Điều tra ca bệnh melioidosis trên lâm sàng và nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn burkholderia pseudomallei ngoài môi trường ở bắc miền trung việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hoàng Sỹ Tiếp ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI NGO

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hoàng Sỹ Tiếp

ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI NGOÀI MÔI TRƯỜNG Ở BẮC MIỀN TRUNG

VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hoàng Sỹ Tiếp

ĐIỀU TRA CA BỆNH MELIOIDOSIS TRÊN LÂM SÀNG VÀ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA VI KHUẨN BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI NGOÀI MÔI TRƯỜNG Ở BẮC MIỀN TRUNG

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài luận văn, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới

TS Trịnh Thành Trung, Ths Bùi Nguyễn Hải Linh cùng toàn bộ các cán bộ Viện Vi Sinh Vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội (IMBT) đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp này

Đồng thời, tôi cũng muốn gửi những lời cảm ơn tới TS Phạm Đức Ngọc và các quý thầy cô của bộ môn Vi sinh vật - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã động viên và hỗ trợ tôi rất nhiều trong qua trình thực hiện

Ngoài ra, tôi cũng muốn cảm ơn những người bạn, những người luôn sát cánh bên tôi những lúc khó khăn và giúp tôi vượt qua để hoàn thành luận văn một cách tốt nhất

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi luôn biết ơn và ghi nhớ những sự giúp đỡ hết sức quý báu đó

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Hoàng Sỹ Tiếp

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH 1

DANH MỤC BẢNG 4

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 5

MỞ ĐẦU 6

Chương 1- TỔNG QUAN 7

1.1.Giới thiệu về bệnh melioidosis 7

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 7

1.1.2 Dịch tễ học 7

1.1.3 Con đường lây nhiễm 9

1.1.4 Đặc điểm lâm sàng 10

1.1.5 Chuẩn đoán 12

1.1.6 Điều trị lâm sàng 14

1.2 Chi Burkholderia 15

1.2.1 Giới thiệu về chi Burkholderia 15

1.2.2 Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei 18

CHƯƠNG II - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguyên vật liệu 23

2.1.1 Mẫu bên ngoài môi trường 23

2.1.2 Chủng vi sinh vật 23

2.2 Hóa chất, thiết bị 24

2.2.1 Hóa chất 24

2.2.2 Thiết bị 24

2.2.3 Môi trường nuôi cấy sử dụng 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.1 Điều tra các ca bệnh lâm sàng 25

2.3.2 Thu thập mẫu đất ngoài môi trường 25

2.3.3 Phương pháp tách chiết ADN từ mẫu đất 26

2.3.4 Phương pháp phát hiện vi khuẩn B pseudomallei bằng realtime PCR 26

2.3.5 Phương pháp nuôi cấy để phát hiện vi khuẩn B pseudomallei từ mẫu đất 27 2.3.6 Multilocus sequence typing (MLST) 27

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Điều tra các ca bệnh melioidosis trên lâm sàng ở Bắc Miền Trung Việt Nam tháng 06 - 12/2015 30

3.1.1 Số lượng ca bệnh và thông tin nhân khẩu học 31

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng và điều trị 33

3.1.3 Phân bố nơi cư trú của bệnh nhân 36

3.2 Điều tra sự phân bố của vi khuẩn Burkholderia pseudomallei ngoài môi trường 36

3.2.1 Bản đồ phân bố vi khuẩn được phát hiện bằng kỹ thuật realtime PCR 36

3.2.2 Bản đồ phân bố vi khuẩn được phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy 42

3.3 Phân tích dịch tễ học phân tử 43

3.3.1 Phân tích Multilocus sequence typing (MLST) 43

3.3.2 Mối quan hệ kiểu gen của các chủng B pseudomallei ở Bắc Miền Trung Việt Nam và các khu vực khác trên thế giới 45

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Sự phân bố của vi khuẩn B pseudomallei và vị trí các ca bệnh

melioidosis theo dữ liệu thu được từ 1910 - 2014

Hình 1.5 Đặc tính sinh học của vi khuẩn B pseudomallei 13

Hình 1.6 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn Burkholderia pseudomallei BG

02 sau 4 ngày nuôi cấy ở 37°C trên môi trường Ashdown Agar

14

Hình 1.7 Cây phân loại dựa trên trình tự rARN 16S của các loài thuộc chi

Burkholderia

17

Hình 1.8 Hình thái tế bào của vi khuẩn B pseudomallei 19

Hình 1.9 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Burkholderia pseudomallei trên môi

trường Ashdown Agar

19

Hình 1.10 Sự xâm nhập và sinh trưởng của Burkholderia pseudomallei

trong nội bào

21

Hình 2.1 Bản đồ vị trí mẫu đất thu thập ở 5 tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt

Nam vào tháng 09 năm 2016

23

Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện số lượng ca bệnh được xét nghiệm chuẩn đoán

nhiễm bệnh melioidosis tại 5 bệnh viện tham gia cuộc khảo sát từ 06 –

12/2015

31

Hình 3.2 Biểu đồ nghề nghiệp của bệnh nhân nhiễm bệnh melioidosis tại

Bắc Miền Trung Việt Nam

32

Hình 3.3 Biểu đồ độ tuổi bệnh nhân nhiễm bệnh melioidosis tại Bắc Miền

Trung Việt Nam

32

Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện số lượng ca bệnh xuất hiện ở các tháng trong

khoảng từ 6 - 12/2015

33

Hình 3.5 Bản đồ phân bố các ca bệnh melioidosis ở 5 tỉnh Bắc Miền Trung

Việt Nam theo báo cáo của 5 bệnh viện tham gia quá trình khảo sát dựa trên

thông tin địa chỉ của các bệnh nhân

37

Hình 3.6 Hình ảnh môi trường chọn lọc Ashdown Agar khi cấy trải dịch

nổi được làm giàu lần 2 với môi trường Galimand Broth biến đổi

40

Hình 3.7 Số lượng điểm dương tính tương ứng với số mẫu dương tính trên

từng điểm lấy mẫu theo phương pháp phát hiện bằng kỹ thuật realtime PCR

41

Hình 3.8 Bản đồ phân bố vi khuẩn B pseudomallei trong đất dựa trên kết

quả realtime PCR ở 5 tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt Nam

41

Hình 3.9 Bản đồ phân bố của vi khuẩn B pseudomallei trong đất nông

nghiệp tại 5 tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt Nam dựa trên kết quả nuôi cấy

