Đánh giá tác dụng của bacillus dạng bào tử chịu nhiệt đến sinh trưởng, hệ vi khuẩn đường ruột và hình thái niêm mạc ruột lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐÌNH TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA BACILLUS DẠNG BÀO TỬ CHỊU NHIỆT ĐẾN SINH TRƯỞNG, HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT VÀ HÌNH THÁI NIÊM MẠC RUỘT LỢN CON THEO MẸ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN ĐÌNH TRÌNH

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA BACILLUS DẠNG BÀO TỬ CHỊU NHIỆT ĐẾN SINH TRƯỞNG, HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT VÀ HÌNH THÁI NIÊM MẠC RUỘT LỢN

CON THEO MẸ VÀ LỢN CON SAU CAI SỮA

Mã số: 60.64.01.01

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Bá Tiếp

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào Các tài liệu tham khảo trích dẫn đều có nguồn gốc xác thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Đình Trình

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Viện đào tạo Sau đại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú Y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Giải Phẩu - Tổ Chức, Khoa Thú Y đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn khoa học, TS Nguyễn Bá Tiếp, đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi luôn biết ơn gia đình, các cộng sự, đồng nghiệp và bạn bè đã đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu và luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Đình Trình

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục những từ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Trích yếu luận văn viii

Thesis abstract x

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tổng quan về probiotic 3

2.1.1 Tổng quan về Probiotic 3

2.1.2 Đặc điểm chung probiotics nhóm Bacillus 9

2.1.3 Các nghiên cứu ứng dụng Probiotics trong chăn nuôi 14

2.2 Đặc điểm sinh trưởng và hệ vi sinh vật đường ruột lợn con 17

2.2.1 Khủng hoảng sinh lý của lợn con trước và sau cai sữa 17

2.2.2 Hệ vi sinh vật đường ruột lợn con trước và sau cai sữa 18

Phần 3 Đối tượng - nội dung và phương pháp nghiên cứu 21

3.1 Đối tượng - thời gian – địa điểm nghiên cứu 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Thời gian nghiên cứu 21

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 21

3.2 Nội dung nghiên cứu 21

3.2.1 Kiểm tra độ bảo toàn số lượng bào tử Bacillus sau quá trình ép viên thức ăn 21

3.2.2 Đánh giá tác động của PBW trên lợn con theo mẹ 22

3.2.3 Đánh giá tác động của PBW trên lợn con sau cai sữa 22

3.3 Phương pháp nghiên cứu 22

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm một nhân tố 22

3.3.2 Các phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 24

3.3.3 Phương pháp tính toán các chỉ tiêu sinh trưởng 29

3.3.4 Phương pháp kiểm tra vi thể biểu mô niêm mạc ruột 31

3.3.5 Phương pháp phân tích số liệu 31

Phần 4 Kết quả và thảo luận 32

4.1 Kết quả kiểm tra độ bảo toàn bào tử Bacillus sau quá trình ép viên thức ăn 32

4.2 Kết quả tác động của chế phẩm PBW trên lợn con theo mẹ 34

4.2.1 Tác động của chế phẩm PBW đến chỉ tiêu sinh trưởng trên lợn con theo mẹ 34

4.2.2 Tác động của chế phẩm PBW đến lượng thức ăn thu nhận lợn con theo mẹ 35

4.2.3 Tác động của chế phẩm PBW đến tỷ lệ tiêu chảy và tỷ lệ chết trên lợn con theo mẹ 37

4.3 Kết quả tác động của chế phẩm PBW Trên lợn con sau cai sữa 48

4.3.1 Tác động của PBW đến một số chỉ tiêu sinh trưởng lợn con sau cai sữa 48

4.3.2 Tác động của chế phẩm PBW đến hiệu quả sử dụng thức ăn trên lợn con sau cai sữa 50

4.3.3 Tác động của chế phẩm PBW đến tỷ lệ tiêu chảy và tỷ lệ chết trên lợn con sau cai sữa 53

4.3.4 Kết quả tác động của chế phẩm PBW đến một số vi khuẩn đường ruột lợn con cai sữa 40

4.3.3 Kết quả tác động của chế phẩm PBW đến hình thái và kích thước biểu mô niêm mạc ruột lợn con theo mẹ và sau cai sữa 55

4.4 Thảo luận chung 58

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 60

5.1 Kết luận 60

5.2 Kiến nghị 61

Tài liệu tham khảo 62

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt

ADG - Average Daily Gain (tăng trọng trung bình /ngày)

ADFI - Average Daily Feed Intake (lượng thức ăn thu nhận /ngày) ATP - Adenosine Triphosphate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong chế phẩm probiotic 4

Bảng 2.2 Tóm tắt thông tin về một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường 16

Bảng 2.3 Trạng thái Eubiosis và Dysbiosis trong đường ruột trên lợn con 19

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm trên lợn con theo mẹ 23

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm lợn con sau cai sữa 23

Bảng 3.3 Khẩu phần dinh dưỡng cơ sở cho thí nghiệm 24

Bảng 4.1 Kết quả đánh giá độ bảo toàn của bào tử Bacillus sau quá trình ép viên 32

Bảng 4.2 Tác động của chế phẩm PBW đến tỷ lệ mắc tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con theo mẹ 38

Bảng 4.3 Số lượng một số vi khuẩn trong chất chứa các đoạn ruột của lợn con cai sữa 41

Bảng 4.4 Tác động của PBW đến tỷ lệ mắc tiêu chảy và tỷ lệ chết của lợn con sau cai sữa 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cơ chế tác động của probiotic trong đường ruột 8

Hình 2.2 Trực khuẩn Bacillus subtilis điển hình trong chi Bacillus 10

Hình 3.1 Pha loàng mẫu từ 10-1 đến 10-5 26

Hình 3.2 Các bước xác định số lượng một số vi khuẩn đường ruột lợn con theo mẹ 27

Hình 4.1 Khối lượng cơ thể ở các giai đoạn trên lợn con theo mẹ 34

Hình 4.2 Tăng trọng trung bình ngày trên lợn con theo mẹ 35

Hình 4.3 Lượng thức ăn thu nhận trung bình/ngày trên lợn con theo mẹ 36

Hình 4.5 Chiều cao lông nhung biểu mô ruột non lợn con theo mẹ 46

Hình 4.6 Chiều rộng lông nhung biểu mô ruột non lợn con theo mẹ 47

Hình 4.7 Khối lượng cơ thể ở các giai đoạn trên lợn con sau cai sữa (Mean±SD) nhóm đối chứng (ĐC) và bổ sung chế phẩm (PBW) 48

Hình 4.8 Tăng trọng trung bình/ngày trên lợn con sau cai sữa 49

Hình 4.9 Lượng thức ăn thu nhận trung bình/ngày trên lợn con sau cai sữa 50

Hình 4.10 Hệ số chuyển hóa thức ăn FCR trên lợn con sau cai sữa 51

Hình 4.11 Biểu mô niêm mạc không tràng lợn con 56 ngày tuổi (HE x 400) 55

Hình 4.12 Biểu mô niêm mạc hồi tràng lợn con 56 ngày tuổi (HE x 400) 56

Hình 4.13 Chiều cao lông nhung biểu mô ruột non lợn con sau cai sữa 57

Hình 4.14 Chiều rộng lông nhung biểu mô ruột non lợn con sau cai sữa 57

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Đình Trình

Tên luận văn: Đánh giá hiệu quả của Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt đến sinh trưởng, hệ

vi sinh vật đường ruột và hình thái niêm mạc ruột lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01

Cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

1 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá được tác động của Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt trong chế phẩm PBW đến một số chỉ tiêu năng suất, hệ vi sinh vật đường ruột và hình thái niêm mạc ruột lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho ứng dụng chế phẩm này trong chăn nuôi lợn

2 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp bố trí thí nghiệm một nhân tố đánh giá tác dụng của chế phẩm PBW đến các chỉ tiêu sinh trưởng, tỷ lệ chết, tỷ lệ tiêu chảy trên lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa

- Phương pháp thường quy nuôi cấy xác định số lượng một số vi khuẩn: Bacillus spp (TCVN 8736:2011), tổng vi sinh vật hiếu khí (TCVN 5165 : 1990), E.coli (TCVN7924-2:2008), Clotridium perfringens (TCVN 4991:2005), Lactobacillus spp (TCVN 8737:2011)

- Phương pháp thường quy làm tiêu bản vi thể nhuộm HE

- Kích thước lông nhung được đo bằng phần mềm Infinity Analysis trên kính hiển

vi Kniss MBL-2000T (Olympus, Japan)

3 Kết quả nghiên cứu chính

- Bacillus dạng bảo tử trong chế phẩm PBW tỷ lệ bảo toàn cao (92 đến 94%) ở nhiệt độ 80oC

- PBW cải thiện 9,82% tăng trọng bình trung bình/ngày ở tuần tuổi 22 đến 28; giảm 68,75% tỷ lệ tiêu chảy; giảm 65,41% số ngày tiêu chảy và giảm 33,33% tỷ lệ chết với lợn con theo mẹ

- Đối với lợn con giai đoạn sau cai sữa, PBW làm giảm 5,7% giá trị FCR; giảm 57,14% tỷ lệ tiêu chảy, 53,95% số ngày tiêu chảy và 50% tỷ lệ chết

- Bổ sung PBW cho lợn con theo mẹ không ảnh hưởng đến số lượng E.coli, Clotridium perfringens trong chất chứa đường ruột nhưng làm tăng số lượng vi khuẩn

Lactobacillus spp trong không tràng, hồi tràng và kết tràng; tăng số lượng tổng vi khuẩn hiếu khí tại không tràng, hồi tràng, mạnh tràng và kết tràng

- PBW không ảnh hưởng đến kích thước lông nhung biểu mô niêm mạc ruột non lợn con theo mẹ nhưng làm tăng chiều cao và chiều rộng lông nhung tá tràng và không tràng của lợn sau cai sữa

4 Kết luận

Tác dụng của chế phẩm PBW chứa bào tử Bacillus spp phụ thuộc vào tuổi của lợn con Mức độ ảnh hưởng đến các chỉ tiêu sinh trưởng, chuyển hóa thức ăn, chỉ hội chứng tiêu chảy, vi sinh vật đường ruột và kích thước biểu mô niêm mạc ruột khác nhau giữa lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa

Những kết quả của nghiên cứu này góp phần chứng minh tác dụng tích cực của bào tử Bacillus spp trong PBW; là cơ sở cho việc ứng dụng chế phẩm này trong chăn nuôi lợn, giảm thiểu sử dụng kháng sinh

THESIS ABSTRACT

Author name: Nguyen Dinh Trinh

Thesis title: Effect of heat resistance Bacillus spores in probiotic feed supplement on the growth, intestinal bacterial counts and intestinal epithelial villum of suckling and post-weaning piglets

Major: Veterinary Medicine Code: 60.64.01.01

Institution: Vietnam National University of Agriculture

1 Aims of the research

Evaluation of effects of heat resistance Bacillus spores in commercial product PBW on some the performance parameters, intestinal microflora and intestinal epithelial villum measurements in suckling and post-weaning piglets as scientific background for the application of PBW in pig production

- Routine methods for microscopic examination with HE staining slides

- Small intestinal epithelial villum measurement was performed with Infinity Analysis software using Kniss MBL-2000T microscope (Olympus, Japan)

- For post-weaning piglets, PBW supplement led to 5.7% decreae of FCR; 57.14% decrease of diarrhea rate; 53.95% decrease of total diarrhea days and 50% decrease of mortality rates

- PBW did not alter intestinal E.coli, Clotridium perfringens counts but led to increases in jejunal, ileal and colon Lactobacillus counts; increase in total aerobic bacteria in jejunum, ileum, caecum and colon of suckling piglets

- Small intestinal epithelial villum measurements of suckling piglets were not affected by PBW supplement while duodenal and jejunal villum height and width were increased in PBW supplement post-weaning piglets

4 Conclusions

- Effects of PBW in piglets were age-dependant The effecting levels of PBW in growth parameters, feed conversion, diarrhea parameters, intestinal bacterium counts, and intestinal epithelial villum measurements were different between suckling and post- weaning piglets

- The results partly proved positive effects of Bacillus spores in PBW and can be considered as evidences for the application of this product in pig production, contributing to the elimination of antibiotic usage

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, chăn nuôi là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của nước ta Trong đó, sản phẩm từ thịt lợn không những đã đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn xuất khẩu thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân Do đó, vấn đề dịch bệnh, năng suất và chất lượng của sản phẩm thịt luôn được đặt lên hàng đầu Trong các vấn đề thường gặp trong chăn nuôi lợn, vấn đề bệnh đường ruột đã gây thiệt hại nghiêm trọng Trong đó, hội chứng tiêu chảy ở lợn con gây thiệt hại nặng nề nhất cho nhà chăn nuôi Có rất nhiều biện pháp đã được áp dụng để phòng và trị tiêu chảy cho lợn con Trong đó, việc dùng kháng sinh đã và đang là lựa chọn hàng đầu của người chăn nuôi hiện nay

Dù biện pháp này có hiệu quả cao, nhưng gần đây có nhiều lo ngại về hàm lượng kháng sinh tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi như thịt, trứng, sữa và thủy sản đã ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng và xuất khẩu các sản phẩm sản phẩm chăn nuôi Việc lạm dụng kháng sinh quá mức còn gây ra nguy cơ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh, ảnh hưởng khó khăn cho việc điều trị và kiểm soát dịch bệnh

Chính vì những lí do đó mà các phương pháp phòng và trị bệnh bằng các biện pháp sinh học ngày càng được ưa chuộng như vacxin, chất tăng cường hệ miễn dịch, chế phẩm sinh học probiotic, prebiotics, synbiotics,…Trong đó, probiotic được xem là một giải pháp có nhiều ưu điểm vượt trội, hiệu quả lâu dài

và an toàn sinh học Probiotic không chỉ giúp phòng chống bệnh thông qua việc đối kháng trực tiếp với vi khuẩn gây bệnh đường ruột đặc biệt là E Coli, Salmonella, Clostriudium perfringens hoặc gián tiếp thông qua sự kích thích hệ miễn dịch của vật nuôi, duy trì vi sinh vật có lợi, nâng cao sức khỏe đường ruột, bảo vệ hệ vi lông nhung đường ruột mà còn giúp vật nuôi tiêu hóa hấp thu triệt để chất dinh dưỡng trong thức ăn và tăng trưởng nhanh

Hiện nay, có rất nhiều chế phẩm sinh học nhập khẩu hoặc sản xuất trong nước được ứng dụng trong chăn nuôi Các chủng vi sinh được sử dụng làm probiotic chủ yếu thuộc nhóm Bacillus sp., Lactobacillus sp., Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp., nấm men Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii Trong số đó, vi khuẩn Bacillus dạng bào tử được xem là một trong những đối tượng giàu tiềm năng để nghiên cứu, sản xuất ứng dụng làm probiotic bổ sung

trong thức ăn chăn nuôi Do Bacillus không chỉ có khả năng sinh bào tử để chịu nhiệt cao và các điều kiện môi trường bất lợi (Sanders et al., 2003; Hong, 2005) Ngoài ra, Bacillus có thể sinh chất tương tự như kháng sinh, chất kháng khuẩn kìm hãm vi khuẩn gây bệnh phát triển (Sanders et al., 2003) Bào tử có thể sống sót khi di chuyển qua môi trường pH acid của dịch vị dạ dày (Barbosa et al., 2005; Spinosa et al., 2000), trong khi phần lớn các Lactobacillus ở dạng vi khuẩn sống sẽ bị tiêu giệt (Tuohy et al., 2007) Ngoài ra, nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm vi khuẩn này còn có thể chuyển hóa các chất khó biến đổi thành chất

dễ tiêu hóa làm cải thiện dinh dưỡng hấp thu, kích thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật nuôi tăng trọng nhanh Đặc biệt, chế phẩm probiotic từ Bacillus dễ sản xuất, bảo quản, sử dụng và không gây hại cho người, động vật

Để góp phần đánh giá hiệu quả của Bacillus dạng bào tử và cung cấp thêm

cơ sở khoa học cho việc ứng dụng chế phẩm này trong chăn nuôi thú y nhằm nâng cao năng suất chăn nuôi, hạn chế một số bệnh liên quan đến đường ruột, giảm sử dụng kháng sinh, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Đánh giá tác dụng của Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt đến sinh trưởng, hệ vi sinh vật đường ruột và hình thái niêm mạc ruột lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa”

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Kết quả của nghiên cứu này cung cấp dữ liệu khoa học cho ứng dụng chế phẩm PBW trong chăn nuôi lợn an toàn, giảm sử dụng kháng sinh và hạn chế ô nhiễm môi trường

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff đã chứng minh rằng Lactobacillus hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột, giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary có thể thọ 115 tuổi hoặc hơn, do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men (The Prolongation of life, 1908) Tisser and Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic (Fuller, 1989) Năm 1930, Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các trẻ

em khỏe mạnh (Fuller, 1992) Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được (Fuller, 1989) Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung probiotic được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 (Fuller, 1992)

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria, Lactobacillus, Nấm men Sacchromyces hoặc Bacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi

nay, thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật chủ Hiện nay có hai định nghĩa được chấp nhận: (i) probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức

ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi cho vật chủ” (Fuller, 1989); (ii) probiotic là “các vi sinh vật sống khi đưa vào

cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ” (WHO, 2001)

2.1.1.3 Các vi sinh vật thường được sử dụng trong chế phẩm probiotics

Một số vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong chế phẩm Probiotic gồm (bảng 2.1.):

Bảng 2.1 Các vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong chế phẩm probiotic

Các nhóm chính Giống (Genus) Loài (Species)

Nhóm Lactic

Enterococcus Lactobacillus

Bifidobacterium

Pediococcus

Enterococcus faecium Lactobacillus salivarius Lactobacillus reuteri Lactobacillus acidophilus Lactobacillus farciminis Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei Lactobacillus bulgaricus Bifidobacterium animalis Bifidobacterium bifidum Pediococcus acidilactici

Saccharomyces boulardii Nguồn: Michaela Mohnl (2014)

Nhóm vi khuẩn Lactic

Là nhóm vi khuẩn thân thuộc với con người, phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua Ngoài khả năng sinh axit lactic do lên men đồng hình và dị hình, vi khuẩn lactic còn có thể sinh hàng loạt chất có hoạt tính kháng sinh được gọi chung là bacteriocin gồm nizin, diplococin, acidofilin, lactoxindin, lactolin, brevin Các chất này được dùng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm, trong chăn nuôi với vai trò là chất kích thích sinh trưởng, ứng dụng trong việc phòng và trị các bệnh đường tiêu hóa cho người và vật nuôi

Theo Lee et al (1999), các chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất chứa các vi khuẩn lactic như: L acidophilus, L casei, L plantarum, L bulgaricus, L kefir, L delbruckii, L sporogenes, Bifidobacterium, Bifidus bacteria, S faecalis,…

Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng một chủng vi sinh vật như chế phẩm Antibio (Hàn Quốc) chứa L acidophilus hay Biosubtyl (Việt Nam) chứa bào tử

B subtilis hoặc kết hợp nhiều chủng vi sinh vật có lợi như chế phẩm Emina thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp Hà Nội (ngoài vi khuẩn lactic còn có vi khuẩn Bacillus, vi khuẩn quang dưỡng khử H2S và nấm men (Lương Đức Phẩm, 2007) Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng: các vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ Nhờ khả năng sản sinh axit lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B, sản sinh enzyme,…nên

có tác dụng ức chế vi sinh vật đường ruột, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ

Nhóm vi khuẩn Bacillus

Bacillus có lợi là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí tùy tiện, phân

bố rộng rãi trong tự nhiên Một số loài còn thấy trong xoang miệng, trong đường ruột của người và động vật Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như protein, tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào như: amylase, cellulase, protease Ngoài ra, các vi khuẩn này còn sinh bacteriocin, chất có hoạt tính ức chế một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột đặc biệt là E coli, đồng thời giúp kích thích tiêu hóa và tăng trọng ở vật nuôi

Trong chế phẩm probiotic, người ta thường sử dụng các chủng Bacillus sau:

B subtilis, B mesentericus, B megathericum, B licheniformis, B clausii, Bacillus coagulan (Lương Đức Phẩm, 2007)

Nhóm nấm men Saccharomyces:

Nhóm này sử dụng trong nghề làm bánh mì, nấu rượu, làm bia, ủ rượu vang

từ lâu Trong nấm men rất giàu protein, vitamin nhóm B và khoáng chất nên thường được bổ sung vào chế phẩm probiotic để làm giàu sinh khối Chúng còn hấp thu và phân giải độc tố, tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các vi sinh vật có lợi hoạt động và sinh sản Ngoài ra, tế bào nấm men

có trong chế phẩm còn tạo mùi thơm, giúp cải thiện mùi cho môi trường và nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn cho vật nuôi Các chủng thường được sử dụng gồm:

S cerevisiae, S carlsbergensis, S vini hoặc S pombe, S boulardii

2.1.1.4 Đặc điểm chung của vi sinh vật sử dụng làm probiotic

Khả năng chống chịu tác dụng của dịch mật

Dịch mật có khả năng kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi

sự xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh Do vậy, khi thức ăn cùng với vi sinh vật probiotic từ dạ dày chuyển xuống sẽ chịu tác động của muối mật Khả năng sống sót của các chủng vi sinh vật sau tác dụng dịch mật là một trong những đặc tính quan trọng của vi sinh vật probiotic

Chịu pH thấp

Nhiều nghiên cứu cho thấy, probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên vi sinh vật probiotic phải chịu được áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5 Do đó, các chủng được

sử dụng làm probiotic phải chịu được pH thấp ít nhất 90 phút, nhưng vẫn bảo toàn khả năng gắn vào biểu mô ruột và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic

Ít bị tác động bởi kháng sinh

Kháng sinh được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh đường ruột cho người cũng như vật nuôi Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phương pháp trị liệu bằng kháng sinh có một số hạn chế nhất định như: tác động loại bỏ không chọn lọc, không phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột Vì thế, đã dẫn đến sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, gây tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa Chính vì vậy, bổ sung Probiotic

cho vật nuôi trong thời gian điều trị bằng kháng sinh có thể hạn chế mất cân bằng

hệ vi sinh vật đường ruột Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu được kháng sinh và phải đảm bảo không chuyển gen đề kháng kháng sinh sang những vi khuẩn khác có mặt trong đường tiêu hóa, đặc biệt là những vi khuẩn gây bệnh

Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột

Các vi sinh vật probiotic chỉ có thể tác động tốt khi có thể sinh trưởng và phát triển được trong đường tiêu hóa Bên cạnh khả năng sống sót, chúng phải có khả năng bám dính vào biểu mô thành ruột Nhờ khả năng bám dính, các vi sinh vật probiotic có thể ngăn cản được sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách giành vị trí bám trên thành ruột hay trên các bề mặt biểu mô khác

Tóm lại, những yêu cầu của probiotic cần đạt được là:

- An toàn cho người và động vật, không gây bệnh và không tạo độc tố

- Có khả năng sống sót trong đường ruột của vật chủ, chịu được pH thấp ở

dạ dày và muối mật trong đường ruột

- Có khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột, cạnh tranh vị trí và làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh

- Có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh nhờ khả năng sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột

- Có lợi cho quá trình tiêu hóa của vật chủ nhờ khả năng sinh một số loại enzyme ngoại bào

- Có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch và sức đề kháng của vật chủ

- Có khả năng sống sót cao và giữ được đặc tính ổn định trong thời gian dài ở điều kiện thường

- Chế phẩm có chất lượng cảm quan tốt

- Đủ số lượng yêu cầu, đạt 108 -109 CFU/g chế phẩm

- Phù hợp với yêu cầu sản xuất công nghiệp, quy trình nuôi cấy và sản xuất đơn giản, chi phí thấp, cách sử dụng đơn giản

2.1.1.5 Cơ chế tác động chung của probiotic

Bên cạnh khả năng sống sót và phát triển được trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa, vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt tính kháng khuẩn như các axit hữu cơ, bacterioxin, H2O2,… Những chất này

được sản sinh cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng trong đường tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh, tạo nên sự cân bằng

hệ vi sinh vật đường ruột Ngoài ra, một số chủng vi sinh vật probiotic còn có khả năng sinh nhiều loại enzyme có lợi cho việc tiêu hóa thức ăn, kích thích tăng trọng, điều hòa hệ miễn dịch vật chủ và tăng khả năng đề kháng cho vật chủ Theo Fuller (1992), WHO (2001) and Han Poong industry Co Ltd (2002),

cơ chế tác động của probiotic được tóm tắt như sau (hình 2.1):

Hình 2.1 Cơ chế tác động của probiotic trong đường ruột

Khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh: Cạnh tranh về vị trí bám dính trên nhung mao ruột để tranh giành chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sinh ra Khi vi sinh vật gây bệnh bị cạnh tranh, thiếu chất dinh dưỡng nên không thể sinh trưởng và phát triển được Từ đó có thể ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh, thiết lập lại sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Phương pháp sử dụng probiotic để loại trừ các vi khuẩn có hại bằng quá trình cạnh tranh tốt hơn nhiều so với phương pháp sử dụng kháng sinh

Ngoài khả năng gia tăng về số lượng để cạnh tranh vị trí bám với vi sinh vật gây bệnh, vi sinh vật probiotic còn có thể tác động nhờ khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như: kháng sinh, bacterioxin, axit hữu cơ, H2O2, ethanol,… Những chất này được sinh ra trong quá trình sống của vi sinh vật, có khả năng tiêu diệt có chọn lọc các vi khuẩn gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ vi sinh đường ruột

Tăng lượng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa: probiotic kích thích tính thèm ăn, làm tăng tích lũy mỡ, nitrogen, Ca, P, Cu, Mn (Nahashon et al., 1992-1996), tiết các enzyme tiêu hóa như amylase, cellulase, lipase, protease,… giúp phân giải các chất dinh dưỡng phức tạp thành chất đơn giản dễ hấp thụ

Tổng hợp vitamin nhóm B như: B1, B2, B6, B12, làm giảm hoạt tính urease trong ruột non, ngăn chặn tổng hợp những amin độc, giảm nồng độ NH3 trong phân gia súc, gia cầm, do đó có ảnh hưởng tốt đối với môi trường

Kích thích hệ thống miễn dịch: yếu tố được xác định có vai trò kích thích

hệ thống miễn dịch là thành phần của vách tế bào vi khuẩn (peptidoglycan)

Sự phân hủy peptidoglycan tạo ra chất muramyl peptid có tác dụng kích thích hoạt động của đại thực bào (Tannock et al., 1997) Theo Saarela et al (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo nên sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống lympho bào đường ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định của hàng rào bảo vệ ruột

Tóm lại, probiotic được xem là sản phẩm hữu hiệu cho việc phòng ngừa

và điều trị bệnh tiêu chảy ở vật nuôi nhờ cơ chế cạnh tranh và đối kháng với vi sinh vật gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ (hình 1.1) Tuy nhiên, lợi ích của nó chỉ thể hiện rõ khi vật nuôi có sức khỏe kém, stress hoặc có sự xáo trộn hệ vi sinh vật đường ruột

2.1.2 Đặc điểm chung probiotics nhóm Bacillus

2.1.2.1 Đặc điểm sinh học của nhóm Bacillus

Đặc điểm phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey, chi Bacillus là một chi lớn và đa dạng, được phân loại như sau: giới: Bacteria, ngành: Firmicutes, lớp: Bacilli, bộ: Bacillales, họ: Bacillaceae, chi: Bacillus

Khuẩn lạc trên môi

trường NB

Hình ảnh bắt màu Gram (+)

Nhuộm soi bào tử

Hình 2.2 Trực khuẩn Bacillus subtilis điển hình trong chi Bacillus

Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả lần đầu tiên năm 1835 là “Virbrio subtilis” Năm 1872, Cohn đặt tên lại là B subtilis (Gordon, 1981) Họ Bacillaceae được chia làm 5 chi gồm: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfortomaculum, đặc trưng của họ này là hình thành nội bào tử Đặc điểm hình thái: tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thước 0,3 - 2,2 x 1,2 -7µm Các tế bào thường xếp thành cặp hay chuỗi, đầu tròn hoặc hơi vuông Là vi khuẩn Gram dương, hầu hết có catalase dương tính Chúng thường

di động nhờ roi Một tế bào chỉ có thể hình thành duy nhất một nội bào tử, nội bào tử có hình oval hoặc hình trụ Bào tử có khả năng chịu nhiệt, axit, sự hình thành nội bào tử không bị ngăn cản bởi sự tiếp xúc không khí

Đặc điểm phân bố: Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau Do vậy, có thể phân lập Bacillus từ nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên và trong thực phẩm

Dinh dưỡng và phát triển: hầu hết Bacillus là những sinh vật dị dưỡng, thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ như đường, amino axit, axit hữu cơ, Một số tự dưỡng không bắt buộc (B schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO2 B subtilis và một số chủng Bacillus khác có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi B sphaericus và B cereus cần các hợp chất hữu cơ (axit amin, vitamin) cho sự sinh trưởng Đặc biệt Bacillus gây bệnh cho côn trùng như B thuringiensis, B popllae, B lentimorbus, B cereus,

B anthracis có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, không phát triển trên môi trường nuôi cấy bình thường

Phần lớn Bacillus là vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 30 – 450C, một số có nhiệt độ sinh trưởng tối ưu lên tới 65 0C, hoặc

ưa lạnh (50C – 250C) Các loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus sinh trưởng trong khoảng

pH rộng từ 2 – 11 Trong phòng thí nghiệm, dưới điều kiện sinh trưởng tối ưu, Bacillus có thời gian thế hệ là 25 phút Nhờ có phổ chịu đựng pH, nhiệt độ và muối rộng nên Bacillus có thể tồn tại ở điều kiện bất lợi trong thời gian dài

Một số loài Bacillus phổ biến trong tự nhiên:

B subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941), có khuẩn lạc khô, không màu hoặc có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo ra các lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch Khuẩn lạc có mép nhăn bám vào môi trường thạch Trực khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, tế bào đứng riêng rẽ hoặc chuỗi Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 36-50 0C, tối đa là 60 0C Bào tử chịu được nhiệt độ khá cao,

có hình bầu dục, phân bố lệch tâm B subtilis được ứng dụng rất rộng rãi trong chăn nuôi, y học, thực phẩm Bacillus subtilis đã được các nhà khoa học chứng minh là rất an toàn và không hề có tác dụng phụ với liều uống lên đến 1x1011CFU/ngày (Hong et al., 2008) Bacillus subtilis cũng đã được nghiên cứu tính chất, sự an toàn, khả năng tồn tại và phát triển ở ruột (Hong et al., 2009) Ngoài

ra, B subtilis còn có nhiều tác dụng khác có lợi cho sức khỏe (Arima et al., 1968), kích thích hệ miễn dich tự nhiên thông qua hệ thống mảng Payer (Huang

et al., 2008), phòng tránh nhiễm khuẩn đường ruột và đường tiết niệu ở người (Meroni et al., 1983)

B licheniformis là vi khuẩn ưa ấm, Gram dương, có nhiệt độ phát triển tối

ưu khoảng 30 0C và nhiệt độ tối ưu để vi khuẩn sản xuất các hợp chất kháng khuẩn là 37 0C Chúng có khả năng hình thành bào tử để chống lại điều kiện bất lợi của môi trường

B coagulans sản sinh ra acid lactic tạo môi trường pH cho đường ruột và coagulins có khả năng ngăn ngừa được sự phát triển của các vi khuẩn có hại (E.coli, Salmonella, Clostridium perfringen), vi khuẩn gây thối rữa (Hyronimus

et al., 1998) Ngoài ra, Bacillus coagulans cũng có khả năng sản sinh các men tiêu hóa như amylase và protease, cellulose có tác dụng tiêu hóa hiệu quả thành phần dinh dưỡng trong thức ăn (Baron et al., 2009), phòng ngừa và phối hợp điều trị rối loạn tiêu hóa cấp và mãn tính ở trẻ em (Mandel et al., 2010) Vì vậy, Bacillus coagulans có thể được dùng làm thực phẩm chức năng để bổ sung hệ vi khuẩn có ích và các enzyme có lợi cho hệ tiêu hóa động vật

B pumilus phát tán rộng khắp nơi, thường có mặt trong đất nhiều hơn B subtilis Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ không ranh giới Tế bào của nó gần giống tế bào B subtilis

B megaterium có khuẩn lạc hình tròn đều, không có thùy, không có nếp, mép tròn hoặc hơi lượn sóng, màu trắng kem, trông giống như giọt bạch lạp (nến trắng), thường có vòng hoặc các vòng đồng tâm trên mặt Tế bào dài, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi Bào tử hình elip, nằm lệch tâm B megaterium được sử dụng trong sản xuất penicillin nhờ khả năng tổng hợp penicillin amidase Bên cạnh đó, chúng còn có thể sản sinh các enzyme phân hủy sinh học, sản sinh vitamin B12, oxetanocin, cytochromes P450 và một số axit amin khác (Furch et al., 2007)

B amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự B subtilis Nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh

và lên men glucose chậm, thành phần G + C của B subtilis khoảng 41,5% - 43,5% còn trong chủng B amyloliquefaciens là 43,5 – 44,9%

Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước Do có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease, lipase, phytase, xenlulase và xylanase nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công nghiệp thuộc da

B polymyxa có khuẩn lạc không màu, phẳng, lồi, trơn, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi, chuỗi ngắn Bào tử hình bầu dục kéo dài Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây Ngoài ra, chúng còn có khả năng cố định đạm Đây là một

vi khuẩn rất phổ biến trong đất

B cereus có khuẩn lạc phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục Tế bào đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi Bào tử có hình bầu dục, nằm lệch tâm, tế bào chất có chứa các hạt và không bào nhỏ Chúng thường phát tán khắp nơi, sinh sôi, nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh độc tố gây ngộ độc thực phẩm

2.1.2.2 Cơ sở khoa học lựa chọn chủng Bacillus trong sản xuất probiotic Ngoài đặc điểm dễ nuôi cấy, tốc độ phát triển nhanh, phân bố rộng rãi trong tự nhiên, Bacillus còn có nhiều đặc tính phù hợp để tạo chế phẩm probiotic như:

Khả năng sinh bào tử: đặc điểm quan trọng của Bacillus là khả năng sinh bào tử Một số loài Bacillus có khả năng hình thành bào tử trong chu trình phát

triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo dinh dưỡng, pH không thích hợp, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất bất lợi Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn Vì vậy, nội bào tử được sinh ra không phải để vi khuẩn nhân lên mà là cơ chế đề kháng của vi khuẩn

Bào tử Bacillus phát triển theo chu kì, trong trạng thái tiềm ẩn, chúng có thể tồn tại trong thời gian rất dài, đến hàng thế kỷ Bào tử của B subtilis có thể duy trì khả năng sống đến 200-300 năm (Sonenshein et al., 1993) Bên cạnh đó, bào

tử Bacillus còn có tính ổn định cao với nhiệt độ và độ ẩm thấp Khả năng đề kháng với tia phóng xạ của bào tử B mesentericus gấp 36 lần so với tế bào dinh dưỡng của E coli; bào tử và tinh thể của B thuringensis có độc tố ức chế nhiều loại côn trùng gây hại cho cây trồng (Todar et al., 2008)

Các nhà vi sinh vật nhanh chóng nhận ra tầm quan trọng của bào tử như là đặc điểm phân loại nổi bật và là đặc điểm rất quan trọng và có liên quan đến việc sản xuất các chế phẩm sinh học probiotic

Khả năng sinh enzyme phân hủy chất hữu cơ

Bacillus có khả năng tạo các chất có hoạt tính sinh học thích ứng với điều kiện môi trường trong đó có các enzyme ngoại bào như protease, amylase, cellulase, alkaline, phosohatase, cyclodextran, glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, urease Protease hay peptide hydrolase là những enzyme thuỷ phân liên kết peptide (- O – NH -) trong phân tử protein và các polypeptide tạo các acid amin, các peptide, các polypeptide chuỗi ngắn Nhờ khả năng bền nhiệt và kháng pH thấp nên protease kiềm từ Bacillus có tầm quan trọng lớn trong ngành công nghiệp chất tẩy rửa, sản xuất bột giặt; trong công nghiệp thuộc da; trong thủy phân protein của cá, thịt,…Điển hình là B licheniformis, B subtilis, B amyloliquefaciens, và B majovensis Amylase từ Bacillus bền hơn trong môi trường acid của dạ dày và được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để sản xuất thuốc điều trị bệnh hệ tim mạch, bệnh hệ thần kinh Ngoài ra, chúng còn được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp dệt, công nghiệp thực phẩm như amylase từ B globisporus (Bandyopadhya et al., 1993), B subtilis (Gupta et al., 2003), B licheniformis (Haq et al., 2003), B amyloliquefaciens (Schallmy et al., 2004)

Khả năng đối kháng

Một số chủng Bacillus thường cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh về nguồn thức ăn, năng lượng, muối khoáng, môi trường sống,… để làm giảm mật độ vi sinh vật gây bệnh và dần dần đẩy lùi được dịch bệnh Chủng B subtilis QST 713

là vi khuẩn di động, ưa khí được Công ty Agra Quest phát hiện và được Cục bảo

vệ môi trường Mỹ (EPA) đánh giá là có hiệu quả đáng kể trong việc phòng chống được nhiều bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra B subtilis QST 713 hoạt động bằng cách chiếm bề mặt lá cây và cạnh tranh với các mầm bệnh để giành không gian sống, nhờ đó đã ngăn cản được nhiều bệnh trên cây trà Nhiều dòng B subtilis được xác định là có khả năng chế ngự mầm bào tử của nấm bệnh bằng cách cạnh tranh dinh dưỡng và muối khoáng

Khả năng chịu được nồng độ muối cao, chịu axit, chịu kiềm

Nhiều loài Bacillus có khả năng phát triển tốt trong môi trường có nồng độ muối khá cao như B subtilis, B licheniformis, B coagulan Chúng thường tồn tại ở môi trường nước lợ, nước mặn, trong đường ruột của tôm và được coi là vi khuẩn có lợi cho tôm (Gomez et al., 2000) B racemilacticus và B coagulans có thể chịu đựng được nồng độ muối mật trên 0,3% (Hyronimus et al., 2000); một vài chủng khác như B pasteurii, B seohaeanensis, B pantothenticus,… có thể sinh trưởng ở nồng độ NaCl 10% (Todar, 2008; Lee et al., 2006)

Đặc biệt, nhờ khả năng sinh bào tử mà rất nhiều loài Bacillus có khả năng sinh trưởng và sống sót trong môi trường acid cũng như trong môi trường kiềm

B cereus NCTC 2599 có thể phát triển ở dải pH khá rộng từ 4-10 (Lindsay et al., 2004); B laevolacticus DSM 6475 có thể phát triển đến tận mức pH 2-3 mà bình thường các chủng vi khuẩn khác không thể phát triển được (Hyronimus et al., 2000), B coagulans, B acidocalderius và B polymyxa có thể sinh trưởng trong môi trường có độ pH từ 4-5 (Warscheid et al., 2003; Todar et al., 2008) Còn B alcalophilus và B pasteurii có thể sinh trưởng tốt ở pH 8-11 (Todar et al., 2008) Chính nhờ những đặc tính ưu việt nêu trên cùng với khả năng dễ bảo quản ở điều kiện thường, Bacillus được đánh giá là một trong những đối tượng giàu tiềm năng khai thác trong lĩnh vực sản xuất chế phẩm sinh học (Schallmey et al., 2004) 2.1.3 Các nghiên cứu ứng dụng Probiotics trong chăn nuôi

Probiotic có tác dụng tốt đối với vật nuôi như gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy sản Cụ thể như sau:

Probiotic giúp phát triển hệ vi sinh đường ruột bình thường, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn Đối với gia súc dạ cỏ,

probiotic còn giúp hệ vi sinh vật dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn Ức chế và

có thể tiêu diệt được các vi sinh vật có hại Làm tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi đối với vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh thường gặp, nhất là bệnh phân trắng ở lợn con do E coli

Lã Văn Kính (1998) đã tổng hợp các công trình nghiên cứu của các tác giả nước ngoài khi sử dụng các chế phẩm probiotic trên gà đẻ và gà thịt cho thấy: đối với gà đẻ, sản lượng trứng tăng 5% ở mức bổ sung 100mg probiotic/kg thức ăn (Mohal et al., 1995) Khi bổ sung hỗn hợp L acidophilus và L casei (khoảng 106CFU/kg thức ăn) đã cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển hóa thức ăn và chất lượng lòng đỏ (Tortuero et al., 1995) Đối với gà thịt, tăng trọng cao và tiêu tốn thức

ăn thấp hơn đối chứng Đặc biệt là hiệu quả sử dụng thức ăn đã cải thiện 2% khi bổ sung hỗn hợp L acidophilus và S faecium (2x109 CFU/kg thức ăn) cho gà thịt

Ở Việt Nam, nghiên cứu sản xuất probiotic bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây Lê Thanh Bình và cs (1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung PRO99 Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6% Phạm Ngọc Lan và cs (2003) đã phân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi Nguyễn Thị Hồng Hà và cs (2003) đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella Nguyễn Thùy Châu (2003)

đã công bố lựa chọn được chủng nấm men Candida ultilis CM 125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước đầu đã đưa ra quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này Nguyễn La Anh và cs (2003), đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải muối chua và đã xác định được rằng chủng

vi khuẩn này có tính chất probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá Lê Tấn Hưng và Võ Thị Hồng Hạnh và cs (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm probiotic BIO

I và BIO II Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các enzym -amylaza và proteaza dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế phẩm BIO

I hiệu quả sử dụng chưa cao

Với đặc điểm sinh lý, sinh hóa ưu việt, Bacillus là một nguồn gen phong phú, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong công nghiệp thực phẩm, trong lĩnh vực CNSH, trong lĩnh vực y học,… Đặc biệt là trong chăn nuôi, con người đã sử dụng Bacillus một cách hiệu quả trong việc tạo

ra nhiều chế phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc, gia cầm Đặc biệt, dùng chế phẩm probiotic Bacillus phối trộn vào thức

ăn hay nước uống cho vật nuôi sẽ làm giảm mùi hôi, giảm ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi Có thể dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơ thể vật nuôi như chó, lợn sẽ giảm được mùi hôi, phun trực tiếp vào bầu vú con cái khi cho con

bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại

Sau đây là thông tin một số chế phẩm phẩm probiotic có mặt trên thị trường

và số lượng vi sinh vật có lợi trong chế phẩm:

Bảng 2.2 Tóm tắt thông tin về một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường

Sản phẩm Nước sản xuất Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)

Vi khuẩn Lactic Bacillus Nấm men BioGuard Việt Nam 107 - - E.lac Việt Nam 2 x 107 - 4 x 107BioSix Việt Nam - 10 5 10 5

Lactacids Việt Nam 10 7 - - Adepro Việt Nam 107 - - Lactizym Việt Nam - 6 x 105 - Ferment Trung Quốc - 109 - Lacto-Sacc Mỹ 2,5 x 108 - 4,6 x 106Bio Plus YC Đan Mạch - 3.2x109 - Clostart Mỹ - 4x108 -

2.2 ĐẶC ĐIỂM SINH TRƯỞNG VÀ HỆ VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT LỢN CON

2.2.1 Khủng hoảng sinh lý của lợn con trước và sau cai sữa

Lợn con có tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh nhưng không đồng đều qua các giai đoạn, nhanh nhất là 21 ngày đầu, sau đó giảm dần Nguyên nhân chủ yếu

là lượng sữa của lợn mẹ tiết ra bắt đầu giảm xuống cùng hàm lượng hemoglobin trong máu lợn con giảm Thời gian lợn con bị giảm tốc độ sinh trưởng thường kéo dài khoảng 2 tuần gọi là giai đoạn khủng hoảng của lợn con Lợn con có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh, khối lượng lợn sau 10 ngày tuổi tăng gấp 2 lần; sau 30 ngày tuổi tăng gấp 6 lần và sau 60 ngày tuổi tăng gấp 14 lần lúc sơ sinh do

có khả năng tích luỹ protein cũng rất nhanh Ở lợn con 20 ngày tuổi, mỗi ngày có thể tích luỹ được 9 – 14 gam protein trên 1kg khối lượng cơ thể, trong khi ở lợn lớn chỉ số này là 0,3-0,5 gam Chính vì vậy hiệu quả chuyển hóa thức ăn ở lợn con cũng tốt hơn lợn lớn, nói cách khác tiêu tốn thức ăn cho 1kg tăng khối lượng ở lợn con là thấp hơn Điều này do nhiều nguyên nhân khác nhau nhưng chủ yếu do lượng sữa của lợn mẹ bắt đầu giảm xuống, trong khi đó khả năng tiêu hoá thức ăn của lợn con lại chưa tốt, làm giảm hàm lượng hemoglobin trong máu, giảm sức đề kháng của lợn con

Giai đoạn khủng hoảng thứ hai là thời điểm cai sữa, đặc biệt là cai sữa sớm thường gây stress nghiêm trọng cho lợn con, lợn con cai sữa sớm thường ăn ít, tăng trọng thấp hay bị tiêu chảy và tỷ lệ chết cao

Để khắc phục hiện tượng khủng hoảng sinh lý ở lợn, có thể sử dụng đồng thời nhiều biện pháp như tập cho lợn con ăn sớm, chọn nguyên liêu thức ăn có chất lượng cao, công nghệ chế biến thức ăn thích hợp và kỹ thuật nuôi dưỡng chăm sóc hợp lý

Tập cho lợn con ăn sớm là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng cho lợn con tập ăn sớm, ăn thêm trong giai đoạn bú sữa sẽ làm tăng khả năng thu nhận thức ăn, tăng tỷ lệ tiêu hoá các chất dinh dưỡng trong giai đoạn cai sữa, đặc biệt khi năng suất sữa của lợn mẹ thấp Tập cho lợn con ăn sớm còn làm giảm tỷ lệ hao hụt của lợn nái, thúc đẩy bộ máy tiêu hoá của lợn con phát triển nhanh, sớm hoàn thiện và tạo tiền đề cho giai đoạn sau cai sữa Hoạt tính của các enzym saccaraza, maltaza, trypsin, amilaza tuyến tụy tăng lên đáng kể ở những lợn con được cho ăn thêm thức ăn trong giai đoạn bú sữa

Đối với lợn con cai sữa sớm, khi hệ thống miễn dịch và bộ máy tiêu hoá phát triển chưa hoàn thiện, cần lựa chọn các loại thức ăn chất lượng cao Protein động vật chất lượng cao như bột cá giàu protein, bột huyết tương (plasme) giàu kháng thể và axit amin thiết yếu, bột whey giàu đường lactose rất dễ tiêu hóa tốt cho lợn con tập ăn để cai sữa sớm (Lin, 2002)

2.2.2 Hệ vi sinh vật đường ruột lợn con trước và sau cai sữa

Khi lợn mới sinh, hệ vi sinh vật đường ruột chưa có hoặc có rất ít Nhờ việc

bú mẹ, liếm láp trên nền chuồng mà vi sinh vật từ bên ngoài đã đi vào đường tiêu hóa lợn con Tại đây, những vi sinh vật không thích nghi với môi trường đường tiêu hóa sẽ bị tiêu diệt và thải ra ngoài Một số ít thích nghi được sẽ sinh sản, phát triển và tạo thành hệ vi sinh vật đường ruột Thành phần, số lượng và chất lượng của hệ vi sinh vật đường ruột phụ thuộc vào tuổi tác loài gia súc, cách nuôi dưỡng, chăm sóc Ngoài ra còn phụ thuộc vào điều kiện vật lý, hóa học của môi trường ở đường tiêu hóa

Thành phần hệ vi sinh vật đường ruột lợn con rất phong phú và được chia làm 2 nhóm:

- Nhóm vi sinh vật tùy nghi: thay đổi tùy theo thức ăn, môi trường đường tiêu hóa, sức đề kháng của cơ thể như nấm men, nấm mốc, Proteus, Salmonella, Klebsiella, E coli, Clostridium, Shigella,… đa số chúng thích nghi với môi trường pH trung tính đến kiềm

- Nhóm vi sinh vật bắt buộc: đây là những vi sinh vật chịu được pH thấp, chúng phát triển tốt trong đường ruột gia súc, gia cầm và định cư vĩnh viễn Đa

số chúng có khả năng tiết ra một số loại enzyme nên giúp cơ thể động vật tiêu hóa thức ăn tốt hơn và giúp phòng chống một số bệnh do vi sinh vật cơ hội gây

ra Nhóm vi sinh vật bắt buộc gồm có:

+ Vi khuẩn: Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus, Streptococcus lactic,

B subtilis, Bifidobacterium, Cellulomonas,…

+ Nấm men: S cerevisiae, S boulardii,…

+ Nấm mốc: Asp niger, Asp oryzae, Mucor spp,…

+ Protozoa: Entodinium, Diplodinium,…

Hai nhóm vi sinh vật trên luôn ở trạng thái cân bằng động và là điều kiện cần thiết đảm bảo cho sức khỏe vật chủ

Bảng 2.3 Trạng thái Eubiosis và Dysbiosis trong đường ruột trên lợn con

Trạng thái Eubiosis

- Cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ vi sinh

vật đường ruột – cộng sinh

- Bảo vệ bề mặt của đường tiêu hóa

chống lại các vi sinh vật xâm nhiễm

- Không cùng tồn tại giữa vật chủ và hệ

vi sinh vật đường ruột

- Phá hủy biểu mô đường ruột, làm cho thành đường ruột mỏng đi dẫn đến giảm

Trong giai đoạn bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001) Do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính

đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần

số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty et al., 1995) Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500 (Tannock et al., 1999) Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các đoạn khác nhau của đường tiêu khác nhau (Jans et al., 2005)

Sức khỏe đường ruột phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật đường ruột Các yếu tố này chịu tác động của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh

vật (Conway, 1994) Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005)

Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật ruột Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật đường ruột được chia thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và

E coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm dao động trong khoảng 90; 1,0 và 0,01% tương ứng Trạng thái mà các nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ) Ở trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần thức

ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật

Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch mật, các enzym, chất đệm và chất nhầy) cũng như kiểu và tần số nhu động ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật Kiểu và tần số nhu động ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển) Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột

bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”) Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể trạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử (tóm tắt trạng thái eubiosis và dysbiosis có trong bảng 2.3)

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG - THỜI GIAN – ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chế phẩm Probiotics Bacillus Weaner (PBW) do Công ty Cổ phần Công nghệ sinh học Mùa xuân sản xuất, chứa số lượng bào tử Bacillus 1x1012 CFU/kg Bào tử Bacillus subtilis ≥ 4x1011 CFU/kg

Bào tử Bacillus licheniformis…… ≥ 3x1011 CFU/kg

Bào tử Bacillus coagulans………… ≥ 3x1011 CFU/kg

Chất mang đặc biệt vừa đủ……… 1kg

Theo khuyến cáo của nhà cung cấp, chế phẩm PBW chứa các chủng Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt trên 950C, có đầy đủ các đặc tính sinh học tốt nhất cho hệ tiêu hóa của vật nuôi Bào tử Bacillus sẽ nẩy mầm trong hệ tiêu hóa

và phát huy các đặc tính sinh học có lợi cho đường ruột vật nuôi khi được bổ sung vào thức ăn, nước uống

- Lợn con theo mẹ 7 ngày tuổi, số lượng 498 lợn con, giống 3 máu (Landrace x Yorshire - Duroc)

- Lợn con cai sữa 28 ngày tuổi, số lượng 300 lợn con, giống 3 máu (Landrace x Yorshire - Duroc)

3.1.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian tiến hành nghiên cứu đề tài từ 30/06/2016 – 30/03/2017

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Trại Nguyễn Văn Hà – Trung đoàn 102, Hòa Lạc – Huyện Quốc Oai – TP

Hà Nội

- Phòng thí nghiệm vi sinh, Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học Mùa Xuân

- Phòng thí nghiệm, Bộ môn Giải Phẩu – Tổ Chức, Khoa Thú Y

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Kiểm tra tỷ lệ bảo toàn của bào tử Bacillus sau quá trình ép viên thức ăn

- Kiểm tra tỷ lệ bảo toàn của bào tử Bacillus sau quá trình ép viên thức ăn tại nhà máy sản xuất

3.2.2 Đánh giá tác động của PBW trên lợn con theo mẹ

- Đánh giá tác động của PBW đến một số chỉ tiêu sinh trưởng: khối lượng

cơ thể (BW), tăng trọng trung bình/ngày (ADG)

- Đánh giá tác động của PBW đến lượng thức ăn thu nhận (ADFI)

- Đánh giá tác động của PBW đến tỷ lệ mắc tiêu chảy và tỷ lệ chết

- Đánh giá tác động của PBW đến một số chỉ tiêu vi sinh vật đường ruột gồm: Tổng vi sinh vật hiếu khí, E.coli, Clostridium perfringens và Lactobacillus spp

- Đánh giá tác động của PBW đến hình thái và kích thước lông nhung biểu

mô niêm mạc ruột non

3.2.3 Đánh giá tác động của PBW trên lợn con sau cai sữa

- Ttác động của PBW đến một số chỉ tiêu sinh trưởng: Khối lượng cơ thể (BW), tăng trọng trung bình/ngày (ADG)

- Ảnh hưởng của PBW đến lượng thức ăn thu nhận (ADFI) và hệ số chuyển hóa thức ăn (FCR)

- Đánh giá tác động của PBW đến tỷ lệ mắc tiêu chảy và tỷ lệ chết

- Tác động của PBW đến hình thái và kích thước lông nhung biểu mô niêm mạc ruột non

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm một nhân tố

- Thí nghiệm 1: Tổng số 498 lợn con 7 ngày tuổi được phân ngẫu nhiên làm hai nhóm (249 con/nhóm): Tất cả các lợn con ở hai nhóm được nuôi trong cùng điều kiện chăm sóc, quản lý

+ Nhóm được bổ sung PBW: Lợn con theo mẹ ở nhóm này được ăn tự

do thức ăn cơ sở có bổ sung thêm 0,03% chế phẩm PBW (300 gam/tấn thức ăn), số lượng bào tử Bacillus 1 x 1012 CFU/kg trộn đều trong thức ăn theo khẩu phần cơ sở

+ Nhóm đối chứng: Lợn con theo mẹ ở nhóm này được ăn tự do thức ăn cơ

sở cho lợn con theo mẹ không có bổ sung chế phẩm PBW

Thời gian thí nghiệm: 21 ngày (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm trên lợn con theo mẹ

Đợt

Số lượng lợn thí nghiệm

Tổng (con)

Đối chứng (n=249)

Bổ sung PBW (n=249)

+ Nhóm được bổ sung PBW: Được ăn tự do thức ăn theo khẩu phần sơ sở

có bổ sung thêm 0,03% chế phẩm PBW (300 gam/tấn thức ăn), số lượng bào tử Bacillus 1 x 1012 CFU/kg

+ Nhóm đối chứng: lợn nhóm này được ăn tự do thức ăn khẩu phần cơ sở không có bổ sung chế phẩm PBW

Thời gian thí nghiệm: 28 ngày (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm lợn con sau cai sữa

Đợt

Số lượng lợn thí nghiệm Tổng

(con) Đối chứng

(n=150)

Bổ sung PBW (n=150)

Tổng (con) 150 150 300

- Khối lượng cơ thể được xác định hàng tuần bằng cân đồng hồ, lượng thức

ăn cho ăn, thức ăn dư thừa được cân và xác định hàng ngày

Khẩu phần dinh dưỡng cơ sở cho thí nghiệm:

Thức ăn thí nghiệm được phối hợp khẩu phần cơ sở bằng phần mềm Brill Formulation – USA

Bảng 3.3 Khẩu phần dinh dưỡng cơ sở cho thí nghiệm

Thức ăn Lợn con theo mẹ

Thức ăn Lợn con sau cai sữa

3.3.1.2 Phương pháp định lượng tổng số bào tử Bacillus trong thức ăn chăn nuôi

Năm mẫu thức ăn cho lợn con sau ép viên được lấy tại nhà máy ngay sau khi sản xuất và gửi về phòng thí nghiệm trong 24 giờ Các mẫu thức ăn được phân tích, kiểm tra số lượng bào tử Bacillus theo TCVN 8736:2011

Các bước tiến hành phân tích mẫu kiểm tra số lượng vi khuẩn Bacillus trong mẫu thức ăn có bổ sung chế phẩm PBW:

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch pha loảng mẫu

Cân 9 g NaCl, hòa tan trong nước cất đựng trong bình định mức 1000 ml, chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N Dùng ống đong cho vào bình nón mỗi bình 90 ml và dùng pipet lấy cho vào ống nghiệm mỗi ống 9 ml dung dịch trên Đậy bằng nút bông không thấm nước, có giấy bạc, hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 0C trong 15 phút Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 đến 8 0C, sử dụng trong 15 ngày

Bước 2: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Cân các thành phần môi trường PCA (Pepton 5,0 g, cao nấm men 2,5 g, D(+)-Glucose 1,0 g, Thạch 14,0 g, Nước cất 1000 ml), chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,0 ± 0,2 bằng dung dịch HCl 0,1 N và NaOH 0,1 N Lắc đều và ñun cách thủy hoặc trong lò vi sóng đến khi sôi (môi trường trong) Rót vào bình 250

ml lượng môi trường 100 ml Tiệt khuẩn trong nồi hấp ở nhiệt độ 121 0C trong 15 phút Nếu môi trường sử dụng ngay, để nguội ñến 45 0C ± 1 0C ở bể điều nhiệt, nếu chưa sử dụng ngay thì cần bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 ñến 8 0C không quá 30 ngày

Bước 3: Chuẩn bị mẫu phân tích và pha loãng mẫu

Cân vô trùng khoảng 10 g (10 ml), chính xác đến 0,1 mg, mẫu thử cho vào bình nón đựng 90 ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-1 Cho lên máy lắc đồng hoá mẫu khoảng 30 phút Đặt trong bể điều nhiệt 80 0C trong 10 phút

Dùng micropipet lấy 1 ml dịch pha loãng 10-1 từ bình nón mẫu đã đồng hóa cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng đã tiệt trùng được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục pha loãng tương tự đến độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 để đếm được từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên đĩa thạch

Hình 3.1 Pha loàng mẫu từ 10-1 đến 10-5 Bước 4: Cấy mẫu trên môi trường thạch PCA

Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng liên tiếp, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri vô trùng Lấy 1 ml mẫu hoặc dung dịch pha loãng ở các đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri Môi trường PCA

đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 0C ± 1 0C Rót vào từng đĩa 12 ml đến 15 ml môi trường thạch, đảo đều dung dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc 3 lần sang phải và 3 lần sang trái Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng mát, nằm ngang Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút

Bước 5: Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả

Khi thạch đã đông, lật úp đĩa và cho vào tủ ấm 37 0C trong thời gian từ 18 giờ đến 24 giờ Sau 24 giờ, đếm kết quả, đếm tổng số các khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch

Chọn những đĩa có từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả Nếu chênh lệch các giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, thì tính số N bào tử cho 1 g hoặc 1 ml sản phẩm bằng cách tính trung bình cộng của tống số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa theo công thức sau:

(*)

Trong đó:

ΣC là tổng các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa ñược giữ lại từ 2 đậm độ pha loãng tiếp theo;

V là thể tích mẫu cấy trên mỗi ñĩa, tính bằng mililit (ml);

n1 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ nhất được giữ lại;

n2 là số đĩa có đậm độ pha loãng thứ hai được giữ lại;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất

Vi khuẩn Bacillus trên môi trường thạch PCA tạo thành khuẩn lạc màu trắng, hình dạng thay đổi

3.3.1.3 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn đường ruột

Ba lợn con/nhóm được mổ lấy mẫu chất chứa ở các đoạn ruột không tràng, hồi tràng, manh tràng, kết tràng và trực tràng Các chỉ tiêu vi sinh vật đường ruột xác định gồm: Tổng vi khuẩn hiếu khí, tổng số E.coli, Clostridium perfringens, Lactobacillus spp theo các bước sau:

Hình 3.2 Các bước xác định số lượng một số vi khuẩn đường ruột lợn con

theo mẹ

Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí theo tiêu chuẩn TCVN 5165 : 1990 Cấy mẫu trên môi trường thạch thường: Đối với một mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ, mỗi đậm độ dùng 2 đĩa petri và 1 pipet vô khuẩn riêng Lấy 1 ml sản phẩm (lỏng) hoặc dung dịch pha loãng ở những đậm độ khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri Rót vào từng đĩa 12 – 15 ml môi trường thạch, trộn đảo đều dung dịch mẫu và môi trường bằng cách lắc sang phải và sang trái mỗi chiều 3 lần Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt ngang Thời gian từ khi bắt đầu pha loãng mẫu đến khi rót môi trường không được quá 30 phút

Nuôi cấy trong tủ ấm và đọc kết quả: Khi thạch đã đông, lật sấp các đĩa petri và để vào tủ ấm ở nhiệt độ 30 ± 10C từ 48 đến 72 giờ Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả

Xác định E.coli theo tiêu chuẩn TCVN7924-2:2008 (ISO 16649-2: 2001) Cấy mẫu trên môi trường thạch TBX: Dùng micropipet vô trùng chuyển 1

ml mẫu thử pha loãng ban đầu (10-1) vào đĩa Petri vô trùng Cấy vào 2 đĩa petri ở mỗi độ pha loãng Lặp lại quy trình trên cho các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng một pipet mới vô trùng cho mỗi độ pha loãng

Rót vào mỗi đĩa petri khoảng 15 ml môi trường TBX mà trước đó đã được làm nguội đến khoảng từ 44 oC đến 47 oC trên nồi cách thủy

Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường và để yên cho hỗn hợp đông lại, để các đĩa petri trên mặt phẳng mát nằm ngang Thời gian tính từ khi phân phối dịch cấy vào đĩa đến khi rót môi trường không được quá 15 phút

Nuôi cấy tủ ấm và đọc kết quả: Lật ngược các đĩa và để vào tủ ấm để ở 44

oC trong khoảng từ 18 giờ đến 24 giờ Tổng thời gian ủ không được quá 24 giờ Sau giai đoạn ủ ấm quy định, đếm các CFU điển hình của Escherichia coli dương tính β-glucuronidaza trên mỗi đĩa thạch chứa ít hơn 150 CFU điển hình và ít hơn

300 CFU tổng số (điển hình và không điển hình)

Vi khuẩn ở nhiệt độ 44 oC hình thành các khuẩn lạc màu xanh điển hình trên môi trường TBX, dương tính β-glucuronidaza (β-glucuronidase-positive Escherichia coli)

Xác định Clostridium perfringen theo tiêu chuẩn TCVN 4991:2005 (ISO 7937/2004)