hành mổ sâu mỗi ngày để xác định các giai đoạn phát triển khác nhau của tuyến trùng

Mẫu tuyến trùng thu được từ những lần mổ khám được làm sạch và xử lý để làm tiêu bản theo quy trình của Seinhorst (1959) :

Bước 1: Giết chết tuyến trùng bằng nước nóng 50 - 60 ºC, rồi chuyển sang

24

dung dịch TAF (Formalin 40 %: 7ml, Triethanolamine: 2 ml, Nước cất: 91 ml) để

cố định trong thời gian 7 ngày

Bước 2: Gắp tuyến trùng từ dung dịch TAF sang đĩa thuỷ tinh lõm có chứa 0.5

ml dung dịch I (Cồn 96º: 20 ml, Glicerin: 1ml, Nước cất: 79 ml) Đặt đĩa thuỷ tinh trong bình hút ẩm của tủ ấm 40ºC trong thời gian tối thiểu là 12h

Bước 3: Chuyển đĩa thuỷ tinh trong bình hút ẩm lên giá của tủ ấm trong

khoảng 12h cho dung dịch bay hơi, cứ sau 3h thi bổ sung thêm dung dịch II (Cồn 96º: 95ml, Glicerin: 5ml) Sau khi cồn bay hơi hết chỉ còn glycerin thì có thể sử dụng tuyến trùng làm tiêu bản được

Bước 4: Làm tiêu bản: Dùng ống đồng để khoanh các vòng parafin lên lam

kính Đặt 1 giọt nhỏ glicerin tinh khiết ở giữa vòng paraffin Gắp tuyến trùng cho vào giọt glicerin Đặt vài mảnh sợi thuỷ tinh để đỡ tuyến trùng, đậy lamen Đặt lamkính lên thanh nhiệt và đốt đèn cồn ở bên dưới, sau vài phút parafin sẽ chảy đều

và gắn lame vào lamkính

Để định loại tuyến trùng tiến hành quan sát tuyến trùng, đo kích thước và vẽ tuyến trùng dưới kính hiển vi Các chỉ số hình thái lượng sử dụng trong mô tả đặc

điểm hình thái của EPN được tiến hành Hominick et al (1997) và Nguyễn Ngọc

Châu (2007) như sau:

n: Số lượng cá thể tuyến trùng được đo

L: Chiều dài cơ thể

W: Chiều rộng cơ thể

EP: Chiều dài từ đỉnh đầu đến lỗ bài tiết

NR: Chiều dài từ đỉnh đầu vòng thần kinh

ES: Chiều dài từ đỉnh đầu cuối thực quản

T : Chiều dài đuôi

ABW: Chiều rộng cơ thể tại hậu môn

H%: Chiều dài Hyalin / Chiều dài đuôi x 100

TES: Chiều dài nhánh sinh dục đực

Lst: Chiều dài xoang miệng

25

Wst: Chiều rộng xoang miệng

Lsp: Chiều dài gai giao cấu

Wsp: Chiều rộng gai giao cấu

Lgu: Chiều dài gai đệm

Wgu: Chiều rộng gai đệm

V (%): Chiều dài từ đỉnh đầu đến Vuval / Chiều dài cơ thể x 100

- Chuyển sang tủ lạnh sâu -200C trong ít nhất 60 phút

- Chuyển sang ủ ở nhiệt độ 650C trong 60 phút

- Chuyển sang tủ lạnh sâu -200C trong ít nhất 60 phút

- Chuyển sang ủ ở nhiệt độ 650C trong 60 phút

- Để ở nhiệt độ 960C trong 10 phút

- Ly tâm 1000 vòng/ phút trong 1 phút thu dịch trong

- Bảo quản ADN thu được ở tủ -200C

 Nhân đoạn DNA đích bằng kỹ thuật PCR

Đoạn ADN đích sẽ được nhân bản (PCR) nhờ các mồi đặc hiệu Trong đó cặp mồi để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu được sử dụng theo nguồn

26

tham khảo sau:

Bảng 2.1 Các mồi đặc hiệu cho PCR

Tên mồi Trình tự mồi ( 5‟- 3‟) Kích thước (bp) Nguồn tham khảo

27

 Điện di DNA trên gel agarose

- Chuẩn bị gel agarose 1 %: cân 0,4 g bột agarose hoà trong 40 ml dung dịch TBE 1X, đun cho bột agarose tan hết Khi gel hạ nhiệt độ xuống khoảng 50 ºC, đổ vào khuôn đã đặt sẵn lược điện di có độ dày răng lược thích hợp Để gel đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 1 giờ

- Đặt gel vào bể điện di, đổ dung dịch TBE 1X ngập mặt gel và nhẹ nhàng rút răng lược ra

- Tra mẫu: mẫu DNA được trộn với dung dịch loading dye theo tỷ lệ 5:1 và tra mỗi mẫu vào một giếng điện di theo thứ tự mẫu

- Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V Các phân tử DNA sẽ chạy từ cực âm sang cực dương

- Gel sau khi chạy điện di được lấy ra và ngâm vào dung dịch Ethidium Bromide nồng độ 0,05 μg/ml trong khoảng 15 phút để nhuộm DNA Băng DNA trong gel có thể nhìn thấy trên máy soi gel bằng tia tử ngoại có bước sóng 302 nm

 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng bộ kit MinElute của hãng QIAgen để tinh sạch sản phẩm PCR Các bước tinh sạch sản phẩm PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất kít và tóm tắt như sau:

Bước 1: Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1 %

Bước 2: Cắt đoạn gel chứa băng DNA đặc hiệu của từng mẫu bằng dao nhỏ,

sắc, sạch Cho băng DNA đã cắt vào ống eppendorf 1,5 ml

Bước 3: Cân đoạn gel từng mẫu đã cắt Thêm 3 lần thể tích dung dịch QG theo

trọng lượng từng mẫu (1g gel tương đương 1000 µl dung dịch QG)

Bước 4: Ủ ở 50 ºC trong 10 phút cho tới khi gel tan hoàn toàn Để làm tan gel

tốt, lắc đều các ống eppendorf vài lần trong quá trình ủ, mỗi lần cách nhau 2 - 3 phút

Bước 5: Khi gel đã tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch mẫu Màu của

dung dịch tốt là màu vàng của QG ban đầu

28

Bước 6: Hút toàn bộ dung dịch cho vào cột MinElute (gọi tắt là cột) đặt trong

ống thu dịch ly tâm (collection tube) của Kit và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

vào cột, để mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 8: Chuyển cột sang ống thu dịch ly tâm khác và ly tâm 13.000 vòng/phút

trong 1 phút

EB vào cột và ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút