Đánh giá tính khả dụng của vắc xin bạch hầu đông khô RD6 dự tuyển mẫu chuẩn quốc gia

Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu được sử dụng trong kiểm định công hiệu của thành phần bạch hầu nên kiểm tra tính đặc trưng của mẫu chuẩn chính là kiểm tra chỉ tiêu công hiệu [32, 35]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ KHÁNH LINH

ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG

KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ KHÁNH LINH

ĐÁNH GIÁ TÍNH KHẢ DỤNG CỦA VẮC XIN BẠCH HẦU ĐÔNG

KHÔ RD6 DỰ TUYỂN MẪU CHUẨN QUỐC GIA

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ trong bộ môn Vi sinh vật học và khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia

Hà Nội đã có nhiều chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tài trợ kinh phí để tôi có thể thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS.Trần Văn Bé, Viện trưởng Viện vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện vềphòng thí nghiệm và cung cấp lượng lớn động vật thí nghiệm giúp tôi hoàn thành luận văn này

Để hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các bạn đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn TS Trần Lan Phương, CN.Nguyễn Lan Anh, các anh chị đồng nghiệp của phòng QC,Viện vắc xin và Sinh phẩm Y tếvà Ths

Lê Thị Hoàng Yến, CN Nguyễn Phương Liên cùng các anh chị đồng nghiệp trong Khoa Vi khuẩn – Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học Viên

Đỗ Khánh Linh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1.VI KHUẨN BẠCH HẦU VÀ BỆNH BẠCH HẦU 3

1.1.1 Những nét chung về vi khuẩn bạch hầu 3

1.1.2Độc tố bạch hầu 4

1.1.3 Bệnh sinh 4

1.1.4 Dịch tễ học 5

1.2 VẮC XIN BẠCH HẦU 7

1.3 MẪU CHUẨN 9

1.3.1Về thuật ngữ 9

1.3.2 Về phương pháp điều chế 9

1.3.3 Tiêu chuẩn chất lượng 11

1.3.4 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế 13

1.3.5 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia 14

1.4 YÊU CẦU ĐỐI VỚI VIỆC CHUẨN ĐỊNH MẪU CHUẨN QUỐC GIA 16

1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU 17

1.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU 19

1.6.1 Phương pháp thử thách trên chuột lang 20

1.6.2 Phương pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt 21

1.7 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN 23

1.7.1 Đánh giá độ ổn định dài hạn (Long- term Stability Studies) 23

1.7.2 Đánh giá độ ổn định cấp tốc (Accelerated Stability Testing) 23

1.7.2.1 Điều kiện tiến hành phương pháp cấp tốc 23

1.7.3 Dự đoán tuổi thọ sản phẩm theo nguyên lý Vant-Hoff [1, 16] 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25

2.2.Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm và vật tư tiêu hao 25

2.2.1.Động vật thí nghiệm 25

2.2.2.Sinh phẩm –hóa chất 25

2.2.3 Vật tư trang thiết bị 25

2.3 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 26

2.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26

2.5 CỠ MẪU NGHIÊN CỨU 26

2.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.6.1 Đánh giá cảm quan 27

2.6.2 Đánh giá vô trùng 27

2.6.3 Đánh giá độ ẩm tồn dư 27

2.6.4 Đánh giá độ ch n hông 28

2.6.5 Đánh giá nhận dạng 28

2.6.6 Đánh giá tính đồng nhất về khối lượng 30

2.6.7 Đánh giá công hiệu và tính đồng nhất về công hiệu 30

2.6.8 Dự đoán hạn dùng của vắc xin mẫu chuẩn 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 ĐÁNH GIÁ CÁC CHỈ TIÊU SAU XUẤT XƯỞNG 34

3.1.1 Đánh giá cảm quan 34

3.1.2 Đánh giá chỉ tiêu vô trùng 35

3.1.3 Đánh giá độ chân không 36

3.1.4 Đánh giá độ ẩm tồn dư 36

3.1.5 Đánh giá nhận dạng 38

3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT 39

3.2.1 Đánh giá tính đồng nhất về trọng lượng khô 39

3.2.2 Đánh giá tính đồng nhất về công hiệu 40

3.3 DỰ ĐOÁN TUỔI THỌ CỦA VẮC XIN MẪU CHUẨN 43

KẾT LUẬN 46

KIẾN NGHỊ 47

Tài Liệu Tham Khảo 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.4 Nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ tư 11

2.1 Sơ đồ nhỏ mẫu của phương pháp nhận dạng bạch hầu 29

Đồ thị biểu diễn Sự phụ thuộc công hiệu bạch hầu của RD6 bảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Kết quả kiểm tra cảm quan mẫu chuẩn RD6 tại NICVB và IVAC 35

3.4 Kết quả độ ẩm tồn dư thực hiện tại NICVB và tại IVAC 37

3.5 Kết quả công hiệu RD6 (trên chuột lang) tại các thời điểm ủ mẫu ở nhiệt độ 500C/ độ ẩm 75% 43

4 ED50 Effective dose (Liều bảo vệ 50% động vật thí nghiệm)

5 IU International Unit (Đơn vị quốc tế)

6 KĐTBH Kháng độc tố bạch hầu

7 LD50 Lethal dose 50

(Liều gây chết 50 % động vật thí nghiệm sau 96 giờ)

8 Lf Limes flocculation: Đơn vị lên bông quốc tế

9 MCQG Mẫu chuẩn quốc gia

10 MCQT Mẫu chuẩn quốc tế

11 NIBSC National Institute for Biological Standards and Control

(Viện Quốc gia về Sinh phẩm chuẩn và chuẩn sinh học)

12 NICVB National Instistute for Control of Vaccines and

MỞ ĐẦU

Bạch hầu là một bệnh nhiễm huẩn nhiễm độc do vi huẩn Gram (

Corynebacterium diphtheriae g y ra Bệnh bạch hầu đã g y ra nhiều vụ dịch lớn và

nguy hiểm ở nhiều quốc gia trên thế giới Và hiện nay sử dụng vắc xin là biện pháp quan trọng nhất để ph ng bệnh bạch hầu Chất lượng vắc xin bạch hầu được đánh giá qua các tiêu chí: an toàn và hiệu quả Thử nghiệm iểm tra công hiệu là thử nghiệm cần thiết để đánh giá hiệu quả của vắc xin Thử nghiệm này cần c mẫu chuẩn do công hiệu của vắc xin mẫu thử được xác định qua so sánh tương quan với vắc xin mẫu chuẩn đã biết trước giá trị công hiệu

Để thống nhất kết quả kiểm định vắc xin bạch hầu trên toàn thế giới, Tổ chức y tế thế giới (WHO) đã thiết lập mẫu chuẩn bạch hầu quốc tế, do NIBSC sản xuất và hiện đang sử dụng mẫu chuẩn lần thứ tư với hàm lượng 213 IU ống

Do số lượng mẫu chuẩn Quốc tế có hạn nên WHO khuyến cáo các quốc gia nên

c mẫu chuẩn tại địa phương cho iểm định t ng lô vắc xin[40] Ở Việt Nam ngoài vắc xin DTP sản xuất trong nước ch ng ta c n nhập vắc xin DTP của nhiều nước để phục vụ nhu cầu phòng bệnh của nh n d n do đ việc iểm tra công hiệu thành phần bạch hầu c tần suất há lớn Nhà sản xuất cần vắc xin mẫu chuẩn quốc gia để kiểm định công hiệu của vắc xin trong quá trình sản xuất c n Viện iểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm y tế cần mẫu chuẩn Quốc gia để iểm định các vắc xin xuất xưởng và đ ng Hiện nay, ch ng ta chưa c vắc xin mẫu chuẩn quốc gia bạch hầu thêm vào đ mẫu chuẩn Quốc tế chỉ c đơn vị trên chuột lang Vì vậy, mẫu chuẩn Quốc gia được thiết lập và nối chuẩn với MCQT theo đơn vị miễn dịch trên chuột lang Phương pháp này c chi phí rất tốn kém và khả n ng c được lượng chuột lang lớn để làm thường quy là không khả thi với nhiều phòng thí nghiệm Do vậy, việc chuyển đổi sang phương pháp dùng chuột nhắt và sử dụng đơn vị trên chuột nhắt là rất cần thiết Việc chuyển đổi này được thực hiện ở t ng Quốc gia Song chưa c bất cứ phòng thí nghiệm nào công bố T những l do đ Viện iểm định Quốc gia Vắc

xin và Sinh phẩm y tế đã phối hợp với Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) sản xuất vắc xin bạch hầu dự tuyển mẫu chuẩn Quốc gia và tiến hành:

“Xác định tính khả dụng của Vắc xin c đ RD6 dự tuyểnmẫu chuẩn Quốc ia” với mục tiêu sau:

Xây dựng một quy trình chuẩn định chất lượng Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu đông khô để làm thước đo đánh giá, kiểm định các vắc xin xuất xưởng phục vụ cho sức khỏe cộng đồng

Mục tiêu cụ thể:

1 Đánh giá các chỉ tiêu sau xuất xưởng

2 Xác định giá trị công hiệu bạch hầu trên chuột lang của Vắc xin mẫu chuẩn

dự tuyển

3 Dự đoán tuổi thọ của vắc xin mẫu chuẩn

4 Đánh giá tính đồng nhất của vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Nh ng nét chung về vi khuẩn bạch hầu

Vi khuẩn Bạch hầu ( tên La tinh: Corynebacterium diphtheriae) hay còn

c tên “vi huẩn Klebs-Loefler” thuộc chi Corynebacterium, là những trực

khuẩn Gram ( hình chùy thường đứng thành đám như chữ nho Loại trực khuẩn này thường gặp trong tự nhiên Chúng là những trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong, có thể chứa các hạt nhiễm sắc Hạt nhiễm sắc thường ở hai đầu trực khuẩn làm cho vi khuẩn phình ra như hình chùy Loài trực khuẩn này không có vỏ, không có lông và không có nha bào Vi khuẩn bạch hầu là loài hiếu kỵ khí tùy tiện, chúng chuyển hóa glucose theo cả hai con đường (Embden-Meyenhof-Parnas và Pentose phospahte Ch ng ưa môi trường có máu, huyết thanh và pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi iềm, nhiệt độ 370C Nuôi cấy vi khuẩn bạch hầu cần môi trường chọn lọc có chứa tellurite Vì vậy trong sản xuất vắc xin người ta thường dùng môi trường tổng hợp t acid amin và một số yếu

tố hác hi đ trực khuẩn bạch hầu phát triển tốt và thu được ngoại độc tố thuận lợi hơn[5]

Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn bạch hầu

Độc tố được tạo ra chỉ khi trực khuẩn này sản sinh ra loại vi r t đặc hiệu,

vi r t mang gen độc, có khả n ng giết chính nó Chỉ những loại mang gen độc mới gây bệnh nghiêm trọng Vi khuẩn bạch hầu có bốn tuýp sinh học là Gravis, intermedius, mitis và belfanti Tất cả các chủng này đều có khả n ng sản xuất

độc tố gây bệnh nghiêm trọng Và đặc tính để phân biệt với các loài

Corynebacterium khác là vi khuẩn bạch hầu thường sống ở vùng họng miệng và

da

1.1.2 Độc tố bạch hầu

N m 1888 Roux và Yersin đã phát hiện: khi lấy dịch lọc trong canh khuẩn

vi khuẩn bạch hầu tiêm cho động vật thì gây bệnh giống như tiêm vi huẩn bạch

hầu Điều này đã chứng minh Corynebacterium diphtheriae gây ra bệnh bạch hầu,

do vi khuẩn này sản sinh ra một ngoại độc tố c độc lực rất cao[2, 5]

Ngoại độc tố bạch hầu là những glycoprotein có trọng lượng phân tử khoảng 63.000 dalton, gồm hai tiểu phần A và B Tiểu phần B, trọng lượng phân tử 41.000 dalton chưa biết về hoạt tính enzym nhưng c nhiệm vụ bám vào màng tế bào cảm thụ giúp tiểu phần A (trọng lượng phân tử 22.000 dalton) chui vào tế bào và ng n cản giải phóng các ARN vận chuyển sau hi n đã đưa các acid amin đến các polyribosom trong việc tổng hợp protein nên sự tổng hợp protein bị ng n cản và làm tế bào chết Độc tố bạch hầu chịu được nhiệt đun sôi trong 5 ph t và há ổn định trong môi trường acid hoặc kiềm mạnh Các chủng vi khuẩn bạch hầu hông độc có thể biến đổi thành chủng độc bằng việc chuyển phage mang gen độc Toxt[2]

Hình 1.2: Cấu tr c độc tố bạc ầu 1.1.3 Bệnh sinh

Bạch hầu là một bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm độc do vi khuẩn bạch hầu

Corynebacterium diphtheriae gây ra Trực khuẩn bạch hầu sinh sản tại nơi tổn

thương và sản xuất ra ngoại độc tố Ngoại độc tố thâm nhập vào cơ thể và gây ra tổn thương ở nhiều cơ quan Màng giả ở họng miệng là dấu hiệu đầu tiên của nhiễm khuẩn bạch hầu có thể thấy ở người Biểu hiện chính của bệnh là g y viêm đường

hô hấp trên thường là ở vùng họng nhưng đôi hi lan truyền đến mũi thanh quản

và khí quản Nguy hiểm hơn là ngoại độc tố của vi khuẩn có thể lan truyền đến các

cơ quan như cơ tim hệ thần kinh, thận… hiến người bệnh có những biến chứng nguy hiểm như liệt, biến chứng tim và có thể tử vong[5, 20]

Hình 1.3: ( ) Màn iả ở ầu do độc tố bạc ầu

1.1.4 Dịch tễ học

Người ta đã ghi nhận rằng, bệnh bạch hầu lây lan bằng những giọt nước bọt

t bệnh nhân hoặc người mang trực khuẩn bạch hầu Nó lây trực tiếp tới những người cảm nhiễm Do đ dịch bệnh bạch hầu có thể xảy ra ở nhiều mức độ khác nhau: các trường hợp tái phát, các vụ dịch bé hoặc các vụ dịch lớn có tính chất vùng Bệnh bạch hầu thường xuất hiện trong những tháng lạnh ở vùng ôn đới Bệnh

c tính mùa thường tản phát, có thể phát triển thành dịch, nhất là ở trẻ dưới 15 tuổi chưa c miễn dịch đầy đủ[14]

Bệnh bạch hầu lưu hành rộng rãi ở mọi nơi trên thế giới và đã g y nên các

vụ dịch nghiêm trọng, nhất là ở trẻ em trong thời kỳ chưa c vắc xin dự phòng

N m 1923 vắc xin giải độc tố bạch hầu ra đời và t đ đến nay tính nghiêm trọng của bệnh dịch đã thay đổi trên toàn thế giới[2]

Bệnh bạch hầu chỉ xảy ra ở những cá thể nhạy cảm (thiếu miễn dịch) Trong vùng dịch bạch hầu lưu hành bệnh bạch hầu xuất hiện ở những người không tiêm vắc xin hoặc c tiêm nhưng hông đầy đủ Tỷ lệ chết cao của bệnh bạch hầu thường

ở vùng kinh tế thấp, phát hiện bệnh chậm và hông được điều trị kịp thời Sự khó

h n về kinh tế, xã hội là điều kiện tốt cho các bệnh nhiễm trùng trong đ c bệnh bạch hầu Vậy nên trong chiến tranh bạch hầu là bệnh nhiễm trùng phổ biến nhất[15]

Theo thông báo của nhiều nước, tỷ lệ mắc bạch hầu liên quan chặt chẽ với việc tiêm vắc xin bạch hầu Ở Anh và Wales, t n m 1915-1942, số lượng bệnh nhân bạch hầu hàng n m là 50.000 và số chết khoảng 4000 người vào những n m đầu và 2500 ở những n m cuối Sau đ người ta thực hiện tiêm chủng toàn dân

N m 1950 số lượng mắc bạch hầu giảm xuống 962 và tử vong khoảng 49 trường hợp; đến n m 1965 số mắc là 25 và không có tử vong Đại chiến thế giới thứ 2 đã cản trở việc tiêm phòng, dẫn đến khoảng 3 triệu người bị bệnh bạch hầu ở châu Âu trong thời gian này[5, 25]

Một sự kiện đáng lưu là do những biến động xã hội ở một số nước như Nga Ucraina…đã làm gián đoạn việc tiêm chủng vắc xin bạch hầu cho trẻ em trong những n m 80 của thế kỷ trước Do đ bệnh bạch hầu đã phát triển và bùng nổ thành dịch lớn ở những nước này trong những n m đ Ví dụ n m 1994 ỏ Nga đã

c hơn 39.000 người mắc bệnh bạch hầu với 1.100 người chết và ở Ucraina c hơn

3000 người mắc Tuổi mắc bệnh là trên 15 tuổi[12, 26]

Ở khu vực T y Thái Bình Dương hiện nay số mắc bệnh bạch hầu hàng n m

đã giảm rõ rệt do hiệu quả của việc tiêm phòng vắc xin bạch hầu cho trẻ em được thực hiện có kết quả ở các nước trong khu vực Những n m đầu thập kỷ 80 của thế

kỷ trước hàng n m ở đ y c trên 13.000 trường hợp bạch hầu đến n m 1990 giảm xuống c n 1130 trường hợp và n m 1994 chỉ c n 614 trường hợp[28]

Ở Việt Nam, thời kỳ chưa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong chương trình tiêm chủng mở rộng thì bệnh bạch hầu thường xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh đặc biệt là ở các thành phố có mật độ d n cư cao Bệnh xuất hiện nhiều

vào các tháng 8 9 10 trong n m Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên

tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần t 3 95 100.000 d n n m 1985 xuống

0 14 100.000 d n n m 2000 và 0 009 100.000 d n n m 2009 So với tỷ lệ mắc bệnh 0,14/100.000 dân của ho gà, 6,2/100.000 dân của bệnh sởi (n m 2009 c thể thấy hiệu quả phòng bệnh bạch hầu do tiêm vắc xin này khá cao[4]

Theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới, tất cả các nước nên ưu tiên tiêm phòng cho trẻ dưới một tuổi đủ 3 liều vắc xin DTP đạt ít nhất 90% và tiêm nhắc lại

để có miễn dịch lâu dài Lịch tiêm ph ng được xem xét cụ thể ở t ng nước, tùy theo tình hình dịch tễ bệnh

1.2 VẮC XIN BẠCH HẦU

Vắc xin bạch hầu là vắc xin giải độc tố Loại vắc xin này được sản xuất t ngoại độc tố của vi khuẩn đã được làm mất tính độc nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên Vắc xin giải độc tố ích thích cơ thể sản xuất ra háng độc tố, loại kháng thể có khả n ng trung h a ngoại độc tố Vắc xin này nhằm phòng chống các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây bệnh chủ yếu bằng ngoại độc tố

N m 1923 Ramon nhận thấy độc tố bạch hầu khi xử lý bằng formalin thì sẽ mất độc tính nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên, có khả n ng tạo kháng thể chống lại bệnh, t đ vắc xin bạch hầu ra đời

Với những tiến bộ của miễn dịch học và các ngành khoa học khác, việc sản xuất vắc xin bạch hầu đã được cải tiến qua nhiều giai đoạn và tập trung vào các vấn

đề sau:

1 Thay đổi phương pháp sản xuất: T thủ công (nuôi cấy tĩnh sang nuôi

cấy theo quy trình công nghệ sinh học (nuôi cấy chìm trong nồi lên men)

2 Thay đổi các phương pháp giải độc: Dùng hóa chất như ICl3, formalin hoặc các biện pháp chọn chủng giống đột biến để thu thẳng giải độc tố

3 Cải tiến khâu tinh chế: Cô đặc bằng phương pháp thủ công đến phương

pháp hiện đại với hệ thống siêu lọc Ngày nay hệ thống lọc tách như Metafilter TFF được dùng rộng rãi trong sản xuất các vắc xin vi khuẩn

