Nghiên cứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh học của các flavonoid từ cây an xoa helicteres hirsuta lour quảng nam

Trong đó, cây An xoa chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, do đó được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết các bộ phận của cây đều đượ

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

H Ồ THỊ HUYỀN TRÂN

CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.)

LU ẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT

Đà Nẵng – Năm 2018

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

H Ồ THỊ HUYỀN TRÂN

CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.)

L ỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các s ố liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công

b ố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác gi ả

H ồ Thị Huyền Trân

NGHIÊN C ỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HO ẠT TÍNH SINH HỌC

Học viên: Hồ Thị Huyền Trân Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã số: 60420201 Khóa: K32 Trường Đại Học Bách Khoa – ĐHĐN

Tóm t ắt

Cao chiết rễ cây an xoa được chiết xuất bằng dung môi methanol 40% theo phương pháp siêu âm điện cực ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 50 phút với tần số là 25 kHz cho hàm lượng flavonoid cao nhất có giá trị là 10,933 mgCE/g ± 0,101a Cao chiết

và dịch chiết có hoạt tính kháng oxy hóa tốt nhất với giá trị IC50 lần lượt là 271,900 µg/mL và 302,850 µg/mL Cao chiết rễ có khả năng kháng khuẩn với vòng kháng khuẩn là 20,667 mm ± 1,155a trên E coli và 16,667 mm ± 1,1528a trên Samonella ở

nồng độ 652 µg/ml An xoa có thể xem là nguồn thực vật tự nhiên đầy tiềm năng của các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn

T ừ khóa: An xoa, flavonoid, chiết xuất, kháng oxy hóa, kháng khuẩn

EXTRACTION AND DETERMINATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES

OF FLAVONOIDS FROM HELICTERES HIRSUTA LOUR QUANG NAM

Abstract

The Root of Helicteres hirsuta Lour was extracted with solvent of methanol

40% by electrodeposition ultrasonic at 60oC for 50 minutes with a frequency of 25 kHz show the highest flavonoid content of 10.933 mg/g ± 0.101a Extracts and extract solution have the best antioxidant activity with an IC50 value that are 271,900 μg/mL and 302,850 μg mL The roof extracts had antibacterial activity with zones of inhibition of 20,667mm ± 1,155a against E coli and 16,667mm ± 1,1528a against

Samonella at concentration 652 µg/ml

Helicteres hirsuta Lour can be regarded as promising candidates for natural plant

soures of antioxidant and antibacterial activities

Key words: Helicteres hirsuta Lour, flavonoid, extracts, antioxidants, antibacterial

M ỤC LỤC

M Ở ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

5 Cấu trúc luận văn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây An xoa 3

1.1.3 Công dụng của cây An xoa 4

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY AN XOA 4

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới 4

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước 5

1.3 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 6

1.3.1 Định nghĩa 6

1.3.2 Phân loại các hợp chất flavonoid 7

1.3.3 Phân bố flavonoid trong thực vật 10

1.3.4 Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoid 11

1.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID 13

1.4.1 Khái niệm phương pháp chiết tách 13

1.4.2 Phương pháp chiết tách các hợp chất flavonoid 14

1.4.3 Các phương pháp chiết tách bằng dung môi 15

1.4.4 Một số phương pháp chiết tách khác 16

1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH CHIẾT 18

1.5.1 Dung môi 18

1.5.2 Những yếu tố về kỹ thuật 18

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Thiết bị, hóa chất 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Xác định một số thành phần hóa học trong lá, thân và rễ cây An xoa 22

2.2.2 Phương pháp tách chiết và xác định hàm lượng flavonoid toàn phần 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY AN XOA 33

3.2 PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN CATECHIN 34

3.3 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN CÓ TRONG CÁC BỘ PHẬN KHÁC NHAU CỦA CÂY AN XOA 35

3.4 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 36

3.5 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT 37

3.6 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG QUÁ TRÌNH CHIẾT 38

3.6.1 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết 38

3.6.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết 39

3.6.3 Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid toàn phần trong quá trình chiết 40

3.7 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID TOÀN PHẦN TỪ RỄ CÂY AN XOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT RSM 41

3.8 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU 44

3.9 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CÓ TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY AN XOA 45

3.10 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG PHÂN BÀO TỪ CAO CHIẾT CỦA RỄ CÂY AN XOA 48

3.10.1 Đánh giá khả năng kháng khuẩn từ cao chiết của rễ cây An xoa 48

3.10.2 Đánh giá khả năng gây độc tế bào 49

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

QUY ẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (BẢN SAO)

OD : Optical Density - Mật độ quang

R/L : Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

SRB : Sulforhodamine B

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

V/v : Thể tích/thể tích

DANH M ỤC CÁC BẢNG

1.2 Độ nhớt và sức căng bề mặt của một số dung môi thường gặp ở nhiệt

2.1 Nhân tố và các mức độ bố trí thí nghiệm theo mô hình Box- behnken 272.2 Mô hình thí nghiệm tác động qua lại giữa các nhân tố 283.1 Một số thành phần hóa học có trong bột cây An xoa 333.2 Nhân tố và các mức độ bố trí thí nghiệm theo mô hình Box- behnken 413.3 Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ cây An xoa thu được

3.5 Phân tích phương sai (ANOVA) của phương trình hồi quy cho quá

3.6 Hàm lượng flavonoid toàn phần có trong dịch chiết và cao chiết 453.7

Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của dịch chiết rễ An xoa trong

dung môi methanol 40% có hỗ trợ bằng phương pháp siêu âm điện

cực

46

3.8

Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của cao chiết rễ An xoa trong

dung môi methanol 40% có hỗ trợ bằng phương pháp siêu âm điện

cực

47

3.9

Giá trị IC50 của dịch chiết và cao chiết từ rễ cây An xoa trong dung

môi methanol 40% bằng phương pháp siêu âm điện cực trong điều

kiện tối ưu

48

3.11 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào của cao chiết trên dòng tế bào ung thư Gan

DANH M ỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

S ố hiệu hình

2.3 Sơ đồ tinh sạch cao chiết flavonoid từ cây An xoa 30 3.1

Đồ thị phương trình đường chuẩn catechin A: Dung môi methanol 40%; B: Dung môi ethanol 40%; C: Dung môi chloroform 40%

35

3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các bộ phận khác nhau của

cây An xoa đến hàm lượng flavonoid toàn phần 36 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các phương pháp chiết khác

3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các dung môi chiết khác nhau

3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các thời gian chiết khác nhau

3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các tỷ lệ nguyên liệu/dung

môi chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần 39 3.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng các cường độ sóng siêu âm

chiết khác nhau đến hàm lượng flavonoid toàn phần 40 3.8 Biểu đồ chu tuyến 3D (A) và biểu đồ bề mặt 2D (B) xác

3.9

Các điều kiện tối ưu của quá trình chiết flavonoid toàn

phần từ rễ cây An xoa bằng phương pháp siêu âm điện

cực trong dung môi methanol 40%

44

M Ở ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây An xoa (hay còn gọi là cây thâu kén cái, thâu kén lông, tổ kén cái, dó lông)

có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour là một loài thực vật thuộc họ Trôm

(Sterculiaceae), là cây bụi, thân gỗ, mọc ở nơi đất ẩm, lá thường to bằng bàn tay, có lông, hoa có màu hồng hay đỏ, quả có hình như con sâu, có lông chạm vào thì ngứa [2]; [24] Cây phân bố chủ yếu ở Nam Trung Quốc, khu vực Nam Á và các nước Đông Nam Á như Lào, Indonesia, Campuchia, Thái Lan và Việt Nam Cây rất dễ trồng, sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiều điều kiện sinh thái Tại một số nước như Ấn Độ, Trung

Quốc, cây An xoa được sử dụng như một loại thuốc truyền thống để điều trị các bệnh như sốt rét và bệnh tiểu đường Trong đó, cây An xoa chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, do đó được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết các bộ phận của cây đều được sử dụng để trị bệnh… Cây An xoa được dùng trong những trường hợp người hay nhức mỏi, đau lưng, mất ngủ, da xanh, kể cả những người tim hay mệt cũng có thể cải thiện sức khỏe một cách hiệu quả [2]; [24] Lá cây An xoa có thể chữa trị được một số bệnh thường gặp như ung nhọt, sưng lở Phần rễ dùng làm dịu cơn đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm, đái dắt và làm thuốc tiêu độc [3] Ở Campuchia và ở tỉnh Bình Phước - Việt Nam, cây cũng được sử

dụng như một loại thuốc dân gian để điều trị các bệnh về gan

Hiện nay, tại Việt Nam cây An xoa được tìm thấy nhiều nơi ở các tỉnh giáp biên

giới Campuchia như Bình Phước và nhiều tỉnh miền Trung Trong đó, tỉnh Quảng Nam là một trong những nơi tìm thấy nhiều cây An xoa, cây mọc hoang và chưa được

trồng phổ biến Tại huyện Phú Ninh cây cũng được tìm thấy nhiều nhưng chưa được

trồng và sử dụng rộng rãi để làm thuốc

Trên thế giới, cũng có một số công trình nghiên cứu đã xác định được trong cây

An xoa chứa các chất có hoạt tính sinh học có tác dụng chữa được một số bệnh Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về cây An xoa vẫn còn hạn chế và chưa thực sự được quan tâm nhiều, chỉ được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền, chưa ứng dụng nhiều vào công nghệ dược phẩm để chữa bệnh Với những tác dụng to lớn của loài cây này, đồng

thời nhằm tìm hiểu để ứng dụng vào dược phẩm và các loại thực phẩm chức năng chúng tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và xác định hoạt tính sinh

h ọc của các flavonoid từ cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Quảng Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng quy trình tách chiết để thu được dịch chiết và cao chiết có chứa hàm lượng flavonoid toàn phần cao nhất từ cây An xoa

- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, và hoạt tính gây độc

tế bào từ cao chiết

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Các bộ phận của cây An xoa (thân, lá, rễ) được thu hái tại huyện Phú Ninh - tỉnh

Quảng Nam, Việt Nam

- Cao chiết từ cây An xoa là nguồn sử dụng tạo ra sản phẩm mới có giá trị dược

liệu cao, góp phần đa dạng hóa sản phẩm và nâng cao giá trị chữa bệnh từ cây An xoa

5 Cấu trúc luận văn

Ngoài phần mở đầu, kết luận và kiến nghị, danh mục tài liệu tham khảo và phụ

lục, trong luận văn gồm có các chương với nội dung như sau:

- Chương 1: Tổng quan tài liệu

- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

- Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)

Cây An xoa có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour., được biết đến với nhiều tên

gọi khác nhau như: cây dó lông, tổ kén lông, thâu kén lông, thâu kén cái [6]

1.1.2 Đặc điểm hình thái của cây An xoa

Cây An xoa là cây thân bụi, cao từ 1 - 3m, nhánh hình trụ, có lông Lá hình trái xoan, dài 5 - 17cm, rộng 2,5 - 7,5cm Gốc cụt hay hình tim, đầu thon dài thành mủi

nhọn Mép có răng không đều Mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao, gân gốc 5cm, cuống lá dài 0,8 - 4cm, có lông, dễ rụng Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có khớp và có lá bắc dễ

rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5 răng, cánh hoa 5, cuống bộ

nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu có nhiều gợn, chứa 25 - 30 màu trong

mỗi lá noãn Quả nang hình trụ nhọn, hạt nhiều hình lăng trụ Ra hoa kết quả từ mùa

hạ đến mùa đông [2]; [6]

Cây An xoa mọc phổ biến từ Bắc vào Nam, mọc phổ biến trong rừng thưa, ven

rừng, trên các bãi hoang, đồi cỏ, ở độ cao từ thấp lên đến 1500m Ra hoa kết trái gần

như quanh năm Riêng tại Lộc Ninh (Bình Phước) và Tân Uyên (Bình Dương) cây thường mọc vùng đất cát, đất xám Sống dưới tán cây rừng, cây khộp, rừng bụi, vùng ven suối, trên đất hoang Mùa khô mọc ít lá, hoa nở nhiều từ tháng 4 - 5 Hiện nay cây

An xoa được dùng như một loại thuốc dân gian chữa được nhiều loại bệnh

1.1.3 Công dụng của cây An xoa

Cây An xoa chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, do đó được sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết các bộ

phận của cây đều được sử dụng Cây An xoa được dùng trong những trường hợp người hay nhức mỏi, đau lưng, mất ngủ, da xanh, kể cả những người tim hay mệt cũng có thể

cải thiện sức khỏe một cách hiệu quả [25] Các bộ phận của cây An xoa dùng để chữa

bệnh về gan [2] Lá có thể chữa trị được một số bệnh thường gặp như ung nhọt, sưng

lở Phần rễ dùng làm dịu cơn đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm, đái dắt và làm thuốc tiêu độc [3] Hiện nay, cây được sử dụng phổ biến như một loại thuốc dân gian dùng

để chữa ung thư gan

1.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 2005, Young - Won Chin và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hợp chất lignan gây độc tế bào từ bộ phận thân của cây An xoa Nghiên cứu đã thành công trong

việc cô lập và xác định sáu lignan, sau đó đánh giá các hiệu ứng độc tế bào của chúng đối với một bảng nhỏ các đường tế bào ung thư ở người, cụ thể là (±)-pinoresinol, (±)-medioresinol, (±)-syringaresinol, (-)-boehmenan, (-)-boehmenan H và (±)-trans-dihydrodiconiferyl alcohol Trong số những phân lập này, (±)-pinoresinol có tác dụng gây độc mạnh khi đánh giá trên một bảng nhỏ có các dòng tế bào ung thư [17]

Năm 2014, Jain và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá hàm lượng flavonoid cũng

như hoạt tính chống oxy hoá của cây Helicteres isora Lour Trong nghiên cứu này,

bốn loại dung môi nước, ethanol, methanol, và axeton được sử dụng trong quá trình tách chiết từ các bộ phận khác nhau của cây Helicters isora Lour Trong đó methanol

đã được chứng minh là dung môi tốt nhất để chiết xuất các hợp chất flavonoid và chất

chống oxy hoá Nghiên cứu này chứng minh được hoạt tính kháng oxy hóa của chiết

xuất thô từ lá khô, rễ khô, quả tươi phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng flavonoid từ đó ứng dụng trong việc phát triển sản xuất các loại thuốc thảo dược [20]

Năm 2015, Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết xuất lên tính chất hóa lý và hoạt tính chống oxy hóa của lá cây An xoa Nghiên cứu này cho thấy các đặc tính vật lý, hóa học và chống oxy hóa của lá cây An xoa đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi các dung môi Trong số các dung môi như acetonitril, ethanol, methanol, ethyl acetate thì methanol là dung môi thích hợp nhất để tách chiết flavonoid [24]

Năm 2016, Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã nghiên cứu cho thấy các loại

dung môi khác nhau có tác động đáng kể đến hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học

và hoạt tính chống oxy hoá từ thân cây An xoa Qua quá trình nghiên cứu cho thấy nước là một dung môi an toàn, rẻ tiền và thân thiện với môi trường được lựa chọn để chiết xuất các hợp chất flavonoid Các hợp chất flavonoid ảnh hưởng đến khả năng

chống oxy hoá của chiết xuất từ thân cây Helicteres hirsuta Lour [24]

Năm 2017, nhằm mục đích tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất thông thường để đạt được hàm lượng flavonoid và hoạt tính chống oxy hoá cao nhất trong cây nên

Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã tiếp tục tiến hành nghiên cứu về cây An xoa Phương pháp quy hoạch thực nghiệm được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của thời gian chiết, nhiệt độ, và tỷ lệ mẫu đến dung môi đối với hoạt tính các hợp chất sinh học

và khả năng chống oxy hoá của cây An xoa Kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu với dung môi

tác động mạnh nhất lên hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hoá của Helicteres hirsuta Lour và các điều kiện chiết tối ưu bao gồm nhiệt độ 600C, thời gian 35 phút ở

tỷ lệ mẫu/dung môi 1:100g/ml bằng 40% (V/v) methanol làm dung môi Trong các điều kiện này, hàm lượng flavonoid cao nhất là 17,55mg CE/g, cao hơn đáng kể so với các giá trị thu được khi sử dụng nước làm dung môi [25]

Năm 2018, Phạm Hồng Ngọc Thúy và cộng sự đã tiến hành khảo sát các đặc tính kháng khuẩn và chống ung thư trong ống nghiệm của chất chiết xuất từ lá và thân của cây An xoa thông qua hai phân đoạn của chúng (phân đoạn butanol chứa saponin ở

dạng lỏng và phân đoạn cô đặc saponin) đã được chứng minh Các xét nghiệm MTT

và CCK-8 được sử dụng để đánh giá các đặc tính chống ung thư trong ống nghiệm đối

với các dòng tế bào ung thư khác nhau Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá bằng phương pháp khuyếch tán đĩa và xác định các giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Kết quả cho thấy các phân đoạn giàu saponin từ lá và thân của cây H hirsuta có hoạt

tính kháng khuẩn cao nhất chống lại vi khuẩn E coli (giá trị MIC 2,50 và 5,00 mg/ml)

và S lugdunensis (giá trị MIC 0,35 và 0,50 mg/mL, tương ứng) Quan trọng hơn,

những phân đoạn giàu saponin này có hoạt tính chống ung thư mạnh trong ống nghiệm đối với một loạt các dòng tế bào ung thư bao gồm MIA PaCa-2 (Tuyến tụy); A2780 (Buồng trứng); H460 (Phổi); A431 (Da); Du145 (Tuyến tiền liệt); HT29 (Đại tràng); MCF-7 (Vú); SJ-G2, U87, SMA (Glioblastoma) và BE2-C (Neuroblastoma) ở liều

thấp (giá trị GI50 0,36-11,17 µg/ml) Nhóm nghiên cứu cho biết hoạt tính chống ung thư tuyến tụy trong ống nghiệm chống lại được các tế bào MIA PaCa-2, BxPC-3 và CFPAC-1 với giá trị IC50 là 1,80-6,43 µg/ml Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng khoa học về hoạt tính gây độc tế bào của chất chiết xuất từ lá và thân cây Helicteres hirsuta và đề xuất các nghiên cứu sâu hơn để phân lập các hợp chất có hoạt tính để phát triển các tác nhân chống ung thư mới từ các chất chiết xuất của cây [29]

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2016, Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước đã thu mẫu thân, lá và hoa

của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) tại Hòn Sơn thuộc xã Lại Sơn, huyện Kiên

Hải, Tỉnh Kiên Giang để tiến hành thí nghiệm Bột khô của cây an xoa được ngâm

dầm trong ethanol 96% trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó lọc và cô quay thu được cao ethanol Cao ethanol được chiết lần lượt với các dung môi petroleum ether (PE), dicloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH) và thu được bốn cao phân đoạn tương ứng Các cao chiết sau đó được gởi tại Phòng Sinh học Thực nghiệm -

Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để khảo sát hoạt tính gây độc trên dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan), được thực hiện theo phương pháp của Skehan (1990) và Likhiwitayawuid (1993) hiện đang được áp dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia của Mỹ (NCI) và trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ Kết quả có hai cao biểu hiện hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2

là cao PE và cao DC Từ cao DC đã cô lập được 4 hợp chất: stigmasterol, lupeol, apigenin và tiliroside Cấu trúc hóa học các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) [3]

Năm 2017, Lê Thị Hải Yến và cộng sự tiếp tục nghiên cứu tác dụng giảm đau và

chống viêm trên chuột nhắt trắng từ các chất chiết xuất của cây Helicteres hirsuta

Lour Tác dụng giảm đau khi nghiên cứu trên máy đo ngưỡng đau và trên mô hình mâm nóng ở chuột nhắt trắng dùng ở liều 24 g/kg/ngày (liều tương đương lâm sàng)

uống trong 5 ngày liên tục Ngoài ra, khi sử dụng liều 72 g/kg/ngày (gấp 3 liều lâm sàng) uống trong 5 ngày liên tục có tác dụng chống viêm cấp ở chuột nhắt trắng trên

mô hình gây phù chân chuột, thể hiện rõ ở các thời điểm sau gây viêm 2 và 4 giờ [15] Năm 2018, từ hoạt tính kháng tế bào ung thư gan khá cao của nghiên cứu trước

đó cũng như các công dụng chữa bệnh về gan trong các bài thuốc trong dân gian Việt Nam của cây an xoa, Nguyễn Hữu Duyên, Lê Thanh Phước và Nguyễn Văn Ky tiếp

tục tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của cây an xoa nhằm góp phần giải thích

rõ ràng hơn công dụng chữa bệnh của loài thảo dược này Từ 200g cao tổng (ethanol)

tiến hành tách phân đoạn bằng kỹ thuật phân bố lỏng - lỏng thu được 20,85g cao dichloromethan Từ 8g cao dichloromethan tiến hành sắc ký cột pha thường và phân

lập được 2 hợp chất HD07 và HD10d Dựa vào số liệu phổ 1D, 2D-NMR, MS và đối chiếu với các tài liệu tham khảo đã nhận danh được 2 hợp chất HD07 và HD10d lần lượt là: α-p-hydroxy truxillic acid và 7,4'-di-O-methyl-8-O-sulphat isoscutellarein [16]

1.3 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID

1.3.1 Định nghĩa

Flavonoid là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon là nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong thực vật (hình 1.1) Phần lớn các flavonoid có màu vàng nhạt, một số có màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu [19]

Hình 1.2 C ấu trúc của flavonoid

1.3.2 Phân loại các hợp chất flavonoid

Phân loại flavonoid: Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl

(vòng B) và các mức độ oxy hoá của mạch 3C Flavonoid được phân loại: euflavonoid

là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, neoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4, (hình 1.2) Ngoài ra, còn phân biệt biflavonoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc lignan [19]

Euflavonoid Isoflavonoid Neoflavonoid

Hình 1.3 Phân lo ại flavonoid

- Euflavonoid: gồm các nhóm anthocyanidin, flavan, flavan 3-ol, flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, flavanon, 3-hydroxy flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron [19]

- Anthocyanidin: hay 2 phenylbenzopyrilium đây cũng là sắc tố phổ biến trong thực vật Trong cây các sắc tố này đều ở dạng glycoside (anthocyanin) nằm trong dịch tế bào Khi đun anthocyanin trong dung dịch HCl 20% thì phần đường trong phân

tử (thường nối vào OH ở C-3) bị cắt và cho phần aglycon được gọi là anthocyanidin Ở trong dung dịch acid (pH 1 - 4) tạo muối có màu đỏ, ở môi trường kiềm (pH>6) là anion cũng tạo được muối với các chất kiềm có màu xanh Dung dịch anthocyanidin mất màu bởi bisulfit kiềm và dễ bị oxi hóa nên ít được dùng làm phẩm màu [19]; [12]

Hình 1.4 C ấu trúc của anthocyanidin

- Flavan 3-ol: tùy theo các nhóm thế đính vào 2 vòng A và B mà có những dẫn chất flavan 3-ol khác nhau Catechin, gallocatechin và những đồng phân của chúng là những dẫn chất của flavan 3-ol nhiều trong thực vật như lá chè Các chất catechin và gallocatechin có công thức như sau:

Hình 1.5 C ấu trúc của Catechin và Gallocatechin

Người ta thường gặp những dẫn chất của flavan 3-ol ở dạng dimer, trimer,

tetramer, pentamer và được gọi là tannin, thường có trong loại trà Camellia sinensis

CV viridis [12]

Flavan 3,4-diol: các dẫn chất flavan 3,4-diol đều không màu, có tính quang hoạt, khi đun sôi với acid thì dễ chuyển thành anthocyanidin có màu đỏ Vì dễ bị oxi hóa và trùng hợp nên việc phân lập chất tinh khiết gặp khó khăn Phần lớn chúng thường ở dạng dimmer Các đơn phân được xác định bằng cách chuyển thành các dẫn chất anthocyanidin tương ứng [12]

Hình 1.6 C ấu trúc của flavan 3,4-diol

Flavanon: flavanon là những chất không màu nhưng khi làm phản ứng cyaniding thì cho màu rõ hơn flavon, ngoài ra flavanon có điểm chảy thấp hơn flavon tương ứng, dựa vào đây có thể sơ bộ nhận biết Nhóm này thường có nhiều trong cây cam thảo (liquiritin và isoliquiritin) Hesperidin, naringin là những flavanon gặp nhiều

trong một số vỏ cây Citrus Naringin có vị đắng bằng 1/5 quinin, tuy nhiên aglycon thì

không đắng ngoài ra nếu thay đường neohesperidose bằng đường rutinose thì lại mất

vị đắng Nếu mở vòng C của naringin để tạo thành chalcon rồi hydrogen hóa tạo thành dihydro chalcon thì dẫn chất này có vị ngọt bằng saccharin [8]; [12]

Hình 1.7 M ột số chất flavanon có trong thực vật

3- Hydroxyflavanon (dihydroflavanol = flavanonol): có 2 carbon bất đối ở C2 và

C3 Phần lớn dihyroflavonol ở dạng aglycon, cũng có một số ở dạng glycoside Dihydroflavonol khó phân lập vì kém bền, dễ bị oxi hóa Trong đó có dẫn chất của taxifolin hay gặp nhất [12]

Flavon: có cấu trúc 2 vòng benzen A và B, với vòng B gắn vào vòng C (pyran)

tại vị trí C2, có nối đôi ở vị trí 2-3 Các dẫn chất flavon rất phổ biến trong thực vật, kết tinh không màu đến vàng nhạt Chỉ tính đến các flavon có nhóm thế OH hoặc OCH3 đã

có tới hơn 300 chất Chất flavon đơn giản nhất không có nhóm thế đã được phân lập từ cây anh thảo (Primula) Hai flavon hay gặp nhất trong cây là apigenin và lutelin [12]

Flavonol (flavon 3-ol): khác với flavon thì flavonol có thêm nhóm OH ở C3 Flavonol kết tinh màu vàng nhạt đến vàng Những dẫn chất flavonol rất phổ biến trong

thực vật, đặc biệt là hành, hoa hòe, lúa mạch, rau nghễ, diếp cá Cho đến năm 1992 đã

có tới 380 chất flavonol có nhóm thế hydroxyl và hoặc methoxyl đã được biết tới Các

chất thường gặp ở thực vật: kaempferol, quercetin, myricetin [12]

Hình 1.8 C ấu trúc của flavonol

Chalcon: có 2 vòng A và B nối với nhau bởi một mạch hở 3C không có dị vòng

C như các flavonoid khác Đây là những chất có màu vàng đến vàng cam Chalcon có

chủ yếu trong một số hoa thuộc họ Cúc (Asteraceae) Để nhận biết chalcon có thể

dùng hơi ammoniac hoặc khói kiềm của thuốc lá, màu sẽ chuyển sang đỏ cam hoặc

cam đỏ hay đỏ Chalcon cũng có thể ở trong các bộ phận khác như vỏ, lá, rễ, quả (ví

dụ: isoliquiritigenin trong rễ cam thảo) [12]

Dihydrochalcon: các chất này ít gặp trong tự nhiên Ví dụ như phloridin có trong

một loài Malus, chất này có độc tính ngăn sự hấp thu glucose ở ruột non và ngăn sự tái hấp thu glucose ở tiểu quản thận Một số dihydrochalcon có vị rất ngọt ví dụ như neohesperidosid có vị ngọt gấp 2000 lần đường mía [12]

Hình 1.9 C ấu trúc của dihydrochalcon

flavonoids khác nhưng dị vòng C có 5 cạnh Số lượng cũng như sự phân bố trong cây cũng bị

hạn chế Chất điển hình là auresidin gặp phổ biến trong hoa của một số họ: Asteraceae, Scrophulariaceae, Plumbaginaceae, Oxalidaceae và ở dạng 4- glucosid hay 6-glucosid [12]

Isoflavonoid: Các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-3, gồm nhiều nhóm khác nhau như isoflavan, isoflava-3-ene, isoflavan 4-ol, isoflavanon; isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon,

các chất này thường gặp trong các cây họ đậu (Fabaceae)

+ Isoflavan: glabridin là một thành phần flavonoid gặp trong rễ cam thảo

+ Isoflavan-3-ene: flabren có trong cam thảo

+ Isoflavon: là nhóm lớn nhất của isoflavonoid Hiện nay, hơn 364 chất đã được

xác định, chúng có nhiều tác dụng trong y học thường gặp trong các họ Rosaceae, Amaranthaceae, Iridacea, ví dụ daizein trong sắn dây, forrmonometin trong cam thảo [8]; [12]

Rotenoid: cho đến nay hơn 75 chất thuộc nhóm chất này đã được phân lập và xác định được cấu trúc Cấu trúc của nhóm rotenoid là C6-C4-C6 vì có thêm 1C do oxy hóa đóng vòng Điển hình là rotenon có tác dụng diệt sâu bọ

Neoflavonoid: các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C-4, gồm nhóm chất có khung arylchroman và 4-aryl coumarin, các chất này chỉ có giới hạn trong một số loài thực

4-vật [12]

1.3.3 Phân bố flavonoid trong thực vật

Flavonoid ít gặp trong thực vật bậc thấp Tuy nhiên, một số nghiên cứu về ngành rêu và dương xỉ cho thấy có sự xuất hiện của các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon,

flavonol, chalcon, dihydrochalcon

Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavonoid cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon,

flavonol, isoflavon Nét đặc trưng của ngành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và ngành hạt kín là sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid

Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm Có rất nhiều họ

chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid, tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho

một số họ khác nhau chứa các loại flavonoid khác

Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có

flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Orchidaceae, Poaceae

Hàm lượng và thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc Cây mọc

ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn cây mọc ở nơi thiếu ánh sáng [19]; [12]

1.3.4 Hoạt tính sinh học của các hợp chất flavonoid

1.3.4.1 Tác dụng của flavonoid đối với đời sống của thực vật

Các nhóm phenol trong flavonoid có tác dụng hòa tan các chất để có thể di chuyển dễ dàng qua màng sinh học Flavonoid có tác dụng như chất chống oxy hóa, bảo vệ acid ascorbic - một thành phần quan trọng trong tế bào; ức chế các enzyme và các chất độc của cây [12]

Nhờ vai trò của các nhóm chức hydroxyl, flavonoid có tác dụng ức chế và kích thích sinh trưởng cây Ví dụ đã có nghiên cứu cho thấy ở cây ổi, các flavonoid có nhóm OH ở vị trí số 4’ làm tăng cường hoạt tính của enzyme trong khi các flavonoid

có nhóm OH ở vị trí 3’ lại có tính ức chế Ngoài ra flavonoid còn tham gia vào sự hô hấp, quang hợp [12]

Flavonoid còn là một chất màu nên nó góp phần tạo màu sắc hấp dẫn cho bộ phận nào đó của cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và sự phát triển của hoa quả Với hệ thống thị giác đặc biệt, sâu bọ rất nhạy cảm với các màu sắc tự nhiên mà chúng có vai trò thụ phấn, dụ các côn trùng có lợi để diệt các côn trùng có hại bảo vệ cây và phát tán hạt giống cho cây Nhóm các flavonoid tạo màu cho cây là: flavon, flavonol, auron, chalcon cho màu vàng, còn các chất thuộc nhóm anthocyanine cho các

màu hồng, đỏ, tím hoặc xanh thẫm [12]

Với một số flavonoid không màu thường có trong lá đóng vai trò như một chất bảo vệ cây Vị đắng và khó chịu của flavonoid làm cho động vật khi ăn mất cảm giác ngon và không thích ăn các loại cây cỏ này Quercetin với nồng độ rất thấp đã có cảm giác mất ngon, nhưng với liều 0,2% sẽ ức chế sự bài tiết nước bọt [19]

1.3.4.2 Tác dụng sinh học

Flavonoid có tác dụng sinh học rất đa dạng, phong phú Một trong những cơ chế sinh học của flavonoid đóng vai trò quan trọng, quyết định hoạt tính sinh học của chúng là tác dụng chống oxy hóa (antioxydant), flavonoid có thể triệt tiêu các gốc tự

do có hại sinh ra trong quá trình sinh lý bệnh lý, giúp cơ thể động vật và người phòng

chống bệnh [19]

+ Tác dụng chống oxy hóa của flavonoid: các dẫn chất flavonoid có khả năng

dập tắt các gốc tự do như HO˙, ROO˙ Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hoá Khả năng dập tắt các gốc

tự do của một số flavonoid theo thứ tự: myricetin> quercetin> rhammetin> morin> diosmetin> naringenin> apigenin> catechin> 5,7 dihydroxy-3', 4', 5' trimethoxy flavon> robinin> kaempferol> flavon [19]

Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa Các flavonoid có 3,5,3’,4’ hydroxyl có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonyl hoặc 3’,4’ orthodioxyphenol [19]

Thành phần của màng tế bào có các chất lipid dễ bị peroxyd hóa, tạo ra các sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất dẫn đến sự hủy hoại tế bào Đưa các chất chống oxi hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có thể ngăn ngừa các nguy cơ như

xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu, lão hóa, tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan… [19]

+ Tác dụng đối với enzyme: flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong

quá trình hoạt động của enzyme oxi hóa - khử Flavonoid còn ức chế các tác động của hyaluronidase Enzyme này làm tăng tính thấm của mao mạch Khi enzyme này thừa thì gây xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P Các chế phẩm của flavonoid chiết từ các loài Citrus như “Cemaflavone”, “Circularine”…, flavonoid từ lá bạc hà như “Daflon”, “Diosmil”, flavonoid từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dược khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính dòn và tính thấm của mao mạch Tác dụng này được hợp lực với acid ascorbic Các dẫn chất anthocyanosid

có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng làm tăng thị lực vào ban đêm [19]

+ Tác dụng chống độc: tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm tổn

thương gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc được đưa vào cơ thể động vật thí nghiệm (CCl4, benzen, ethanol, CHCl3, quinin…) dưới tác dụng của flavonoid ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan Một số dược liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan rất hiệu quả như: cây

actisô, cây Silibum marianum Gaertn, cây bụt dấm Hibiscus sabdariffa [19]

Tác dụng kích thích tiết mật thể hiện ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon, flavonol và flavan-3-ol

+ Tác dụng kháng sinh, chống viêm: flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt

những cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản…) Ví dụ apigenin có tác dụng làm

giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, acetylcholin, seretonin [19]

Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon Flavonol

thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt Scoparosid trong Sarothamnus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capitata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoid của cây râu mèo đều có tác dụng thông tiểu [12]

Tác dụng chống viêm loét của flavanon và chalcon glycosid của rễ cam thảo đã

được ứng dụng để chữa đau dạ dày Một số dẫn chất khác như catechin,

3-O-methylcatechin, cũng đã được thử và thấy có tác dụng chống loét [19]

Các flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavanon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan-3-ol, chalcon, isoflavon, biflavon, 4-aryl coumarin đã được chứng minh có tác dụng ức chế con đường sinh tổng hợp prostagladin Ngoài ra, các chất như rutin, quercetin, catechin, còn được dùng để điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương và màng nhày trong trường hợp xạ trị [19]; [12]

+ Tác dụng trong hệ tim mạch: trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm

flavonol, flavan-3-ol, anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelargonin, hỗn hợp catechin của chè có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích phút của tim [19]

+ Tác dụng trên hệ thần kinh: trên hệ thần kinh, một số C-flavon glycosid của

hạt táo có tác dụng an thần rõ rệt Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, eucopelargonidin, leucodelphinidin và tác

dụng kháng HIV của một số dẫn chất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin-7-O-βD-galactopyranosid [19]

-Cao chiết từ lá cây bạch quả - Ginko biloba chứa các dẫn chất 3-rutinosid của

kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược ví dụ

"Ginkogink", "Tanakan" có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch

và mao mạch Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc bằng trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt [19] Một số C-

flavon glycosid của hạt táo Ziziphus vulgaris var spinosus (chứa spinosin, swertisin và

các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng an thần [12]

+ Tác dụng chống ung thư và HIV: leucocyanidin, leucopelargonidin,

leucodelphinidin có tác dụng chống ung thư; và một số dẫn chất thuộc nhóm flavon

như chrysin, acacetin 7-O-β-D-galactopyranosid có tác dụng kháng HIV [12]

1.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID

1.4.1 Khái niệm phương pháp chiết tách

Phương pháp chiết tách là phương pháp tách một hay một số chất ra khỏi nguyên

liệu dựa vào đặc tính của chất cần chiết và dung môi Dung môi phân cực sẽ tách được

chất phân cực còn dung môi không phân cực sẽ tách chất không phân cực Khi nguyên

liệu và dung môi tiếp xúc với nhau, lúc đầu dung môi thấm vào nguyên liệu, sau đó hòa tan những chất có trong tế bào nguyên liệu rồi được khuyếch tán ra ngoài tế bào

Sản phẩm thu được của quá trình chiết là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi, dung dịch này gọi là dịch chiết [8]

1.4.2 Phương pháp chiết tách các hợp chất flavonoid

1.4.2.1 Nguyên tắc lựa chọn dung môi

Dung môi dùng để chiết các hợp chất ra khỏi nguyên liệu rất đa dạng và thay đổi tùy theo bản chất của mỗi loại nguyên liệu Cơ sở để lựa chọn một dung môi chiết xuất

là tính phân cực của hợp chất tự nhiên chứa trong nguyên liệu và dung môi

Dung môi có thể chia thành hai loại: phân cực và không phân cực, độ phân cực được tính bằng hằng số điện môi Hằng số điện môi của dung môi phản ánh sơ bộ tính phân cực của dung môi Tính phân cực của nước được lấy làm chuẩn, ở 200C, hằng số điện môi là 80 [7]

B ảng 1.1 Tính chất lý học của các dung môi

+ Có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu)

+ Không độc, không dễ bốc cháy

+ Có độ nhớt kém để không làm cản trở quá trình khuyếch tán

+ Các dung môi cần có độ tinh khiết nhất định để không làm ảnh hưởng đến hiệu

quả và chất lượng của dịch chiết

1.4.2.2 Chiết tách flavonoid

Các flavonoid có độ hòa tan khác nhau tùy theo số nhóm hydroxy và các nhóm

thế khác có trong cấu trúc hóa học, nên rất khó có một phương pháp chung để trích ly flavonoid ra khỏi cây Tuy nhiên, có một số nguyên tắc chung để chiết tách như sau: Flavonoid ở hầu hết bộ phận của cây: rễ, gỗ, lá, hoa, quả, hạt, sáp Trường hợp chiết ở lớp sáp bên ngoài lá thì dùng dung môi rửa lấy sáp Các bộ phận khác nói

chung là sấy khô, tán bột Cần lưu ý, các enzyme có thể thủy phân glycozit Vì vậy nếu

muốn chiết dạng glycozit thì ổn định dược liệu trước khi sấy bằng cách nhúng dược

liệu tươi vào cồn hoặc nước đun sôi

Nói chung các glycozit có độ phân cực mạnh hơn các aglycon tương ứng Đối

với các aglycon thì isoflavon, flavanon, dihydroflavonol và các flavon, flavonol có nhiều nhóm metoxy, ít nhóm hydroxy đều là những chất cực yếu Để chiết chúng, dùng các dung môi phân cực yếu như benzen, chloroform, etylaxetat Một số có thể tan một phần trong ete dầu

Các flavon và flavonol có nhiều OH, các biflavon, auron, chalcon và glycozit đều

là chất phân cực mạnh Có thể chiết chúng bằng cồn, nước riêng hoặc hỗn hợp Dung môi có thể áp dụng cho hầu hết flavonoid là dung dịch cồn (EtOH, MeOH)

Chiết bằng nước nóng áp dụng tốt đối với polyglycozit và các antoxyanin Đối

với antoxyanin, nên cho thêm lượng nhỏ HCl vào nước chiết nóng dưới dạng clorua, vì chúng khá bền vững với nhiệt độ

Flavonoid do có các nhóm OH phenol, chúng tan được trong kiềm Lợi dụng tính

chất này có thể chiết chúng bằng dung dịch kiềm loãng, nước vôi Sau đó axit hóa dịch chiết để kết tủa flavonoid hoặc tách ra bằng dung môi hữu cơ ở môi trường axit

1.4.3 Các phương pháp chiết tách bằng dung môi

1.4.3.1 Phương pháp ngấm kiệt

Sau khi chuẩn bị nguyên liệu, ngâm nguyên liệu vào dung môi trong bình ngấm

kiệt Sau một khoảng thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời

bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp nguyên liệu nằm yên (không được khuấy trộn) Có hai loại ngấm kiệt là ngấm

kiệt đơn giản và ngấm kiệt phân đoạn (tái ngấm kiệt)

Ưu điểm của phương pháp này là nguyên liệu được chiết kiệt

Nhược điểm là năng suất thấp, lao động thủ công, cách tiến hành phức tạp hơn so

với phương pháp ngâm, tốn dung môi đối với phương pháp ngấm kiệt đơn giản [8]

có thể ngâm tĩnh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc ngâm lạnh, ngâm một lần hoặc nhiều lần

Cách ngâm nóng nguyên liệu trong dung môi được gọi là chưng ninh Hay nói cách khác chưng ninh là kỹ thuật sắc thuốc cổ truyền nhưng có sử dụng thiết bị chuyên

dụng để hồi lưu nhằm tránh tổn thất dung môi Thiết bị chưng ninh hiện đại có thể điều

chỉnh được áp suất của quá trình chiết

Ưu điểm của phương pháp là đơn giản, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền Nhược điểm của phương pháp ngâm là năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu), nếu chỉ một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu, nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết [8]

1.4.3.3 Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm

Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuyếch tán chất tan Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được

sử dụng trong chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển, khi đó người ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để để quá trình chiết được nhanh hơn Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu Do khả năng xuyên sâu kém nên việc sử dụng thường ở quy mô phòng thí nghiệm [12]

1.4.4 Một số phương pháp chiết tách khác

Các phương pháp chiết tách mới mang lại nhiều ưu điểm đáng kể như: giảm lượng dung môi sử dụng, giảm chất thải, độ chọn lọc cao, dễ thu hồi, giảm thời gian tách chiết, an toàn, hiệu quả, dễ tự động

1.4.4.1 Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng

Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời hai tác động: sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường Cả hai tác động này làm sinh nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và

hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống

Trong chiết xuất, khi chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan

giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa tan đơn giản Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn [19]

1.4.4.2 Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn

Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi Tuy nhiên,

nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một

áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một chất lỏng đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng

Điểm mà một chất chuyển từ trạng thái hơi sang trạng thái lỏng này được gọi là điểm tới hạn của chất đó Do mang cả đặc tính của chất khí và chất lỏng nên chất lỏng quá tới hạn có khả năng hòa tan các chất, đồng thời chất lỏng này có độ nhớt thấp và

khả năng khuyếch tán cao nên được ứng dụng vào chiết xuất các chất trong dược liệu Các đặc tính của chất lỏng quá tới hạn phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất thay đổi các điều kiện này sẽ làm thay đổi đặc tính của chất lỏng quá tới hạn [19]

1.4.4.3 Chiết dưới áp suất cao

Một kỹ thuật chiết hiện đại cũng được sử dụng là chiết dưới áp suất cao Khả năng hòa tan của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giảm thời gian chiết

Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn

của nó là nhiệt độ sôi của dung môi Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa

Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất cao [19]

1.4.4.4 Phương pháp chiết hồi lưu

Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp ngâm chiết truyền thống Sự đun

hồi lưu là sự chuyển chất trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ, cơ

sở của phương pháp là sự tách các chất có nhiệt độ sôi khác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng

Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng một ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất Sự chiết xuất hoạt động liên tục nên nhanh chóng

Nhược điểm của phương pháp là không chiết xuất được một lượng lớn mẫu nên

chỉ thích hợp cho việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm [12]

1.4.4.5 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

Đây là phương pháp đặc biệt để trích ly tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi có trong nguyên liệu Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước, hơi nước sẽ được dẫn vào bình sục có chứa mẫu, hơi nước xuyên thấm qua màng tế bào nguyên

liệu và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu được hợp chất tinh dầu Dùng ete dầu hỏa hoặc ete etylic để trích

ly tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình sẽ có sự phân tách giữa hai pha tinh dầu và nước

1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH CHIẾT

giảm hiệu quả chiết

1.5.2 Những yếu tố về kỹ thuật

1.5.2.1 Nhiệt độ chiết

Theo công thức tính hệ số khuyếch tán của Eintein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuyếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuyếch tán cũng tăng lên Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận

lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:

+ Đối với hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một

số hoạt chất như vitamin, glycosid, alkaloid…

+ Đối với tạp: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng mà độ tan của tạp

chất cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy… khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của

dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế

+ Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

+ Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độ tăng,

độ tan của chúng lại giảm Do đó, để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên cho thấy tùy trường hợp cụ thể mà lựa chọn nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết…) [12]

1.5.2.2 Thời gian chiết

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuyếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp như nhựa, keo…) Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều

tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết sao cho phù hợp với thành phần dược liệu, dung môi, phương pháp chiết [12]

1.5.2.3 Độ mịn của nguyên liệu

Khi kích thước của nguyên liệu chiết thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt được,

hoạt chất khó hòa tan vào dung môi Khi độ mịn của nguyên liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên, lượng chất khuyếch tán vào dung môi tăng lên, do đó thời gian chiết sẽ nhanh hơn

Trong thực tế nguyên liệu quá mịn sẽ gặp một số bất lợi sau:

+ Bột nguyên liệu bị dính bết vào nhau tạo thành dạng bột nhão vón cục, khi đó

sẽ làm chậm quá trình chiết xuất Mặt khác khi lọc, dịch chiết sẽ chảy chậm hoặc không chảy được vì bột nguyên liệu dính kết vào nhau và do các hạt kích thước nhỏ bít kín lỗ chảy của màng lọc

+ Nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp, gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản

Do đó phải lựa chọn độ mịn nguyên liệu thích hợp, tùy vào nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết Với nguyên liệu đã già cần xay mịn; với nguyên liệu nhiều chất nhầy, chất nhựa nên xay thô Với dung môi dễ hòa tan nhiều tạp hoặc chiết

ở nhiệt độ cao thì nguyên liệu không nên quá mịn [12]

1.5.2.4 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi góp phần quan trọng trong việc chiết xuất, tạo điều

kiện khuyếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi Nếu tỷ lệ nguyên

liệu/dung môi quá thấp dẫn đến tốc độ khuyếch tán cơ chất chậm, có thể dẫn đến hiệu

suất thấp, ngược lại nếu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi cao quá sẽ tạo ra hiệu suất cao thời gian ngắn, nhưng tốn dung môi [12]

1.5.2.5 pH dung môi

pH có ảnh hưởng đến khả năng chiết các hợp chất tự nhiên Trong môi trường

kiềm việc hút cation mạnh hơn anion, còn trong môi trường acid thì ngược lại [12]

CHƯƠNG 2

Với các mục tiêu của đề tài đặt ra, chúng tôi tiến hành thực hiện các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thực hiện đề tài

Lựa chọn nguyên liệu

oxy hóa từ dịch chiết cây An xoa

Cô cao và xác định hàm lượng flavonoid toàn phần và khả năng kháng oxy hóa từ cao chiết cây An

xoa

Đánh giá khả năng kháng khuẩn và hoạt tính gây độc tế bào ung thư từ cao chiết cây An xoa

Cây An xoa

Lá, thân, rễ cắt nhỏ, nghiền mịn

- Cường độ sóng siêu âm

Xây dựng bài toán thực nghiệm tối ưu

Chiết tách, loại tạp

Để thực hiện đề tài theo các bước của sơ đồ hình 2.1, cần sử dụng vật liệu và phương pháp nghiên cứu như sau:

2.1.1 Nguyên liệu

Rễ, thân, lá cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) được thu hái vào tháng 4/2018

tại huyện Phú Ninh, tỉnh Quảng Nam đã được rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn, tạp chất và đem sấy khô ở nhiệt độ 500C trong 4 giờ Nguyên liệu sau đó được xay nhỏ và cho vào

lọ thủy tinh có chứa chất hút ẩm để sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo (hình 2.2)

Hình 2.2 M ẫu nguyên liệu

sử dụng trong phòng thí nghiệm

2.1.2.2 Hóa chất

- Methanol, ethanol, chloroform do hãng Merck, Đức cung cấp

- Pb (CH3COO)2, FeCl3, H2SO4, NaNO2, NaOH, AlCl3… xuất xứ Trung Quốc

- Chất chuẩn Catechin xuất xứ Mỹ

- DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl), Sigma

- Môi trường Luria Bertani Broth (Himediam Ấn Độ)

- Kháng sinh thương mại được sử dụng như chất kháng sinh chuẩn là amipicillin (500 mg)

- Chủng vi sinh vật: Escherichia coli (E coli), Samonella typhi do Viện Công

nghệ sinh học - Đại học Huế cung cấp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xác định một số thành phần hóa học trong lá, thân và rễ cây An xoa

2.2.1.1 Xác định độ ẩm của nguyên liệu tươi bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [5]

Nguyên tắc: Nguyên liệu được sấy 100 - 1050C cho đến khi khối lượng giữa hai lần cân chênh lệch không quá 0,005 mg/g mẫu

Tính k ết quả:

Độ ẩm (hàm lượng nước) (X) tính bằng % khối lượng theo công thức

Trong đó:

p: Số gam của mẫu thử trước khi sấy

a: Số gam của mẫu thử sau khi sấy

Kết quả được làm tròn và lấy chính xác đến 0,01 Chênh lệch kết quả giữa 2 lần xác định đồng thời không quá: 0,5%

2.2.1.2 Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet [14]

Nguyên tắc: Mẫu được đun sôi với HCl, lọc và rửa sạch phần lọc, sấy khô và

chiết chất béo bằng ether petroleum Làm bay hơi dung môi, sấy và cân lượng chất béo còn lại đến khối lượng không đổi

Cách tiến hành và tính toán kết quả xem chi tiết tại mục 2.1, phụ lục 2

2.2.1.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl [14]

Nguyên t ắc:

Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác Dùng kiềm mạnh (NaOH

hoặc KOH) đẩy NH3 ra khỏi muối (NH4)2SO4 Định lượng NH3 bằng axit H2SO4 [14]

Cách tiến hành và tính toán kết quả xem chi tiết tại mục 2.2, phụ lục 2

tổng số muối khoáng) Dùng sức nóng 500 - 6000C nung cháy hoàn toàn các chất hữu

cơ, phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro có trong bột cây

Lặp lại quá trình này đến khi thu được khối lượng không đổi (chênh lệch kết quả của hai lần cân liên tiếp không lớn hơn 0,3 mg)

Tính k ết quả:

Hàm lượng tro tổng (X) biểu thị theo % khối lượng, tính bằng công thức

(2) Trong đó:

m: Trọng lượng của chén, tính bằng gam

m1: Trọng lượng của chén nung và mẫu thử, tính bằng gam

m2: Trọng lượng của chén nung và tro trắng sau khi đã nung và cân đến khối lượng không đổi, tính bằng gam

Kết quả được làm tròn và lấy chính xác đến 0,01 Chênh lệch kết quả giữa 2 lần xác định đồng thời không quá: 0,1% Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của các kết

Nguyên t ắc:

Phần mẫu thử được làm khô và sau đó tro hóa ở 450oC với nhiệt độ tăng dần Bổ sung dung dịch axit clohydric 6M và cho bay hơi đến khô Phần cặn được hòa tan trong dung dịch axit nitric 0,1M, các chất phân tích được xác định bằng đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa dùng lò graphit

Cách tiến hành và tính toán kết quả xem chi tiết tại mục 2.3, phụ lục 2

* Kim loại nặng Hg có trong bột cây An xoa được chúng tôi xác định hàm lượng

bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa theo TCVN 7604:2007 được xây dựng dựa trên AOAC 971.21 được thực hiện tại trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 - Quatest 2 [10]

* Kim loại nặng As có trong bột cây An xoa được chúng tôi xác định hàm lượng

bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử giải phóng hydrua theo TCVN 7770:2007 (ISO 17239:2004) được xây dựng dựa trên AOAC 986.15 được thực hiện tại trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2 - Quatest 2 [11]

2.2.2 P hương pháp tách chiết và xác định hàm lượng flavonoid toàn phần

2.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn catechin bằng phương pháp đo quang [24]

Flavonoid là một nhóm lớn của các hợp chất phenol thực vật Flavonoid được chia thành các nhóm dựa vào vị trí của các gốc aryl và mức độ oxy hóa của mạch 3C, trong đó nhóm flavan 3-ol còn được gọi là nhóm catechin Theo nghiên cứu của Phạm

Hồng Ngọc Thúy và cs thì catechin là hợp chất hiện diện nhiều trong cây An xoa và nhóm nghiên cứu đã sử dụng catechin làm chất chuẩn để xác định hàm lượng flavonoid tổng số trong cây Kế thừa từ kết quả đó chúng tôi đã sử dụng catechin là

chất chuẩn để đo hàm lượng flavonoid toàn phần trong toàn bộ nghiên cứu của mình

Có nhiều cách để định lượng hàm lượng các chất có trong nguyên liệu như phương pháp cân, phương pháp đo quang, phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC Phương pháp cân đơn giản nhưng độ chính xác không cao, phương pháp HPLC tuy có

độ chính xác cao hơn nhiều nhưng khá phức tạp và tốn kém Do đó, với mục đích xác định hàm lượng catechin có trong dịch chiết và cao chiết một cách tương đối chính xác

và không tốn nhiều chi phí, phương pháp đo độ hấp thụ phân tử UV-VIS được đề xuất

để sử dụng

Mỗi một loại dung môi hữu cơ có tính phân cực, độ nhớt và bước sóng hấp thu

UV khác nhau, độ tan trong nước cũng khác nhau Trong thí nghiệm khảo sát lựa chọn

loại dung môi chúng tôi sử dụng 3 loại dung môi khác nhau là chloroform, ethanol và methanol Để đo được hàm lượng catechin một cách chính xác nhất chúng tôi tiến

hành xây dựng đường chuẩn catechin dựa trên việc pha loãng một dãy dung dịch catechin (Sigma) thành các nồng độ chính xác 45, 90, 180, 360, 450, 540 và 590 µg/ml trong các dung môi (methanol 40%, ethanol 40% và chloroform 40%) Sử dụng 0,5 ml

mỗi nồng độ pha loãng cho vào ống nghiệm có chứa 2 ml nước cất, 0,15 ml NaNO2 lắc

đều sau đó để yên trong thời gian 6 phút Sau đó bổ sung 0,15 ml AlCl3, lắc đều và để yên trong 6 phút Tiếp tục bổ sung 2 ml NaOH và 0,7 ml nước cất lắc đều để yên trong

15 phút Dung dịch phản ứng được tiến hành đo quang ở bước sóng 510 nm

Sử dụng phần mềm Excel để xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa nồng

độ catechin với mật độ quang OD 510 nm, từ đó rút ra được phương trình đường chuẩn catechin Dựa vào phương trình này, suy ra được hàm lượng flavonoid có trong các mẫu nguyên liệu theo công thức sau:

Trong đó:

V1: thể tích dịch chiết ban đầu

m1: hàm lượng flavonoid toàn phần được tính dựa trên đường chuẩn catechin n: Số lần pha loãng

V2: thể tích mẫu dùng cho phản ứng

m2: khối lượng mẫu ban đầu

1000: hệ số chuyển đổi từ µg sang mg

2.2.2.2 Khảo sát hàm lượng flavonoid trong các bộ phận khác nhau của cây

An xoa

Bột cây An xoa ở các bộ phận khác nhau (thân, lá và rễ) được chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này Quá trình trích ly flavonoid toàn phần được chúng tôi thực hiện theo mô tả của Vuong và cs (2013) và Pham và cs (2017) có sửa đổi cho phù hợp với điều kiện nghiên cứu [27]; [29]

Cân chính xác 10 g bột (kích thước <1.40 mm) cho vào bình tam giác (500 ml)

có chứa 200 ml (tỷ lệ 1:20) dung môi methanol 40%, lắc đều Hỗn dịch sau đó được

tiến hành tách chiết flavonoid toàn phần bằng phương pháp siêu âm sử dụng đầu điện

cực ở 60ºC, 20 kHz trong thời gian 50 phút Huyền dịch sau đó được ly tâm 15000 vòng/phút trong 15 phút thu dịch nổi chuyển sang một bình tam giác mới Dịch nổi này được sử dụng để xác định hàm lượng flavonoid toàn phần dựa trên chất chuẩn catechin Các bước tiến hành phản ứng xác định hàm lượng flavonoid toàn phần được

thực hiện như được trình bày ở mục 2.2.2.1

2.2.2.3 Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng flavonoid toàn

ph ần có trong cây An xoa

Nguyên liệu xác định được ở thí nghiệm 2.2.2.2 được sử dụng cho thí nghiệm này

Chuẩn bị 9 bình tam giác thể tích 250 ml, cân chính xác 10 g bột nguyên liệu (kích thước <1,40 mm) cho vào mỗi bình tam giác có chứa 200 ml (tỷ lệ 1:20) dung môi thích hợp, lắc đều Hỗn dịch sau đó được tiến hành tách chiết flavonoid toàn phần

bằng 3 phương pháp khác nhau (siêu âm bể (ở 60ºC, 50 Hz trong thời gian 50 phút), siêu âm điện cực (ở 60ºC, 20 kHz trong thời gian 30 phút) và ngâm trong thời gian 48

giờ ở 60ºC Các bước tiến hành phản ứng xác định hàm lượng flavonoid toàn phần được thực hiện như được trình bày ở mục 2.2.2.1

2.2.2.4 Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng flavonoid toàn phần có trong cây An xoa

Nguyên liệu xác định được ở thí nghiệm 2.2.2.2 và phương pháp chiết xác định ở thí nghiệm 2.2.2.3 được sử dụng cho thí nghiệm này

Chuẩn bị 9 bình tam giác thể tích 250 ml, cân chính xác 10g bột nguyên liệu (kích thước <1,40 mm) cho vào mỗi bình tam giác có chứa 200 ml (tỷ lệ 1:20) dung môi methanol 40%, ethanol 40% và chloroform 40%, lắc đều Quá trình tách chiết và xác định flavonoid toàn phần được thực hiện như mục 2.2.2.1 và 2.2.2.2

2.2.2.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng trích ly flavonoid toàn phần từ cây An xoa

a) Ảnh hưởng của thời gian chiết

Tiến hành khảo sát lần lượt các thời gian 10, 30, 50 và 70 phút với nguyên liệu, phương pháp và dung môi, nhiệt độ chiết như được chọn ở trên

Cân 10 g bột nguyên liệu cho vào mỗi bình tam giác 250 ml có chứa 200 ml dung môi thích hợp, lắc đều Hỗn dịch sau đó được tiến hành tách chiết flavonoid toàn phần

bằng phương pháp thích hợp (2.2.2.3) ở 60oC Các bước tiến hành phản ứng xác định hàm lượng flavonoid toàn phần được thực hiện như được trình bày ở mục 2.2.2.1 và 2.2.2.2

b) Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến khả

năng trích ly flavonoid toàn phần, ở các tỷ lệ: 1/10, 1/20, 1/30, 1/40 g/ml Nguyên liệu, phương pháp, dung môi, nhiệt độ ở 60oC và thời gian như được chọn ở các thí nghiệm trên

Các bước tiến hành phản ứng xác định hàm lượng flavonoid toàn phần được thực

hiện như được trình bày ở mục 2.2.2.1 và 2.2.2.2

c) Ảnh hưởng của cường độ sóng siêu âm

Tiến hành khảo sát lần lượt các mức cường độ: 15, 20, 25, 30 kHz với nguyên

liệu, phương pháp và dung môi như được chọn ở trên

Cân 10g bột nguyên liệu cho vào mỗi bình tam giác (250 ml) có chứa 200 ml dung môi thích hợp, lắc đều Hỗn dịch sau đó được tiến hành tách chiết flavonoid toàn

phần bằng phương pháp thích hợp (2.2.2.3) Các bước tiến hành phản ứng xác định hàm lượng flavonoid toàn phần được thực hiện như được trình bày ở mục 2.2.2.1 và 2.2.2.2

2.2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của một số yếu tố đến hàm lượng flavonoi d toàn phần

Mô hình thí nghiệm ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố (thời gian (phút), cường

độ sóng siêu âm (kHz) và tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml)) sẽ được chúng tôi xây

dựng dựa trên phần mềm Minitab 17 bằng phương pháp đáp ứng bề mặt RSM theo mô hình Box- behnken [26] Bởi vì, trong phương pháp đáp ứng bề mặt mô hình Box- behnken cho ít điểm mẫu, do đó ít tốn kém hơn mô hình CCD với cùng số yếu tố Do

vậy, chúng tôi đã sử dụng mô hình này để tối ưu hóa các điều kiện chiết flavonoid toàn

phần từ cây An xoa Phương trình hồi quy ứng với các mô hình của phương pháp đáp ứng bề mặt RSM [25]

(4)Trong đó:

B ảng 2.1 Nhân tố và các mức độ bố trí thí nghiệm theo mô hình Box- behnken

Yếu tố ảnh hưởng

Mức dưới Mức cơ sở Mức trên khoảng biến

thiên

X3, Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Bố trí thí nghiệm theo mô hình Box- behnken dưới sự tác động qua lại của 3 nhân tố với 12 thí nghiệm nhân tố được thành lập và 3 thí nghiệm tại tâm (bảng 2.2)

B ảng 2.2 Mô hình thí nghiệm tác động qua lại giữa các nhân tố

Số thí

nghiệm Thời gian (X 1 )

Cường độ (X 2 )

Tỷ lệ R/L (X 3 )

2.2.2.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết và cao chiết

Dịch chiết và cao chiết từ rễ cây An xoa được chúng tôi đánh giá khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH theo Vuong và cs và Pham và cs [27]; [25]

Nguyên t ắc:

Là phương pháp nhằm xác định khả năng kháng oxy hóa của hợp chất dựa trên

khả năng bắt gốc tự do của nó 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo

ra các gốc tự do bền trong methanol Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này,

nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm DPPH chuyển

từ màu tím sang vàng Tín hiệu này được đo bằng máy quang phổ UV-Vis (U-2900, Hitachi, Nhật Bản) Hoạt tính kháng oxy hoá của chất thử nghiệm được đánh giá thông qua phần trăm làm giảm giá trị hấp thụ ánh sáng của mẫu thử nghiệm so với đối

chứng

Cách ti ến hành:

- Chuẩn bị dung dịch DPPH 0,2 mM pha trong methanol 40%, sử dụng ngay

- Chuẩn bị mẫu thử: mẫu thử chính là mẫu dịch chiết thô hay mẫu hòa tan từ cao chiết được pha loãng thành các nồng độ khác nhau từ 1, 1:25, 1:50 1:100, 1:200, 1:400, 1:600, 1:800 và 1:1000

- Tiến hành phản ứng: Hút 50 µl mẫu thử ở mỗi độ pha loãng cho vào ống nghiệm có chứa 5 ml nước cất và bổ sung thêm 1ml DPPH 0,2 mM (mẫu trắng tiến hành tương tự như mẫu thử nhưng thay mẫu thử thành nước cất), trộn đều, để yên trong tối 30 phút, sau đó đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 517 nm

Tính k ết quả:

Phần trăm bắt gốc tự do DPPH được tính theo công thức:

Trong đó:

ODm: mật độ quang mẫu thí nghiệm sau khi đã trừ blank (không có DPPH)

ODc: mật độ quang mẫu trắng sau khi đã trừ blank (không có DPPH)

Vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa giá trị mật độ quang của mẫu ở các nồng độ khác nhau, từ đó xác định giá trị IC50 ((nồng độ chất thử nghiệm bắt giữ 50% gốc tự do DPPH) [21]

2.2.2.8 Phương pháp tinh sạch flavonoid từ cao chiết

Cao thu được từ dịch chiết cây An xoa được chúng tôi tiến hành tinh sạch loại bỏ

tạp chất theo quy trình sau [30]:

Cao chiết flavonoid được bổ sung thêm nước sao cho chất khô đạt 12% và hiệu chỉnh pH bằng Ca(OH)2 đến môi trường kiềm pH=11 để thực hiện quá trình hòa tan các chất flavonoid đồng thời kết tủa các tạp chất carbohydrat như đường, pectin Lọc loại bỏ kết tủa, thu được dung dịch kiềm chứa flavonoid Tiếp đó, cho vào dung dịch

kiềm dung môi n-hexane (tỷ lệ dung môi/dung dịch kiềm là 3/1) để tiến hành quá trình

tách các hợp chất ít phân cực Quá trình tách diễn ra trong 1 giờ và được đảo trộn liên

tục, rồi phân ly, tách lớp dung dịch n-hexane (lớp trên) ra Lớp dưới (dung dịch kiềm)

được hiệu chỉnh pH đến 4 bằng HCl đậm đặc, rồi khuấy đều ở nhiệt độ 50 - 55oC trong thời gian 1h Sau đó, flavonoid được kết tinh trong 24h Lọc tách flavonoid kết tinh Rửa kết tinh 2 lần bằng hệ dung môi EtOAc/H2O (1/1, v/v); tỷ lệ DM/flavonoid

là 3/1 (v/v) trong phễu phân ly, lọc loại bỏ lớp nước Cô đuổi dung môi, sấy đông khô thu được sản phẩm flavonoid tinh sạch

Hình 2.3 Sơ đồ tinh sạch cao chiết flavonoid từ cây An xoa

2.2.2.9 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

Nguyên tắc:

Cao chiết được thấm ở trong khoanh giấy sẽ khuyếch tán vào thạch LB đặc có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với cao chiết được biểu hiện bằng đường kính các vòng kháng khuẩn xung quanh khoanh giấy thấm cao chiết

Cách tiến hành:

Chuẩn bị cao chiết: Cân 0,1 g cao chiết pha trong 0,9 ml dung môi methanol, sau

đó pha loãng thành 1, 1/2, 1/4 Dịch nuôi vi khuẩn được pha loãng trong nước muối sinh lý tương đương mật độ vi khuẩn là 108 tế bào/ml được trải đều trên môi trường

LB đặc Đĩa thạch được để khô 15 phút trước khi đặt khoanh giấy có tẩm cao An xoa Cao chiết An xoa ở các nồng độ khảo sát khác nhau (100 µl) được cho lên khoanh giấy (đường kính 6 mm) vô trùng Kháng sinh ampicillin được sử dụng như đối chứng dương và được pha thành các nồng độ tương tự như cao chiết Ngoài ra, do

sử dụng methanol để pha cao chiết nên ảnh hưởng của methanol lên sự phát triển của

vi khuẩn cũng được khảo sát Mỗi đĩa thạch được đặt từ 1, 2 hay 3 khoanh giấy tẩm cao chiết, sau đó để khô Các nồng độ pha loãng 1, 1/2 và 1/4 được sử dụng trong khảo sát, mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần Các đĩa thạch được ủ ở 32ºC trong 24 - 48 giờ Đường kính vòng kháng khuẩn được đo bằng thước đo đơn vị mm [13]; [13]