42

Hình 3.10 Số lượng điểm dương tính tương ứng với số mẫu dương tính trên

từng điểm lấu mẫu theo phương pháp phát hiện bằng kỹ thuật nuôi cấy

43

Hình 3.11 Tổ hợp dòng (Clonal Complex) của B.pseudomallei trên toàn thế

giới được xác định bằng goeBURST

46

Hình 3.12 Sự phân bố của các ST có nguồn gốc từ Việt Nam (A, B, C, D)

bên cạnh sự phân bố của các ST thuộc vùng khác như Australia, Thái Lan

48

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Trình tự các mồi và kích thước các mảnh gen được khuếch đại 28 Bảng 3.1 Thông tin lâm sàng của các ca bệnh ở Bắc Miền Trung Việt Nam 34 Bảng 3.2 Giá trị Ct của các mẫu đất dương tính ở các giai đoạn làm giàu 37

Bảng 3.3 Kết quả phân tích Multilocus sequence typing (MLST) 44

CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Bcc: Burkholderia cepacia complex

CF: Cystic fibrosis (Chứng xơ nang)

CDC: U.S Centers for Disease Control and Prevention

MALDI-TOF MS: Matrix - assisted laser desorption/ionization of time - of - flight mass spectrometry

MHA: Mueller Hinton Agar

CLSI: The Clinical & Laboratory Standards Institute

TSB: Tryptone Soya Broth

MRI: Magnetic Resonnace Imaging

TTSS1: The type three secretion system 1

ADN: Acid deoxyribonucleic

MỞ ĐẦU

Bệnh melioidosis (hay còn gọi là bệnh whitmore) là một bệnh truyền nhiễm cấp

tính nguy hiểm ở người và động vật do vi khuẩn Burkholderia pseudomallei gây nên

Đây là căn bệnh có bệnh cảnh lâm sàng đa dạng và phức tạp, do đó dễ bị chuẩn đoán nhầm thành các bệnh khác, bệnh melioidosis có diễn tiến lâm sàng nhanh và có thể gây tử vong nếu không áp dụng phác đồ kháng sinh điều trị phù hợp Từ lâu, Việt Nam

là nước nằm trong tâm điểm của dịch bệnh nhưng số liệu báo cáo về ca bệnh vẫn còn rất ít Đến nay, chỉ có hai báo cáo ở một bệnh viện phía Bắc và một bệnh viện phía

Nam Do đó, toàn bộ dịch tễ học về ca bệnh cũng như sự phân bố của vi khuẩn B pseudomallei ở miền Trung Việt Nam vẫn còn bỏ ngỏ Bên cạnh đó, xét nghiệm nuôi cấy B pseudomallei từ mẫu bệnh phẩm gặp rất nhiều khó khăn, các máy xét nghiệm

định danh thường quy như Phoenix 100 hay API 20NE thường định danh sai vi khuẩn gây bệnh melioidosis Điều này gây ra tình trạng chuẩn đoán nhầm bệnh và điều trị kháng sinh không đúng, làm tăng nguy cơ tử vong

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Điều tra ca bệnh melioidosis trên lâm

sàng và nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn Burkholderia pseudomallei ngoài môi

trường ở Bắc Miền Trung Việt Nam” với nội dung:

- Ứng dụng kỹ thuật định danh vi khuẩn đơn giản để phát hiện ca bệnh whitmore ở Bắc Miền Trung Việt Nam

- Lập bản đồ để xác định sự phân bố của vi khuẩn B pseudomallei trong đất

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về bệnh melioidosis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Bệnh melioidosis là bệnh truyền nhiễm cấp tính được gây ra bởi vi khuẩn

Gram âm Burkholderia pseudomallei Nó được phát hiện lần đầu tiên với tên Bacillus pseudomallei bởi Alfred Whitmore và C.S Krishnaswami trong số

những người nghiện morphine ở Rangoon, Myanmar (Burma) năm 1911 [6, 20] Ban đầu, bệnh xuất hiện với tên “glanders - like” Nhưng đến năm 1932, Stanton và Fletcher đề xuất tên “melioidosis” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, mô tả tình trạng tương tự với bệnh Glanders - Một bệnh truyền nhiễm ở ngựa [3]

1.1.2 Dịch tễ học

Melioidosis là một bệnh truyền nhiễm xuất hiện phổ biến ở Đông Nam Á, Bắc Australia, và các quốc gia đang phát triển ở khu vực nhiệt đới, tương ứng với vùng nhiệt đới giữa vĩ độ 20oN và 20oS [3] Ở Đông bắc Thái Lan, có khoảng 2000

ca bệnh melioidosis được ghi nhân mỗi năm với tỷ lệ tử vong lên đến 40%, tỷ lệ này cao thứ 3 trong các bệnh gây tử vong nơi đây (sau HIV/AIDS và lao) Còn tại Singapore (một đất nước phát triển với tỷ lệ nông dân thấp) cũng đã xác nhận có

550 ca trong suốt 10 năm qua và trong đó 1/5 bị tử vong [14] Trong năm 2015, ước tính có khoảng 165.000 ca bệnh trong 3 tỷ người sống ở những vùng đất có nguy cơ

nhiễm B pseudomallei (tỷ lệ 5.0 trên 100.000 có nguy cơ mắc bệnh mỗi năm) và

Ngoài ra, tỷ lệ mắc bệnh melioidosis ở Thái Lan và các nước lân cận xuất

hiện tương đồng với sự hiện diện của vi khuẩn B pseudomallei ở trong đất Tỷ lệ có

thể tăng lên ở một khu vực nhất định sau các thảm họa thiên nhiên như trận sóng thần năm 2004 hay cơn bão Haitang làm tăng tỷ lệ mắc bệnh từ 0.7 – 70 trên 100.000 người một năm tại Tây Nam Đài Loan năm 2005 [14]

Bảng 1.1 Ước tính số ca bệnh melioidosis năm 2015 [16]

Vùng

Dân số có nguy

cơ

Triệu người (khoảng tin cậy)

Số ca bệnh melioidosis

Nghìn người (khoảng tin cậy)

Số ca tử vong vì melioidosis

Nghìn người (khoảng tin cậy)

Đông Á và TBD 858 (795-920) 65 (28-161) 31 (13-77) Cận Sahara Châu Phi 602 (482-695) 24 (8-72) 15 (6-45)

Mỹ Latin và Caribe 246 (153-334) 2 (1-7) 1 (<1-3)

Hình 1.1 Sự phân bố của vi khuẩn B pseudomallei và vị trí các ca bệnh

melioidosis theo dữ liệu thu được từ 1910 – 2014 [16]

Theo các báo cáo công bố từ năm 1910 - 2014, 22.338 vị trí địa lý ghi nhận

sự hiện diện của melioidosis ở người và động vật cũng như sự hiện diện của B pseudomallei ngoài môi trường, dữ liệu này được tổng hợp ở hình 1.1

1.1.3 Con đường lây nhiễm

Vi khuẩn B pseudomallei sống chủ yếu trong đất và nước, cho nên những

người tiếp xúc thường xuyên với hai nguồn này có nguy cơ nhiễm bệnh cao Vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua con đường tiếp xúc và hô hấp Quan sát cho thấy rằng, người lao động nông nghiệp đặc biệt là người nông dân những người thường xuyên tiếp xúc với đất và nước trong thời gian dài, nếu có vết thương trên da nhưng không được các thiết bị bảo vệ, có thể tiếp xúc vùng da bị tổn thương với nguồn đất nước ô nhiễm thì nguy cơ nhiễm bệnh tương đối cao (Hình 1.2) [3, 4]

Hình 1.2 Hình thức nhiễm bệnh thông qua tiếp xúc với nguồn đất nước chứa B

pseudomallei (A: Người nông dân trồng lúa ở Campuchia, B: tiếp xúc với nguồn

nước ô nhiễm tại Bắc Australia) [3,4]

Đối với con đường hô hấp, vi khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể thông qua việc hít các tác nhân gậy bệnh Dựa trên các nghiên cứu của quân đội Mỹ, thì nhiều cựu binh Mỹ đặc biệt là không quân, sau khi chiến đấu ở Việt Nam trở về cũng biểu

hiện các triệu chứng lâm sàng nhiễm bệnh melioidosis do vi khuẩn B pseudomallei

có khả năng tiềm ẩn trong cơ thể người bệnh Nên melioidosis còn được gọi với cái tên “Vietnamese Time Bomb” để chỉ ra đây là bệnh truyễn nhiễm nguy hiểm nhiễm

tại Việt Nam, sau đó ủ bệnh và khởi phát các triệu chứng lâm sàng khi hệ thống miễn dịch của các cựu binh Mỹ bị suy yếu Quá trình lây nhiễm qua cơ chế này được phát hiện năm 1950, cùng với đó là sự tăng nguy cơ mắc bệnh trong giai đoạn mùa mưa, khi mà cơ thể hít phải không khí trong thời tiết khắc nghiệt Trong một

số nghiên cứu cho rằng, các bệnh nhân nhiễm bệnh tại Singapore, có biểu hiện bệnh trong thời kỳ mưa lớn, đều là người lớn tuổi và không có tiền sử tiếp xúc với đất hoặc nước [3]

1.1.4 Đặc điểm lâm sàng

1.1.4.1 Các yếu tố nguy cơ

Tỷ lệ mắc bệnh melioidosis cao ở những người bị suy giảm miễn dịch và có tiền sử mắc bệnh đi kèm Đái tháo đường là nguy cơ quan trọng và phổ biến nhất, một nghiên cứu đã chỉ ra 60,9% bệnh nhân bị đái tháo đường Các nhóm có nguy

cơ cao khác bao gồm người bị suy thận mãn tính (chiếm 12% số ca), bệnh phổi (27% số ca), bệnh tan máu bẩm sinh - thalassaemia, bệnh suy tim xung huyết, điều trị bằng corticosteroid, khối u ác tính (đặc biệt là bệnh máu trắng và u bạch huyết),

và suy giảm miễn dịch Nó còn kết hợp với việc uống rượu trong một thời gian dài

và có tiền sử nghiện rượu Điều này thể hiện rõ ở 39% các ca bệnh ở Bắc Australia

và 12% ca bệnh melioidosis ở Thái Lan Ngoài ra, việc ăn kava (cây bụi nhỏ thuộc

họ hồ tiêu có nguồn gốc từ Nam Thái Bình Dương) cũng đã được liên hệ với việc tăng nguy cơ mắc bệnh melioidosis, 8% ca bệnh ở Bắc Australia do tiêu thụ một lượng lớn kava

Những người tiếp xúc thường xuyên với đất và nước cũng có nguy cơ mắc

bệnh cao, đặc biệt là nông dân trồng lúa và người lao động [6]

1.1.4.2 Biểu hiện lâm sàng

Thời gian phơi nhiễm B pseudomallei và bắt đầu biểu hiện các triệu chứng

lâm sàng của bệnh là rất khác nhau và khó xác định Trong một nghiên cứu, 25% các trường hợp nhớ lại các sự kiện nhiễm bệnh cụ thể có khoảng thời gian ủ bệnh là

từ 1 - 21 ngày (trung bình là 9 ngày) Nếu hít vào hoặc nhiễm một lượng lớn vi khuẩn gây bệnh thì thời gian ủ bệnh sẽ rất ngắn Tuy nhiên, thời gian ủ bệnh cũng

có thể rất dài (lên đến 62 năm) Thời gian khởi đầu các triệu chứng lâm sàng thể

hiện phạm vi rộng mức độ nghiêm trọng của bệnh Ở miền Bắc Australia, 13% bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng đầu tiên trong hơn 2 tháng [6, 14]

Biểu hiện lâm sàng phổ biến và thường gặp nhất của bệnh là nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi (Hình 1.3A) Bên cạnh đó, bệnh nhân có thể bị áp xe da, áp xe nội tạng, viêm tủy xương, khớp thậm chí là viêm não [1] Nhiều hệ thống cơ quan đều bị ảnh hưởng bao gồm phổi, thận, tuyến tiền liệt, da, tuyến mang tai, não (Hình 1.3 B) Trong các ca nhiễm bệnh, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi chiếm 50% số

ca Mầm bệnh chủ yếu theo đường máu vào phổi hơn là đường hô hấp (hít phải mầm bệnh) Mức độ nghiêm trọng cũng rất khác nhau, bệnh nhân viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết có thể biểu hiện từ ho nhẹ, sốt cao, đau màng phổi đến ho nhiều hơn kèm theo khó thở

Bên cạnh đó, áp xe ở một hoặc nhiều vị trí có thể xảy ra ở gan hay lách Sự hình thành áp xe gan xuất hiện ở 1/4 bệnh nhân nhiễm melioidosis ở Thái Lan, nhưng chỉ chiếm 6% bệnh nhân ở Australia Viêm tủy xương và viêm khớp nhiễm

trùng do vi khuẩn B pseudomallei cũng đã được ghi nhận Xuất hiện mụn mủ ở bên

ngoài, áp xe dưới da, viêm cơ mủ (pyomyositis) là những biểu hiện tương đối phổ biến (15 - 25%) Có thể là cơ quan nhiễm nhiễm trùng ban đầu hay thứ cấp mà từ

đó lây lan theo đường máu Nhiễm trùng tiết niệu là một biểu hiện thường gặp của bệnh melioidosis ở Australia, với áp xe tuyến tiền liệt (Hình 1.3B) xảy ra ở 18% bệnh nhân nam, áp xe thận có thể được kết hợp với sỏi Nhiễm trùng đường tiết niệu bắt gặp ở ít nhất 1/4 bệnh nhân ở Thái Lan được nuôi cấy nước tiểu và cho kết

quả dương tính với B pseudomallei [14]

Ngoài ra, tác động của bệnh melioidosis lên hệ thân kinh thông qua biểu hiện viêm não, chứng liệt nhũn hai chi dưới (paraparesis) xuất hiện trên 4% bệnh nhân ở Bắc Australia, nhưng không biểu hiên trên bệnh nhân ở Đông Bắc Thái Lan - Nơi

sự ảnh hưởng tới hệ thần kinh trung ương xảy ra trên 2% số ca và thường gắn với hình thành áp xe Viêm tuyến mang tai mưng mủ là một biểu hiện cấp tính phổ biến

ở trẻ em Thái Lan nhưng không phổ biến ở người lớn Bên cạnh đó, nhiễm trùng ở các vùng khác nhau cũng đã được mô tả như viêm hạch, áp xe tuyến thượng thận, nhiễm trùng trung thất, viêm màng ngoài tim, viêm tai giữa cấp tính, viêm loét giác mạc, áp xe vú, áp xe bìu [14]

A B

Hình 1.3 Tổn thương các cơ quan do vi khuẩn B pseudomallei gây ra (A): Ảnh

chụp X – quang cho thấy viêm phổi thùy bên trái do vi khuẩn B pseudomallei, (B): Ảnh chụp cộng hưởng từ MRI cho thấy vi khuẩn B pseudomallei gây áp xe tuyến

tiền liệt [6]

1.1.5 Chuẩn đoán

Trong chuẩn đoán lâm sàng, các bác sỹ cần để ý bệnh nhân có biểu hiện sốt hay các biểu hiện lâm sàng đáng nghi ngờ Bên cạnh đó xem xét các yếu tố nguy cơ như có tiền sử nghiện rượu, có bệnh nền như đái tháo đường, bệnh thận, hay bệnh

phổi, nơi cư trú, liên quan đến sự hiện diện của vi khuẩn B pseudomallei và nghề

nghiệp có nguy cơ tiếp xúc với đất và nước Tuy nhiên, những biến đổi trong đặc điểm lâm sàng của bệnh nhiễm trùng thường rất khó để chuẩn đoán vì rất dễ nhầm với bệnh khác nên melioidosis còn có một thuật ngữ “the great mimicker” để chỉ bệnh có triệu chứng lâm sàng không điển hình nên dễ bị chuẩn đoán nhầm với các bệnh truyền nhiễm khác [14]

Vậy nên, nuôi cấy được xem là tiêu chuẩn vàng trong chuẩn đoán bệnh melioidosis Trên môi trường không chọn lọc, hình thái khuẩn lạc vi khuẩn nhỏ, mịn, ánh kim loại và có mùi đất ải sau 24 - 48 giờ Sau 3 - 5 ngày, khuẩn lạc trở nên

khô và nhăn (Hình 1.5A) giống với Pseudomonas stutzeri Dương tính với oxidase test (Hình 1.4), có hình kim băng khi nhuộm Gram và soi tế bào B pseudomallei

nhạy với augmentin (amoxicillin/clavulanate), kháng colistin và gentamicin (Hình 1.5B)

Bên cạnh đó, trên môi trường chọn lọc phổ biến nhất là môi trường Ashdown Agar, sau 3 - 5 ngày được ủ ở 37°C, khuẩn lạc có màu tím, khô, nhăn (Hình 1.6)

Hình 1.4 Phản ứng dương tính với oxidase của các chủng vi khuẩn B

pseudomallei (1, 2, 3, 4) so với đối chứng âm Escherichia coli (5)

Hình 1.5 Đặc tính sinh học của vi khuẩn B pseudomallei (A): Hình thái khuẩn lạc

của vi khuẩn B pseudomallei trên môi trường thạch máu sau vài ngày nuôi cấy [1] (B) Khả năng nhạy/kháng kháng sinh của B pseudomallei với (1): Amoxicillin +

Clavunanic acid (20/10 μg), (2): Colistin (10 μg) và (3): Gentamicin (30 μg)

MALDI-TOF MS và phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng cũng đang cho thấy tín hiệu tích cực với việc phát hiện nhanh và độ chính xác cao Hơn nữa, Tap Realtime PCR cũng chứng minh sự hiệu quả thông qua độ nhạy vượt trội

Ngoài ra, trong xác định vi khuẩn B pseudomallei còn sử dụng API 20NE,

Vitek 2 hay hệ thống WalkAway 96 nhưng đem lại kết quả không cao khi 37% kết

quả API 20NE định danh ra được xác định là B pseudomallei bằng sinh học phân

tử

Hình 1.6 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn B pseudomallei BG 02 sau 4 ngày nuôi

cấy ở 37°C trên môi trường Ashdown Agar

1.1.6 Điều trị lâm sàng

Quá trình điều trị gồm 2 pha: Pha điều trị chuyên sâu thông qua tiêm tĩnh mạch dùng để điều trị các bệnh nhân cấp tính, và tiếp theo là pha duy trì

1.1.6.1 Pha điều trị chuyên sâu

Hiện nay, tiêm tĩnh mạch ceftazidime (2 g, 6 giờ) hoặc meropenem (1 g, 8 giờ) cộng với liều cao cotrimoxazole là thuốc được lựa chọn ở Australia, nó thường được dùng cho ít nhất 14 ngày Một điều đặc biệt ở bệnh melioidosis là tác nhân

gây bệnh có thể kháng lại các loại kháng sinh thông thường như penicillin, ampicillin, gentamicin, streptomycin, cephalosporin thế hệ thứ nhất và thứ hai Tuy nhiên phần lớn các chủng nhạy với nhóm kháng sinh phổ rộng beta-lactams, ceftazidime, imipenem, meropenem, piperacillin, amoxycillin-clavulanate, ceftriaxone và cefotaxime [6]

1.1.6.2 Pha điều trị duy trì

Ba tháng điều trị kháng sinh bằng đường uống thường là thời gian tối thiểu cho giai đoạn tiêu diệt mầm bệnh, và việc này được tiếp tục kéo dài trong trường hợp nhiễm khuẩn nặng Trước đây, phác đồ điều trị gồm bốn loại thuốc (trimethoprim, sulfamethoxazole, doxycycline, chloramphenicol) đã được sử dụng nhưng mang lại hiệu quả không cao Các nhóm nghiên cứu đã chỉ ra rằng ở những bệnh nhân sống sót sau điều trị bệnh ban đầu, sự lựa chọn và thời gian điều trị kháng sinh là yếu tố quan trọng nhất quyết định khả năng tái phát, có thể giảm nguy

cơ tái phát lên đến 90% đối với những người tuân thủ phác đồ thích hợp trong 12

-16 tuần so với 8 tuần Ở Australia, điều trị bằng đường uống với cotrimoxazole liều cao (320 mg trimethoprim và 1600 mg sulphamethoxazole, 12 giờ) Trong khi ở Thái Lan, việc điều trị thực hiện theo cân nặng (<40 kg thể trọng, 160/800 mg; 40-

60 kg, 240/1200 mg; > 60 kg, 320/1600 mg - 12 giờ/trên một lần uống), cùng với

đó là sự kết hợp với doxycycline (100 mg, 12 giờ/trên một lần uống) Nếu việc điều trị này không thể thực hiện được do chống chỉ định thì có thể sử dụng amoxicillin - clavulanate (500 và 125 mg tương ứng, 8 giờ) để thay thế, theo cân nặng (20 mg và

5 mg tương ứng / kg, ba lần mỗi ngày) [6]

1.2 Chi Burkholderia

1.2.1 Giới thiệu về chi Burkholderia

1.2.1.1 Lịch sử nghiên cứu

Chi Burkholderia là một chi rất đa dạng bao gồm các loài là nguyên nhân

quan trọng gây nhiều bệnh nguy hiểm ở người và động vật cũng như các loài vi khuẩn có ích góp phần vào sự tăng trưởng của thực vật và xử lý sinh học [27]

Chi Burkholderia thuộc lớp Betaproteobacteria trong nghành

Proteobacteria Lần đầu tiên được mô tả vào năm 1992 bởi Yabuuchi và cộng sự,

gồm các loài ban đầu thuộc chi Pseudomonas Dựa vào trình tự rARN 16S, giá trị

tương đồng ADN - ADN, lipid tế bào, thành phần acid béo, và các đặc điểm hình

thái, chi Burkholderia được thành lập với 7 loài mới là: Burkholderia cepacia (Palleroniand Holmes, 1981), Burkholderia mallei (Zopf, 1885), Burkholderia pseudomallei (Whitmore, 1913), Burkholderia caryophilli (Burkholder, 1942), Burkholderia gladioli (Severini, 1913), Burkholderia picketii (Ralston et al.,1973),

và Burkholderia solanaceareum (Smith, 1896) Dựa vào các đặc tính sinh hóa, miễn dịch và thông tin di truyền, B pseudomallei, B mallei, B cepacia và B thailandensis có quan hệ gần gũi] Tuy nhiên, sau đó hai loài Burkholderia pickettiia và B solanacearum và một loài thuộc chi Alcaligenes đã được phân loại thành một chi mới Ralstonia [27]

1.2.1.2 Hệ thống phân loại

Trong suốt hơn 2 thập kỷ qua, nhiều loài mới thuộc chi Burkholderia đã được mô tả và công bố Đến nay (2016), chi Burkholderia có 90 loài trong hệ thống

phân loại vi khuẩn [27]

Đây là chi rất đa dạng gồm nhiều nhóm các loài có quan hệ gần gũi (Hình 1.7)

Nhóm đầu tiên của chi Burkholderia bao gồm loài Burkholderia cepacia cùng với các loài thuộc nhóm Bcc (Burkholderia cepacia complex), trong đó Burkholderia cenocepacia là nguyên nhân chính của chứng xơ nang, nhưng gần đây đã có công

trình chứng minh vai trò tăng khả năng sinh trưởng ở thực vật , một nhóm là những

loài gây bệnh cho cây trồng như B gladioli, B plantarii và B glumae, một nhóm gồm những loài có quan hệ gần gũi với nhau và là những tác nhân gây bệnh B mallei và Burkholderia pseudomallei, nguyên nhân gây ra bệnh “glanders” ở ngựa

hay melioidosis ở người Không chỉ có vậy, ở nhóm này còn có các loài có khả năng sinh các chất kích thích sinh trưởng cho thực vật và kiểm soát sinh học như là

Burkholderia vietnamiensis và Burkholderia ambifaria, chúng giúp năng suất lúa

gạo tăng 13 - 22%, khi được phân lập trên rễ của cây đậu Hà Lan, phát hiện khả

năng kháng lại Pythium aphanidermatum và Aphanomyces euteiches (2 tác nhân

gây bệnh héo rủ và thối rễ ở đậu) [27]

Hình 1.7 Cây phân loại dựa trên trình tự rARN 16S của các loài thuộc chi

Burkholderia [5]

Burkholderia glathei và 11 loài mới được lập thành một nhóm trên cây phát sinh chủng loại Một số loài được phân lập từ đất ô nhiễm như Burkholderia udeis

có khả năng phân hủy naphthalene phân lập từ đất đồi bị ô nhiễm Các loài khác trong nhánh này đã được phân lập từ các nguồn ít nghiên cứu hơn như sợi nấm và

rêu (Burkholderia sordidicola và Burkholderia grimmiae) Và đến nay, chưa có

công trình nào ghi nhận khả năng gây bệnh của các loài thuộc nhóm này

Nhóm thứ ba của chi Burkholderia gồm 40 loài chủ yếu ở ngoài môi trường

và ở trên thực vật Phần lớn thì chúng được ghi nhận là có lợi cho vật chủ của

chúng Tuy nhiên, trong số các loài, Burkholderia fungorum là một ngoại lệ đáng

chú ý vì nó được phân lập trên người và các mẫu thú y như máu, dịch não tủy, dịch tiết âm đạo, đờm, mẫu rửa của bệnh nhân CF, thân não của con nai bị thương và

mũi chuột Ngoài ra, Burkholderia tropica còn được phân lập từ bệnh nhân sơ sinh

bị viêm ruột hoại tử

Ngoài ba nhóm chính nêu trên, có một số loài đại diện khá độc đáo như

Burkholderia rhizoxinica và Burkholderia endofungorum (hai vật thể sống ký sinh

ở nấm gây bệnh thực vật Rhizopus microsporus), một nhóm gồm Burkholderia caryophylli (tác nhân gây bệnh ở hoa cẩm chướng và hành tây), Burkholderia symbiotica (một loài cộng sinh trong nốt rễ ở các loài Mimosa), và Burkholderia soli (một vi khuẩn sống trong đất) [5]

