Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra

Chính vì vậy, một trong các hướng nghiên cứu mới để tăng giá trị kinh tế của phụ phẩm được đặt ra là tìm cách thu nhận và ứng dụng nguồn enzyme từ nội tạng cá tra... Các enzyme của động

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

-

LÊ NGUYỄN TỐ QUYÊN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME

TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm và Đồ uống

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2009

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

Tp HCM, ngày 01 tháng 08 năm 2009

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Lê Nguyễn Tố Quyên Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 12/09/1984 Nơi sinh: Đồng Tháp

Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm và Đồ uống

MSHV: 01107438

1- TÊN ĐỀ TÀI: Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂĂN:

- Khảo sát hoạt tính hệ enzyme thu từ nội tạng cá tra

- Khảo sát quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra

- Tối ưu hóa quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra

- Khảo sát quá trình kết tủa enzyme thô từ nội tạng cá tra

- Khảo sát sự giảm hoạt tính enzyme lipase theo thời gian

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị): TS Trần Bích Lam

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký) QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)

Đối với một học viên cao học, quá trình thực hiện Luận văn thạc sĩ được xem là cơ hội và thách thức lớn để có thể tổng kết lại các kiến thức đã được đào tạo suốt khóa học

và ứng dụng chúng vào các thí nghiệm thực tế Chính vì thế, trong quá trình làm việc, tôi cũng đã đối mặt với không ít những khó khăn, trở ngại Tuy nhiên, với sự hỗ trợ của thầy cô, người thân, đồng nghiệp và bạn bè, tôi đã hoàn thành đề tài của mình

Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình đến:

- Tiến sĩ Trần Bích Lam – người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài – và các thầy cô bộ môn

- Gia đình và đặc biệt là cha mẹ – hai người đã luôn theo sát, động viên tôi trong thời gian qua

- Đồng nghiệp – những người đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong công việc để tôi có dành toàn tâm toàn ý làm đề tài

- Bạn bè – những người luôn quan tâm và giúp đỡ tôi

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Từ thực trạng nguồn phụ phẩm của ngành chế biến thuỷ sản nói chung và cá tra nói riêng vẫn chưa được khai thác và xử lý đúng mức, vấn đề đặt ra là làm thế nào để chế biến nguồn phụ phẩm này thành những sản phẩm giá trị gia tăng để mang lại hiệu quả kinh tế cho nhà sản xuất và đồng thời giảm thiểu tình trạng ô nhiễm môi trường do phế liệu của các nhà máy thuỷ sản gây ra Với mục đích tìm giải pháp cho vấn đề vừa nêu, nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm cách thu nhận hệ enzyme của nội tạng cá tra Các kết quả thu được khi khảo sát hoạt tính các enzyme amylase, protease và lipase trong dịch chiết enzyme thu từ nội tạng cá tra cho thấy đây không phải là nguồn thu nhận amylase và protease lý tưởng Vì vậy, quá trình trích ly hệ enzyme này được khảo sát và tối ưu hoá với hàm mục tiêu là hoạt tính riêng lipase Dịch chiết enzyme có hoạt tính riêng enzyme lipase cao nhất là 2.149 µmol acid béo/h/mg protein khi tiến hành quá trình trích ly trong điều kiện như sau: tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch trích ly: 96/500 (w/w), nhiệt độ: 28oC, pH 9 và thời gian trích ly: 3 giờ Bên cạnh đó, quá trình kết tủa enzyme thô bằng ethanol bằng các tỷ lệ ethanol và dịch chiết enzyme khác nhau cũng được thực hiện và kết quả cho thấy khi tiến hành kết tủa với tỷ lệ ethanol và dịch chiết

enzyme là 50:50 thì hoạt tính của lipase thu được là cao nhất là 4.153 µmol acid

béo/h/ml dịch chiết enzyme Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm enzyme thô khi đó là 93% và 6.08 lần Hoạt tính lipase của chế phẩm giảm dần trong quá trình bảo quản nó Tuy nhiên, trong thời gian đầu, hoạt tính lipase giảm nhanh và những ngày sau hoạt tính giảm chậm dần Sự thay đổi hoạt tính có thể biểu diễn bằng hàm số mũ: y = 5.3979e-0.375x

MỤC LỤC

MỤC LỤC I DANH MỤC BẢNG III DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC HÌNH V

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2

2.1 Cá tra 2

2.1.1 Sơ lược [9, 34] 2

2.1.2 Hiện trạng nghề nuôi và chế biến cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long [4,35] .4

2.1.3 Chế biến phụ phẩm cá tra: thực trạng và những giải pháp [34] 5

2.1.4 Tiềm năng về nguồn enzyme từ nội tạng cá tra 6

2.2 Các enzyme của động vật thuỷ sản [8, 22] 7

2.2.1 Sơ lược 7

2.2.2 Các enzyme tiêu hoá quan trọng ở động vật thuỷ sản 9

2.2.3 Các enzyme tiêu hoá của cá da trơn 25

2.3 Các ứng dụng của các enzyme từ động vật thuỷ sản [22] 28

2.3.1 Biến tính có chọn lọc các mô của cá và các động vật không xương sống 28

2.3.2 Tận dụng các protease từ cá và động vật có vú sống dưới nước để thay thế cho rennet trong quy trình sản xuất phô mai 33

2.3.3 Khử mùi ôi do oxy hoá ở sữa 34

CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

3.1 Nguyên liệu 36

3.1.1 Nội tạng cá tra 36

3.1.2 Thiết bị 36

3.2 Phương pháp nghiên cứu 36

3.2.1 Mục đích nghiên cứu 36

3.2.2 Nội dung nghiên cứu 37

3.2.3 Các phương pháp phân tích 40

3.2.4 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 46

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 48

4.1 Xây dựng đường chuẩn 48

MỤC LỤC

4.1.1 Xây dựng đường chuẩn albumin 48

4.1.2 Xây dựng đường chuẩn tyrosin 49

4.2 Khảo sát hoạt tính hệ enzyme thu từ nội tạng cá tra 50

4.2.1 Tiến trình khảo sát 50

4.2.2 Kết quả khảo sát 50

4.3 Khảo sát quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra 56

4.3.1 Xác định thời gian trích ly 56

4.3.2 Xác định tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly 58

4.3.3 Xác định nhiệt độ trích ly 60

4.3.4 Xác định pH trích ly 63

4.4 Tối ưu hóa quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra [4] 66

4.4.1 Chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm 66

4.4.2 Tổ chức thí nghiệm trực giao cấp I 67

4.4.3 Tiến hành tối ưu hoá thực nghiệm bằng phương pháp dốc đứng 68

4.5 Khảo sát quá trình kết tủa enzyme thô từ nội tạng cá tra 69

4.6 Khảo sát sự giảm hoạt tính của enzyme lipase theo thời gian 71

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 76

5.1 Về hoạt tính của hệ enzyme của nội tạng cá tra 76

5.2 Về ảnh hưởng của các điều kiện trích ly đến hoạt tính riêng lipase của dịch chiết enzyme thu từ nội tạng cá tra 76

5.3 Về quá trình kết tủa enzyme thô bằng ethanol 76

5.4 Về sự biến đổi hoạt tính lipase theo thời gian 76

PHỤ LỤC 1: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN 77

1 Định lượng protein thô bằng phương pháp Micro-Kjeldahl [2, 10] 77

2 Định lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry [11, 26] 79

PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME 82

1 Enzyme amylase 82

2 Enzyme protease [16] 83

3 Enzyme lipase [17, 23, 26, 29, 30] 83

PHỤ LỤC 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME [5] 91

1 Phương pháp trích ly và kết tủa bằng muối 91

2 Phương pháp trích ly và kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ 91

3 Phương pháp sử dụng pH 92

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên 3

Bảng 2 2: Khối lượng các phần khác nhau của cá tra 4

Bảng 2 3: Một số enzyme tiêu hóa ngoại bào của động vật thủy sản [22] 8

Bảng 2 4: Tính bền nhiệt, tính bền pH và các tính chất động học của các protease dạ dày của các loài cá khác nhau [22] 11

Bảng 2 5: Tính bền nhiệt, tính bền pH và các tính chất động học của các protease thu từ ruột của động vật thuỷ sản [22] 14

Bảng 2 6: Các proteinase thu từ mô cơ của động vật thuỷ sản [22] 19

Bảng 2 7: Hoạt tính của các enzyme có mặt trong các phần khác nhau của nội tạng cá da trơn Brazil (Pseudoplatystoma coniscans) [28] 27

Bảng 2 8: Các ứng dụng của các enzyme thu nhận từ một số loài động vật thuỷ sản 29 Bảng 3 1: Thành phần các ống nghiệm để xác định hoạt tính amylase 41

Bảng 3 2: Thành phần các dung dịch tyrosin chuẩn 43

Bảng 3 3: Thành phần các ống nghiệm để xác định hoạt tính protease 43

Bảng 3 4: Thành phần các ống nghiệm để xác định hoạt tính lipase 45

Bảng 4 1: Mật độ quang ứng với các nồng độ dung dịch albumin chuẩn khác nhau 48

Bảng 4 2: Mật độ quang ứng với các nồng độ dung dịch tyrosin chuẩn khác nhau 49

Bảng 4 3: Nồng độ protein trong dịch trích ly của mẫu bỏ mật và mẫu không bỏ mật .50

Bảng 4 4: Hoạt tính riêng của enzyme amylase trong nội tạng cá của mẫu bỏ mật và mẫu không bỏ mật 52

Bảng 4 5: Hoạt tính riêng của enzyme protease trong nội tạng cá của mẫu bỏ mật và mẫu không bỏ mật 52

Bảng 4 6: Hoạt tính riêng của enzyme lipase trong nội tạng cá của mẫu bỏ mật và mẫu không bỏ mật 53

Bảng 4 7: Nồng độ protein hòa tan trong dịch trích ly ứng với các khoảng thời gian trích ly khác nhau 56

Bảng 4 8: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra ứng với các khoảng thời gian trích ly khác nhau 57

Bảng 4 9: Nồng độ protein hòa tan trong dịch trích ly ứng với các tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly khác nhau 59

Bảng 4 10: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra ứng với các tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly khác nhau 59

Bảng 4 11: Nồng độ protein hòa tan trong dịch trích ly ứng với các nhiệt độ trích ly khác nhau 61

MỤC LỤC

Bảng 4 12: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra với các nhiệt độ trích ly

khác nhau 61

Bảng 4 13: Nồng độ protein hòa tan trong dịch trích ly ứng với các pH trích ly khác nhau 64

Bảng 4 14: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra với các pH trích ly khác nhau 64

Bảng 4 15: Điều kiện thí nghiệm được chọn 66

Bảng 4 16: Ma trận quy hoạch TYT 22 67

Bảng 4 17: Kết quả tính bước chuyển động δj của các yếu tố 68

Bảng 4 18: Kết quả thí nghiệm theo hướng dốc đứng 69

Bảng 4 19: Nồng độ protein hòa tan trong dịch trích ly ứng với các tỷ lệ dung môi kết tủa khác nhau 70

Bảng 4 20: Hoạt tính riêng enzyme của chế phẩm enzyme thô ứng với các tỷ lệ dung môi kết tủa khác nhau 70

Bảng 4 21: Hoạt tính riêng enzyme lipase, hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của chế phẩm enzyme thô ứng với các tỷ lệ dung môi kết tủa khác nhau 70

Bảng 4 22: Hoạt tính lipase thu từ một số loài vi sinh vật bằng phương pháp lên men [15] 74

Bảng PHỤ LỤC 1 1: Thành phần các dung dịch tyrosin chuẩn 80

Bảng PHỤ LỤC 1 2: Thành phần các ống nghiệm để xác định mật độ quang của các mẫu dịch chiết enzyme 80

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1: Cá tra 2

Hình 2 2: Diện tích và sản lượng nuôi cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2001 đến năm 2006 [3] 5

Hình 2 3: Khối lượng và giá trị kim ngạch cá tra xuất khẩu tại Đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2001 đến năm 2006 [3] 5

Hình 2 4: Sự hình thành các protein dưới tác động xúc tác của transglutaminase 24

Hình 2 5: Hoạt tính amylase ở các phần của nội tạng cá da trơn răng nhọn [32] 26

Hình 2 6: Hoạt tính protease ở các phần của nội tạng cá da trơn răng nhọn [32] 26

Hình 3 1: Cấu tạo hệ thống tiêu hoá của cá 36

Hình 3 2: Sơ đồ nghiên cứu 37

Hình 3 3: Quy trình trích ly enzyme từ nội tạng cá tra 38

Hình 3 4: Quy trình kết tủa enzyme thô từ dịch chiết enzyme nội tạng cá tra 39

Hình 4 1: Đường chuẩn albumin 48

Hình 4 2: Đường chuẩn tyrosin 49

Hình 4 3: Nồng độ protein hòa tan của dịch trích ly so sánh giữa mẫu bỏ mật (BM) và mẫu không bỏ mật (M) 51

Hình 4 4: Hoạt tính riêng của enzyme amylase trong nội tạng cá so sánh giữa mẫu bỏ mật (BM) và mẫu không bỏ mật (M) 54

Hình 4 5: Hoạt tính riêng của enzyme protease trong nội tạng cá so sánh giữa mẫu bỏ mật (BM) và mẫu không bỏ mật (M) 54

Hình 4 6: Hoạt tính riêng của enzym lipase trong nội tạng cá so sánh giữa mẫu bỏ mật (BM) và mẫu không bỏ mật (M) 55

Hình 4 7: Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease kiềm ở một số loài cá [14] 55

Hình 4 8: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra ứng với khoảng thời gian trích ly khác nhau 58

Hình 4 9: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra ứng với các tỷ lệ nguyên liệu và dung môi trích ly khác nhau 60

Hình 4 10: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra ứng với các nhiệt độ trích ly khác nhau 62

Hình 4 11: Hoạt tính riêng enzyme lipase của nội tạng cá tra ứng với các nhiệt độ trích ly khác nhau 65

Hình 4 12: Hoạt tính enzyme lipase của nội tạng cá tra ứng với các tỷ lệ dung môi trích ly và dịch chiết enzyme khác nhau 71

Hình 4 13: Sự biến đổi hoạt tính riêng lipase theo thời gian 72

Hình PHỤ LỤC 2 1: Mô hình phương pháp pH – stat 85

Hình PHỤ LỤC 2 2: Sơ đồ phương pháp nhỏ giọt dầu “oil drop” 86

Chương 1:

MỞ ĐẦU

Chương 1: MỞ ĐẦU

Sản lượng khai thác thủy hải sản trên thế giới năm 2007 ước đạt 146 triệu tấn (theo VASEP) 50% sản lượng này được sử dụng để chế biến thức ăn cho con người Tuy nhiên, con người chỉ thật sự tiêu thụ được khoảng 30% sản lượng thủy sản đem chế biến, còn 70% còn lại là phụ phẩm [34]

Ở nước ta, cùng với sự phát triển của ngành nuôi trồng và đánh bắt thủy hải sản, diện tích và sản lượng nuôi trồng thủy sản ở nước ta ngày càng gia tăng, đặc biệt là cá tra và cá ba sa Chỉ tính từ năm 2001 đến năm 2006, diện tích nuôi và sản lượng đã gia tăng một cách nhanh chóng: từ 2 ngàn hecta và 114 ngàn tấn (năm 2001) lên 9 ngàn hecta và 825 ngàn tấn (năm 2006) [3]

Cùng với việc mở rộng quy mô nuôi trồng, ngành chế biến và xuất khẩu các sản phẩm từ cá tra cũng được chú trọng Tuy nhiên, do sản phẩm xuất khẩu chủ lực từ cá tra

là phi lê đông lạnh (với định mức khoảng 2.6 kg nguyên liệu cho ra 1 kg thành phẩm) nên lượng phụ phẩm từ công nghiệp chế biến cá tra là rất lớn Theo đó, lượng phụ phẩm

cá tra do các nhà máy chế biến thải ra trong năm 2007 ước tính khoảng 600 ngàn tấn Hiện nay, nguồn phụ phẩm chế biến này vẫn chưa được khai thác và xử lý đúng mức Bên cạnh các sản phẩm chế biến từ phụ phẩm cá tra hiện có như bột cá, dầu cá và một

số dưỡng chất có giá trị khác, nhiều hướng nghiên cứu để tăng giá trị kinh tế của nguồn phụ phẩm này cũng đã và đang được triển khai [3, 34]

Trong khuôn khổ luận văn của mình, tôi tiến hành nghiên cứu thu nhận hệ enzyme

từ nội tạng cá tra và đề ra một số ứng dụng của nó Nội dung chính của luận văn gồm các phần sau:

- Khảo sát hoạt tính hệ enzyme thu từ nội tạng cá tra

- Khảo sát quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra

- Tối ưu hóa quá trình trích ly enzyme lipase từ nội tạng cá tra

- Khảo sát quá trình kết tủa enzyme thô từ nội tạng cá tra

- Khảo sát sự giảm hoạt tính enzyme lipase theo thời gian

Chương 2:

TỔNG QUAN

Chương 2: TỔNG QUAN

2.1 Cá tra

2.1.1 Sơ lược [9, 34]

Cá tra (Hình 2 1) – tên tiếng Anh là “sutchi catfish” – là một đối tượng nuôi có

nhiều đặc tính quý: dễ nuôi, chóng lớn và có khả năng chịu đựng đặc biệt với môi trường không thuận lợi Nó được nuôi phổ biến ở hầu hết các nước Ðông Nam Á Trong đó, bốn nước trong hạ lưu sông Mê Kông đã có nghề nuôi cá tra truyền thống là Thái Lan, Capuchia, Lào và Việt Nam

pH thích hợp cho cá tra từ 6.5 – 8 nhưng cá vẫn có thể sống được pH 4.5 Nhiệt độ thích hợp cho cá tra 26 – 30oC

Cá tra sống được ở môi trường chật hẹp, nước giàu các chất hữu cơ và ở những nơi có nồng độ oxy hoà tan rất thấp do cá tra có cơ quan hô hấp là bóng khí, thở được khí trời

2.1.1.3.Đặc điểm dinh dưỡng

Cá tra có đặc điểm của loài cá ăn thịt Dạ dày của cá phình to hình chữ U và co giãn được, ruột cá tra ngắn, không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí và tuyến sinh dục Ngay khi vừa hết noãn hoàng cá thể hiện rõ tính ăn thịt và ăn lẫn nhau Khi lớn, cá thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các lọai thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật Trong

ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn khác nhau như cám, rau, động vật đáy

Khi phân tích thức ăn trong ruột cá đánh bắt ngoài tự nhiên, D Menon và

P.I.Cheko (1955) nhận thấy thành phần thức ăn khá đa dạng (Bảng 2 1), trong đó cá tra

ăn tạp thiên về động vật Bảng 2 2 cho ghi nhận khối lượng các phần khác nhau của cá tra

Bảng 2 1: Thành phần thức ăn trong ruột cá tra ngoài tự nhiên

Bảng 2 2: Khối lượng các phần khác nhau của cá tra

4.4 4.8 4.9 4.9 4.9 5.0 5.1 5.1 5.2 5.5

9.8 9.9 10.1 10.1 10.2 10.4 10.5 10.5 10.9 11.0

1.2 1.3 1.5 2.0 3.1 4.1 4.4 4.9 5.1 5.2

5.1 5.2 5.4 6.0 6.1 6.2 6.2 6.6 6.7 6.7

39.3 38.8 38.3 37.4 36.8 35.3 35.1 34.6 33.6 32.5 Trung bình 38.52 4.98 10.34 3.28 6.02 36.17

2.1.2 Hiện trạng nghề nuôi và chế biến cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long [4, 35]

Đồng bằng sông Cửu Long được xem là nơi có truyền thống lâu đời trong nghề nuôi

cá tra Trong vài thập kỷ gần đây, nhờ chủ động hoàn toàn về sản xuất giống và tìm được thị trường xuất khẩu, nghề nuôi và chế biến cá tra ở đây càng ổn định và phát triển triển vượt bậc Chỉ tính từ năm 2001 đến năm 2006, diện tích nuôi và sản lượng đã gia tăng một cách nhanh chóng: từ 2 ngàn hecta và 114 ngàn tấn (năm 2001) lên 9 ngàn

hecta và 825 ngàn tấn (năm 2006) (Hình 2 2) Cùng với việc mở rộng quy mô nuôi

trồng, ngành chế biến và xuất khẩu các sản phẩm từ cá tra (chủ yếu là phi lê cá) cũng được chú trọng Nhờ đó, kim ngạch từ xuất khẩu các sản phẩm từ cá tra từ con số

không đáng kể vào năm 2001 đã tăng lên 737 triệu đô la vào năm 2006 (Hình 2 3) [3]

Hiện nay, cá tra đã xuất khẩu đến 117 quốc gia và vùng lãnh thổ Chỉ tính riêng tới tháng 10/2008, lượng cá tra xuất khẩu đạt hơn 550 ngàn tấn, đạt kim ngạch trên 1.2 tỉ USD (vượt qua kế hoạch năm 2008) Kim ngạch xuất khẩu cá tra hiện nay chiếm đến 32.4% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước [3, 34]

Chương 2: TỔNG QUAN

Hình 2 2: Diện tích và sản lượng nuôi cá tra tại Đồng bằng sông Cửu Long từ năm

2001 đến năm 2006 [3]

Hình 2 3: Khối lượng và giá trị kim ngạch cá tra xuất khẩu tại Đồng bằng sông Cửu

Long từ năm 2001 đến năm 2006 [3]

2.1.3 Chế biến phụ phẩm cá tra: thực trạng và những giải pháp [34]

2.1.3.1.Thực trạng

Do sản phẩm xuất khẩu chủ lực từ cá tra là phi lê đông lạnh (với định mức khoảng 2.6 kg nguyên liệu cho ra 1 kg thành phẩm) nên lượng phụ phẩm từ công nghiệp chế biến cá tra là rất lớn Hiện nay, Đồng bằng sông Cửu Long đang có 70 nhà máy chế biến mặt hàng phi lê cá tra với khả năng tiêu thụ khoảng 40 ngàn tấn nguyên liệu/ngày Với sản lượng này, mỗi ngày các nhà máy chế biến tung ra thị trường hơn 20 ngàn tấn xương, đầu, mỡ, da cá Năm 2006, với 800 ngàn tấn cá nguyên liệu được đưa vào chế

tấn phụ phẩm Năm 2007, sản lượng cá nguyên liệu đạt 1 triệu tấn và lượng phụ phẩm ước đạt hơn 600.000 tấn Hiện nay, trong khi giá 1 kg phi lê cá xuất khẩu là hơn 3 USD thì giá cá tra mất phi lê chỉ dao động ở mức từ 2000 – 4000 đồng/kg Vì vậy, cùng với

sự phát triển của nghề nuôi và chế biến – xuất khẩu cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long, một vấn đề mới đã được đặt ra: làm thế nào để có thể tận thu và xử lý tốt nguồn phụ phẩm này để nâng cao giá trị kinh tế cũng như góp phần bảo vệ môi trường

mỡ cá là một hướng rất triển vọng, phù hợp với xu thế thời đại bởi hiện nay nguồn nhiên liệu hoá thạch (dầu mỏ, than đá ) ngày càng cạn kiệt, nhu cầu sử dụng nhiên liệu tái tạo, không gây ô nhiễm như dầu biodiesel là rất lớn

