Nghiên cứu thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu nành

Các đề xuất về quy trình sản xuất chế phẩm protease giàu enzyme nattokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis natto, quy trình sản xuất chế phẩm enzyme nattokinase ở quy mô phòng t

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

VĂN THỊ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT

TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Công nghệ sinh học

Đà Nẵng – Năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -

VĂN THỊ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS TS Trương Thị Minh Hạnh

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác

Ngày 11 tháng 01 năm 2018

Văn Thị Diệu Linh

BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH

Họ và tên: Văn Thị Diệu Linh Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01 Khóa: K32.CSH Trường Đại học Bách Khoa - ĐHĐN Tóm tắt - Nattokinase là enzyme có khả năng làm tiêu huyết khối, giúp ngăn ngừa các bệnh lý liên quan đến chứng huyết khối Sản xuất enzyme nattokinase từ lên men phế liệu

bã đậu nành là một phương pháp chẳng những góp phần tăng cường hiệu quả kinh tế, mà việc tận dụng phế phẩm bã đậu nành còn có nhiều ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường Nghiên cứu này tiến hành khảo sát điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto trên cơ chất bã đậu nành và thu nhận enzyme Kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lên men bã đậu nành với tỷ lệ giống 14% (v/w), có bổ sung 20% (w/w) bột đậu nành, sau 24 giờ lên men thu được enzyme nattokinase với hoạt lực cao nhất là 11,67 đv/ml Nghiên cứu cũng đã tiến hành kết tủa enzyme bằng dung dịch ethanol 96%, sau đó sấy thăng hoa thu chế phẩm enzyme thô có hoạt độ riêng 35,29đv/g Các đề xuất về quy trình sản xuất chế phẩm protease giàu enzyme nattokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis natto, quy trình sản xuất chế phẩm enzyme nattokinase ở quy mô phòng thí nghiệm cũng được trình bày trong nghiên cứu này

Từ khóa – nattokinase; bã đậu nành; Bacillus subtilis natto; lên men bề mặt; tiêu huyết khối

EXTRACTION ENZYME NATTOKINASE BY SOLID STATE FERMENTATION SOYBEAN CURD RESIDUES

Abstract - Nattokinase is an enzyme with fibrinolytic activity that can be used for preventing thrombolytic diseases Production nattokinase enzyme by fermentation soybean curd residues does not only increase economic value, but also brings many enviromental benefits In this study, I make survey the effect fermentation conditions to Bacillus subtilis natto strain on the soybean curd residues substrate to enhance the nattokinase activity and extraction nattokinase enzyme It is showed that when ferment conditions were involved with 14% (v/w) of Bacillus subtilis natto, 20% (w/w) soybean power added, for 24 hours, the highest protease activity could reach 11,67 units/ml I also try to extract enzyme by ethanol 96% and create dried products by freeze drying process and obtain nattokinase activity 35,29 units/g Offerings of the process of receiving nattokinase and Bacillus subtilis natto rich protease and receiving crude nattokinase enzyme in laborary were showed in this research

Key words – nattokinase; soybean curd residues; Bacillus subtilis natto; solid state fermentation; fibrinolytic activity

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ……… …… 1

1 Tính cấp thiết của đề tài……… 1

2 Mục tiêu nghiên cứu……… .2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ……… 3

4 Phương pháp nghiên cứu……… … 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu……… 4

6 Bố cục đề tài……… 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ……….… ……… … 5

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH ……… … 5

1.1.1 Giới thiệu về bã đậu nành……… …….5

1.1.2 Một số ứng dụng của bã đậu nành……… …….…… … 8

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME NATTOKINASE……… … 10

1.2.1 Giới thiệu về nattokinase……… …10

1.2.2 Cơ chế tác dụng của nattokinase………12

1.3 TỔNG QUAN VỀ BACILLUS SUBTILIS NATTO…….………… ……13

1.3.1 Giới thiệu về Bacillus subtilis natto……….… 13

1.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa của Bacillus subtilis natto … …… 15

1.3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus subtilis natto ……… …….16

1.3.3.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis natto 16

1.3.3.2 Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis natto 16

1.3.4 Các phương pháp lên men 16

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis natto 17

1.3.5.1 Nhiệt độ 17

1.3.5.2 pH 18

1.3.5.3 Thời gian nuôi cấy 18

1.3.5.4 Thành phần môi trường 18

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC …… ……18

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới……… ……18

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước……… … 19

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

……… ……… … 21

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT….……… …….21

2.1.1 Nguyên liệu……… … 21

2.1.2 Thiết bị……… 21

2.1.3 Hóa chất……… ……….22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… ….23

2.2.1 Phương pháp xác định một số thành phần hóa học của bã đậu nành……… ….…… …24

2.2.2 Phương pháp hoạt hóa và giữ giống 24

2.2.3 Phương pháp nhân giống ………… 24

2.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào ……… … 24

2.2.5 Phương pháp lên men 25

2.2.5.1 Khảo sát thời gian lên men……… ……… ……… 26

2.2.5.2 Khảo sát tỷ lệ giống……… ………26

2.2.5.3 Khảo sát tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung……… ………… 26

2.2.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô………… ……… 26

2.2.7 Phương pháp kết tủa enzyme nattokinase bằng dung môi ethanol 96% .27

2.2.8 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 27

3.2.9 Phương pháp sấy thăng hoa……… ……… 29

2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu… ……… ……… 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN … ……… 30

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÃ ĐẬU NÀNH……… … 31

3.2 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN TYROSIN.… ……… 32

3.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG… ……… 32

3.4 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN.34 3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men … ……… 34

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống……… …… 36

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ bột đậu nành bổ sung vào môi trường lên men 38

3.5 KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÀM TAN HUYẾT KHỐI CỦA ENZYME NATTOKINASE 41 3.6 KHẢO SÁT TỶ LỆ ETHANOL 96% TRÊN DỊCH CHIẾT ENZYME THÔ THU NHẬN KẾT TỦA ENZYME… …… 42 3.7 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROTEASE GIÀU

ENZYME NATTOKINASE VÀ SINH KHỐI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO 45

3.8 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME NATTOKINASE THÔ QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM .48

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số hiệu

bảng

2.1 Các thiết bị và dụng cụ chính được sử dụng trong

3.3 Kết quả thử khả năng làm tan huyết khối của dịch chiết

1.2 Quy trình thu nhận bã đậu nành của các cơ sở sản xuất đậu phụ 8

1.6 Các sản phẩm natto truyền thống (C) và natto hiện đại (A, B) 14

2.2 Quy trình lên men bã đậu nành bằng phương pháp lên men bề

2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận dịch chiết enzym nattokinase thô 27

3.4 Ảnh hưởng của thời gian lên men đối với quá trình lên men bã

3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đối với quá trình lên men bã đậu