1.2.2 Vi khuẩn Burkholderia pseudomallei

B pseudomallei là trực khuẩn Gram âm, có khả năng di động nhờ vào sợi

actin (Hình 1.8C) [28], sống trong đất và mặt nước ở các quốc gia nóng và ẩm, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á và Bắc Australia Chúng được Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) liệt vào tác nhân tiềm năng gây khủng bố sinh học bời vì là nguyên nhân gây ra bệnh melioidosis – bệnh truyền nhiễm gây nhiễm trùng máu rất nguy hiểm ở người [10]

Chủng vi khuẩn được mô tả lần đầu tiên với tên Bacillus pseudomallei, Bacillus whitmorii (hoặc Bacille de Whitmore), Malleomyces pseudomallei, Pseudomonas pseudomallei, và từ năm 1992 mang tên Burkholderia pseudomallei

Đây là vi khuẩn hình que, kích thước rất nhỏ (0,8-1,5 μm), khi nhuộm bắt màu đậm

ở hai cực (hình kim băng) vì trong tế bào có sự tích lũy acid β-hydroxy butyric (Hình 1.8A, 1.8B) [1, 20]

Hình 1.8 Hình thái tế bào của vi khuẩn B pseudomallei Vi khuẩn hình que,

nhuộm Gram bắt màu đậm ở hai cực với hình thái kim băng (A, B), và sự hình

thành đuôi actin (màu đỏ) trong tế bảo của vi khuẩn B pseudomallei (màu xanh)

(C) [1, 20, 28]

Hình 1.9 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn B pseudomallei trên môi trường Ashdown

Agar: (a) hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch, (b): B pseudomallei NCTC

13177 biểu hiện hình thái có nhiếu nếp nhăn, (c): chủng B pseudomallei BCC 11

có bề ngoài trơn, bóng Thước đo có giá trị 0,5 cm [10]

Vi khuẩn có phản ứng dương tính với oxidase và sinh trưởng trong điều kiện

hiếu khí Tuy nhiên, khi có mặt nitrat hoặc acginine, vi khuẩn có thể sống trong

điều kiện kỵ khí Khuẩn lạc có một mùi hương đất ải (ngọt) đặc trưng

Bên cạnh đó, nó có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau để sinh tổng

hợp, từ đó có thể thích ứng với nhiều môi trường sống Điều đáng lưu ý, B

pseudomallei không có khả năng sử dụng đường L - arabinose, trong khi B

thailandensis có thể sử dụng để sinh trưởng Khi nuôi cấy trên môi trường thạch

rắn, vi khuẩn có hình thái đặc trưng, ban đầu bề mặt trơn mịn, nểu được nuôi cấy thêm thì bề mặt khô và nhăn (Hình 1.9) [10]

Thời gian tồn tại của B pseudomallei rất dài, trong nước ở nhiệt độ phòng nó

có thể sống 8 tuần, trong bùn nước có thể lên đến 7 tháng, còn ở trong đất phòng thí nghiệm có thể được 30 tháng Ngoài ra, chiếu xạ UV hay ánh sáng mặt trời cũng ảnh hưởng rất nhiều đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Do đó, ở trong đất, thường bắt gặp với nồng độ cao ở độ sâu 25 - 120 cm

1.2.2.1 Yếu tố gây bệnh

Hệ gen của vi khuẩn B pseudomallei tương đối lớn chứa 2 chromosomes

với chromosomes I có kích thước 4.07 megabase pairs và chromosomes II là 3.17 megabase pairs[2] Chúng mã hóa cho một số lượng lớn các yếu tố gây bệnh Trong số này bao gồm các polysaccharide bề mặt như polysaccharide bao vi khuẩn (capsular polysaccharide-CPS) và lipopolysaccharide (LPS), hay hệ thống tiết chuyên biệt, đặc biệt là cụm 3 hệ thống tiết loại III (T3SS-3) và 1 cụm hệ thống tiết loại VI (T6SS-1), chúng tạo điều kiện thuận lợi cho sự tồn tại và sinh trưởng trong

tế bào vật chủ Ngoài ra các yếu tố độc lực còn bao gồm adhesins, roi, và các protein tiết khác ( phospholipases, proteases) và các chất chuyển hóa thứ cấp

Nhiều hệ thống liên quan đến độc lực biểu hiện ở B pseudomallei được quy định

bởi hệ thống hai thành phần (TCSs) hoặc bộ phận cảm ứng (Quorum sensing) [21]

1.2.2.2 Cơ chế gây bệnh của Burkholderia pseudomallei

B pseudomallei không phải là tác nhân gây bệnh sống nội ký sinh bắt buộc,

nếu hệ thống phòng thủ của tế bào bị vượt qua, nó mang nhiều thuận lợi hơn một kiểu sống ngoại ký sinh Ví dụ như tránh hệ thống miễn dịch của cơ thể, giảm thiểu

sự tiếp xúc với chất kháng sinh từ đó tăng thời gian ủ bệnh và chậm phát tác bệnh Lối sống nội ký sinh là điều rất quan trọng cho sự lây lan từ vị trí nhiễm trùng đến các vị trí khởi phát bệnh sau cùng [25]

B pseudomallei có thể xâm nhập, sống, và nhân lên ở cả tế bào thực bào lẫn

tế bào không thực bào, và hoạt động nội bào của nó được xem là quan trọng đối

với tính chất sinh bệnh Sau khi vào nội bào, vi khuẩn này có thể lẫn tránh hốc thực

bào và nhân lên bên trong cytosol của tế bào vật chủ Rồi B pseudomallei có thể

gây cảm ứng các đuôi actin được tổng hợp từ những sợi actin mà trở nên bị phân cực và cho phép chuyển động bên trong tế bào, với sự hình thành kế tiếp của các phần tử hình thành từ màng tế bào và trực chỉ lan tỏa vi khuẩn từ tế bào này đến tế bào khác (Hình 1.10)

Hình 1.10 Sự xâm nhập và sinh trưởng của B pseudomallei trong nội bào

B pseudomallei có thể xâm nhập đại thực bào và rồi có thể sống sót và nhân

lên trong suốt những thời kỳ dài Mặc dầu một số vi khuẩn bị phá hủy sau khi bị thực bào, một số khác thoát khỏi các hốc tiêu khuẩn nội bào hoặc trực tiếp bị phá

vỡ ở khoang ngoại bào hoặc nhiễm vào các tế bào khác thông qua sự nhú màng trên cơ sở cấu tạo actin Các thụ thể Toll-like (TLRs) được biểu thị ở các tế bào vật

chủ là phát hiện trước tiên cho sự xâm nhập của B pseudomallei, làm cho yếu tố

nhân κB (NF-κB) gây cảm ứng sự hoạt động của đáp ứng miễn dịch thông qua việc giải phóng các cytokine tiền viêm