- Đầu, xương sống, ruột, kỳ vi… được chế biến thành thức ăn công nghiệp phục

vụ chăn nuôi

- Bong bóng cá, bao tử cá được cung cấp cho các nhà hàng, quán ăn làm nguyên liệu chế biến

- Máu cá đang được nghiên cứu để thu nhận protein

2.1.4 Tiềm năng về nguồn enzyme từ nội tạng cá tra

Từ thực trạng và những giải pháp của ngành chế biến phụ phẩm từ cá tra tại Đồng

bằng sông Cửu Long (mục 2.1.3), chúng ta có thể thấy rằng cho đến hiện tại, hệ enzyme

của nội tạng cá tra vẫn chưa được chú ý khai thác và ứng dụng rộng rãi Chính vì vậy, một trong các hướng nghiên cứu mới để tăng giá trị kinh tế của phụ phẩm được đặt ra là tìm cách thu nhận và ứng dụng nguồn enzyme từ nội tạng cá tra

Chương 2: TỔNG QUAN

2.2 Các enzyme của động vật thuỷ sản [8, 22]

2.2.1 Sơ lược

Động vật thuỷ sản hầu hết là loài máu lạnh vì sống trong môi trường nhiệt độ thấp

Do đó, để duy trì cuộc sống (trao đổi chất, tiêu hoá, hoạt động ), chúng cần phải có hệ enzyme tương đối mạnh (Simpson et al., 1991)

Việc nghiên cứu enzyme của động vật thuỷ sản chỉ mới bắt đầu được quan tâm trong vài thập kỷ vừa qua Tuy nhiên, nhờ hiểu biết ngày một tăng cũng như tính sẵn có của các nguồn enzyme này (Stefansson & Steingrimsdottir, 1990; Han, 1993), các nhà

khoa học cũng đã xác định được một số loại enzyme thu nhận từ các nguồn này (Bảng

2 3) cũng như khả năng về ứng dụng của chúng (Bảng 2 8)

Hầu hết các enzyme động vật thuỷ sản đều hiện diện ở các sinh vật trên cạn (Haard, 1998) Tuy nhiên, chúng có sự khác biệt về trọng lượng phân tử, thành phần acid amin,

pH tối thích, nhiệt độ tối thích cũng như về độ bền, các đặc tính ức chế và các tính chất động học (De-Vecchi & Coppes, 1996) Các enzyme của động vật thuỷ sản có hoạt tính phân tử cao hơn tại các giá trị nhiệt độ thấp hơn do chúng giúp các phản ứng diễn ra tại các giá trị nhiệt độ thấp hơn, do đó giảm năng lượng cần thiết cũng như giải quyết được vấn đề tính ổn định nhiệt vì phản ứng có thể diễn ra ở điều kiện nhiệt độ thấp hơn cũng như có thể kết thúc nó bằng xử lý nhiệt một cách ôn hoà (Haard, 1998; Simpson, 1984; Simpson & Haard, 1987a), nhờ đó tránh được nhiều bất lợi như tốn năng lượng gia nhiệt cho quá trình cũng như có thể gây biến tính một số thành phần nhất định trong thực phẩm (Hultin, 1978) Chính vì vậy, động vật thuỷ sản được xem là nguồn đầy tiềm năng để cung cấp các chất xúc tác cho các phương pháp enzyme ôn hoà thay thế cho các phương pháp cơ học và hoá học - vốn thường gây tổn hại đến sản phẩm và giảm khả năng thu hồi sản phẩm (Gildberg, 1993) Việc kiểm tra độc tính của các nguyên liệu thô này để xác định tính an toàn của chúng cũng không cần thiết bởi vì chúng vốn được lấy từ các mô ăn được của động vật (Wasserman, 1984)

Nội tạng cá được xem là một nguồn cung cấp enzyme tiêu hoá lớn (Reece, 1988) Gần đây, một số enzyme đã được nghiên cứu và thu nhận từ nguồn phụ phẩm của quá trình chế biến động vật thuỷ sản như alkaline phosphatase, hyluronidase, acetylglucosaminidase, chitinase và protease (Venugopal, 1995) Việc trích ly các enzyme từ chất thải của quá trình chế biến động vật thuỷ sản cũng như tận dụng chúng trong công nghiệp thực phẩm sẽ giúp giảm ô nhiễm môi trường (Raa, 1997)

Bảng 2 3: Một số enzyme tiêu hóa ngoại bào của động vật thủy sản [22]

Chymosin

Collagenase Elastase

Cá ốt-me châu Mỹ, cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết Đại Tây Dương, cá tuyết đảo băng, cá hồi, cá thu, cá orange roughy, Parona signata, cá ngừ…

Cá hồi có đốm đen và hai vạch đỏ kéo dài từ mõm đến đuôi, cá ngừ, cá mập…

Hải cẩu Bắc Cực,

Cá tuyết, cá tuyết Đại Tây Dương

Cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết đảo băng, cá tuyết Đại Tây Dương, cá hồi, cá trồng, Parona signata, cá chép, tôm đồng, hàu…