4 Phối hợp tá dược: Giải độc tố ban đầu dùng gel hấp phụ để t ng và éo

dài hoạt tính miễn dịch Thường dùng gel của nhôm hydroxyd Al(OH)3hoặc Al(PO) 4 để hấp phụ Hoặc dùng các oligonucleotid chứa CpG demetyl h a đưa vào vắc xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay vì tế bào

5 Phối hợp kháng nguyên: Phối hợp thành vắc xin đa giá để có hiệu quả

kinh tế t ng hiệu quả t ng thành phần trong kháng nguyên và giảm bớt

số mũi tiêm chủng hoặc làm giảm bớt số lần tổ chức tiêm chủng Các vắc xin bạch hầu phối hợp 3 thành phần (Bạch hầu- Ho gà- Uốn ván), 4 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt), 5 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B), 6 thành phần (Bạch hầu- ho gà vô bào- Uốn ván- Bại liệt-Viêm gan B- Hib đã ra đời[2, 36]

Ở Việt Nam, vắc xin bạch hầu được nghiên cứu sản xuất t những n m 60 tại Viện Vệ sinh dịch tễ Hà Nội bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh phối hợp với thành phần uốn ván để tạo vắc xin nhị liên DT (Bạch hầu- Uốn ván)

N m 1986 Viện Vắc xin (IVAC) chính thức sản xuất phối hợp DTP tinh chế cô đặc và hấp phụ bằng AlPO4 theo tiêu chuẩn WHO Vắc xin này đã được dùng trong chương trình tiêm chủng mở rộng Quốc gia nên tỷ lệ mắc bệnh bạch hầu ở Việt Nam

đã giảm t 1187 trường hợp (n m 1984 xuống c n 188 trường hợp (n m 1991 Hiện nay IVAC vẫn đang tiếp tục sản xuất vắc xin này và đang c dự án với Cuba để sản xuất vắc xin phối hợp 5 thành phần (Bạch hầu- Ho gà - Uốn ván- Bại liệt-Hib)[2, 24]

Ở Việt Nam, vắc xin DTP nằm trong chương trình tiêm chủng mở rộng và tiêm ba mũi cho trẻ em với phác đồ 3, 4, 5 tháng tuổi Mũi thứ tư tiêm nhắc lại sau mũi thứ ba là một n m

Theo huyến cáo của tổ chức y tế thế giới WHO TRS No.980 và Dược điển Việt Nam IV vắc xin bạch hầu trước hi sử dụng phải được iểm tra các tiêu chuẩn như: Cảm quan nhận dạng thành phần bạch hầu công hiệu bạch hầu tính chất vật

l an toàn chung an toàn đặc hiệu bạch hầu vô huẩn và một số chỉ tiêu lý hóa khác[4, 28]

1.3 MẪU CHUẨN

Đối với mẫu chuẩn WHO có những khuyến cáo sau:

1.3.1 Về thuật ng

Chuẩn quốc ( IS): Mẫu chuẩn quốc tế (International biological measurement

standards, WHO International Standards, IS) là chế phẩm sinh học được cung cấp

để đảm bảo kết quả của các thử nghiệm sinh học hoặc miễn dịch học được biểu thị theo cùng một cách trên toàn thế giới Giá trị đưa ra bởi WHO theo đơn vị quốc tế (IU) hoặc đơn vị phù hợp khác ISS được coi là mẫu chuẩn gốc cao nhất (primary)

để chuẩn định mẫu chuẩn quốc gia/mẫu chuẩn thứ cấp khác [35]

Chuẩn chính (Reference standards): Là những chất được sử dụng như thước đo

trong các thử nghiệm Nó cung cấp một đơn vị cơ sở hằng định cho việc xác định công hiệu hoặc định lượng [35]

Chuẩn chính thứ cấp (Secondary reference standards): Là những chất chuẩn

chính được xây dựng bởi một khu vực hoặc một quốc gia hoặc bởi các tổ chức khác Chuẩn này được xác định dựa vào việc nối tới chuẩn ban đầu của WHO Những chất chuẩn này được sử dụng trong những thử nghiệm kiểm tra công hiệu hoặc định lượng thường quy [35]

1.3.2 Về p ươn p áp điều ch

Trong sản xuất mẫu chuẩn yếu tố quan trọng hàng đầu là tính đồng nhất ổn định và sự tương đồng về thành phần với mẫu để thử nghiệm Mẫu chuẩn có thành phần càng tương đồng với mẫu thử thì độ chính xác càng cao Merthiolate là chất thường được sử dụng làm chất bảo quản vì nó không ảnh hưởng đến chế phẩm hoặc không bị th ng hoa hi làm hô chế phẩm Những tá dược khác lựa chọn theo tiêu chí không làm giảm và không ảnh hưởng đến hoạt tính cũng như độ ổn định của sản phẩm

Q á trì đ :

Mẫu chuẩn có thể được sản xuất dưới dạng lỏng hoặc đông hô Mẫu dạng đông hô cho thấy độ ổn định và tuổi thọ cao hơn rất nhiều so với dạng nước, thông thường khoảng hơn 10 n m trong hi dạng nước chỉ tính theo tháng hoặc

vài n m Dạng đông hô dễ vận chuyển hơn dạng nước do yêu cầu về dây truyền lạnh đơn giản hơn Chính vậy hiện nay các nhà sản xuất đều ưu tiên sản xuất mẫu chuẩn ở dạng đông hô

Nguyên lý: Sự th ng hoa phần nước ở trạng thái rắn sang hơi hầu như hông gây hại cho sự sống cũng như các hệ thống enzym và tế bào khi quá trình xảy ra nhanh ở nhiệt độ thấp và ch n hông Tá dược có tác dụng nhũ h a và đông lạnh không làm vỡ tế bào đồng thời ở điều kiện chân không đã loại gần hết oxy nên chủng giống hoặc tế bào vi sinh vật không bị biến tính trong thời gian dài bảo quản sau đ

Cơ chế: Lạnh đông Giai đoạn làm đông là cho phản ứng hóa học bị ức chế không xảy ra đồng thời làm ngưng hẳn các hoạt động xúc tác của enzyme Kỹ thuật làm đông hông chỉ tạo thể rắn cho sinh phẩm mà quan trọng hơn là hình thành một trạng thái kết tinh tối ưu c thể tránh được sự hủy hoại sinh phẩm trong giai đoạn chuyển t trạng thái lỏng sang trạng thái rắn

Khi các tinh thể nước được tạo nên sẽ loại các phân tử khác (NaCl, đường protein… và lớn dần lên cho tới hi đông cứng toàn bộ Thời điểm đ là điểm đông b ng Bằng máy hút chân không tinh thể sẽ chuyển sang dạng hơi thoát ra ngoài đọng lại trong hoang condenser Đốt nóng ở 300C ở áp lực chân không trong ít nhất 1 giờ