Đáp ứng TLR được điều hòa một cách chặt chẽ: khởi động thụ thể được biểu thị trên các tế bào 1 dòng tủy (triggering receptor expressed on myeloid cells 1: TREM-1) khuếch đại các tín hiệu gây cảm ứng TLR, và phân tử giống như

kinase được kết hợp với thụ thể của interleukin 1 (IRAK) (IRAK-M) làm giảm đáp ứng miễn dịch suốt quá trình mắc melioidosis Các thụ thể túi viêm nội bào (intracellular inflammasome receptors), đáng chú ý nhất, các thụ thể giống như nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) (NLRs) NLRC4 và NLRP3, phát hiện các yếu tố độc của vi khuẩn và các tín hiệu nội sinh nguy hiểm, dẫn đến việc giải phóng interleukin-1β và interleukin-18 qua trung gian caspase 1, bên cạnh hiện tượng pyroptosis (chết tế bào lệ thuộc caspase làm hạn chế sự tăng trưởng vi khuẩn nội bào) Interleukin-18 gây cảm ứng thêm nữa sự sản xuất interferon-γ có tính chất bảo vệ Bạch cầu đa nhân trung tính được tuyển mộ hướng tới vị trí nhiễm khuẩn, và các dòng thác bổ thể và dòng thác đông máu bị hoạt hóa Khi sự nhiễm khuẩn tiến triển, đáp ứng miễn dịch mắc phải dẫn đến sự tụ tập các tế bào T góp phần trong việc sản xuất interferon-γ, làm tăng đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào

và sản xuất kháng thể của các tế bào B Hầu hết dữ liệu trong mô hình này được bắt nguồn từ những nghiên cứu trong ống nghiệm và mô hình melioidosis trên động vật Chết tế bào theo chương trình liên quan đến protein giống speck gồm vùng tuyển mộ caspase (ASC) được dùng như một phân tử thích ứng NLR, trái lại yếu tố 88 biệt hóa tế bào tủy (MyD88) được dùng như một phân tử thích ứng TLR trung tâm (Hình 1.10)

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

Sử dụng 385 mẫu đất được thu thập từ 77 vị trí được thu thập ở 5 tỉnh Bắc Miền Trung Việt Nam vào tháng 09 năm 2016 và đánh dấu trong hình 11

Hình 2.1 Bản đồ vị trí mẫu đất thu thập ở 5 tỉnh thuộc Bắc Miền Trung Việt

Nam vào tháng 09 năm 2016

Các chủng B pseudomallei nhóm nghiên cứu đã thu thập từ 06 - 12 năm

2015 tại 5 bệnh viện Bắc Miền Trung Việt Nam (Bệnh viện Hữu nghị Đa khoa

Nghệ An, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Tĩnh, Bệnh viện Hữu nghị Việt Nam - Cu

Ba Đồng Hới, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Quảng Trị, Bệnh viện Trung ương Huế)

2.2 Hóa chất, thiết bị

Hóa chất được sử dụng cho quá trình nghiên cứu bao gồm phân lập, nuôi cấy, tách chiết, phát hiện và phân loại bằng sinh học phân tử đều có xuất xứ từ các hãng uy tín với sự đảm bảo độ chính xác cho thí nghiệm cao như Merck, Sigma, Wako, Thermo Scientific

2.2.2 Thiết bị

Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu đã sử dụng các thiết bị hiện có

của Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - Đại Học Quốc Gia Hà Nội gồm có:

 Máy Realtime PCR (Eppendorf, Đức)

 Cân điện tử AL - 300 (Osi, Mỹ)

 Nồi hấp khử trùng (Hirayama, Nhật Bản)

 Máy ly tâm (Eppendorf, Đức)

 Tủ cấy (Nuaire, Mỹ)

 Máy PCR (Eppendorf, Đức)

 Kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức)

 Thiết bị điện di (Bio Rad, Mỹ)

 Máy Vontex (IKA, Đức)

 Máy rung (Eyela Cute Mixer-1000, Nhật Bản)

 Tủ ấm (Eyela, Nhật)

 Nhiệt kế điện tử (BKG, Nhật Bản)

 Máy định vị GPS (Garmin, Mỹ)

 Môi trường Ashdown Agar (g/l): Tryptone Soya Broth- 10, Agar- 15, Glycerol- 40ml; Crystal Violet (0.1%)- 5ml; Neutral Red (1%)- 5ml, Gentamycin- 5 mg

 Môi trường Galimand Broth (g/l): KH2PO4- 0.451, K2HPO4- 1.73, MgSO4 7H2O- 0.123, CaCl2.2H2O- 0.0194, NaCl- 10, C6H9NO6- 0.2, Solution A- 20

ml, H2O- 880 ml, L - Threonine- 5.95; pH 7.2

Solution A (g/l): FeSO4.7H2O- 0.556, ZnSO4.7H2O- 0.297, CuSO4.5H2O- 0.0218, MnSO4.H2O- 0.125, Co(NO3)2.6H2O- 0.03, Na2MoO4.H2O- 0.03,

H3BO3- 0.062, H3PO4 85%- 2.306 ml

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Quá trình điều tra dịch tễ học lâm sàng được thực hiện trong khoảng thời gian từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2015 trên 70 bệnh nhân tương ứng với 70 ca bệnh được báo cáo lại ở 5 bệnh viện tuyến cơ sở gồm: Bệnh viện Hữu nghị Đa khoa Nghệ An, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà Tĩnh, Bệnh viện Hữu nghị Việt Nam - Cu Ba Đồng Hới, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Quảng Trị, Bệnh viện Trung ương Huế Các thông tin bao gồm: các thông tin cá nhân (độ tuổi, giới tính, địa chỉ, nghề nghiệp), đặc điểm lâm sàng (sốt, triệu chứng nhập viện, tỷ lệ tử vong, kết quả chuẩn đoán hình ảnh và xét nghiệm), các yếu tố nguy cơ mắc bệnh melioidosis (tiền sử mắc bệnh nền, nghiện rượu), quá trình điều trị (loại kháng sinh, liều lượng và thời gian điều trị) [11, 19] (Xem phụ lục)