Cá ốt vảy nhỏ, cá trích, cá tuyết Đại Tây Dương, cá nhám góc, cá hồi có đốm đen và hai vạch đỏ kéo dài

từ mõm đến đuôi, sò điệp, bào ngư, tôm trắng, cá chép

ăn cỏ…

Con cáy, tôm sông, cá tuyết Đại Tây Dương…

Cá chép, cá trê, cá tuyết Đại Tây Dương…

Chương 2: TỔNG QUAN

2.2.2 Các enzyme tiêu hoá quan trọng ở động vật thuỷ sản

2.2.2.1.Các protease

Trong số các enzyme vốn có của động vật thuỷ sản, các enzyme protease là nhóm

cơ bản, gồm các enzyme proteinase (endo-) các enzyme peptidase (exo-) Hai thuật ngữ này được dùng để chỉ tất cả các enzyme có khả năng thuỷ phân các liên kết peptide trong các polypeptide và các protein

Các nghiên cứu về hoạt tính protease có mặt trong nội tạng cá đã được thực hiện vào thế kỷ thứ 19 và lần đầu tiên được theo dõi một cách kỹ lưỡng bởi Stirling vào năm

1884 (Gildberg, 1988) Ngoài ra, tác động làm mềm các mô ở bụng của các protease trong quá trình tồn trữ cá sau khi giết mổ cũng đã được nghiên cứu bởi Almy vào năm

1926 (Haard, 1994)

Ở động vật thủy sản, hoạt tính protease chủ yếu được phát hiện ở dạ dày, ruột và gan tuỵ (Haard, 1994) Chúng có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau như dựa vào khoảng pH hoạt động, khả năng thuỷ phân các protein đặc hiệu hay cơ chế hoạt động của chúng (Han, 1993) Căn cứ vào pH hoạt động, chúng thường được chia làm hai nhóm là các protease acid và các protease trung tính và kiềm (Haard, 1994) Tuy nhiên, theo phân loại của Hội liên hiệp các nhà hoá sinh ứng dụng quốc tế (International Union of Applied Biochemist), các protease của động vật thuỷ sản thuộc bốn nhóm cơ bản là các acidic- và aspartic protease, các serine protease, các thiol- hay và cystine protease và các metallo-protease (Haard & Simpson, 1994)

Các protease thu từ dạ dày

Các protease dạ dày thuộc nhóm aspartic protease Chúng không được tìm thấy ở các loài động vật thuỷ sản không có bao tử Các loài này có thể chứa một enzyme tương ứng là cathepsin D (Gildberg, 1988)

Sự khác biệt giữa các protease thu nhận từ các nguồn khác nhau thể hiện chủ yếu ở các tính chất xúc tác và vật lý (Han & Shahidi, 1995) Nhìn chung, các enzyme tiêu hoá

từ cá thường hoạt động tối thích ở nhiệt độ cao hơn nhiều so với nhiệt độ môi trường sống của cá (Koury, Spinelli, & Wieg, 1971) Điều này có thể là do nhiệt độ bên trong

hệ tiêu hoá của cá cao hơn nhiệt độ môi trường (Gildberg, 1988) Mặc dù giữa các protease của các loài sống ở biển vẫn có sự khác nhau (đặc biệt là các loài sống ở Đại Tây Dương), nhưng chúng có những tính chất chung là dễ bị biến tính nhiệt, có hoạt tính phân tử cao tại nhiệt độ thấp và có khả năng và thuỷ phân các protein tự nhiên (Simpson & Haard, 1989a) Chẳng hạn như pepsin thu nhận từ niêm mạc dạ dày của cá

tuyết ở địa cực (Boreogadus saida) có năng lượng hoạt hoá Arrhenius thấp, hằng số

Michaelis biểu kiến cao, nhiệt độ hoạt động tối thích thấp và pH hoạt động tối thích

(ứng với từng giá trị nhiệt độ) để thuỷ phân haemoglobin cao hơn so với giá trị của các enzyme tương ứng thu từ đông vật máu lạnh sống trong môi trường ấm cũng như động vật máu nóng (Arunchalam & Haard, 1985; Gildberg, 1988; Martinez & Olsen, 1989; Simpson & Haard, 1984a)

Tính bền nhiệt, tính bền pH và các tính chất động học của các protease dạ dày của

các loài cá khác nhau được tóm tắt trong Bảng 2 4

Trong số các protease dạ dày, pepsin được nghiên cứu khá sâu còn chymosin (Shamsuzzaman & Haard, 1984) và các enzyme từ dịch vị (Sanchez-Chiang & Ponce, 1981) lại ít được tìm hiểu

các loài sống vùng nước ấm (tham khảo Bảng 2 3)

• Các chymosin và các gastricsin

Chymosin (EC 3.4.23.4) – thông dụng nhất là enzyme “rennin” – là một loại acidic protease (Wong, 1995) với một số đặc tính để phân biệt với các enzyme acidic protease khác như bền ở pH gần 7.0, thuỷ phân đặc hiệu một số ít cơ chất (Haard & Simpson, 1994; Shamsuzzaman & Haard, 1984)

Chymosin thường được tìm thấy dạ múi khế túi của các động vật nhai lại lúc còn nhỏ (Foltmann, 1970; Shamsuzzaman & Haard, 1984; Wong, 1995) Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng dạ dày cá chép (Cohen & Gertler, 1981) và hải cẩu Bắc Cực (Han & Shahidi, 1995; Shamsuzzaman & Haard, 1983, 1984) cũng có hoạt tính của enzyme chymosin và các enzyme giống chymosin

Chương 2: TỔNG QUAN

Bảng 2 4: Tính bền nhiệt, tính bền pH và các tính chất động học của các protease dạ dày của các loài cá khác nhau [22]

Enzyme Nguồn thu nhận

Nhiệt độ tối thích ( o C)

pH tối thích

Giá trị

K m

Năng lượng hoạt hóa Arrhenius (Kcal/mol)

Nguồn tham khảo

Cá tuyết đảo băng

Cá tuyết đảo băng

Cá tuyết Bắc Cực

Cá ốt có vảy nhỏ Bắc Cực

Cá tuyết Đại Tây Dương

Cá ốt có vảy nhỏ Bắc Cực

Cá tuyết Đại Tây Dương

Cá hồi có đốm đen và hai vạch

đỏ kéo dài từ mõm đến đuôi

3.00 3.75 4.75

- 0.124

- 0.517

- 1.140 0.860 0.400

- 0.175

- 0.033

- 0.060 1.330

- 4.10

Noda and Murakami (1981)

Xy et al (1996)

Noda and Murakami (1981)

Xy et al (1996) Pavlisko, Rial, Vecchi, and Coppes (1997) Haard, Feltham, Helbig and Squires (1982)

Han và Shahidi (1995) cũng đã ghi nhận rằng protease từ dạ dày hải cẩu ở trạng thái cố định sẽ có hoạt tính đông tụ sữa thấp hơn so với ở khi nó ở trạng thái tự nhiên Các gastricsin là các aspartyl protease với tính chất enzyme và hoá học tương tự như pepsin (De-Vecchi and Coppes, 1996; Sanchez-Chiang & Ponce, 1981) Sanchez-Chiang and Ponce (1981) đã chiết tách được hai dạng zymogen của các gastricsin từ dạ

dày của một loài cá tuyết (Merluccius gayi) và ghi nhận rằng pH hoạt động của hai

enzyme này là ở 3.0 và chúng vẫn có thể hoạt động khi pH tăng đến 10 Ngoài ra, các ông cũng ghi nhận rằng, khác với các protease của động vật có vú, các enzyme bền ở

pH kiềm và có hoạt tính khác nhau đối với protein và các cơ chất tổng hợp Các kết quả tương tự cũng được ghi nhận ở enzyme giống với gasticisin của cá tuyết Đại Tây Dương (Haard, 1986)

Các protease thu từ ruột và tuyến tuỵ

Các protease từ ruột cá thường được tiết ra manh tràng môn vị (pyloric caeca) hay tuyến tuỵ (Haard, 1994; Walsh & Wilcox, 1970) Các nhà nghiên cứu đã tìm thấy hai loại serine protease ở manh tràng môn vị cá và chúng được đặt tên là trypsin và chymotrypsin (Han, 1993) Ngoài hai enzyme này, các enzyme collagenase, elastase và carboxypeptidase cũng được xác định là có mặt trong ruột cá

Một nghiên cứu về các enzyme protease trong hệ tiêu hoá của các loài cá khác nhau

đã cho thấy rằng các serine protease phân bố ở ruột cá có hoạt tính trong môi trường kiềm cao hơn so với giá trị tương ứng trong môi trường trung tính (Walsh & Wilcox, 1970) Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác cũng chứng tỏ rằng các serine protease từ cá cũng tương tự với các enzyme này ở động vật máu nóng về kích thước phân tử, thành phần amino acid và sự nhạy cảm với các chất có tác động ức chế các serine protease (Haard, 1994; Haard & Simpson, 1994)

• Trypsin và chymotrypsin

Trong các thập kỷ vừa qua, trypsin và các enzyme giống trypsin đã được chiết tách

và xác định ở một loạt các loài cá nước ngọt cũng như nước mặn Trypsin và các enzyme giống trypsin có hoạt tính protease cũng được tinh sạch và định tính ở một số

loài cá, trong đó có loài cá không có bao tử Carassius auratus gibelio (Jany, 1976), cá

mòi (Murakami &Noda, 1981), cá ốt vảy nhỏ (Hjelmeland & Raa, 1982), cá tuyết đảo băng (Greenland cod) (Simpson &Haard, 1984c; Simpson, 1984; Simpson, et al., 1989), cá tuyết Đại Tây Dương (Amiza, Galani, & Owusu-Apenten, 1997; Asgeirsson, Fox, & Bjarnason, 1989; Han, 1993; Simpson, Simith, & Yaylayan, 1989; Simpson, Simpson et al.,1989;Simpson et al., 1990), cá hồi trứng (Uchida, Tsukayama, & Nishide, 1984a, 1984b), cá hồi Đại Tây Dương (Male, Lorens, Smalas, & Torrissen, 1995; Schroder, Willassen, & Smales, 1998), cá hồi bạc (Haard, Dimes, Arndt, &

Chương 2: TỔNG QUAN

Dong, 1996), cá trồng (Martinez, Olsen, & Serra, 1988) và loài Parona signata

(Pavlisko, Rial, Vecchi, & Coppes, 1997)

Trypsin và các enzyme giống trypsin có phân tử lượng khoảng 25000 Da (Cohen & Gertler, 1981) Simpson, Simpson và các cộng sự (1989) cũng đã ghi nhận phân tử lượng trypsin từ cá tuyết Đại Tây Dương và cá tuyết đảo băng tương ứng là 24,000,

24000 và 23500 Da Nếu đa phần các trypin thu nhận từ động vật có vú là bền với pH acid thì ngược lại, các trypsin của hầu hết các loài cá đều bền ở pH kiềm (De-Vecchi and Coppes, 1996; Haard, 1992; Haard & Simpson, 1994) Tính bền nhiệt của các trypsin thu từ cá khác nhau tuỳ thuộc vào loài cũng như và điều kiện ủ (De-Vecchi & Coppes, 1996) Tính chất động học của các trypsin thu từ ba loài cá và bò đã được khảo sát và kết quả cho thấy số lượng các phản ứng esterase và amidase của trypsin từ cá cao

hơn so trypsin từ bò (Simpson, 1984; Simpson et al., 1989) Trong khi đó, năng lượng

hoạt hoá Arrhenius của trypsin từ cá thấp hơn so với các trypsin thu từ động vật có vú

và điều này được lý giải là do phản ứng của chúng ít nhạy cảm với sự sai khác về nhiệt

độ hơn (Haard, 1992; Haard and Simpson, 1994)