Sản phẩm sau đông hô dễ hút ẩm và hấp thụ oxy trở lại do đ cần hút chân không hoặc dùng hí trơ lấp đầy khoang ống và hàn kín

bên ngoài bằng nắp nhôm để sản xuất mẫu chuẩn Hiện nay các đơn vị thường dùng dạng ống để sản xuất do độ hàn kín của ống tốt hơn gi p cho viêc bảo quản sản phẩm được l u hơn Tuy nhiên hi chọn dạng ống cần lưu hình dạng, kích thước ống sao cho dễ bảo quản, dễ mở, dễ lấy hết sản phẩm [2, 21, 27]

Dán nhãn: Nhãn ghi đầy đủ các thông tin sau:

 Tên đơn vị sản xuất: Nếu là mẫu chuẩn Quốc tế thì sẽ là WHO

 Tên mẫu chuẩn

 N m thiết lập

 Mã số

 Số đơn vị Quốc tế

 Điều kiện bảo quản

 Tên và địa chỉ nơi cấp phát

Phải ghi “Không được dùng cho người”

Ví dụ, nhãn của vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế như sau:

Hình 1.4: N ãn của vắc xin Bạc ầu mẫu c uẩn Quốc t lần t ứ tư

Năm thiết lập xuNămất Tên mẫu chuẩn

giảm thiểu sai số khi làm thử nghiệm đồng thời các mẫu lấy để kiểm tra cũng c tính đại diện tốt, phản ánh được chất lượng của cả lô vắc xin Với vắc xin đông

hô tính đồng nhất thể hiện ở hai chỉ tiêu: độ đồng đều về trọng lượng khô và công hiệu.Trọng lượng khô thể hiện sự phân liều c đồng đều hay không Công hiệu thể hiện quá trình pha vắc xin lỏng c đồng đều hay không

Tính đặc trưng cho thấy loại thử nghiệm mà mẫu chuẩn được sử dụng, t đ cho thấy các đặc tính cần quan tâm của mẫu chuẩn Ví dụ: Mẫu chuẩn cho thử nghiệm công hiệu thì đặc tính cần quan t m hàng đầu là giá trị công hiệu Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia Bạch hầu được sử dụng trong kiểm định công hiệu của thành phần bạch hầu nên kiểm tra tính đặc trưng của mẫu chuẩn chính là kiểm tra chỉ tiêu công hiệu [32, 35]

Tính ổn định: Vắc xin mẫu chuẩn là thước đo cho vắc xin mẫu thử nên phải

ổn định trong một khoảng thời gian nhất định (tối thiểu là 5 n m Để vắc xin được

ổn định, sản phẩm phải đạt yêu cầu về độ ẩm tồn dư cảm quan, vô khuẩn và độ chân không Sự ổn định công hiệu của vắc xin cũng cần được kiểm tra trong quá trình

sử dụng

Đáp ứng các tiêu chí trên cần kiểm tra các chỉ tiêu cảm quan độ đồng đều

khối lượng, nhận dạng, vô khuẩn độ ẩm tồn dư độ chân không và công hiệu

Trong đ :

Công hiệu (potency): Công hiệu là thử nghiệm đánh giá hiệu quả bảo vệ của

vắc xin Công hiệu được thể hiện bằng đơn vị miễn dịch hay hàm lượng các chất tạo miễn dịch trong một đơn vị đo lường Công hiệu cần được kiểm tra bằng phương pháp phù hợp Nên sử dụng các phương pháp đã được khuyến cáo bởi WHO hoặc các Dược điển Vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia cần được nối với chuẩn quốc tế của WHO (chuẩn gốc cao nhất) [8] [10] Phương pháp xác định giống như phương pháp sử dụng cho mẫu chuẩn Quốc tế Trong trường hợp sử dụng phương pháp khác cần có sự chuyển đổi đơn vị phù hợp

Độ chân không, cảm quan: Đ y là chỉ tiêu quan trọng cần được kiểm tra vì bất

kỳ sự nứt, vỡ dù rất nhỏ của ống đông hô sẽ khiến độ ẩm tồn dư trong ống t ng lên

Độ ẩm tồ dư: Với mẫu chuẩn đông hô độ ẩm tồn dư được coi là thông số

then chốt bậc nhất giúp cho sản phẩm ổn định l u dài đặc biệt là với vắc xin bạch hầu Vắc xin bạch hầu sản xuất t giải độc tố bạch hầu (một loại protein) Phản ứng giáng hóa protein xảy ra với x c tác là nước Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự kết

tụ và những phản ứng có hại hác đối với protein c liên quan đến hàm lượng nước tồn dư cao trong ống Tiêu chuẩn cho chỉ tiêu này đối với vắc xin mẫu chuẩn Quốc gia là dưới 3% [17, 22]

Tính vô khuẩn: sản phẩm không bị nhiễm vi sinh vật sẽ có tính ổn định lâu dài Tính ổ định:Công hiệu cần được kiểm tra nhiều lần, ở nhiều thời điểm và nhiệt

độ bảo quản hác nhau Qua đ ước tính được thời gian sử dụng của sản phẩm lưu trữ

và phân phối đến các phòng thí nghiệm Sản xuất mẫu chuẩn là công việc tốn nhiều thời gian, công sức nên mẫu chuẩn sản xuất phải có hạn dùng lâu dài (ít nhất 10 n m Phải sản xuất với số lượng đủ lớn để phục vụ cho sử dụng cũng như nghiên cứu trong nhiều

n m.[8]

Sự khác biệt lớn nhất giữa mẫu chuẩn Quốc tế với mẫu chuẩn Quốc gia là: Với mẫu chuẩn Quốc tế cần có sự hợp tác giữa nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới trong việc sản xuất cũng như trong iểm định chất lượng Còn với mẫu chuẩn Quốc gia thì có thể chấp nhận việc hợp tác ở phạm vi trong một Quốc gia.[8]

1.3.4 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc t

Vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ nhất sản xuất n m 1955 ở dạng hấp phụ với gel nhôm hydroxit đạt 132 IU/ống N m 1978 Vắc xin Bạch hầu mẫu chuẩn Quốc tế lần thứ hai được sản xuất bởi Viện SSI dưới dạng ống đông khô Mỗi ống chứa 100 Lf giải độc tố, 1 mg Al+++, 26mg Haemacel khô đạt 132 IU/ống Cả hai mẫu chuẩn này đều được xác định công hiệu bằng phương pháp thử thách trên chuột lang Sau đ Yenny và cộng sự đã sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn ở dạng nước và xác định công hiệu trên tế bào Vero thay thế cho phương pháp thử thách trên chuột lang Mẫu chuẩn này đạt 173IU/ml Tuy nhiên mẫu này sau đ giảm công hiệu há nhanh nên hông được sử dụng làm mẫu chuẩn Quốc tế [10] Mẫu chuẩn lần thứ ba do Sanofi (Pháp) sản xuất n m 1999 với công thức :

70 Lf giải độc tố bạch hầu, 1 mg Al+++, 10 mg trehalose trên một ống đạt công hiệu

160 IU/ống Mẫu chuẩn này được mã hóa 98/560.[8]

Vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu Quốc tế lần thứ tư (4th WHO International Standard for Diphtheria Toxoid Adsorbed được tuyển chọn t hai vắc xin dự tuyển do công ty Sanofi Pasteur (Pháp) và công ty Biken (Nhật Bản) sản xuất Mẫu chuẩn này được kiểm tra các chỉ tiêu như: Cảm quan độ ẩm tồn dư độ vô trùng, chân không, trọng lượng khô, công hiệu Riêng với thử nghiệm công hiệu, NIBSC

đã tiến hành hợp tác với 30 phòng thí nghiệm của 20 quốc gia trên thế giới kiểm tra Kết quả vắc xin mẫu chuẩn dự tuyển của Biken với mã số 07/216, công hiệu đạt

213 IU/ống (theo phương pháp thử thách trên chuột lang đã được lựa chọn N m

2014 WHO đã công bố đ y là giá trị công hiệu được xác định bằng phương pháp thử thách trên chuột lang và mẫu chuẩn Quốc gia khi nối chuẩn phải sử dụng phương pháp này Mẫu chuẩn này hiện chưa c đơn vị Quốc tế trên phương pháp miễn dịch ở chuột nhắt[8] Đ y là h h n rất lớn cho các Quốc gia khi cần chuẩn định mẫu chuẩn Quốc gia vì phương pháp thử thách trên chuột lang đ i hỏi lượng chuột lang khá lớn (ít nhất 72 chuột/ lần) Không phải phòng thí nghiệm nào cũng

có thể c được lượng chuột lang nhiều như vậy trong một thời điểm Hơn nữa chuột lang giá cũng rất đắt khiến giá thành của phương pháp này rất cao

1.3.5 Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia

Vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia (Việt Nam) là loại chuẩn chính thứ

cấp (Secondary reference standards được sử dụng làm chất chuẩn chính trong thử

nghiệm công hiệu bạch hầu tại NICVB và tại các nhà sản xuất trong nước

N m 1991 viện Vắc xin (IVAC đã phối hợp cùng Cencobi tiến hành sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia Vắc xin mẫu chuẩn hi đ được sản xuất dưới dạng lỏng, cho công hiệu trên 300 IU ml nhưng đã bị giảm công hiệu rất nhanh Chỉ sau ba n m công hiệu đã giảm gần như về không

N m 1999 GS.Nguyễn Thị Kê cùng cộng sự đã sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia theo công thức:

Trong 1 ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu:

- 60 Lf giải độc tố bạch hầu

- AlPO4 6mg

- NaCl: 0.09 g

- Merthiolate: 100 µg

- Dung dịch Dextran 3% (cho dạng đông hô

Kết quả: Mẫu chuẩn đông hô mã số RD4 đạt công hiệu 172 IU/ống (đơn vị trên chuột nhắt) và 340 IU/ống (đơn vị trên chuột lang) Mẫu chuẩn dạng nước mã

số RD5 đạt công hiệu 173 IU/ml [3]

Tuy nhiên, mẫu chuẩn dạng nước cũng giảm công hiệu rất nhanh sau đ c n dưới 30 IU ml và hông được sử dụng Mẫu chuẩn đông hô c công hiệu chưa cao nên cần dùng tới bốn ống mẫu chuẩn cho một lần kiểm định dẫn đến kết quả chưa đầy hai n m đã hết

N m 2006 NICVB phối hợp với IVAC tiếp tục sản xuất vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn Quốc gia theo công thức:

Trong 1 ml vắc xin mẫu chuẩn bạch hầu:

Mục tiêu sản xuất mẫu chuẩn bạch hầu có công hiệu cao (trên 500 IU ml để chỉ dùng một ống mẫu chuẩn cho một lần kiểm định Mẫu chuẩn này phải có sự ổn định công hiệu đáp ứng nhu cầu sử dụng trong thời gian dài (ít nhất n m n m và

c đáp ứng trên chuột nhắt để có thể chuyển đổi sang đơn vị chuột nhắt

Vắc xin bạch hầu là vắc xin giải độc tố nên giá trị công hiệu thu được phụ thuộc vào hàm lượng kháng nguyên và tá chất đưa vào Thành phần ho gà trong vắc xin DTP phối hợp gi p t ng công hiệu của bạch hầu và uốn ván Do đ vi khuẩn

ho gà được thêm vào mẫu chuẩn RD6 như là một tá chất và t ng hoạt tính so với các nghiên cứu trước đ Ngoài ra, hàm lượng kháng nguyên bạch hầu trong mẫu RD6 cũng t ng lên là 90 Lf ml Số lượng mẫu sản xuất là 2370 ống vắc xin bạch hầu đông hô Nhiệt độ bảo quản: -200C

Việc kiểm định thực hiện bắt đầu t nguyên liệu đầu như: chủng gốc, chủng sản xuất nước, hóa chất pha môi trường, lọ, nắp nhãn… Trong quá trình sản xuất việc giám sát và kiểm định chất lượng phải thực hiện thường xuyên theo đ ng SOP Trong phòng thí nghiệm, việc kiểm định chất lượng vắc xin này dựa trên các tiêu chí chính sau đ y:

 Công hiệu bạch hầu

Nghiên cứu trước đ y của GS Kê và cộng sự trong việc chuẩn định Mẫu chuẩn bạch hầu Quốc gia RD4 có kiểm tra các thử nghiệm trên nhưng chưa c kết quả của các phòng thí nghiệm khác nhau nên trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai phòng thí nghiệm là khoa KĐVX Vi huẩn (NICVB) và phòng QC(IVAC) làm các thử nghiệm song song Điều này cũng phù hợp với khuyến cáo mới nhất của WHO là có sử dụng kết quả của các phòng thí nghiệm khác nhau trong việc chuẩn định Mẫu chuẩn Quốc gia [3]

1.5 ĐỘNG VẬT DÙNG TRONG KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BẠCH HẦU

Chuột nhắt và chuột lang là loài động vật được dùng phổ biến nhất trong nghiên cứu y sinh học trong đ có sản xuất và kiểm định vắc xin Đặc biệt, trong kiểm định chất lượng vắc xin DTP hai loài này được sử dụng trong các thử nghiệm quan trọng là an toàn, công hiệu Trong phép thử xác định công hiệu của vắc xin, phương pháp thử thách trên động vật thí nghiệm thường cho kết quả chính xác nhất Phương pháp thử thách trên động vật chính là gây miễn dịch cho động vật bằng kháng nguyên, sử dụng độc tố gây bệnh của vi sinh vật gây bệnh cho động vật đã miễn dịch Xem đáp ứng của động vật theo tỷ lệ sống/ chết hoặc mức độ liệt để đánh giá