Mẫu đất được lấy theo một quy trình tiêu chuẩn Trước khi lấy mẫu đất, vị trí tọa độ được đánh dấu và phác thảo trên Google Map để đảm bảo khoảng cách giữa các mẫu là đồng đều nhau (10 - 15 km) Vị trí tọa độ được lưu vào máy GPS để dẫn đường trong quá trình đi lấy mẫu Phần lớn đất được lấy ở các ruộng trồng lúa, nhưng bên cạnh đó cũng có một số mẫu được thu ở trên đất trồng hoa màu, cây công nghiệp, cỏ Tại mỗi điểm, chúng tôi sử dụng khoan để khoan tới độ sâu 30 cm Mẫu đất ở độ sâu 30 cm được đưa vào túi zip bằng đũa sạch sử dụng một lần nhằm tránh sự nhiễm chéo giữa các mẫu Mỗi mẫu đất lấy khoảng 300 gram, sau đó khoan được rửa sạch bằng nước cất RO và khử khuẩn bằng cồn Tọa độ thực tế được lưu lại bằng thiết bị định vị toàn cầu GPS Garmin và nhiệt độ được đo và ghi lại bằng nhiệt kế điện tử Đất sau khi lấy được bảo quản ở nhiệt độ thường và vận

chuyển về cơ quan phân tích Và tại mỗi điểm, thực hiện lấy 5 mẫu đất và được ký hiệu 1-5, mỗi mẫu được lấy cách nhau 10 - 20 m [13, 15, 22]

Phương pháp được dựa trên phương pháp tách ADN từ mẫu đất [23]

 Hút 500 µl dịch nổi của mẫu đã được nuôi trong môi trường làm giàu vào ống Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8000 vòng/5 phút và sau đó loại bỏ dịch nổi

 Bổ sung 200µl Lysis buffer, 10µl lyzozyme (50 mg/ml), 2.5µl proteinase K (10 mg/ml)

 Bổ sung 60µl isopropanol vào 100 µl dịch vừa hút rồi invert mạnh bằng tay

và ủ ở 0˚C (ngăn đá tủ lạnh) Sau 1 giờ (hoặc qua đêm) ly tâm 16000 g/5 phút ở 4°C Sau đó loại bỏ dịch nổi

 Bổ sung 1 ml cồn 70%, đảo ống trong 2 phút và ly tâm 16000 g/ 5 phút ở 4°C Sau đó loại dịch nổi, thao tác này được thực hiện 2 lần và spindown với

16000 rcf/ 2 phút Để khô và bổ sung 50µl MQ vào, ủ ở 37 ˚C

Sau khi ủ ADN ở 37°C trong 1 giờ, vontex mạnh để thu được dịch đồng nhất Thực hiện phản ứng Realtime PCR với thể tích 25 µl chưa các thành phần phản ứng sau: 1x Taqman Uni PCR MasterMix (Thermo Sciencetific) chứa các chất: AmpliTaq Gold DNA polymerase và AmpErase uracil-N-glycosylase (UNG); 6,5 pM của BpTT4208 Probe (MWG-Biotech, Đức); 10 pM mỗi loại mồi 4176F

(5’-CGTGCACACCGGTCAGTAT C -3’) và 1µl ADN Chu trình chạy Realtime PCR như sau: 50°C trong 2 phút để hoạt hóa UNG Sau đó biến tính ADN trong vòng 10

phút ở 95°C và 40 chu kỳ với biến tính sợi ADN ở 95°C trong 15 giây, khuếch đại

ở 60°C trong 1 phút Chu trình ngưỡng Ct là giá trị được tính toán tự động

đất

2.3.5.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Burkholderia pseudomallei

Cân 10 gram đất vào ống Falcon 50ml, sau đó bổ sung 20 ml môi trường làm giàu Galimand Broth (TBSS - C50) Sau 30 phút, vortex mạnh khoảng 30 giây - 1 phút để hòa trộn thành một thể đồng nhất và sau khi hoàn thành, thực hiện ủ ở nhiệt

độ 40°C Sau 4 ngày, vortex khoảng 30 giây, hút 100 μl để thực hiện pha loãng giới hạn và cấy trải trên môi trường Ashdown’s Agar trước khi ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 40°C Kiểm tra và thu thập khuẩn lạc sau 4 ngày [15]

2.3.5.2 Phương pháp nuôi cấy 2 giai đoạn

Cân 10 gram đất vào ống Falcon 50 ml, và tiếp đó bổ sung 20 ml môi trường làm giàu Galimand Broth (TBSS - C50) chứa 50 mg/l Colistin (UK) Vortex mạnh để thu được một hỗn hợp đồng nhất và ủ ở 40°C Sau 4 ngày, hút 500 μl dịch nổi vào ống Eppendorf 1.5 ml và tách ADN tổng số Sau khi thu được ADN, thực hiện phản ứng Realtime PCR và chọn ra các mẫu có phản ứng dương tính với gen đặc hiệu TTSS1 Đối với những mẫu dương tính có giá trị Ct nhỏ hơn 32, hút 100 μl dịch nổi, thực hiện pha loãng giới hạn để cấy trải trên môi trường chọn lọc Ashdown Agar và ủ ở 40°C Sau 4 ngày, kiểm tra và thu thập khuẩn lạc Còn với những mẫu dương tính nhưng có giá trị Ct lớn hơn 32, hút 1 ml dịch nổi, cho vào 9 ml môi trường Galimand Broth thay đổi Vortex để được một dung dịch hỗn hợp đồng nhất

và ủ ở 40°C, sau 4 ngày, hút 500 μl dịch nuôi cấy và tách ADN và kiểm tra giá trị

Ct bằng phản ứng realtime PCR Sau đó, hút 100 μl dịch nổi, thực hiện pha loãng giới hạn để cấy trải trên môi trường chọn lọc Ashdown Agar và ủ ở 40°C Sau 4 ngày, kiểm tra và thu thập khuẩn lạc

Lựa chọn 21 chủng vi khuẩn B pseudomallei trên các ca bệnh lâm sàng thu

thập được ở 5 bệnh viện Bắc Miền Trung Việt Nam trong khoảng 06 – 12 năm

2015 ở 3 độ tuổi trẻ em, trung niên và người già cùng với 11 chủng vi khuẩn B pseudomallei thu thập được từ mẫu đất ngoài môi trường

Các chủng được cấy trên môi trường Mueller Hinton Agar, sau 24 giờ, dùng que cấy gạt khuẩn lạc và hòa tan trong 200 μl H2O Tiếp đó, ủ trong nhiệt độ 100°C trong 10 phút, và cho ngay vào 0°C Sau 10 phút lấy ra đợi tan đá và ly tâm 8000

rpm/ 5 phút Dịch nổi ở trên chứa ADN của chủng vi khuẩn B pseudomallei (ADN

khuôn)

Bảng 2.1 Trình tự các mồi và kích thước các mảnh gen được khuếch đại

Sử dụng các cặp mồi sau cho việc khuếch đại 7 đoạn ADN của

“housekeeping genes” được tổng hợp ở bảng 2

Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần sau trên thể tích 25 μl: