Sàng lọc một số chất từ dịch chiết cây nhọ nồi (eclipta prostrata l) có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh động kinh trên mô hình chuột thông qua thụ thể GABA (gamma amino butyric acid)

Về cơ chế phân tử, các cơn co giật trong bệnh động kinh chủ yếu bắt nguồn từ một số nguyên nhân, như sự mất cân bằng trạng thái ổn định giữa kích thích và ức chế ở các tế bào thần kinh m

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Dương Đức Thiện

SÀNG LỌC MỘT SỐ CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT CÂY

NHỌ NỒI (Eclipta prostrata L.) CÓ KHẢ NĂNG HỖ

TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH ĐỘNG KINH TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT THÔNG QUA THỤ THỂ GABA

(GAMMA – AMINO BUTYRIC ACID)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Dương Đức Thiện

Sàng lọc một số chất từ dịch chiết cây Nhọ nồi

(Eclipta prostrata L.) có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh

động kinh trên mô hình chuột thông qua thụ thể

GABA (gamma – amino butyric acid)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 8460201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp thạc sĩ của mình, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn các thầy, cô giáo cũng như toàn thể cán bộ, nhân viên phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme và protein, Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu, bổ ích, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn của mình

Tôi xin được dành lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo, TS Trịnh Tất Cường – Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, chia sẻ

và động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2020

Học viên Dương Đức Thiện

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ILAE Liên đoàn quốc tế chống động kinh

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

ELISA Enzyme – linked Immunosorbent assay

BMDM Bone marrow derived – macrophages

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Tỷ lệ mắc bệnh động kinh theo độ tuổi trên 100.000 trường hợp năm 2016

[6] 6

Hình 2 Tỷ lệ mắc bệnh động kinh toàn cầu theo độ tuổi và giới tính năm 2016 [6] 7

Hình 3 Viêm não – một cơ chế gây bệnh quan trọng của bệnh động kinh [5] 13

Hình 4 Cấu trúc của GABA và thụ thể GABAA 17

Hình 5 Hình ảnh cây nhọ nồi (Eclipta prostrata) 21

Hình 6 Sơ đồ quy trình tách chiết Wedelolactone từ cây nhọ nồi 29

Hình 7 Sắc kí bản mỏng Wedelolactone 31

Hình 8 Sắc ký lỏng cao áp của Wedelolactone 32

Hình 9 Sắc ký bản mỏng Luteolin 33

Hình 10 Sắc ký lỏng cao áp của Luteolin 34

Hình 11 Đại thực bào phân lập từ tủy xương chuột 35

Hình 12 Khả năng sống sót của đại thực bào xử lý với Wedelolactone 36

Hình 13 Khả năng sống sót của đại thực bào xử lý với Luteolin 37

Hình 14 Nồng độ cytokine gây viêm sản xuất bởi đại thực bào xử lý với Wedelolactone 38

Hình 15 Nồng độ cytokine gây viêm sản xuất bởi đại thực bào xử lý với Luteolin 39 Hình 16 Sắc ký bản mỏng GABA trong não các nhóm chuột xử lý với Wedelolactone 44

Hình 17 Sắc ký bản mỏng GABA trong não các nhóm chuột xử lý với Luteolin 46

Hình 18 Nồng độ cytokine gây viêm trong não chuột sử dụng Wedelolactone 48

Hình 19 Nồng độ cytokine gây viêm trong não chuột sử dụng Luteolin 49

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Một số thuốc chống động kinh phổ biến [14] 11

Bảng 2 Hóa chất sử dụng trong đề tài 23

Bảng 3 Thiết bị sử dụng trong đề tài 24

Bảng 4 Hoạt tính chống co giật của Wedelolactone 40

Bảng 5 Hoạt tính chống co giật của Luteolin 42

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh động kinh 3

1.1.1 Bệnh động kinh là gì? 3

1.1.2 Phân loại và chẩn đoán bệnh động kinh 4

1.1.3 Thực trạng bệnh động kinh hiện nay 6

1.1.4 Nguyên nhân của bệnh động kinh 8

1.1.5 Điều trị bệnh động kinh 10

1.1.6 Bệnh động kinh và quá trình viêm 12

1.2 GABA và thụ thể GABA 16

1.2.1 GABA và thụ thể GABA trong bệnh động kinh 16

1.2.2 Thụ thể GABA và quá trình viêm 19

1.3 Cây nhọ nồi và vai trò của cây nhọ nồi trong bệnh động kinh 20

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu và thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Tách chiết Wedelolactone, Luteolin từ cây nhọ nồi 25

2.2.2 Tách chiết đại thực bào từ tủy xương chuột 26

2.2.3 Đánh giá độc tính của Wedelolactone và Luteolin đối với sự sống sót của đại thực bào phân lập từ chuột 27

2.2.4 Đánh giá khả năng kháng viêm của Wedelolactone hoặc Luteolin trên đại thực bào phân lập từ chuột 27

2.2.5 Đánh giá khả năng chống co giật của Wedelolactone hoặc Luteolin trên mô hình chuột động kinh cấp tính 27

2.2.6 Phân tích GABA trong não chuột 28

2.2.7 Đánh giá mối liên quan giữa viêm và động kinh trên não chuột 28

2.2.8 Phân tích thống kê 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tách chiết Wedelolactone từ cây nhọ nồi 29

3.1.1 Quy trình tách chiết Wedelolactone 29

3.1.2 Sắc ký bản mỏng Wedelolactone 30

3.1.3 Đánh giá độ tinh sạch của Wedelolactone bằng sắc ký lỏng cao áp 31

3.2 Tách chiết Luteolin từ cây nhọ nồi 33

3.2.1 Sắc ký bản mỏng Luteolin 33

3.2.2 Đánh giá độ tinh sạch của Luteolin bằng sắc ký lỏng cao áp 34

3.3 Độc tính của Wedelolactone đối với sự sống sót của đại thực bào 35

3.4 Độc tính của Luteolin đối với sự sống sót của đại thực bào 37

3.5 Khả năng kháng viêm của Wedelolactone trên đại thực bào 37

3.6 Khả năng kháng viêm của Luteolin trên đại thực bào 39

3.7 Khả năng chống co giật của Wedelolactone trên mô hình chuột động kinh cấp tính 40

3.8 Khả năng chống co giật của Luteolin trên mô hình chuột động kinh cấp tính 42

3.9 Kết quả phân tích GABA trong não chuột điều trị với Wedelolactone 44

3.10 Kết quả phân tích GABA trong não chuột điều trị với Luteolin 46

3.11 Mối liên quan giữa viêm và động kinh trên não chuột điều trị với Wedelolactone 48

3.12 Mối liên quan giữa viêm và động kinh trên não chuột điều trị với Luteolin 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

MỞ ĐẦU

Động kinh là một rối loạn não đặc trưng bởi sự bất bình thường về cảm xúc và nhận thức Rối loạn này ảnh hưởng đến 50 triệu người trên toàn thế giới Mặc dù, một loạt các loại thuốc chống động kinh đã được thương mại Tuy nhiên, khoảng một phần ba số người bị động kinh vẫn trải qua các cơn động kinh không đáp ứng với thuốc Nguyên nhân chính xác của bệnh động kinh vẫn chưa được biết Do đó, hiểu được các cơ chế liên quan đến việc gây ra bệnh động kinh sẽ hỗ trợ sự phát triển của các loại thuốc mới Hiện nay, nhiều bằng chứng cho thấy rằng bệnh động kinh có thể được liên kết với một loạt các yếu tố như: di truyền, rối loạn phát triển và các chấn thương thần kinh… Cùng với đó, trong hơn 10 năm qua, các bằng chứng lâm sàng

và thực nghiệm đã hỗ trợ mạnh mẽ cho giả thuyết rằng các quá trình viêm trong não

có thể tạo thành một cơ chế phổ biến và quan trọng trong sinh lý bệnh động kinh Viêm não mạn tính, bao gồm kích hoạt microglia, tế bào hình sao, tế bào nội mô của hàng rào máu não và các tế bào miễn dịch ngoại biên, và sự sản xuất đồng thời của các chất trung gian gây viêm đã được quan sát lần đầu tiên ở bệnh nhân viêm não Rasmussen Việc kích hoạt các chất trung gian gây viêm như interleukin (IL), interferon (IFN), cyclooxygenase (COX)– 2, yếu tố hạt nhân kappa B (NF – κB) và

sự dư thừa của các chất trung gian gây viêm bao gồm IL– 1β, IL– 6, yếu tố hoại tử khối u (TNF)– α và prostaglandin E2 (PGE2) góp phần vào sự phát triển co giật Gamma – Aminobutyric acid, hoặc axit γ– aminobutyric (GABA), là chất ức chế dẫn truyền thần kinh chính trong hệ thống thần kinh trung ương động vật có vú trưởng thành Vai trò chính của nó là làm giảm sự kích thích thần kinh trong toàn bộ hệ thống thần kinh Khi sự cân bằng này bị xáo trộn, co giật có thể xảy ra Hiện có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng quá trình ức chế thông qua trung gian thụ thể GABA là nguyên nhân

dẫn đến co giật trên mô hình in vivo

Cây nhọ nồi hay cỏ mực, hàn liên thảo (Eclipta prostrata L.) là một loài thực

vật phân bố rộng rãi trên toàn thế giới ở các vùng ôn đới, nhiệt đới Chúng thích nghi với điều kiện môi trường thay đổi, thường là trên các khu vực thoát nước kém, ẩm ướt dọc theo suối và mương, trong đầm lầy, trên những nơi đầy nắng, từ bờ biển đến

cổ truyền và cả những người chữa bệnh truyền thống, đặc biệt là ở khu vực phía Nam

Ấn Độ để điều trị bệnh động kinh từ thời cổ đại

Tuy nhiên, hiện chưa có công trình nghiên cứu nào chỉ ra được chất nào trong cây nhọ nồi có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh động kinh thông qua thụ thể GABA Dựa trên cơ sở đã biết về sự tác động qua lại giữa bệnh động kinh và thụ thể GABA cũng

như quá trình viêm, chúng tôi thực hiện đề tài: “Sàng lọc một số chất từ dịch chiết

cây Nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh động kinh

trên mô hình chuột thông qua thụ thể GABA (gamma – amino butyric acid)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh động kinh

1.1.1 Bệnh động kinh là gì?

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO), động kinh là một bệnh mạn tính không lây nhiễm của não, nó được đặc trưng bởi các cơn co giật tái phát, là những đợt cử động không tự chủ ngắn có thể liên quan đến một phần cơ thể hoặc toàn bộ cơ thể Thuật

ngữ động kinh có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “epilam-banein”, có nghĩa là tấn công hoặc giành giật "Co giật do động kinh" được sử dụng để phân biệt cơn động kinh do

kích hoạt tế bào thần kinh bất thường với một sự kiện không gây động kinh, chẳng hạn như động kinh do tâm thần [64] Một cơn co giật gây ra bởi một chấn thương thuận nghịch (ví dụ, sốt, hạ đường huyết) không thuộc định nghĩa của bệnh động kinh

vì nó là một tình trạng thứ phát tồn tại trong thời gian ngắn, không phải là một trạng thái mạn tính Các cơn co giật là kết quả của sự phóng điện quá mức trong một nhóm

tế bào não Các phần khác nhau của não có thể là nơi phóng điện như vậy Co giật có thể thay đổi từ những lần không được chú ý tới như giật cơ thoáng qua đến co giật nghiêm trọng và kéo dài Các cơn co giật cũng có thể khác nhau về tần suất, từ ít hơn

1 cơn mỗi năm đến vài cơn mỗi ngày Mọi người đều có xu hướng bị co giật Khái niệm về ngưỡng co giật có nghĩa là mỗi cá nhân tồn tại một mức độ nhạy cảm với động kinh và có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến tính nhạy cảm đó [29] Những người bị động kinh thường sẽ gặp nhiều vấn đề về thể chất (chẳng hạn như gãy xương và bầm tím do các chấn thương liên quan đến động kinh), cũng như các vấn đề về tình trạng tâm lý, bao gồm lo lắng và trầm cảm Tương tự, nguy cơ tử vong sớm ở những người mắc bệnh động kinh cao gấp ba lần so với dân số chung, trong đó tỷ lệ này cao nhất

ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, đặc biệt là ở các vùng nông thôn

Động kinh là một trong những bệnh lâu đời nhất được công nhận trên thế giới, với các ghi chép có niên đại từ 4000 năm trước Công nguyên Nhiều tài liệu tham khảo về chứng động kinh có thể được tìm thấy trong các văn bản cổ của tất cả các nền văn minh, quan trọng nhất là trong các văn bản y học Hy Lạp cổ đại của bộ

sưu tập Hippocrate [35] Hippocrates trong cuốn sách “Về căn bệnh thiêng liêng”

được thực hiện ở phía đối diện của não bị động kinh, để cứu bệnh nhân khỏi

“phlegma” (đờm) gây ra bệnh Tuy nhiên, phải đến thế kỷ 18 và 19, khi y học có những bước tiến quan trọng, nghiên cứu về bệnh động kinh mới được giải thích rõ khỏi những mê tín tôn giáo cho rằng động kinh là một hình phạt hoặc sở hữu của thần thánh [19, 61] Vào đầu thế kỷ 18, động kinh được xem là một căn bệnh vô căn xuất phát từ não và các cơ quan nội tạng khác Trong nửa sau của thế kỷ 19, y học tập trung vào việc xác định sinh lý bệnh và xác định vị trí bắt nguồn của các cơn động kinh Bằng chứng cho thấy chứng động kinh xuất phát từ não là công trình của nhà sinh lý học Fritsch (1838–1927) và bác sĩ tâm thần Hitzig (1838–1907) Công trình này đã trình bày các thí nghiệm trong đó các nhà khoa học gây ra cơn động kinh bằng cách kích thích điện trong vỏ não của chó [23] Trong những năm 1940, những khám phá quan trọng đã được thực hiện trong lĩnh vực động kinh tâm thần vận động Trong suốt hai thập kỷ qua, những thay đổi khác nhau liên quan đến tổn thương não

do động kinh cũng đã được nghiên cứu, chẳng hạn như sự nảy mầm của sợi rêu và tái

tổ chức khớp thần kinh [28, 67, 68, 70] Nỗi sợ hãi, hiểu lầm, phân biệt đối xử và kỳ thị xã hội đã bao vây bệnh động kinh trong nhiều thế kỷ Sự kỳ thị này vẫn tiếp diễn

ở nhiều quốc gia ngày nay và có thể ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của những người mắc bệnh và gia đình của họ

1.1.2 Phân loại và chẩn đoán bệnh động kinh

Hội chứng động kinh trước đây được phân loại theo vị trí khởi phát của chúng (tổng quát hoặc liên quan đến khu trú cụ thể trong vỏ não) và căn nguyên, nghĩa là nguyên nhân đã được biết (có triệu chứng) hay không được biết (vô căn) Phân loại gần đây nhất của Liên đoàn quốc tế chống động kinh (ILAE) về động kinh và chứng động kinh được xuất bản vào năm 2010, sửa đổi các phân loại trước đây bằng cách sử dụng thuật ngữ và khái niệm phù hợp với kỷ nguyên hiện đại [7, 8, 38], co giật được chia thành ba loại: toàn thể, khu trú (trước đây gọi là một phần)

và co thắt động kinh Các cơn động kinh tổng quát bắt nguồn trong mạng lưới tế bào thần kinh phân bố hai bên Co giật có thể bắt nguồn từ vỏ não hoặc trong các cấu trúc dưới vỏ Các dạng phụ chính của co giật toàn thân là vắng mặt (vắng ý thức – absence), cơn co cứng, co giật toàn thể (GTC), động kinh rung giật cơ (Myoclonic) và

động kinh nhược cơ (Atonic) Động kinh do vắng mặt liên quan đến việc nhìn chằm

chằm và không phản ứng với các kích thích bằng lời nói bên ngoài, đôi khi kèm theo

nháy mắt hoặc gật đầu Co giật GTC bao gồm các cử động co giật đối xứng hai bên

(cứng lại sau đó là giật) của tất cả các chi kèm theo suy giảm ý thức Co giật

myoclonic bao gồm các chuyển động đột ngột, ngắn (“nhanh như chớp”) không liên

quan đến bất kỳ rối loạn ý thức rõ ràng nào Co giật nhược cơ liên quan đến việc mất

trương lực cơ thể, thường dẫn đến ngã hoặc các chấn thương đầu Động kinh khu trú

bắt nguồn từ mạng lưới tế bào thần kinh giới hạn ở một phần bán cầu đại não Các

biểu hiện lâm sàng của cơn động kinh khu trú phụ thuộc vào vùng vỏ não liên quan Ví

dụ, một cơn động kinh khu trú phát sinh từ thùy chẩm có thể biểu hiện bằng các hiện

tượng thị giác Khi ý thức bị suy giảm trong cơn động kinh khu trú, tức là bệnh nhân

không thể đáp ứng bình thường với các kích thích bằng lời nói hoặc xúc giác, cơn

động kinh được phân loại là rối loạn nhận thức, ví dụ co giật phát sinh từ thùy thái

dương thường là rối loạn nhận thức Nguồn gốc của loại co giật thứ ba, co thắt động

kinh, là không chắc chắn Co thắt động kinh được biểu hiện bằng cách đột ngột duỗi

ra hoặc uốn cong các chi, giữ trong vài giây, sau đó tái phát Co thắt động kinh có thể

xảy ra ở mọi lứa tuổi, từ khi bắt đầu bước vào năm đầu đời, bao gồm một hội chứng

gọi là chứng co thắt ở trẻ sơ sinh (IS) (West syndrome [WS])

Tiên lượng của bệnh nhân bị co giật hầu hết phụ thuộc vào bất kỳ nguyên

nhân cơ bản nào Ở những bệnh nhân có triệu chứng co giật cấp tính khác, tiên lượng liên quan đến quá trình bệnh Nếu một bệnh nhân có một cơn động kinh

vô cớ duy nhất đã được xác định rõ ràng, việc điều tra đòi hỏi các công việc bao gồm

các xét nghiệm cần thiết, điện não đồ Trong trường hợp tất cả các kết quả không có

gì bất thường thì ước tính tỷ lệ tái phát của một cơn động kinh vô cớ khác trong vòng

năm năm là từ một phần ba đến một phần hai Tuy nhiên, nếu có cơn co giật vô cớ

thứ hai hoặc thứ ba, nguy cơ co giật thêm nữa sẽ tăng lên khoảng ba phần tư [27, 39]

Một người được chẩn đoán mắc chứng động kinh nếu họ có hai cơn co giật vô cớ

hoặc một cơn co giật vô cớ với khả năng nhiều hơn mà không phải do một số tình

trạng y tế đã biết và có thể hồi phục được Chẩn đoán bệnh động kinh là một công

việc phức tạp, đòi hỏi kết hợp giữa nhiều yếu tố, từ bác sĩ giàu kinh nghiệm, đến các

yếu tố lâm sàng cũng như xét nghiệm Thông thường, bác sĩ thường dựa vào một số yếu tố để chẩn đoán bệnh động kinh như: tiền sử bệnh, các triệu chứng lâm sàng thông qua thăm hỏi bệnh nhân, tiến hành các xét nghiệm để phát hiện các bất thường như điện não đồ, điện não đồ mật độ cao, chụp cắt lớp vi tính, chụp cộng hưởng từ, chụp cắt lớp phát xạ Positron, cũng có thể các xét nghiệm máu hoặc các xét nghiệm di truyền được chỉ định để tăng khả năng chẩn đoán và độ chính xác của chẩn đoán

1.1.3 Thực trạng bệnh động kinh hiện nay

Bệnh động kinh chiếm một tỷ lệ đáng kể trong gánh nặng bệnh tật của thế giới Trên toàn cầu, khoảng 65 triệu người mắc chứng động kinh và gần 80% những

người mắc chứng động kinh sống ở các nước đang phát triển [42]

Hình 1 Tỷ lệ mắc bệnh động kinh theo độ tuổi trên 100.000 trường hợp năm

2016 [6]

Tỷ lệ ước tính của dân số chung mắc bệnh động kinh tại một thời điểm nhất định là từ 4 đến 10 trên 1000 người Ở các nước thu nhập cao, ước tính có 49 trên 100.000 người được chẩn đoán mắc bệnh động kinh mỗi năm trong khi con số này ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình có thể cao tới 139 trên 100.000 Tỷ lệ mắc bệnh động kinh được điều chỉnh theo độ tuổi ở Bắc Mỹ dao động từ 16 trên 100.000 đến 51 trên 100.000 người trên năm [29] Tỷ lệ mắc động kinh ở Châu Mỹ

La Tinh (10/1.000) cao hơn gấp hai lấn so với Bắc Mỹ và Châu Âu Ở Hoa Kỳ, các nghiên cứu báo cáo có khoảng 2 triệu người mắc động kinh, 3% dân số Hoa Kỳ có triệu chứng động kinh trong cuộc đời của họ Ở Châu Á tỷ lệ hiện dao động giữa 4 – 10/1.000 người Tỷ lệ mắc bệnh động kinh cao nhất ở nhóm tuổi trẻ và lớn hơn và tăng đều sau 50 tuổi (Hình 2) Nguyên nhân phổ biến nhất của co giật và động kinh

ở người lớn tuổi là bệnh mạch máu não [56] Gánh nặng bệnh tật đối với bệnh động kinh đã được đánh giá về mặt kinh tế bởi Hội đồng não Châu Âu cho các nước Châu

Âu, với dữ liệu từ năm 2004 [2, 66] và 2010 [25] và dựa trên dữ liệu kinh tế dịch tễ học và sức khỏe, con số tương ứng là 161 và 212 triệu € Theo WHO, ở các nước có thu nhập thấp, khoảng ba phần tư số người mắc bệnh động kinh có thể không nhận được sự điều trị mà họ cần Ở nhiều quốc gia có thu nhập thấp và trung bình, lượng thuốc chống động kinh rất ít Một nghiên cứu gần đây cho thấy mức độ sẵn có trung bình của các loại thuốc chống động kinh chung trong khu vực công của các nước có thu nhập thấp và trung bình là dưới 50%

Ở Việt Nam tỷ lệ mắc bệnh động kinh là 4,9 hoặc 7,5/1.000 người tùy từng vùng Theo một nghiên cứu năm 2008 tiến hành trên 50.000 dân tại Ba Vì, Hà Nội,

tỷ lệ mắc động kinh ở Việt Nam khoảng 4,4/1.000 người

Hình 2 Tỷ lệ mắc bệnh động kinh toàn cầu theo độ tuổi và giới tính năm

1.1.4 Nguyên nhân của bệnh động kinh

Bộ não được tạo thành từ hàng tỷ tế bào thần kinh (neuron) Các khu vực khác nhau của não sẽ có vai trò khác nhau, bao gồm chuyển động, lời nói, nhận thức và cảm giác Các tế bào thần kinh giao tiếp với nhau bằng các tín hiệu điện và hóa học Trong cơn động kinh, sự tương tác giữa các tế bào thần kinh tạm thời không hoạt động Kết quả là, một số khu vực của não hoặc tất cả các khu vực của não trở nên hoạt động quá mức và phát ra quá nhiều tín hiệu dẫn đến hiệu ứng "cơn bão trong não" gây ra những tác động đáng chú ý, chẳng hạn như co giật

Những suy đoán về nguyên nhân của bệnh động kinh đã có từ thời tiền sử Tư duy ma thuật và niềm tin siêu nhiên là nguyên nhân của chứng động kinh trước thời đại Hippocrate Ngoài mặt trăng, chiêm tinh học Hy Lạp ám chỉ các hành tinh như Sao Thổ, Sao Hỏa và Sao Thủy là nguyên nhân gây ra trạng thái động kinh để tạo ra những kẻ điên loạn [45] Cuộc tranh luận xung quanh nguyên nhân của chứng động kinh vẫn tiếp tục diễn ra trong suốt các thời kỳ sau đó Nguyên nhân cấu trúc của chứng động kinh đã được nêu rõ bởi Hughlings Jackson, người đã hợp tác với bác sĩ phẫu thuật Victor Horsley (1857-1916), đánh dấu sự ra đời của phẫu thuật động kinh Nguyên nhân di truyền của bệnh động kinh lần đầu tiên được phát hiện ra vào năm

1903 bởi Herman Bernhard Lundborg (1868-1943), người đã công bố nghiên cứu của mình về sự di truyền của bệnh động kinh myoclonic Bệnh động kinh qua trung gian

tự miễn dịch như một căn nguyên chỉ trở nên đáng chú ý trong nửa sau của thế kỷ

20 Vào những năm 1960, Brierley, Corsellis và các đồng nghiệp đã mô tả bệnh nhân

bị mất trí nhớ bán cấp khởi phát, mất phương hướng và co giật, với bằng chứng mô học về viêm hệ limbic [13, 16] Năm 2017, ILAE phân loại các nhóm căn nguyên của bệnh động kinh bao gồm cấu trúc, di truyền, lây nhiễm, chuyển hóa, miễn dịch và chưa biết Trong đó, theo WHO, khoảng một nửa số người mắc chứng động kinh không có nguyên nhân xác định được Đối với các trường hợp còn lại, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra một số loại động kinh với các gen cụ thể, nhưng đối với hầu hết mọi người, gen chỉ là một phần nguyên nhân gây ra chứng động kinh Một số gen nhất định có thể khiến một người nhạy cảm hơn với các điều kiện môi trường gây ra cơn động kinh Ví dụ: chấn thương đầu do tai nạn xe hơi hoặc các chấn thương khác,

chẳng hạn như khối u não hoặc đột quỵ, viêm màng não, AIDS và viêm não do vi rút,… có thể gây ra chứng động kinh Ngoài ra, bệnh động kinh đôi khi có thể liên quan đến các rối loạn phát triển, chẳng hạn như chứng tự kỷ và bệnh u xơ thần kinh

Về cơ chế phân tử, các cơn co giật trong bệnh động kinh chủ yếu bắt nguồn từ một số nguyên nhân, như sự mất cân bằng trạng thái ổn định giữa kích thích và ức chế ở các tế bào thần kinh mà cụ thể là ở các synap trước và sau trên các khớp thần kinh Chịu trách nhiệm cho sự cân bằng và ổn định này là các tế bào thần kinh sản xuất GABA (GABAergic) và các tế bào thần kinh sản xuất glutamate (glutamatergic), nằm tại các synap Cơ chế phát sinh tiềm năng được cho là sự giảm quá mức GABAergic tại các khớp thần kinh trên các tế bào thần kinh kích thích [12] và sự giảm quá mức glutamatergic trên các tế bào thần kinh ức chế [34], cũng như tăng glutamatergic quá nhiều ở các tế bào thần kinh kích thích [30] và tăng quá nhiều GABAergic ở các tế bào thần kinh ức chế [37] Quá trình này liên quan chặt chẽ đến điều hòa nồng độ ion trong không gian nội và ngoại bào Các ion liên quan đến quá trình hình thành phụ thuộc vào hoạt động bao gồm kali, canxi, proton và clorua

Một nguyên nhân khác là sự mất cân bằng nội môi thần kinh Cân bằng nội môi thần kinh là quá trình các tế bào thần kinh điều chỉnh khả năng hưng phấn của chúng Do đó, trong các điều kiện tạo ra hoạt động quá mức, các tế bào thần kinh điều chỉnh giảm các dây dẫn kích thích và điều chỉnh các dây dẫn ức chế Tuy nhiên, hiện mới có các bằng chứng thực nghiệm hỗ trợ cho giả thuyết này, các cơ chế phân tử của cân bằng nội môi vẫn chưa được hiểu rõ [43] Gần đây, một cách tiếp cận khác

để giải mã các cơ chế phân tử của cân bằng nội môi tế bào thần kinh là xem xét các gen mã hóa cho các kênh vận chuyển Các đột biến mất chức năng trong các gen mã hóa kênh natri được cho là nguyên nhân dẫn đến các rối loạn về cảm giác, vận động

và nhận thức hơn là chứng động kinh Tuy nhiên, một loạt các đột biến mất chức năng trong kênh natri dẫn đến chứng động kinh Trước khi việc giải trình tự gen trở nên nhanh chóng, rẻ tiền, số lượng gen được biết đến có liên quan đến bệnh động kinh là

13 và tất cả các gen này đều mã hóa cho các kênh ion [36] Hiện nay, các nghiên cứu giải trình tự đã phát hiện ra hơn 400 gen liên quan đến bệnh động kinh [49] Tuy

nhiên, mọi gen được phát hiện đều có tương tác sinh học phức tạp và sẽ mất một thời gian để khám phá [65]

Trong những năm trở lại đây, nhiều dữ liệu mới nổi từ các mô hình động kinh thực nghiệm và mô não người khẳng định sự tham gia của hệ thống miễn dịch bẩm sinh và hậu quả là viêm trong bệnh động kinh [75]

1.1.5 Điều trị bệnh động kinh

Rối loạn động kinh đã được điều trị hàng nghìn năm với nhiều loại thực vật và thảo mộc [3, 55] Kali bromua là hợp chất đơn lẻ đầu tiên được sử dụng để điều trị chứng động kinh sau khi Sir Charles Locock tình cờ phát hiện về tác dụng của nó vào năm 1857 [33, 60] Vì muối bromua là loại thuốc duy nhất có sẵn để điều trị bệnh động kinh vào thời điểm đó, chúng được sử dụng thường xuyên trong 50 năm sau đó, mặc dù hiệu quả hạn chế và tác dụng phụ nghiêm trọng của chúng Phenobarbital là hợp chất đơn thứ hai được phát hiện điều trị chứng động kinh vào năm 1912 bởi Alfred Hauptmann, người ban đầu sử dụng nó như một loại thuốc an thần cho các bệnh nhân động kinh của mình và nhận thấy rằng phenobarbital làm giảm các cơn động kinh của những bệnh nhân này [26] Diazepam, được sử dụng rộng rãi để điều trị tình trạng động kinh, được giới thiệu vào cuối những năm 1960 [48] Trong hai thập kỷ qua, một số loại thuốc mới đã được cấp phép để điều trị động kinh bao gồm felbamate, gabapentin, lamotrigine, topiramate, tiagabine, levetiracetam, oxcarbazepine, zonisamide, pregabalin, rufinamide, stiripentol, clobazam, vigabatrin,

và lacosamide

Điều trị bằng thuốc chống động kinh là phương pháp chính trong quản lý bệnh động kinh Liệu pháp điều trị bằng thuốc chống động kinh (AED), có bốn mục tiêu: loại bỏ các cơn co giật hoặc giảm tần suất đến mức tối đa có thể, tránh các tác dụng phụ liên quan đến việc điều trị lâu dài, giúp bệnh nhân duy trì hoặc khôi phục các hoạt động tâm lý xã hội và nghề nghiệp thông thường của họ, và duy trì lối sống bình thường [46] Việc điều trị bệnh động kinh bằng thuốc đòi hỏi phải có kiến thức kỹ lưỡng về AED về cơ chế, dược động học, liều lượng, chỉ định, tương tác thuốc và các tác dụng phụ cấp tính và mạn tính Đồng thời, quyết định bắt đầu liệu pháp AED phải dựa trên phân tích thông tin về khả năng tái phát cơn co giật, hậu quả của việc tiếp

tục co giật đối với bệnh nhân, và tác dụng có lợi và bất lợi của tác nhân dược lý đã chọn [20] Ngoài ra, quan điểm của bệnh nhân và gia đình cũng nên được xem xét khi bắt đầu điều trị AED Với một AED thích hợp được lựa chọn, hiệu quả có thể đạt được ở khoảng 50 – 70% bệnh nhân Tuy nhiên, khoảng 30 – 50% bệnh nhân không đáp ứng với liệu pháp đơn thuốc Vì vậy, bác sĩ hoặc bác sĩ điều trị phải chọn AED thích hợp hoặc kết hợp các loại thuốc giúp kiểm soát tốt nhất các cơn co giật Liệu pháp này thành công cao hơn ở những bệnh nhân mắc chứng động kinh mới được chẩn đoán và tỷ lệ thành công phụ thuộc vào loại động kinh, tiền sử gia đình và mức

độ của các bất thường thần kinh liên quan [21] Ở hầu hết các bệnh nhân, thuốc chống động kinh được kê đơn để điều trị suốt đời vì những bệnh nhân hết co giật khi sử dụng thuốc chống động kinh có khả năng tái phát cao sau khi ngừng thuốc [9, 62] Phẫu thuật điều trị động kinh có thể là một giải pháp thay thế, nhưng hiện nay, phẫu thuật chỉ có thể thực hiện được ở một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân dùng thuốc và sau khi phẫu thuật hầu hết bệnh nhân vẫn được kê đơn thuốc chống động kinh để kiểm soát cơn co giật hoàn toàn, do đó nhóm bệnh nhân này vẫn còn nguy cơ đối với các tác dụng phụ

có hại và tương tác thuốc [74] Trong thời điểm hiện tại, nghiên cứu không chỉ tập trung vào các hợp chất hóa học mà còn cả các thiết bị chống động kinh cấy ghép đang được nghiên cứu [63]

Bảng 1 Một số thuốc chống động kinh phổ biến [14]

Thuốc cho các hội chứng và động

kinh khởi phát cục bộ (khu trú)

Thuốc có tiềm năng rộng (động kinh khởi phát cục bộ và toàn thể)

1.1.6 Bệnh động kinh và quá trình viêm

Những hiểu biết đầu tiên về vai trò tiềm ẩn của viêm trong bệnh động kinh ở người phát hiện từ bằng chứng lâm sàng chỉ ra rằng steroid và các phương pháp điều trị chống viêm khác cho thấy hoạt động chống co giật ở một số bệnh động kinh kháng thuốc [52, 76, 77] Các bằng chứng hỗ trợ đến từ các cơn co giật do sốt, thường là sự gia tăng nồng độ của các tác nhân gây viêm Có bằng chứng cho thấy việc kích hoạt

hệ thống miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch đáp ứng và động kinh được liên kết với nhau trong một số bệnh động kinh ở người Trong một nghiên cứu năm 2014, nguy cơ mắc bệnh động kinh tăng lên ở những bệnh nhân mắc các bệnh tự miễn, ở trẻ em tăng gấp năm lần và ở người lớn ≤ 65 tuổi gấp bốn lần so với bệnh nhân không mắc các bệnh

tự miễn [44] Mặc dù các cơ chế tế bào và phân tử của quá trình phát sinh động kinh không rõ ràng, nhưng người ta cho rằng các quá trình viêm không được kiểm soát dẫn đến kết nối thần kinh không ổn định và mạng lưới tế bào thần kinh bị tăng kích

thích, là trung gian khởi phát bệnh động kinh [40, 41] Bộ não được coi là một vị trí đặc quyền miễn dịch vì sự hiện diện của hàng rào máu não, thiếu hệ thống bạch huyết thông thường và sự tập trung hạn chế của các tế bào miễn dịch ngoại vi Tuy nhiên,

cả phản ứng miễn dịch bẩm sinh và đáp ứng đều dễ dàng được kích hoạt trong hệ thần kinh trung ương để phản ứng lại các mầm bệnh, kháng nguyên tự thân hoặc tổn thương mô do một số nguyên nhân [73] Tế bào thần kinh đệm, tế bào hình sao, tế bào nội mô hàng rào máu não và các tế bào miễn dịch ngoại vi xâm nhập vào nhu mô não đều có thể tạo ra các phân tử tiền viêm và chống viêm [5, 50] Sự kích hoạt miễn dịch bẩm sinh và quá trình chuyển đổi sang miễn dịch đáp ứng thực hiện bởi nhiều chất trung gian gây viêm, trong đó cytokine có vai trò then chốt Các phân tử này bao gồm interleukin (ILs), interferon (IFNs), yếu tố hoại tử khối u (TNFs) và yếu tố tăng trưởng (ví dụ, yếu tố tăng trưởng biến đổi TGF– β) (Hình 3) Trong hệ thần kinh trung ương, các cytokine có thể tham gia vào quá trình sửa chữa các mô bị hỏng, tuy nhiên, việc sản xuất quá nhiều cytokine có thể dẫn đến chết tế bào [32] Các cytokine được nghiên cứu rộng rãi nhất trong thần kinh trung ương cũng như bệnh động kinh là IL– 1β, TNF– α và IL– 6

Hình 3 Viêm não – một cơ chế gây bệnh quan trọng của bệnh động kinh [5]

Họ Interleukin (IL) – 1 là họ lớn nhất của interleukin, và đã được nghiên cứu rộng rãi nhất Cytokine tiền viêm IL– 1β, được biểu hiện trong các tế bào thần kinh đệm và tế bào hình sao, giúp tăng cường giải phóng glutamate từ tế bào hình sao và giảm tái hấp thu glutamate, do đó làm tăng khả năng cung cấp glutamate trong các khớp thần kinh và thúc đẩy sự hưng phấn của tế bào thần kinh [1] Ngoài ra, cũng có

ý kiến cho rằng IL– 1β gây ra cơn động kinh thông qua việc điều hòa các thụ thể NMDA trên các tế bào sau synap thông qua sự kích hoạt tiểu đơn vị GluN2B của thụ thể NMDA Bên cạnh đó, cytokine IL– 1β cũng được phát hiện là tăng đáng kể trong dịch não tủy ở nhóm bệnh nhi bị động kinh, trái ngược với nhóm đối chứng, cho thấy vai trò quan trọng của cytokine này trong việc khởi phát và tiến triển bệnh động kinh [59] Đối với các phản ứng viêm ngoại vi điển hình, việc sản xuất IL– 1β đi kèm với sự tổng hợp đồng thời của chất đối kháng IL– 1R nội sinh (IL– 1Ra) tăng lên 100 đến 1000 lần, chất này nhanh chóng ngăn chặn sự hoạt hóa của thụ thể này Ngược lại, khi các tổn thương trong não giải phóng IL– 1β từ các tế bào đệm và tế bào hình sao, IL– 1RA vẫn ở mức độ thấp hơn nhiều và thậm chí vẫn duy trì trạng thái này rất lâu sau đó Phát hiện này cho thấy rằng não bộ kém hiệu quả hơn nhiều so với vùng ngoại vi trong việc điều chỉnh mức độ IL– 1β nội sinh

Interleukin – 6 (IL– 6) được coi là cytokine gây khuyng hướng co giật [31] IL– 6 cytokine hiện diện ở nồng độ thấp trong não khỏe mạnh Đại thực bào là nơi sản xuất chính của IL– 6, nhưng IL– 6 cũng được sản xuất bởi các tế bào khác như tế bào nội mô, tế bào lympho T Đồng thời, sự kích thích tế bào hình sao và tế bào thần kinh đệm có thể dẫn đến tăng sản xuất IL– 6 Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc biểu hiện IL– 6 chuyển gen và sử dụng IL– 6 qua đường mũi khiến chuột nhạy cảm hơn

và dễ bị co giật hơn [22] Trong một nghiên cứu khác, sử dụng IL– 6 (400 ng/kg) qua đường mũi ở chuột trưởng thành làm tăng mức độ nghiêm trọng của cơn co giật do pentylenetetrazole gây ra , được chứng minh bằng thời gian khởi phát động kinh ngắn hơn, thời gian co giật dài hơn và tỷ lệ tử vong cao hơn Ngoài ra, các mô hình động vật gặm nhấm có tình trạng động kinh thể limbic (SE) được gây ra bởi axit kainic, bicuculline methiodide, hoặc kích thích điện, mRNA IL– 6 và protein IL– 6 gia tăng đáng kể trong tế bào thần kinh đệm Bên cạnh đó, một nghiên cứu khác trên chuột

chuyển gen biểu hiện quá mức IL– 6 trong tế bào hình sao đã cho thấy sự gia tăng nhạy cảm với các cơn co giật do các chất chủ vận glutamatergic gây ra (tức là axit kainic và NMDA) và sự mất đi cấu trúc miễn dịch GABA và parvalbumin ở hồi hải

mã [54] Đối với các nghiên cứu trên con người, sự gia tăng nồng độ IL– 6 trong dịch não tủy sau cơn co giật tăng trương lực toàn thân được nhận thấy rõ ràng hơn sự gia tăng trong huyết tương Không chỉ vậy, các nghiên cứu khác cũng cho thấy mối quan

hệ giữa nồng độ IL– 6 trong huyết tương và các chứng động kinh khu trú Ví dụ, IL– 6 đã được phát hiện là tăng đáng kể trong động kinh thùy thái dương tại thời điểm

6 giờ sau cơn co giật Tóm lại, các thí nghiệm trên động vật cũng như các nghiên cứu trên người cho thấy nồng độ IL– 6 cao trong não là một yếu tố gây độc và co giật rõ ràng cho thần kinh, đồng thời, sự gia tăng biểu hiện của IL– 6 cả trong não và máu đều có liên quan chặt chẽ với co giật và động kinh

TNF– α cũng là một cytokine được nghiên cứu trong sinh lý bệnh động kinh Trong hệ thần kinh trung ương, TNF– α kích hoạt hai thụ thể của nó (p55 và p75) qua

đó, điều chỉnh các con đường tín hiệu tế bào Thụ thể p55 liên quan đến việc kích hoạt quá trình chết tế bào theo chu trình, trong khi thụ thể p75 có liên quan đến việc kích hoạt hệ thống yếu tố nhân Kappa B (NF – kB) TNF– α đóng một vai trò hai mặt trong bệnh động kinh, bắt nguồn từ việc kích hoạt các thụ thể khác nhau của nó trong não, p55 và p75 Trên mô hình nghiên cứu động vật, những con chuột biến đổi gen biểu hiện TNF– α trong các tế bào thần kinh trên toàn bộ não dễ bị co giật và chết sớm Balosso và cộng sự phát hiện hoạt động chống co giật của TNF–α ở chuột được trung gian bởi thụ thể p75, trong khi những con chuột loại bỏ thụ thể p55 đã giảm độ nhạy cảm với động kinh [4] Tuy nhiên, các cơ chế gây ra ưu thế của con đường p55

so với con đường p75 hoặc ngược lại vẫn chưa rõ ràng Bên cạnh đó, có rất ít dữ liệu

về TNF– α ở bệnh nhân động kinh TNF– α trong huyết tương hoặc dịch não tủy ở một số bệnh nhân co giật do sốt, hoặc sau 24 giờ ở một số bệnh nhân bị động kinh được ghi nhận là không có thay đổi đáng kể Vai trò về mức độ biểu hiện cũng như

cơ chế của TNF– α vẫn cần được nghiên cứu thêm

1.2 GABA và thụ thể GABA

1.2.1 GABA và thụ thể GABA trong bệnh động kinh

Động kinh có thể được coi là sự phóng điện thoáng qua kịch phát trong não do

bị kích thích quá nhiều hoặc ức chế quá ít ở khu vực bắt đầu phóng điện bất thường Kích thích và ức chế tế bào thần kinh có thể được trung gian bởi nhiều chất dẫn truyền thần kinh khác nhau, và luôn ở trạng thái cân bằng Khi sự cân bằng này bị xáo trộn,

co giật có thể xảy ra GABA (γ– aminobutyric acid) được phát hiện trong não vào năm 1950 và kể từ đó, nó được coi là chất dẫn truyền thần kinh ức chế chính trong não Cấu trúc hóa học của GABA được thể hiện dưới hình 4 GABA được hình thành tại các đầu tận cùng của sợi trục bởi các tế bào sản xuất GABA (GABAergic) bằng cách chuyển hóa α– ketoglutarate thành axit glutamic, sau đó khử cacboxyl bởi axit glutamic decarboxylase (GAD) thành GABA [71] Tại các synap, GABA hoạt động liên kết với một trong hai thụ thể: GABAA hoặc GABAB Các thụ thể GABAA là các kênh ion phối tử (còn được gọi là các thụ thể ionotropic) có chức năng siêu phân cực

tế bào thần kinh bằng cách tăng độ dẫn clorua vào trong tế bào và có tác dụng ức chế nhanh chóng Phức hợp thụ thể GABAA là một dị đồng phân pentameric có chứa các

vị trí liên kết với GABA, barbiturat, benzodiazepin, picrotoxin, và neurosteroid, với

16 tiểu đơn vị được biết đến (α1 – α6, β1 – β3, γ1 – γ3, δ, ε, θ, và π) ở động vật có

vú Các thụ thể GABAB, có tác dụng ức chế chậm, là các thụ thể liên kết với protein

G (còn được gọi là các thụ thể metabotropic) làm siêu phân cực tế bào thần kinh bằng cách tăng độ dẫn kali, giảm sự xâm nhập của canxi, đồng thời ức chế tiền synap giải phóng các chất dẫn truyền khác GABAA là thụ thể có chức năng thích ứng với độ tuổi trong não Cụ thể, trong suốt giai đoạn phát triển đầu, chúng làm trung gian các tác động kích thích dẫn đến kích hoạt các quá trình truyền tín hiệu nhạy cảm với canxi, rất quan trọng đối với sự biệt hóa của não Trong các giai đoạn phát triển trưởng thành hơn và ở người lớn, các thụ thể GABAA truyền tín hiệu ức chế [24] Với khả năng ức chế nhanh chóng, tác dụng này được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các tình trạng cần thiết phải làm giảm hoạt động tế bào thần kinh, điển hình như trong bệnh động kinh, các loại thuốc nhắm vào các thụ thể GABAA là phương pháp chính trong điều trị co giật

Hình 4 Cấu trúc của GABA và thụ thể GABAA

Về cơ chế hoạt động, thụ thể GABAA có 2 vị trí liên kết với GABA nằm giữa

2 tiểu đơn vị α và β, 1 vị trí nằm giữa 2 tiểu đơn vị α và γ là vị trí liên kết với các chất thuốc nhóm Benzodiazepines (Diazepam, Lorazepam, Temazepam,…) Một nhóm thuốc khác là nhóm Barbituates cũng có khả năng liên kết với thụ thể GABAA tại vị trí tiểu đơn vị α hoặc β Khi các thuốc thuộc nhóm Benzodiazepines gắn vào thụ thể GABAA, làm cho lỗ trung tâm mở ra với tần số nhiều hơn Không giống như vậy, GABA và các thuốc nhóm Barbiturates khi gắn vào thụ thể GABAA sẽ giữ cho lỗ trung tâm mở ra trong thời gian lâu hơn, gây ra dòng chảy ion Cl¯ vào trong tế bào thần kinh, dẫn đến trạng thái siêu phân cực của tế bào bằng cách thúc đẩy điện thế màng tiến tới điện thế đảo ngược của ion Cl¯ là khoảng – 65 mV trong tế bào thần kinh, qua đó ức chế việc kích hoạt điện thế hoạt động mới, cũng như giảm hoạt động hưng phấn của các chất dẫn truyền thần kinh như Acetylcholine hay Glutamate, dẫn đến giảm trạng thái kích thích của tế bào

Các thụ thể GABAB lần đầu tiên được xác định bởi Tiến sĩ Norman Bowery vào năm 1979 Các thụ thể GABAB là thành viên của họ thụ thể kết hợp với protein lớp CG (GPCR) GPCR thường được chia thành bốn lớp (A, B, C và F) dựa trên mức

độ tương đồng trình tự của các miền xuyên màng của chúng Các thụ thể GABAB là

các dị phân tử của các tiểu đơn vị R1 và R2 Mỗi tiểu đơn vị thụ thể GABAB bao gồm

ba miền: miền tận cùng N dài ngoài tế bào được gọi là miền Venus flytrap (VFT), chứa vị trí liên kết trực tiếp với GABA, miền xuyên màng heptahelical (7TM), và một đuôi nội bào đầu C Trong đó, các tiểu đơn vị R2 kết hợp với protein G để tạo ra tín hiệu qua trung gian protein G Các con đường truyền tín hiệu qua trung gian thụ thể GABAB liên quan đến một trong ba loại protein tác động lên kênh K + (GIRK), kênh Ca 2+ (CaV ) và adenylyl cyclase Các tác động của các thụ thể GABAB bao gồm

ức chế giải phóng chất dẫn truyền thần kinh và điều chỉnh tính hưng phấn của tế bào thần kinh Sau khi kích hoạt thụ thể GABAB, protein G phân ly thành các tiểu đơn vị

Gα và Gβγ Các tiểu đơn vị Gαi / o ức chế adenylyl cyclase để giảm mức AMP vòng (cAMP), trong khi tiểu đơn vị Gβγ ức chế kênh Ca 2+ và kích hoạt các kênh K+ [11,

15, 72] Con đường truyền tín hiệu thông qua adenylyl cyclase chủ yếu có liên quan đến trí nhớ dài hạn của vùng hồi hải mã Kênh CaV làm trung gian cho dòng canxi để đáp ứng với sự khử cực của màng, do đó điều hòa các quá trình nội bào như co cơ, giải phóng hormone và chất dẫn truyền thần kinh, kích thích tế bào thần kinh Các kênh K+ được biểu hiện rộng rãi trong hệ thần kinh trung ương Khi được kích hoạt, các thụ thể GABAB sau synap làm tăng độ dẫn kali trong màng tế bào thần kinh bằng cách mở các kênh GIRK để thúc đẩy dòng chảy K+ ra khỏi tế bào thần kinh, dẫn đến

sự siêu phân cực của tế bào thần kinh làm cơ sở cho các điện thế ức chế sau synap chậm và kéo dài

Nhiều bằng chứng lâm sàng và thực nghiệm đã chứng minh vai trò của GABA trong bệnh động kinh Cụ thể, sự bất thường về chức năng của tế bào sản xuất GABA

đã được quan sát thấy trong các mô hình động vật động kinh Ngoài ra, thuốc chủ vận GABA ngăn chặn cơn co giật, thuốc đối kháng GABA, cũng như thuốc ức chế tổng hợp GABA gây ra co giật Bên cạnh đó, benzodiazepine (BZDs), barbiturat,… là những thuốc chống co giật hiệu quả, hoạt động bằng cách tăng cường hoạt động của thụ thể GABAA thông qua tương tác trực tiếp với thụ thể Thuốc gián tiếp làm tăng GABA có sẵn tại các synap bằng cách ức chế dị hóa GABA (vigabatrin (VGB)) hoặc tái hấp thụ GABA (tiagabine (TGB)) là những thuốc chống co giật hiệu quả được phát triển gần đây

1.2.2 Thụ thể GABA và quá trình viêm

Những hiểu biết của sự tương tác giữa các cytokine gây viêm và thụ thể GABA trong bệnh động kinh hiện vẫn còn khá hạn chế Tuy nhiên, cũng đã có các bằng chứng cho thấy tác động ức chế của các cytokine đối với GABA và thụ thể của nó Nghiên cứu của Roseti và cộng sự cho thấy nồng độ của IL– 1β trong bệnh động kinh thùy thái dương làm giảm tới 30% dẫn truyền thần kinh qua trung gian GABA và dẫn đến co giật do tăng kích thích tế bào thần kinh [53] Hơn nữa, IL– 1β không chỉ có thể làm tăng hình thành oxit nitric để tăng nhạy cảm co giật mà còn cũng có thể tăng kích thích tế bào thần kinh bằng cách: ức chế trực tiếp thụ thể GABAA Ngoài ra, IL– 1β được giải phóng từ các tế bào thần kinh đệm đã được kích hoạt và các tế bào thần kinh được kích thích sau các chấn thương thần kinh(nhiễm trùng, đột quỵ, viêm,…) sau đó liên kết với các thụ thể Toll like (TLR) và thụ thể IL– 1 (IL– 1R) Các hiện tượng viêm sẽ tiếp tục dẫn đến việc sản xuất và giải phóng các phân tử miễn dịch khác bởi các tế bào hình sao và tế bào thần kinh đệm, do đó khuếch đại các dòng viêm hạ lưu Sự giải phóng các chất trung gian gây viêm này sẽ gây ra quá trình kích thích quá mức tế bào thần kinh bằng cách tăng tính thấm của tế bào thần kinh với glutamate và với ion canxi (Ca 2+ ) thông qua thụ thể GABA Hầu hết các phản ứng viêm này có xu hướng ảnh hưởng lâu dài, cuối cùng gây ra sự tái phát của các cơn co giật Ở mức độ tương đối thấp, IL– 1β dường như có tác dụng chống co giật bằng cách hạn chế Ca2+ nội bào và tăng cường truyền GABAergic, trong khi nồng độ IL– 1β cao hơn có thể có ảnh hưởng như chất tiền co giật Một nghiên cứu khác trên chuột biến đổi gen biểu hiện quá mức IL– 6 trong tế bào hình sao đã chỉ ra sự tăng độ nhạy cảm với các cơn co giật do các chất chủ vận glutamatergic (ví dụ, axit kainic và NMDA) và mất cấu trúc miễn dịch GABA Những kết quả này cho thấy rằng quá trình ức chế thông qua trung gian thụ thể GABA là nguyên nhân khiến cho những con chuột này bị co giật Ngoài ra, TNF– α có thể kích thích lên thụ thể glutamate, làm tăng số lượng thụ thể này và làm giảm biểu hiện của thụ thể GABA bằng cách gây nên hiện tượng nhập bào đối với thụ thể GABA, qua đó gây ra trạng thái bị kích thích của các tế bào dẫn đến động kinh Mặc dù vẫn cần nghiên cứu thêm, tuy nhiên

việc kích thích hoạt động của thụ thể GABA thông qua ức chế các tín hiệu gây viêm hứa hẹn mở ra một con đường mới trong điều trị bệnh động kinh

Dựa trên những công bố về vai trò của quá trình viêm và thụ thể GABA, có thể thấy, việc nồng độ các chất trung gian gây viêm (IL– 1β, TNF– α, IL– 6) tăng lên trong não là một trong những nguyên nhân gây ức chế hoạt động của thụ thể GABA, qua đó, gián tiếp làm tăng nguy cơ gây nên các cơn co giật Chính vì vậy, một hướng nghiên cứu để hỗ trợ điều trị bệnh động kinh có thể được mở ra thông qua việc làm giảm nồng độ các tín hiệu gây viêm trong não, giúp cho thụ thể GABA trở về trạng thái hoạt động bình thường Các nghiên cứu trước mắt có thể tập trung vào các hợp

chất trong tự nhiên đã được báo cáo về công dụng kháng viêm

1.3 Cây nhọ nồi và vai trò của cây nhọ nồi trong bệnh động kinh

Cây nhọ nồi hay cỏ mực, hàn liên thảo (Eclipta prostrata L.) là một loài thực

vật có hoa thuộc họ Cúc (Asteraceae), phân bố rộng rãi trên toàn thế giới, điển hình như trên khắp Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, Brazil,… Nhọ nồi

là cây thân thảo sống hàng năm, nảy mầm vào cuối mùa xuân và mùa hè, cây ra hoa vào mùa hè và đầu mùa thu sau đó tàn vào mùa đông Cây có thân cao và dài 5 – 90

cm, đôi khi thành chùm, thân có nhiều thịt hoặc sần sùi, màu đỏ tía và có thể mọc rễ

ở các đốt Lá cây hình trứng hẹp, hình elip hẹp hoặc hình elip, dài 2 – 12 cm, rộng 0,3 – 4 cm, gốc hình nón hoặc nhỏ dần, mép khía răng cưa hoặc hình răng cưa, đỉnh nhọn hoặc hơi nhọn, hình chóp nhọn hoặc hình chùy nhô lên trên cả hai bề mặt, cuống

lá có thể dài đến 3 mm Cụm hoa hình cầu hoặc bán cầu, có cuống dài tới 1 cm, tổng bao dài đến 6 mm, lá bắc 8 – 11 lá, đính lông tơ Hoa của cây nhọ nồi dạng chùm tia thành nhiều dãy, không lộ, màu trắng, hình tia dài 1 – 2 mm, các bông hình đĩa màu trắng, hiếm khi có màu vàng, dài 1 – 2 mm Quả bế màu nâu hoặc đen với các mép nhạt, hình thuôn, dài 2 – 2,5 mm, phẳng hoặc có 3 gân, phân nhánh, không có mào lông hoặc có vành nhỏ

Theo nghiên cứu của Zhang JS và cộng sự, có 10 hợp chất được phân lập từ cây nhọ nồi, bao gồm: wedelolactone (1), demethylwedelolactone (2), isodemethylwedelolactone (3), alpha-formylterthienyl (4), strychnolactone (5), beta-

sitosterol (6), nonacosanol (7), stearic acid (8), lacceroic acid (9), 3,4-dihydoxy

benzoic acid (10) [79] Trong dân gian, cây nhọ nồi được coi là một loại cỏ dại phổ

biến bởi vai trò quan trọng trong y học dân tộc và đã được sử dụng từ lâu để điều trị

huyết áp cao, bệnh tim mạch vành, bệnh bạch biến, bệnh tiểu đường, bệnh ngoài da,

bệnh đường tiêu hóa, bệnh đường hô hấp, vết cắt và vết thương của người dân Châu

Á và Nam Mỹ Các bộ phận trên cây khô của cây được sử dụng làm thuốc trong hệ

thống Y học Cổ truyền Trung Quốc và được phân loại là thảo mộc dưỡng âm, thường

được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan như răng lung lay, bạc tóc, chóng mặt, ù

tai và xuất huyết Ở Ấn Độ, cây có giá trị y học rộng và được sử dụng chủ yếu để điều

trị các rối loạn hô hấp (ví dụ: viêm phế quản, hen suyễn và ho), bệnh ngoài da (ví dụ

như bỏng, viêm da và vết thương), nhiễm trùng, sốt, rụng tóc và xám tóc, mệt mỏi,

tiểu đường, vàng da Ở Thái Lan, các bộ phận khác nhau được sử dụng cho các mục

đích khác nhau Các lá được sử dụng cho các bệnh chết tóc và da, thân cây được coi

như một vị thuốc bổ máu hoặc chữa bệnh lao, bệnh amip và bệnh hen suyễn, rễ được

coi là một chất kháng khuẩn và chất bảo vệ gan Nó cũng được dùng làm thuốc tự

điều trị cho bệnh nhân AIDS Bên cạnh đó, trong y học cổ truyền của Brazil,

E prostrata được sử dụng rộng rãi để điều trị rắn cắn, giang mai, giun chỉ và bệnh

phong

Việc phát triển các loại thuốc mới rất tốn kém và rủi ro Cơ hội hoàn thành việc phát triển và được cơ quan quản lý phê duyệt thành công là ít hơn 10%, ngay cả đối với những loại thuốc đang ở giai đoạn Pha 1 Các thuốc điều trị động kinh lý tưởng nên ngăn chặn tất cả các cơn động kinh mà không gây ra bất kỳ tác dụng phụ không mong muốn nào Thật không may, các thuốc hiện có không chỉ không kiểm soát được hoạt động co giật ở một số bệnh nhân mà còn thường xuyên tạo ra các tác dụng phụ có mức độ nghiêm trọng Chính vì vây, nghiên cứu về các hợp chất có nguồn gốc từ cây thuốc có thể cung cấp loại thuốc an toàn nếu chúng đã được người dân sử dụng

Ngoài những tác dụng đã liệt kê, cây nhọ nồi còn được sử dụng trong hệ thống

y học cổ truyền và cả những người chữa bệnh truyền thống, đặc biệt là ở khu vực phía Nam Ấn Độ để điều trị bệnh động kinh từ thời cổ đại Lá nhọ nồi giã nát với nước ép tỏi và ớt được dùng bằng đường uống để điều trị bệnh động kinh bởi các thầy lang

truyền thống Cho đến nay, các chất chiết xuất trong nước và cồn của E prostrata đã

được đánh giá về các hoạt động an thần, giãn cơ, giải lo âu, nootropic và chống trầm cảm, tăng cường trí nhớ Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào chỉ ra rằng chất nào trong cây nhọ nồi có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh động kinh cũng như chỉ ra cơ chế tác động của nó

Xuất phát từ thực trạng hiện nay của bệnh động kinh, cùng với hướng nghiên cứu mới hứa hẹn trong điều trị bệnh động kinh thông qua viêm và thụ thể GABA, dựa trên cơ sở đã biết là khả năng kháng viêm của cây nhọ nồi, chúng tôi thực hiện

đề tài: “Sàng lọc một số chất từ dịch chiết cây Nhọ nồi (Eclipta prostrata L.) có

khả năng hỗ trợ điều trị bệnh động kinh trên mô hình chuột thông qua thụ thể GABA (gamma – amino butyric acid)”, với mục tiêu:

- Tinh sạch được ít nhất một chất từ cây nhọ nồi có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh động kinh thông qua thụ thể GABA trên mô hình chuột bị kích thích với Picrotoxin

- Đánh giá được mối liên quan giữa quá trình điều hòa đáp ứng viêm và bệnh động kinh trên mô hình chuột của chất tinh sạch

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu và thiết bị

- Vật liệu nghiên cứu:

Mẫu thực vật: cây nhọ nồi được thu thập tại tỉnh Thái Bình Sau khi được định danh tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (TC01, TC02, TC03), mẫu được sấy khô ở 600C trong 24 giờ, sau đó được nghiền thành dạng bột và bảo quản ở nhiệt độ phòng

Mẫu động vật: Nghiên cứu được thực hiện trên dòng chuột đực Swiss trắng có cân nặng từ 17-19g, được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương

- Hóa chất: Các hóa chất sử dụng được liệt kê trong bảng

Bảng 2 Hóa chất sử dụng trong đề tài

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

2 Mouse IL– 6, IL– 1β, TNF– α ELISA Invitrogen (Mỹ)

11 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Merck (Đức)

13 potassium dihydrogen phosphate

- Thiết bị: Các thiết bị sử dụng được liệt kê trong bảng

Bảng 3 Thiết bị sử dụng trong đề tài

STT Tên thiết bị Nguồn gốc

5 Máy HPLC Shimadzu

11 Máy đo quang phổ SpectraMax 384

12 Tủ âm sâu -270C MDF-C8V1 Panasonic (Nhật)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết Wedelolactone, Luteolin từ cây nhọ nồi

Tách chiết Wedelolactone: bột lá khô của cây nhọ nồi được chiết xuất bằng Soxhlet với dung môi methanol trong 36 giờ Dịch chiết methanol sau đó được loại

bỏ, phần cặn còn lại được chiết xuất với nước ở 800C trong 30 phút Sau 30 phút, dịch chiết nước được phân chia lần lượt với các dung môi toluen, cloroform : methanol (7:3), hexan Pha nước thu được sau cùng được phân chia với ethyl acetate Pha ethyl acetate được thu và kiểm tra sự hiện diện của Wedelolactone bằng phương pháp sắc

ký bản mỏng (TLC) với pha động sử dụng hệ dung môi toluen: axeton: axit formic (11: 6: 1) Độ tinh sạch của Wedelolactone được kiểm tra bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp Bước sóng phát hiện được đặt ở 351 nm, pha động sử dụng acetonitril: nước (35: 65 v / v) Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng và tốc độ dòng chảy được cố định ở 1,0 mL/phút

Luteolin được tách chiết theo phương pháp mô tả trước đó bởi Rufi Tambe và cộng sự [69] Cụ thể, bột khô của lá cây nhọ nồi đã được khử khí bằng cách sử dụng xăng ete và sau đó được chiết xuất bằng Soxhlet với methanol 95% (60 – 800C) trong

18 giờ Dịch chiết methanol sau đó được kết tủa bằng nước lạnh Phấn kết tủa và dịch chiết nước được tách ra bằng cách ly tâm Dịch chiết nước được tiếp tục phân đoạn bằng ethyl acetate Lớp ethyl acetate thu được sẽ được cô đặc đến khô, hòa tan trong methanol sau đó được tinh chế thêm bằng chloroform để có được một hợp chất thô

Sự kết tinh lặp lại của hợp chất thô với metanol được thực hiện để thu được Luteolin Luteolin thu được sẽ được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng TLC với pha động sử dụng

hệ dung môi ethyl acetate: toluene: formic acid: methanol (3:3:0.8:0.2) và PEG được

sử dụng là chất phát màu Độ tinh sạch của Luteolin được đánh giá bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp Bước sóng phát hiện được đặt ở 350 nm, pha động sử dụng nước : metanol : axit axetic (700: 300: 10 v/v/v) Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng và tốc độ dòng chảy cố định ở 1,0 mL/phút

2.2.2 Tách chiết đại thực bào từ tủy xương chuột

Tế bào đại thực bào được tách ra từ xương đùi chuột (BMDM) theo phương pháp được mô tả bởi Trinh Tat Cuong và cộng sự [17] Sau đó, BMDMs được phân chia từ 5 đến 7 ngày trong môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) đã được bổ sung cùng với 10% môi trường điều kiện nuôi tế bào L929 (được xem như yếu tố kích thích M – CSF (macrophage-specific colony stimulating factor), 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 50 U/mL penicinin, 50 μg/mL Streptomycin, và

5 x 10-5 M β – mercaptoethanol, ở 370C bổ sung 5% CO2 Môi trường được thay mới sau mỗi hai ngày Sau 5 – 7 ngày nuôi cấy, tế bào được thu lại từ các giếng bằng cách

sử dụng Trypsin 10%