Chuột lang có nguồn gốc t núi Andes ở Nam Mỹ, t Colombia và Venezuela xuống Brazil và Argentina Lần đầu tiên chuột lang được sử dụng như

động vật thí nghiệm là vào đầu thế kỷ 19 Chuột lang thuộc bộ Rodentia, tiểu bộ

Hystricomorpha, họ Caviidae Chuột lang có ba loại lông ngắn: English, lông xù xì

với các đốm hình hồng: Abyssian và lông dài: Peruvian Chuột lang lông ngắn hầu hết được dùng trong nghiên cứu y sinh học và chiếm 2-3% tất cả các động vật thí nghiệm đã sử dụng Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chuột English, do IVAC cung cấp Chuột lang là loài động vật phổ biến thứ tư (sau chuột nhắt, chuột

Na Uy và thỏ) Mặc dù theo xu hướng chung là giảm số lượng động vật trong nghiên cứu trong những n m gần đ y nhưng chuột lang vẫn là một động vật thí nghiệm quan trọng vì những đặc điểm độc đáo hông tìm thấy ở các loài gặm nhấm khác Chuột lang là loài động vật thí nghiệm gặm nhấm ít hung hãn nhất, có thể vì lịch sử thuần h a l u đời của nó Nên các nghiên cứu sinh hóa, miễn dịch học, sinh

lý học và dược học thường được tiến hành trên đối tượng này Ch ng được sử dụng chủ yếu cho sản xuất và kiểm soát huyết thanh, kiểm định chất lượng vắc xin và các chế phẩm sinh học Chuột lang dễ gây mẫn cảm, bằng cách tiêm nhắc lại trong một phản ứng quá mẫn Điều này được thực hiện để nghiên cứu phản ứng quá mẫn chậm như đáp ứng miễn dịch tương tự như đáp ứng miễn dịch ở người Ngoài ra, chuột lang là một vật chủ phù hợp cho một số bệnh do các vi khuẩn gây ra, chúng rất nhạy cảm với một số các bệnh lây nhiễm như lao bạch hầu…Đặc biệt chuột

lang rất nhạy cảm với độc tố bạch hầu Đ y là đặc tính quan trọng giúp cho chuột lang là loài động vật được nhiều phòng thí nghiệm c uy tín ưu tiên sử dụng cho thử nghiệm xác định công hiệu bạch hầu vì phương pháp thử thách trên chuột lang cho kết quả chính xác nhất Tuy nhiên, chuột lang chỉ đẻ 2-5 con trong một lần sinh

và một n m đẻ khoảng 3,7 lần, lại có trọng lượng lớn (chuột trưởng thành khoảng 800g – 1200g)nên so với chuột nhắt thì chuột lang c giá thành đắt hơn rất nhiều và cũng cần diện tích lớn hơn trong việc nuôi dưỡng cũng như hi làm thí nghiệm

Đ y cũng là h h n rất lớn cho các nước đang phát triển khi làm thử nghiệm công hiêu bạch hầu trên chuột lang, vì số lượng chuột này cho một lần làm thử nghiệm ít nhất là 72 chuột Không phải phòng thí nghiệm nào cũng c hả n ng c

và nuôi được số lượng lớn chuột này cho một thử nghiệm Ở Việt Nam hiện chỉ có Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (IVAC) là có thể cung cấp được số lượng chuột lang đáp ứng được nhu cầu trên [13]

Chuột nhắt là loài động vật được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu y

sinh Nó thuộc bộ Rodentia, họ Muridae, loài Mus[8] Ít nhất khoảng 1000 chủng

chuột nhắt hác nhau được sử dụng trong phòng thí nghiệm Chuột nhắt có hai loại chuột thuần chủng (in-bred) : chuột BALBc và không thuần chủng (out-bred) Dù sử dụng chuột thuần chủng cho kết quả đồng nhất hơn tuy nhiên đa dạng di truyền của chúng có giới hạn và đôi hi ch ng lại nhạy cảm với ảnh hưởng của môi trường hơn Bên cạnh đ phép ngoại suy với con người cũng dễ hơn nếu thử nghiệm sử dụng chuột không thuần chủng Thêm vào đ chuột thuần chủng c giá thành đắt hơn chuột không thuần chủng khá nhiều Nên hầu hết chủng chuột sử dụng cho kiểm định vắc xin

là chuột không thuần chủng [33] Trong đ chuột Swiss là loài được sử dụng tương đối rộng rãi Chuột Swiss trắng (Lynch 1969) có nguồn gốc t một nhóm chuột nhỏ (02 đực và 07 cái được đưa t Trung tâm Anticancéreux Romand de Lausance (Switzerland đến Viện Roc erfeller New Yor vào n m 1962 Sau đ Viện này đã

nh n đàn và cung cấp rộng rãi ra toàn thế giới [8, 11] NICVB và IVAC cũng đang duy trì chuột này phục vụ cho làm thí nghiệm tại Viện Tuy nhiên, chuột nhắt lại không nhạy cảm với độc tố bạch hầu nên thử nghiệm công hiệu bạch hầu bằng phương pháp

thử thách không áp dụng được Thay vào đ n m 1974, Miyamura K và cộng sự đã tiến hành phương pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin bạch hầu thông qua việc sử dụng tế bào Vero Tế bào Vero là dòng tế bào nhạy cảm nhất với độc

tố bạch hầu, do nó có khả n ng chiếm được số lượng rất lớn các receptor của độc tố này So với chuột lang, chuột nhắt c ích thước nhỏ hơn (< 50g chuột), số lượng con trong một lần đẻ cũng cao hơn (4-12 chuột/ lứa), số lần đẻ trong n m cũng cao hơn (khoảng 8 lứa n m nên phương pháp này cho giá thành rẻ hơn và tính hả thi cao hơn so với phương pháp dùng chuột lang, nhất là với những nước đang phát triển như Việt Nam

Nhìn chung, với thử nghiệm trên động vật đáp ứng có thể quan sát và định lượng được dựa trên biểu hiện “dương tính’ hay “ m tính” hoặc “sống” hay

“chết” Một số đáp ứng sinh l đặc biệt có thể xác định được như thay đổi nhiệt

độ, mức độ sản xuất kháng thể t ng giảm trọng lượng Khác với các thử nghiệm

h a l thường c độ chính xác cao, các thử nghiệm sinh học trên động vật thí nghiệm có thể xác định hoạt tính sinh học với tính đặc hiệu và độ nhạy cao nhưng lại cho kết quả với độ chính xác thấp và độ biến thiên lớn tức là độ tái lặp thấp Đặc biệt với thử nghiệm công hiệu độ dao động của 95% khoảng tin cậy phụ thuộc vào độ dao động trong đáp ứng giữa động vật với động vật và phạm vi này c độ dao động rất lớn Theo thống kê, ở Châu Âu có khoảng 37% thử nghiệm công hiệu bạch hầu phải tiến hành lại do kết quả hông đáp ứng được các tiêu chuẩn của thử nghiệm có giá trị [34] Như vậy để thấy rằng thử nghiệm trên động vật thí nghiệm gặp khá nhiều h h n

1.6 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CÔNG HIỆU BẠCH HẦU

WHO TRS cũng như Dược điển ch u Âu Dược điển Việt Nam khuyến cáo công hiệu bạch hầu cần được kiểm tra trên tất cả các lô vắc xin sản xuất Công hiệu vắc xin của nhà sản xuất được kiểm định bằng việc so sánh với vắc

xin mẫu chuẩn Quốc gia (secondary reference standards và được tính theo

đơn vị IU C hai phương pháp iểm tra công hiệu bạch hầu đang được sử dụng

phổ biến đ là phương pháp thử thách trên chuột lang (sau đây xin được gọi là

phương pháp trên chuột lang và đơn vị công hiệu thu được từ phương pháp này gọi

là đơn vị chuột lang và phương pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt trên tế bào

Vero (sau đây xin được gọi là phương pháp trên chuột nhắt và đơn vị công hiệu thu

được từ phương pháp này gọi là đơn vị chuột nhắt)

Theo khuyến cáo mới nhất của WHO, do vắc xin bạch hầu mẫu chuẩn quốc tế được xác định công hiệu bằng phương pháp thử thách trên chuột lang nên khi chuẩn định mẫu chuẩn Quốc gia cũng phải sử dụng phương pháp này cho thử nghiệm công hiệu[30, 35] Sau đ các ph ng thí nghiệm có thể tiến hành chuyển đổi sang đơn vị chuột nhắt để sử dụng trong các thử nghiệm thường quy (nếu phù hợp)

1.6.1 P ươn p áp t ử thách trên chuột lang

Mối liên hệ giữa phương pháp này với sự đáp ứng nồng độ kháng thể trên người đã được nghiên cứubởi Greenberg t n m 1953 Theo đ lượng giải độc tố đưa vào tỷ lệ thuận với sự đáp ứng nồng độ kháng thể ở trẻ nhỏ Do chuột lang có

độ nhạy cao với độc tố bạch hầu nên đ y là phương pháp được coi là tiêu chuẩn vàng trong kiểm tra công hiệu bạch hầu [9]

Nguyên lý: Đưa giải độc tố bạch hầu (protein) vào cơ thể chuột lang

(kháng nguyên) Cơ quan miễn dịch của chuột lang sẽ sinh kháng thể, kháng thể này có khả n ng trung hoà độc tố bạch hầu đưa vào sau đ Mức độ trung hòa tỷ lệ thuận (đến một giới hạn nhất định hông quá ngưỡng của sự tê liệt miễn dịch) với lượng giải độc tố đưa vào Đánh giá mức độ trung hòa bằng đáp ứng trên chuột theo các cấp độ nhiễm độc t nhẹ đến nặng như: mất th ng bằng, liệt, chết Tỷ lệ sống/ chết là thước đo công hiệu của vắc xin

Kỹ thuật: Chuột lang được tiêm miễn dịch (chứa giải độc tố bạch hầu) với mẫu

vắc xin chuẩn (đã biết công hiệu) và mẫu vắc xin thử (chưa biết công hiệu) ở các khoảng nồng độ khác nhau Sau khoảng thời gian tuần thứ 4-6 sau khi tiêm miễn dịch, toàn bộ chuột được tiêm thử thách với khoảng 50 liều LD50 độc tố bạch hầu Theo dõi động vật trong 5-7 ngày và ghi lại tỷ lệ sống chết ở mỗi độ pha[28][13]

Tính kết quả và biện luận: Kết quả được tính theo chương trình Probit

analysis Đ y là chương trình tính ết quả cho những phép thử định lượng (xác định công hiệu) của vắc xin theo phương pháp tiêm thử thách bằng đường tiêm dưới da

Dữ liệu đưa vào tính ết quả là tỷ lệ sống/chết của động vật ở các độ pha loãng của mẫu chuẩn và mẫu thử Trong phép tính toán này, liều biến đổi theo hàm logarit của liều, và tỷ lệ đáp ứng quan sát được sẽ biến đổi theo mô hình probit So sánh tương quan giữa mẫu chuẩn và mẫu thử để tính kết quả công hiệu của mẫu thử theo mẫu chuẩn[28]

Theo đ để thử nghiệm có giá trị thì phải đáp ứng các tiêu chuẩn sau:

ED50 của mỗi loạt vắc xin phải nằm giữa liều miễn dịch nhỏ nhất và lớn nhất.Đáp ứng của chuột ở các độ pha loãng phải đạt được tính tuyến tính theo hàm logarit và probit

Ưu điểm của phương pháp thử thách trên chuột lang là cho kết quả c độ chính xác cao Phương pháp này đã được sử dụng để xác định công hiệu của Mẫu chuẩn bạch hầu Quốc tế lần thứ tư[19, 29] Như trên đã đề cập nhược điểm của phương pháp là sử dụng nhiều chuột lang, tốn kém

1.6.2 P ươn p áp c uẩn độ kháng thể chuột nhắt

Hàm lượng háng độc tố trong huyết thanh của những động vật (chuột nhắt hoặc chuột lang đã được miễn dịch bằng vắc xin được chuẩn độ bằng phản ứng Schick (phản ứng trung hòa trong da) hoặc trên nuôi cấy tế bào Vero, hoặc bằng phản ứng ngưng ết thụ động

Nguyên lý của phương pháp: Do chuột nhắt không nhạy cảm với độc tố bạch hầu nên không thể sử dụng phương pháp thử thách trên chuột nhắt với thử nghiệm công hiệu bạch hầu Tế bào Vero là dòng tế bào nhạy cảm nhất với độc tố bạch hầu,

do nó có khả n ng chiếm được số lượng rất lớn các receptor của độc tố này Phương pháp chuẩn độ kháng thể chuột nhắt để đánh giá hả n ng trung h a độc tố của kháng thể được tạo ra ở chuột sau khi tiêm miễn dịch thông qua tế bào Vero Tế bào được cấy vào phiến 96 giếng cùng với độc tố bạch hầu và huyết thanh chuột chứa kháng thể kháng bạch hầu ở những nồng độ khác nhau Kháng thể háng độc