3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ bột đậu nành bổ sung đối với quá trình lên

3.10 Thí nghiệm kiểm tra khả năng làm tan huyết khối của dịch chiết

3.11 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol 96% đối với quá trình kết

3.13 Sơ đồ qui trình sản xuất chế phẩm protease giàu enzyme

nattokinase và sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis natto 44

3.14 Chế phẩm protease giàu enzyme nattokinase và sinh khối vi

3.15 Sơ đồ qui trình sản xuất chế phẩm enzyme nattokinase thô ở

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các bệnh liên quan đến tim mạch như: nhồi máu

cơ tim, suy tim, rối loạn nhịp tim, cao huyết áp, đột quỵ,…đang gia tăng một cách báo động Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), mỗi năm có khoảng 17,5 triệu người tử vong do các bệnh liên quan đến tim mạch Trong khi đó tại Việt Nam, theo số liệu của Hội Tim mạch, hàng năm, các bệnh lý về tim mạch cướp đi sinh mạng của 200.000 người, chiếm ¼ tổng số trường hợp tử vong của cả nước Bên cạnh đó, số ca tử vong do bệnh lý tim mạch có xu hướng ngày càng tăng và trẻ hóa [39] Song song với đó, chi phí điều trị, chăm sóc, phục hồi chức năng cho các bệnh nhân cũng là gánh nặng lớn cho các quốc gia, trong đó có Việt Nam

Theo các nghiên cứu, nguyên nhân chính gây ra các bệnh lý tim mạch là do sự hình thành các cục máu đông hay còn gọi là huyết khối Các cục máu đông gây tắc nghẽn các mạch máu, gây tổn hại đến các cơ quan trong cơ thể và là nguyên nhân trực tiếp gây ra các bệnh nguy hiểm như: tai biến do tăng huyết áp, nhồi máu cơ tim, nhồi máu não, suy tim, thuyên tắc phổi,…Nhiều phương pháp đã được áp dụng để điều trị huyết khối như: sử dụng các chất chống đông như heparin, coumarin; sử dụng các enzyme làm tan huyết khối như: streptokinase, urokinase,…thậm chí là phương pháp phẫu thuật Tuy nhiên, chi phí điều trị bằng các biện pháp trên rất cao, ngoài ra các loại thuốc điều trị chỉ có tác dụng trong thời gian ngắn, không có tác dụng phòng ngừa, đồng thời gây ra các tác dụng phụ như xuất huyết toàn thân, dị ứng [22, 37] Do đó, việc tìm kiếm các phương pháp có giá thành rẻ và an toàn hơn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong những năm qua Việc phát hiện nattokinase mở ra một triển vọng mới cho việc điều trị và phòng ngừa chứng huyết khối Nattokinase được thu nhận từ các thực phẩm lên men truyền thống như: natto Nhật Bản, douche Hàn Quốc, nước tương Chung kook-jang Hàn Quốc

và Thua nao từ phía Bắc Thái Lan So với các loại thuốc tan huyết khối sẵn có hiện nay, nattokinase có nhiều ưu thế như an toàn, giá thành thấp hơn, hiệu quả, tác dụng kéo dài,

sử dụng phòng ngừa và sử dụng qua đường ăn uống dễ dàng [16, 21]

Hiện nay, enzyme nattokinase chủ yếu được thu nhận từ quá trình lên men với cơ chất là hạt đậu nành Một số nghiên cứu đã đề cập đến các nguồn nguyên liệu khác thay thế như: gạo lức, cao ngô, bã đậu nành,…Trong đó, bã đậu nành từ các nhà máy sản xuất đậu phụ là nguồn nguyên liệu rẻ tiền cần được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất

Bã đậu nành hiện được sử dụng làm thức ăn gia súc hoặc đạm đậu tương dùng cho người Một số nghiên cứu đề cập sử dụng bã đậu nành làm cơ chất cho các quá trình lên men ethanol, methanol, axit xitric; xử lý kỹ thuật để thay thế một phần bột mì trong sản xuất bánh mì, bánh cookie, cracker

Mặc dù bã đậu nành đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nhưng lượng bã đậu nành chưa được xử lý trên thế giới vẫn chiếm lượng lớn Tại các nước Châu

Á, các sản phẩm thực phẩm làm từ đậu nành như đậu phụ, sữa đậu nành, nước tương, dầu đậu nành, tempeh, được sử dụng phổ biến rộng rãi Do đó, lượng phế liệu bã đậu nành phát sinh ra tại khu vực này là khá lớn Thống kê trên toàn thế giới, hàng năm xấp xỉ 14 triệu tấn phế liệu bã đậu nành được thải ra chủ yếu từ các nước Châu Á và Châu Mỹ [34] Riêng tại Nhật Bản, lượng bã đậu nành được xử lý là 800.000 tấn với chi phí xử lý lên đến 16 tỷ yên mỗi năm, số còn lại được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi, phân bón và lượng lớn trở thành rác thải được xử lý bằng cách đốt hoặc chôn lấp Đây cũng là thực trạng chung của các nước còn lại trong khu vực Những vấn đề môi trường phát sinh từ nguồn phế phẩm khổng lồ này đã đặt ra nhiều thách thức cho các nhà quản lý và các nhà khoa học [32]

Trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi ước tính có khoảng hơn 100 cơ sở sản xuất đậu phụ Tuy nhiên, hiện nay phần lớn bã đậu nành được bán cho các hộ gia đình nhỏ lẻ làm thức

ăn chăn nuôi ở dạng thô chưa qua xử lý, số lượng còn lại tạo thành rác thải dẫn đến nguy

cơ gây ô nhiễm môi trường

Trong sản xuất công nghiệp, bên cạnh việc sản xuất ra các chính phẩm, việc tận dụng các phụ phẩm, phế phẩm là rất cần thiết Ngoài ý nghĩa về mặt tăng cường hiệu quả kinh tế, việc tận dụng các phụ phẩm, phế phẩm còn có nhiều ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường

Từ yêu cầu thực tiễn đó, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme

nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu nành”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto thu nhận enzyme nattokinase trên bã đậu nành

- Xác định tỷ lệ thích hợp ethanol 96% trên dịch chiết enzyme thô trong quá trình thu nhận enzyme nattokinase

- Thu nhận chế phẩm enzyme thô

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

* Đối tượng nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto do phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc trường

Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp

- Bã đậu nành lấy từ 03 cơ sở sản xuất đậu phụ trên địa bàn thành phố Quảng Ngãi

* Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên chủng vi khuẩn

Bacillus subtilis natto với cơ chất là bã đậu nành ở quy mô phòng thí nghiệm

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

* Nghiên cứu lý thuyết

Trên cơ sở tìm hiểu thông tin khoa học về bã đậu nành, vi khuẩn Bacillus subtilis natto, natto, enzyme nattokinase, những nghiên cứu về tổng hợp thu nhận enzyme

nattokinase trong nước và trên thế giới, tiến hành tổng hợp, phân tích các công trình nghiên cứu, các tài liệu khoa học nhằm định hướng và thực hiện đề tài

* Nghiên cứu thực nghiệm

Phương pháp hóa học

- Phân tích một số thành phần hóa học của bã đậu nành

- Xác định hoạt lực enzyme bằng phương pháp Amano

Phương pháp vi sinh

- Nhân giống và hoạt hóa vi khuẩn Bacillus subtilis natto

- Khảo sát quá trình nhân giống và xây dựng đường cong sinh trưởng

- Thực hiện lên men bằng phương pháp lên men bề mặt

Phương pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu thí nghiệm bằng phần mềm ANOVA trên Excel 2016 Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại thí nghiệm

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

* Ý nghĩa khoa học

- Đóng góp thông tin khoa học về bã đậu nành và làm phong phú thêm những nghiên cứu về ứng dụng của bã đậu nành, cung cấp thêm giải pháp xử lý và tận dụng nguồn phế liệu bã đậu nành

- Đóng góp thông tin khoa học về điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis natto

thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt với cơ chất là bã đậu nành

6 BỐ CỤC ĐỀ TÀI

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Danh mục tài liệu tham khảo

Phụ lục

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH

1.1.1 Giới thiệu về bã đậu nành (okara)

Bã đậu nành (okara) là phần phế phẩm dạng rắn thu được sau quá trình lọc thu dịch sữa đậu nành trong quá trình sản xuất sữa đậu nành, đậu phụ (đậu khuôn) và các sản phẩm khác từ đậu nành

Bã đậu nành (Hình 1.1.) có màu trắng ngà hoặc vàng nhạt, dạng rắn tơi hơi ướt, như mùn cưa ướt, chủ yếu chứa nước (60-80%), protein (4-25%), chất xơ và các thành phần khác như lipit, khoáng chất, các vitamin [34]

Hình 1.1 Bã đậu nành [40]

Bã đậu nành có chứa 6.99% H, 46.34% C, 3.99% N, 0.25% S, và 3.59% oxit kim loại Thành phần bã đậu nành phụ thuộc vào giống đậu nành, thổ nhưỡng canh tác và công nghệ sản xuất

Phế phẩm bã đậu nành có protein chất lượng cao, đặc biệt là acid amin thiết yếu như: aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, glycine, alanine, cysteine, methionine, valine, isoleucine, leucine, tyrosine, (Bảng 1.1.)

Bảng 1.1 Thành phần acid amin trong bã đậu nành [32]

Các thành phần khác trong bã đậu nành bao gồm khoáng chất (Bảng 1.2.), lignan, phytosterols, coumantans và phytates Các hợp chất này có nhiều chức năng sinh lý và điều trị như chất chống oxy hoá, phòng chống các bệnh tim mạch và ngăn ngừa các tác nhân gây ung thư đối với một số loại ung thư [32]

Bảng 1.2 Thành phần khoáng chất có trong bã đậu nành [32]

(mg/100g khối lượng khô)

cứ 1kg đậu nành sản xuất sẽ phát sinh ra 1,1kg bã đậu nành [18]

Hiện nay, phần lớn bã đậu nành được bán cho các cơ sở chăn nuôi để làm thức ăn gia súc, gia cầm ở dạng thô Tuy nhiên, đây là một phụ phẩm giàu dinh dưỡng có tiềm năng lớn trong ứng dụng sản xuất thực phẩm, chế phẩm sinh học, bên cạnh việc sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

Bã đậu nành được chọn là cơ chất lên men cho nghiên cứu này vì đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phong phú, dễ kiếm, có thành phần dinh dưỡng đa dạng phù hợp cho quá trình lên men Bên cạnh đó, việc tận dụng nguồn phế phẩm bã đậu nành là một giải pháp hữu ích trong việc giải quyết vấn đề môi trường do các hoạt động sản xuất các sản phẩm thực phẩm từ đậu nành

Hình 1.2 Quy trình thu nhận bã đậu nành của các cơ sở sản xuất đậu phụ [41]

Đậu phụ

làm thức ăn cho tằm vì bã đậu nành cung cấp nhiều chất dinh dưỡng, tận dụng nguồn nguyên liệu tại chỗ, giảm chi phí mua thức ăn

- Làm phân bón: bã đậu nành được sử dụng làm phân bón sinh học cung cấp dinh dưỡng cho đất phục vụ hoạt động trồng trọt

- Làm bao bì: với hàm lượng chất xơ cao, bã đậu nành đã được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất giấy gói thực phẩm

- Làm vật liệu xây dựng: bã đậu nành là thành phần chính phối hợp với đất sét và một số phụ gia để sản xuất gạch gia cố được cấp bằng sáng chế tại Nhật Bản, bã đậu nành còn được dùng làm phụ gia trong sản xuất gốm

- Làm thức ăn cho thú cưng: bã đậu nành được xử lý sấy khô và tạo thành dạng hạt, đóng gói để thuận lợi dùng làm thức ăn cho động vật nuôi cảnh

- Làm cơ chất cho quá trình lên men: bã đậu nành là nguồn cơ chất dinh dưỡng và rẻ tiền cho các quá trình lên men như lên men ethanol, methan, axit xitric, surfactin, iturin (thuốc diệt nấm), thuốc trừ sâu, ( Bảng 1.3.) Một số nghiên cứu sử dụng bã đậu nành là

cơ chất lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto nhằm sản xuất enzyme nattokinase [24, 36] Đây cũng là một hướng đi mới trong việc ứng dụng bã đậu nành

Bảng 1.3 Các sản phẩm lên men từ bã đậu nành [32]

- Làm thực phẩm: bã đậu nành được xử lý làm thực phẩm hoặc làm nguyên liệu thay thế một số nguyên liệu truyền thống trong sản xuất thực phẩm

Bã đậu nành được sử dụng làm tương xay do thành phần dinh dưỡng cao Bã đậu nành còn được xử lý tạo thành thực phẩm giàu chất xơ hoặc bổ sung vào các loại thực phẩm khác nhau nhờ vào đặc điểm có hàm lượng chất xơ cao và có giá trị trong hỗ trợ ngăn ngừa các bệnh khác nhau ở người

Bã đậu nành được xử lý kỹ thuật có thể thay thế 10-17% bột mì trong sản xuất bánh

mì, cracker và cookie; đồng thời tăng hàm lượng chất xơ cho bánh, là thành phần dinh dưỡng hữu ích cho cơ thể

Bã đậu nành chứa nhiều thành phần cellulose, hemicellulose và lignin, nên phù hợp làm phụ gia bổ sung trong các sản phẩm ăn kiêng như bánh quy và đồ ăn nhẹ vì có khả năng làm giảm lượng calo và tăng lượng chất xơ

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME NATTOKINASE

1.2.1 Giới thiệu về nattokinase

Nattokinase hay còn gọi là subtilisin NAT (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một protease serine, có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid amin, khối lượng phân

tử là 27,728 kDa và pI=8,6 Là một protease không chứa cysteine, nattokinase không có cầu nối disulfua trong phân tử [2, 23]

Hình 1.3 Cấu trúc bậc 3 của nattokinase [2]

Enzyme nattokinase ổn định trong khoảng pH 6-10, nhiệt độ < 500C; hoạt tính tăng lên một phần khi có mặt H2O2, HgCl2 Nattokinase bị bất hoạt ở nhiệt độ > 700

C, pH < 5

và sự có mặt của các ion Fe3+

, Al3+ Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His và Asp

Nattokinase là một trong các enzyme ngoại bào được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

Bacillus subtilis Natto

Nattokinase được tiến sỹ Hyroyuki Sumi phát hiện lần đầu tiên vào năm 1987 trong natto - một loại thực phẩm truyền thống từ đậu tương lên men của Nhật Bản Nhiều nghiên cứu đã chứng minh: nattokinase có khả năng trực tiếp làm tiêu huyết khối, không những thế nó còn tăng khả năng sản sinh ra plasmin, một loại enzyme nội sinh có khả năng làm tan huyết khối của cơ thể Nattokinase được ghi nhận có khả năng phân giải fibrin mạnh hơn gấp 4-5 lần so với plasmin Ngoài ra, nattokinase còn có khả năng hỗ trợ điều trị tăng huyết áp, bệnh alzheimer [15]

Trong các nghiên cứu lâm sàng ở người được thực hiện bởi các cơ quan quản lý và các công ty dược phẩm, ghi nhận không có tác dụng phụ được tìm thấy khi tình nguyện viên người khỏe mạnh bình thường uống nattokinase (10 mg/kg) mỗi ngày trong 28 ngày Những người tham gia trong nghiên cứu không có thay đổi đáng kể về nước tiểu, huyết

áp, hoặc xung Các dữ liệu trong các nghiên cứu về độc tính đã cung cấp một đánh giá an

toàn mạnh mẽ cho việc sử dụng nattokinase an toàn ở người [37]

Nattokinase có khả năng phá vỡ thrombi và fibrin Nattokinase, không giống như hầu hết các protein, có khả năng chống lại chất dịch dạ dày có tính axit cao trong dạ dày

và có thể hấp thu vào các phần sau của đường tiêu hóa Điều này chắc chắn góp phần làm cho khả năng của enzym này còn nguyên vẹn trong đường tiêu hóa

So với các loại thuốc điều trị đông máu khác, nattokinase có nhiều ưu điểm như hiệu quả, an toàn, tác dụng lâu dài, sử dụng phòng ngừa, sử dụng dễ dàng qua đường ăn uống

và bền vững trong hệ tiêu hóa của người [38]

Hiện nay, với những ưu điểm vượt trội trên, các sản phẩm enzyme nattokinase thương mại (Hình 1.4) được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Liên minh châu Âu, Canada và Hoa Kỳ như một chất bổ sung ngăn ngừa đông máu và cải thiện lưu thông máu Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nattokinase có thể cải thiện các bệnh khác như cao huyết áp, đột quị, bệnh Alzheimer và xơ vữa động mạch Khả năng sử dụng enzyme nattokinase để giảm nguy cơ huyết khối và làm chậm sự tiến triển của xơ vữa động mạch cũng như suy giảm nhận thức hiện đang trong quá trình đánh giá thử nghiệm lâm sàng ở người

Hình 1.4 Một số sản phẩm thương mại chứa nattokinase

1.2.2 Cơ chế tác dụng của nattokinase

Fibrinogen là một loại glycoprotein tồn tại trong máu và là nhân tố cần thiết cho quá trình đông máu bằng cách chuyển đổi thành fibrin tạo thành cục máu đông hoặc dạng gel không tan nhằm giúp cơ thể ngăn ngừa sự chảy máu khi bị tổn thương

Ức chế

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của enzyme nattokinase[38]

Ở điều kiện bình thường, luôn có sự cân bằng động giữa quá trình đông máu và quá trình giảm fibrin để tránh hiện tượng xuất huyết hoặc đông tụ gây tắc nghẽn quá trình lưu

thông máu Các tế bào nội bào của thành động mạch có cơ chế ngăn chặn sự dính kết gây đông tụ máu Tình trạng tăng đông máu ở cơ thể xảy ra khi có sự mất cân bằng giữa hệ thống hoạt hóa và ức chế đông máu mà nguyên nhân là do giảm các yếu tố ức chế đông máu hoặc tăng hoạt hóa đông máu dẫn đến hình thành huyết khối nhiều quá mức cần thiết, gây tắc nghẽn cục bộ hoặc toàn bộ trong cơ thể Đây chính là nguyên nhân chính gây ra các bệnh như: bệnh suy tim, động mạch vành, xơ vữa động mạnh, cao huyết áp, Nattokinase có khả năng tiêu fibrin bằng cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các con đường khác nhau như mô tả Hình 1.5:

Thứ nhất, nattokinase trực tiếp phân giải các sợi fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp, hòa tan, giải phóng các tiểu cầu, dẫn đến làm tan các cục máu đông

Thứ hai, nattokinase có khả năng hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin - một loại enzyme tiêu fibrin nội sinh trong cơ thể bằng 02 cách: hoạt hóa pro-urokinase sinh urokinase từ đó hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin; tăng lượng plasminogen mô (t-PA)- đây là yếu tố hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin, đồng thời nattokinase cũng

ức chế enzyme plasminogen activator inhibitor -1( PAI -1) – đây là enzyme ức chế tác dụng hoạt hóa của plasminogen mô t-PA [15]

Như vậy có thể thấy rằng: enzyme nattokinase không chỉ làm tan huyết khối mà còn

có tác dụng phòng ngừa sự hình thành huyết khối Ngoài ra, enzyme nattokinase không ảnh hưởng đến sự hình thành fibrin từ fibrinogen nên không làm suy giảm khả năng đông máu tự nhiên của cơ thể Đây chính là ưu điểm vượt trội của enzyme nattokinase

1.3 TỔNG QUAN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO

1.3.1 Giới thiệu về Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto được phân lập lần đầu tiên vào năm 1906 từ natto bởi tiến sỹ Shin Sawamura, thuộc trường Đại học Tokyo, Nhật Bản Bacillus subtilis natto được biết

đến là loại vi khuẩn lên men hạt đậu nành tạo mùi hương đặc biệt cho natto Tên gọi

Bacillus subtilis natto được xem là tên không chính thức, tuy nhiên nó vẫn được dùng phổ

biến trong ngành công nghệ thực phẩm và trong các báo cáo khoa học nhằm phân biệt với

Bacillus subtilis về khả năng lên men natto [36]

Từ khi Bacillus subtilis natto được phân lập bởi tiến sỹ Shin Sawamura, các sản

phẩm natto thương mại bắt đầu được phát triển ở dạng sản phẩm truyền thống – natto lên men trong rơm khô (hình 1.6C) và sản phẩm natto lên men trong các bao bì polystyrene (hình 1.6A, B)

Hình 1.6 Các sản phẩm natto truyền thống (C) và natto hiện đại(A, B) [33]

Từ những năm 1920, các nhà khoa học cũng quan tâm nghiên cứu tìm cách sản xuất

natto từ môi trường lên men Bacillus subtilis natto thay vì lên men hạt đậu nành và đánh giá sự an toàn của Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto (1.51 x 109 CFU / ml) được tiêm cho chuột không gây ra bất

kỳ dấu hiệu độc tính 14 ngày sau khi tiêm, không có tế bào Bacillus subtilis natto sống

còn được quan sát thấy ở phổi, gan, não hoặc thận thông qua kiểm tra mô bệnh học[38]

Như vậy, cùng với nhiều nghiên cứu lâm sàng khác đã chứng minh rằng Bacillus subtilis natto là sinh vật an toàn, có thể được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu khoa học

và sản xuất công nghiệp, với nhiều ưu điểm như môi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền, dễ nuôi cấy, sinh trưởng tốt, phát triển nhanh, không sinh độc tố và an toàn

1.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa của Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto là vi khuẩn nhân nguyên thủy (tế bào chưa có màng nhân),

thuộc:

Giới (Kingdom) : Bacteria

Ngành (Division) : Firmicutes

Họ (Family) : Bacillaceae Hình 1.7 Vi khuẩn Bacillus subtilis [35]

Giống (Genus) : Bacillus

Loài (Species) : Bacillus subtilis

Bacillus subtilis natto là trực khuẩn hình que, hai đầu tròn, gram dương Tế bào vi

khuẩn đứng đơn lẻ hoặc nối với nhau thành chuỗi ngắn Khuẩn lạc vi khuẩn không màu, khô, bề mặt hơi nhăn, có mép nhăn bám chặt vào môi trường

Hình 1.8 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis natto [hình thí nghiệm]

Bacillus subtilis natto là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Bacillus subtilis natto có thể

phát triển trong khoảng nhiệt độ 300

C – 500C, pH hơi kiềm hoặc trung tính Nhiệt độ tối

ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,2 - 7,6

Vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào các tiêm mao, có khả năng sinh bào tử hình bầu dục khi gặp điều kiện bất lợi Bào tử có khả năng chống chịu các điều kiện không thuận lợi về nhiệt độ, độ ẩm,… khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành tế bào mới

Bacillus subtilis natto là vi sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng các nguồn

hydocarbon như glucose, fructose, maltose, saccharose, polysaccharid, Protein và các acid amin là nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn [23]

1.3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus subtilis natto

1.3.3.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis natto

Trong tế bào Bacillus subtilis natto, những enzyme nội bào được sinh tổng hợp xúc

tác các phản ứng sinh hóa

Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis natto: các enzyme thủy phân như protease

nội bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; các enzyme tổng hợp như aspagagin-syntetase; các enzyme tham gia các quá trình oxy hóa - khử như dehydrogenase, oxydase, cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế bào

1.3.3.2 Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme cần thiết cho quá trình

sống để thích ứng với hoàn cảnh và điều kiện môi trường: amylase (α-amylase), glucanase, xylanase, protease… Trong đó, enzyme nattokinase là một loại protease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhiều

-1.3.4 Các phương pháp lên men [9]

Có 03 phương pháp lên men gồm: lên men chìm, lên men bán rắn và lên men bề mặt

Lên men chìm: là phương pháp mà vi khuẩn sinh trưởng và phát triển trong môi trưởng lỏng và phân tán khắp các vị trí trong lòng chất lỏng Đây là phương pháp phù hợp cho sản xuất công nghiệp, dễ tự động hóa, cơ giới hóa Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là: hoạt lực enzyme thu được thấp hơn so với phương pháp lên men bề mặt, việc xử lý thành phẩm sau lên men phức tạp, quá trình lên men dễ bị nhiễm trùng hoàn toàn, chi phí sản xuất cao

Lên men bán rắn: là phương pháp lên men mà môi trường lên men có hàm lượng nước chiếm 70% và có sự kết hợp của các thiết bị khuấy trộn Hiện nay, người ta sử dụng thiết bị thùng quay để thực hiện lên men bán rắn cũng như thực hiện luôn công đoạn sấy khô sau lên men

Lên men bề mặt là phương pháp lên men mà sự sinh trưởng và các sản phẩm hình thành trên bề mặt cơ chất Phương pháp lên men bề mặt được ứng dụng từ nhiều năm qua

và là phương pháp phổ biến trong sản xuất enzyme Vi sinh vật vừa phát triển trên bề mặt

môi trường, vừa len lõi phát triển trong lòng môi trường tại các khe, rãnh do các hạt môi trường tơi xốp tạo nên Môi trường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt không chỉ có độ

ẩm thích hợp cho vi sinh vật phát triển, mà phải có độ tơi xốp cao, tránh các môi trường

bị dính bết, không thoáng khí, làm hạn chế lượng oxy cung cấp cho vi sinh vật phát triển

Ưu điểm của lên men bề mặt gồm:

- Kỹ thuật vận hành đơn giản, ít tốn kém, năng lượng sử dụng ít, nồng độ cơ chất cao, ít nguy cơ nhiễm tạp và dễ xử lý khi có sự cố nhiễm tạp

- Việc xử lý thu chế phẩm khô sau lên men đơn giản bằng phương pháp sấy, ít hao tổn về hoạt tính enzyme, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp mà không cần qua công đoạn chiết tách và làm sạch

- Trang thiết bị kỹ thuật phục vụ lên men đơn giản, ít tốn kém

Bên cạnh đó, phương pháp lên men bề mặt vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như: tốn diện tích, khó điều chỉnh thành phần môi trường, do đó khó thực hiện tối ưu hóa điều kiện lên men

Tuy nhiên, với những ưu điểm đáng kể, thời gian gần đây, phương pháp này được quan tâm trở lại và ứng dụng rộng rãi trong lên men nhằm làm tăng giá trị thương phẩm cho những nguyên liệu rẻ tiền, các phụ phẩm, phế phẩm từ ngành sản xuất thực phẩm, ngành nông nghiệp, chất thải công nghiệp

Trong nghiên cứu này, tôi chọn phương pháp lên men bề mặt để lên men vi khuẩn

Bacillus subtilis natto thu enzyme nattokinase vì nhiều lý do như: phương pháp lên men

dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, việc xử lý thu chế phẩm sau lên men đơn giản,

ít tổn hao về hoạt tính enzyme, dễ bảo quản, kỹ thuật lên men đơn giản

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp

enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis natto [2,7]

1.3.5.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ không những tác động trực tiếp đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp

enzyme của Bacillus subtilis natto mà còn ảnh hưởng đến tính chất của enzyme Mỗi vi

sinh vật có nhiệt độ tối thích và khoảng nhiệt độ hoạt động khác nhau Tại nhiệt độ tối thích, vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme tối đa Khi nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối thích, khả năng sinh tổng hợp enzyme giảm đáng kể Khi nhiệt độ quá cao, màng tế bào bị tổn thương, vi sinh vật chết, enzyme bị biến tính Khi nhiệt độ quá thấp, màng sinh chất bị đông kết, enzyme cũng ngừng hoạt động Theo Hidehiro Miyamura, nhiệt độ tối thích để

lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto thu nhận enzyme nattokinase là 370C [24]

E M.và Abdul-Raouf U M, ở pH= 7 vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh tổng hợp thu

enzyme nattokinase có hoạt độ cao nhất [20]

1.3.5.3 Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy thích hợp là thời gian cho phép tích tụ lượng enzyme tối đa và chủ yếu phụ thuộc vào chủng vi sinh vật Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ kín trải qua 04 pha: pha tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy vong Thời gian của các pha chủ yếu phụ thuộc vào tuổi của giống, lượng giống và thành phần môi trường Enzyme protease thường được tiết ra vào pha lũy thừa

1.3.5.4 Thành phần môi trường

Thành phần môi trường đóng vai trò quan trọng đối với sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật Thành phần môi trường tác động trực tiếp đến loại enzyme được sinh tổng hợp từ cùng một chủng vi sinh vật Khi trong môi trường lên men có chứa chất cảm ứng sẽ có tác dụng kích thích việc sản sinh các enzyme mong muốn Theo Junguo Liu và cộng sự [25], nguồn hydratcarbon mà cụ thể là maltose đóng vai trò là chất cảm ứng tốt nhất làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme nattokinase Như vậy, khi môi

trường nuôi cấy có mặt maltose sẽ kích thích vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh tổng

hợp enzyme nattokinase

Ngoài các yếu tố trên, các yếu tố môi trường khác như độ ẩm, độ thông khí, cũng ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme nattokinase của vi khuẩn

Bacillus subtilis natto

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

Bên cạnh những nghiên cứu, thử nghiệm xác định những lợi ích to lớn của nattokinase đối với sức khỏe, các tính chất, đặc tính, ứng dụng của nattokinase, nhiều nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu các nguồn cơ chất, điều kiện nuôi cấy và thu nhận để

Bacillus subtilis natto sinh tổng hợp nattokinase có hoạt độ cao nhất

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1998, Hidehiro Miyamura và các cộng sự đã nghiên cứu các điều kiện nhiệt độ,

thời gian, độ ẩm thích hợp lên men Bacillus subtilis trên bã đậu nành, kết quả thu được ở

điều kiện thích hợp là nhiệt độ 370C, độ ẩm 80%, thời gian 24 giờ [24]

Năm 2010, Xiaoyan Zu và các cộng sự đã khảo sát so sánh quá trình lên men

Bacillus subtilis với cơ chất là hạt đậu nành và cơ chất là bã thải của nhà máy sản xuất

đậu phụ Kết quả cho thấy: sản lượng enzyme sản xuất từ bã thãi đậu nành cao hơn và có hoạt tính không thấp hơn so với lên men natto hạt đậu nành [36]

Năm 2013, Rohit Kapoor và Bibhu Prasad Panda đã nghiên cứu lên men Bacillus subtilis với cơ chất là hạt đậu nành bổ sung 1% khối lượng sữa bột, 30% nước (v/w) thu

được enzyme protease có hoạt độ cao nhất khi thu nhận enzyme bằng đệm Tris pH 9 [30] Bên cạnh đó, một số nghiên cứu được thực hiện theo hướng tận dụng những nguồn

cơ chất rẻ tiền, sẵn có khác là phế phẩm từ ngành sản xuất thực phẩm như: Năm 2009,

nghiên cứu của Ting – Wei Ku và các cộng sự sản xuất nattokinase bằng lên men Bacillus subtilis natto trên bã đậu nành từ nhà máy sản xuất dầu đậu nành thu được enzyme

nattokinase có hoạt lực đạt 13,87 U/ml, đồng thời giảm 13% chi phí mua cơ chất so với việc sử dụng cơ chất là môi trường dinh dưỡng tổng hợp [35] Năm 2011, Sang-Lan

Wang và các cộng sự đã tiến hành lên men vi khuẩn Bacillus subtilisTKU007 với cơ chất

là vỏ tôm, phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến thủy sản và tinh sạch enzyme thu được chế phẩm enzyme nattokinase có hoạt lực là 27,5 FU/kg protein [31] Năm 2016,

Sumaya Ali Hmood và Ghazi Munim Aziz tiến hành lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis với cơ chất là cám lúa mì thu kết quả hoạt độ enzyme protease cao nhất ở điều

kiện pH 7,0; tỷ lệ cấy giống 5.107 sau 72 giờ lên men [33]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự đã phân lập thành công hai chủng

Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên môi trường đậu

nành hấp chín nuôi cấy trên đĩa Petri và khay [5]

Năm 2013, Bùi Thị Nhung và cộng sự đã nghiên cứu thu được kết quả điều kiện lên

men bề mặt Bacillus subtilis với cơ chất là bột đậu nành và cám mì thu enzyme

nattokinase có hoạt lực cao nhất ở pH 9, độ ẩm từ 50-60% và thời gian lên men 48h, sau khi dựa trên kết quả khảo sát pH từ 6-12, các khoảng thời gian lên men 24h, 48h, 72h [1] Năm 2016, Nguyen Nhut Huy và Nguyen Thuy Huong đã thực hiện khảo sát quá

trình lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto với cơ chất là hạt đậu nành ở điều

kiện nhiệt độ: 320C, 370C, 420C, 470C, pH 5,5; 6; 7; 7,5; 8, thời gian lên men 12h, 24h, 36h, 38h Kết quả ở 370C; pH 7,5; thời gian lên men 36h thu nhận được enzyme nattokinase có hoạt lực cao nhất [26]

Năm 2016, Trương Thị Minh Hạnh đã phân lập và định danh được 2 chủng vi khuẩn

Bacillus subtilis natto từ natto thương phẩm của Nhật Bản Nghiên cứu cũng đã tiến hành

lên men natto từ hạt đậu nành bằng phương pháp bề mặt thu chế phẩm enzyme thô với kết

quả điều kiện thích hợp là tỷ lệ giống 4% (v/w), thời gian lên men: 42 giờ, độ dày lớp đậu nành lên men: 3cm và đề xuất quy trình lên men quay vòng natto [13]

Như vậy, việc nghiên cứu quá trình lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto nhằm

thu nhận enzyme nattokinase được không ít nhà khoa học quan tâm thực hiện đặc biệt trên nhiều loại cơ chất khác nhau, đặc biệt một số nhà khoa học bắt đầu quan tâm nghiên cứu thực hiện trên cơ chất là bã đậu nành Việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ giống trong quá trình lên men bề mặt bã đậu nành cũng chưa được báo cáo trong các nghiên cứu khoa học được tìm thấy Tại Việt Nam, chưa ghi nhận được nghiên cứu nào

về lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto trên cơ chất bã đậu nành thu nhận enzyme

nattokinase Do đó, tôi chọn nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như thời gian

lên men, tỷ lệ giống, cơ chát bổ sung đối với quá trình lên men Bacillus subtilis natto trên

cơ chất bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase, đồng thời bước đầu thu nhận chế phẩm enzyme nattokinase thô, đề xuất quy trình thu nhận các chế phẩm enzyme nattokinase ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto do phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Hóa

thuộc trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp

- Bột đậu nành được tạo thành bằng cách sử dụng hạt đậu nành rang chín, xay mịn Bột đậu nành có độ ẩm 5,72% (theo khối lượng)

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.1 Các thiết bị và dụng cụ chính được sử dụng trong nghiên cứu

2.1.3 Hóa chất

Bảng 2.2 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nhân giống Bã đậu nành

- Thời gian lên men

(20h, 22h, 24h, 26h, 28h)

- Tỷ lệ giống Lên men (10%, 12%, 14%, 16%, 18%)

- Bổ sung bột đậu nành (10%, 20%, 30%, 40%)

Thử khả năng làm tan huyết khối

Khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng

2.2.1 Phương pháp xác định một số thành phần hóa học của bã đậu nành

- Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy mẫu đến khối lượng không đổi [10]

- Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet [3, 4]

- Xác định hàm lượng protein, tinh bột bằng cách gửi mẫu cho Trung tâm Tiêu chuẩn, Đo lường, Chất lượng tỉnh Quảng Ngãi

2.2.2 Phương pháp hoạt hóa và giữ giống [8]

Pha môi trường thạch- peptone thịt đun cho đồng nhất, thành phần môi trường như Phụ lục 1 Cho môi trường vào 1/4 - 1/3 ống nghiệm, nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường

ở 1210C, 1atm trong 20 phút Sau khi tiệt khuẩn xong, để ống thạch nghiêng cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn Thực hiện cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi trường mới theo hình chữ chi Ủ các ống nghiệm vào tủ ấm ở 370C trong 24h Bảo quản các ống giống ở nhiệt độ 4-50

C Thực hiện lặp lại việc cấy truyền 1-2 tháng/lần

2.2.3 Phương pháp nhân giống: [6]

Sử dụng sữa đậu nành làm môi trường nhân giống: hạt đậu nành ngâm nước với tỷ

lệ đậu nành: nước 1/5 trong 10-12 giờ, sau đó đem xay và lọc thu dịch lọc Cho 40ml môi trường vào bình nón nút kín Hấp tiệt trùng môi trường ở 1210

C, 1atm trong 20 phút Sau khi tiệt trùng, để môi trường nguội dưới 400C, cấy khuẩn lạc trong ống giống vào trong môi trường Tiến hành nuôi trên máy lắc ở tốc độ 180 vòng/phút, trong điều kiện 370

C

Để xác định thời gian nhân giống thích hợp, cần tiến hành xây dựng đường cong

sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis natto

Nguyên tắc xây dựng đường cong sinh trưởng: căn cứ số lượng tế bào phát triển theo thời gian ta xác định đường cong sinh trưởng bằng cách vẽ đồ thị với trục hoành là thời gian nuôi cấy, trục tung là số logarit của số lượng tế bào

2.2.4 Phương pháp xác định mật độ tế bào [11]

- Nguyên tắc: Số lượng Vi sinh vật trong mẫu được xác định bằng cách đếm trực

tiếp khuẩn lạc vi khuẩn

C

Sau khoảng 24h, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 0,1ml mẫu Chọn đĩa thạch có số lượng 30-300 khuẩn lạc Đếm tất cả các khuẩn lạc đơn lẻ nằm trên đĩa thạch, tránh đếm nhầm bọt khí và các hạt không hòa tan trên mặt thạch.

- Tính kết quả

Mật độ tế bào là:

Mi (CFU/ml) = Ai x Di/ V Trong đó: Ai: số lượng tế bào

Di: là độ pha loãng V: là dung dịch huyền phù tế bào (ml)

2.2.5 Phương pháp lên men [36]

- Sử dụng phương pháp lên men bề mặt trên môi trường rắn ở điều kiện nhiệt độ

370C theo quy trình lên men như Hình 2.2 Bã đậu nành được bổ sung nước đến độ ẩm 80% theo cách tính nêu tại Phụ lục 2 Bã đậu nành tiếp tục được hấp tiệt trùng ở 1210C, 1atm trong 30 phút Sau khi hấp xong, bã đậu nành được làm nguội đến nhiệt độ 36-390C trước khi lên men Môi trường lên men được đánh cho tơi xốp và phân phối vào các khay Giống được cho vào môi trường bã đậu nành với tỷ lệ nghiên cứu, đảo trộn môi trường lên men để phân tán đồng đều tế bào vi khuẩn trong môi trường Tiến hành lên men ở điều kiện 370

C, bề dày lớp cơ chất là 3cm trong thời gian nghiên cứu

Hình 2.2 Quy trình lên men bã đậu nành bằng phương pháp lên men bề mặt

Bổ sung nước

Để nguội (36-390C)

- Khảo sát 03 yếu tố đơn biến ảnh hưởng đến quá trình lên men gồm: thời gian lên men, tỷ lệ giống, tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung Mỗi yếu tố được khảo sát tại 5 giá trị

Các thí nghiệm được lặp lại 2 lần và kết quả được xử lý bằng phần mềm ANOVA

2.2.5.1 Khảo sát thời gian lên men

Để xác định thời gian lên men thích hợp thu enzyme có hoạt lực cao nhất, tiến hành lên men 05 mẫu với các thời gian lên men: 20h, 22h, 24h, 26h, 28h; mỗi mẫu gồm 02 thí nghiệm thực hiện với tỷ lệ giống 10% (v/w) Mẫu sau lên men được đo hoạt tính enzyme protease theo phương pháp trình bày tại phần 2.2.8 Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme

protease đo được tại các thí nghiệm, xác định thời gian lên men thích hợp

2.2.5.2 Khảo sát tỷ lệ giống

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto được nuôi cấy trong 5 mẫu, mỗi mẫu gồm 02 thí

nghiệm thực hiện lên men trong thời gian thích hợp đã được xác định tại mục 2.2.5.1 Các

tỷ lệ giống được khảo sát gồm: 10%, 12%, 14%, 16%, 18% (v/w) Sau khi lên men được

đo hoạt tính enzyme protease theo phương pháp trình bày tại phần 2.2.8 Dựa vào giá trị

hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí nghiệm, xác định tỷ lệ giống thích hợp

2.2.5.3 Khảo sát tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung

Nghiên cứu khảo sát bổ sung bột đậu nành vaò cơ chất bã đậu nành được xem xét thực hiện sau khi khảo sát các yếu tố thời gian lên men và tỷ lệ giống Bã đậu nành sau khi được hấp tiệt trùng, tiến hành bổ sung bột đậu nành theo các tỷ lệ: 10%, 20%, 30%, 40%, trộn đều, đánh cho tơi xốp và phân phối vào các khay lên men Giống vi khuẩn được cấy vào môi trường lên men với tỷ lệ thích hợp đã được xác định thí nghịệm tại mục 2.2.5.2 và lên men trong thời gian thích hợp đã được xác định tại mục 2.2.5.1 Sau khi lên men được đo hoạt tính enzyme protease theo phương pháp trình bày tại phần 2.2.8 Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí nghiệm, xác định tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung thích hợp

Sau khi thực hiện lên men khảo sát 03 yếu tố: thời gian lên men, tỷ lệ giống, tỷ lệ bột đậu nành bổ sung vào môi trường lên men như các mục 2.2.5.1, 2.2.5.2, 2.2.5.3, thu được các giá trị thích hợp làm điều kiện lên men để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

2.2.6 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô [36]

Hỗn hợp sau lên men được giữ ở nhiệt độ 40C trong 10 phút Thêm dần dần dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ 40C vào hỗn hợp sau lên men đồng thời khuấy đều, để yên trong 40 phút Tiến hành lọc và ly tâm 4000 vòng/phút, 20 phút để thu dịch chiết enzyme

thô

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thu nhận dịch chiết enzym nattokinase thô

2.2.7 Phương pháp kết tủa enzyme nattokinase bằng dung môi ethanol

96% [1]

- Nguyên tắc: Khi cho ethanol 96% vào dung dịch có chứa enzyme protease, khả

năng hòa tan của enzyme giảm dẫn đến sự kết tủa

2.2.8 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease [13]

Để xác định hoạt lực của enzyme nattokinase, người ta thường sử dụng 02 phương pháp phổ biến là: phương pháp giáng hóa fibrin và phương pháp thử casein (mục tiêu là protein) Tuy nhiên, vì phương pháp giáng hóa fibrin có chi phí cao, thời gian xác định lâu, do đó trong nghiên cứu này tôi sử dụng phương pháp Amano xác định hoạt độ enzyme protease phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm hiện có Theo các tài liệu tham khảo [1], hoạt lực enzyme nattokinase thay đổi tuyến tính với hoạt lực enzyme protease

Lọc (40

C)

Bã

Khuấy (40C, 40 phút) NaCl 0,9%

Bã đậu nành lên men

vòng/phút, 20 phút)

Dịch chiết enzyme thô

Điều này có nghĩa là, khi hoạt lực enzyme protease tăng thì hoạt lực enzyme nattokinase cũng tăng

- Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp Amano xác định hoạt độ enzyme protease

Phương pháp này dựa trên sự thủy phân casein bởi enzym protease có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic Định lượng acid amin được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm

do enzym xúc tác tạo nên

Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương tương với 100µg tyrosin trong 1µl dịch lọc ở điều kiện thí nghiệm

- Tiến hành:

Xây dựng đường chuẩn Tyrosin

Bảng 2.3 Bảng pha dung dịch xây dựng đường chuẩn tyrosine

Pha dung dịch tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90;

100 µg tyrosin/ml HCl 0,1M Tiếp tục thêm vào mỗi ống 5ml Na2CO3 0,4M và 1ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 370

C trong 20 phút

Đo độ hấp thụ A của dung dịch ở bước sóng 660nm

Ống số 0 là ống thử đối chứng, các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔA (ΔA = ATN – A0)

Tiến hành xác định mẫu

Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch cơ chất casein 1%, để ở 370

C trong 10-15 phút Sau đó, cho 1ml dung dịch mẫu và lắc đều Đem ủ hỗn hợp này ở 370C trong 60 phút Cho tiếp 2ml dung dịch acid trichloracetic 0,4M (TCA), để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa

Tiếp tục thêm vào 5ml Na2CO3 0,4M và 1ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, để ở 370C trong 20 phút, khi dung dịch xuất hiện màu xanh đo độ hấp thụ Am của dung dịch ở bước sóng 660nm

Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho dung dịch mẫu và tiến hành thí nghiệm như trên Đo độ hấp thụ A0 của dung dịch ở bước sóng 660nm

- Tính kết quả

Hàm lượng tyrosin được giải phóng do enzyme protease thủy phân được tính bằng cách lấy (Am - A0) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosin để xác định hoạt độ protease:

A0 : Độ hấp thụ của mẫu đối chứng;

n: Độ pha loãng của enzyme

F: Là lượng tyrosin có trong đường chuẩn (µg);

1/100: Hệ số chuyển đổi

3.2.9 Phương pháp sấy thăng hoa [12]

- Nguyên tắc: Loại bỏ ẩm bằng cách chuyển nước từ trạng thái rắn sang trạng thái

hơi Quá trình chuyển ẩm trong sấy thăng hoa thực hiện ở áp suất thấp nên các phân tử nước không va chạm vào nhau, giúp bảo toàn chất lượng sinh học của sản phẩm sấy

- Tiến hành: Dùng màng nhôm lót đều đĩa petri, tạo các cạnh cao để tránh enzyme

bị văng ra ngoài trong quá trình sấy Cho kết tủa enzyme vào đĩa petri đã lót màng nhôm

Dàn đều mẫu với bề dày khoảng 1-2 cm Lạnh đông kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp

(-150C đến -100C); sau đó cho mẫu vào thiết bị sấy thăng hoa Cho các đĩa ptetri vào các tầng đặt mẫu của thiết bị Quá trình sấy thực hiện ở nhiệt độ < 500

C trong thời gian 10-14 giờ Sản phẩm sau khi sấy được nghiền mịn, cho vào lọ kín và bảo quản