So với trypsin, chymotrypsin thu từ cá vẫn còn ít được nghiên cứu (Haard, 1994), Nghiên cứu đầu tiên về nó do Overnell thực hiện vào năm 1973 (De-Vecchi and Coppes, 1996) Việc tinh sạch và định tính các chymotrypsin từ các loài cá biển đã được tiến hành ở cá ốt vảy nhỏ, cá trích (Kalac, 1978), cá nhám góc có gai (Ramakrishan, Hultin, & Atallah, 1987) và cá tuyết Đại Tây Dương (Asgeirsson & Bjarnason, 1991) Kết quả cho thấy chymotrypsin thu từ cá tuyết Đại Tây Dương có hoạt tính cao hơn ở cả cơ chất dạng ester và cơ chất dạng amide (Asgeirsson & Bjarnason, 1991) Các nhà nghiên cứu đã giải thích rằng sự khác biệt về các tính chất động học của chymotrypsin thu từ cá tuyết Đại Tây Dương so với chymotrypsin thu từ động vật có vú là do khả năng đáp ứng với nhiệt độ môi trường sống thấp của nó

Một số tài liệu cũng đã ghi nhận sự có mặt cũng như đặc tính của trypsin và chymotrypsin ở các loài cá nước ngọt như cá chép (Cohen & Gertler, 1981) và cá tilapia lai (El-Shemy, 1997) Theo đó, cá tilapia lai có hoạt tính esterase cao hơn so với hoạt tính amidase ở điều kiện hoạt động tối thích là pH 9.0 và nhiệt độ 40oC C Fong, Chan và Lav (1998) đã tinh sạch hai loại chymotrypsin (I và II) từ gan tuỵ của cá chép

ăn cỏ và nhận thấy rằng chúng nhạy cảm với các chất ức chế trypsin như đậu nành và phenylmethylsulphonyl fluoride Các kết quả này tương tự cũng thu được khi Kristjansson và Nielson (1992) chiết tách hai loại chymotrypsin từ manh tràng môn vị của loại cá hồi có đốm đen và hai vệt hơi đỏ kéo từ mõm đến đuôi

Tính bền nhiệt, tính bền pH và các tính chất động học của các protease thu từ ruột

của động vật thuỷ sản được trình bày trong Bảng 2 5

Bảng 2 5: Tính bền nhiệt, tính bền pH và các tính chất động học của các protease thu từ ruột của động vật thuỷ sản [22]

Enzyme Nguồn thu nhận

Nhiệt độ tối thích ( o C)

pH tối thích

Giá trị

K m

Năng lượng hoạt hóa Arrhenius (Kcal/mol)

Nguồn tham khảo

Chymotrypsin Cá tuyết đảo băng

Cá tuyết đảo băng

Cá tuyết Đại Tây Dương

Cá tuyết Đại Tây Dương

Cá tuyết Đại Tây Dương

Cá tuyết Đại Tây Dương

Cá tuyết Đại Tây Dương

Cá hồi Đại Tây Dương

Parona signata

Cá trê

Cá trê Con hàu Tôm trắng

1.670 0.260 1.480 0.077 1.480

- 0.510

-

-

- 0.226

- 1.600

8.20 7.00 12.80 7.57 8.90

Simpson (1984), Simpson et al (1989)

Simpson and Haard (1984b)

Simpson (1984), Simpson et al (1989) Asgeirsson et al (1989)

Simpson and Haard et al (1990)

Han (1993) Asgeirsson and Bjarnason (1991) Reece (1988)

Pavlisko, Rial, Vecchi and Coppes (1997) Garcia-Carreno and Haard (1993)

Garcia-Carreno et al (1994)

Tasao and Nagayama (1991)

Hernandez-Cortes et al (1997)

Chương 2: TỔNG QUAN

Ở động vật giáp xác, tụy tạng hay tuyến trung tràng là cơ quan đảm nhiệm tất các chức năng của gan và lá lách ở động vật có vú; và là nơi sản sinh ra các protease tiêu hoá (Tsai, Lu, & Chuang, 1991) Trypsin được tìm thấy ở động vật giáp xác và các loài động vật có vỏ (Garcia-Carreno & Haard, 1993; Kim et al., 1992; Osness, 1985); còn chymotrypsin thì được tìm thấy ở sò (Le-chevalier, Sellos, & Van-Wormhoudt, 1995), bào ngư (Groppe & Morse, 1993) và tôm trắng (Hernandez-Cortes, Whitaker, & Garcia-Carreno, 1997)

Tasao và Nagayama (1991) đã chiết tách hai enzyme giống trypsin từ con hào Các enzyme protease tiêu hoá này được xem là nguyên nhân chủ yếu của sự tự phân các mô của các sinh vật này sau khi đánh bắt (Kawamura, Nishimura, Matoba, & Yunezawa, 1984; Osness, 1985; Salem et al., 1970) Một cách gián tiếp, chúng cũng nguyên nhân gây ra hiện tượng đốm đen ở tôm và tôm hùm (Gopakumara, 1990; Wang, Taylor, & Yan, 1992, Zotos & Taylor, 1996) Bên cạnh đó, Tsai, Chuang và Chuang (1986) cũng

đã ghi nhận rằng chymotrypsin từ động vật giáp xác có đặc tính là chỉ thuỷ phân một số

cơ chất tổng hợp do nó có tính đặc hiệu trong khoảng hẹp Tuy nhiên, sự tồn tại hoạt tính chymotrypsin trong tuyến tiêu hoá của các loài giáp xác mười chân hiện vẫn còn là một vấn đề tranh cãi

• Các collagenase và elastase

Các collagenase này có bản chất là các serine protease có khả năng thuỷ phân collagen khác nhau Chức năng sinh lý của chúng ở một số sinh vật phụ thuộc vào khả năng tiêu hoá của chúng (Kristjansson, Gudmundsdottir, Fox, & Bjarnason, 1995) Các enzyme này khác với các collagenase thật sự trong các mô (vốn thuộc nhóm metallo-protease) Do có sự khác biệt về các vị trí hoạt động, chúng có khả năng thuỷ phân ba loại phân tử tropocollagen (I, II và III) (Zefirova, Mamaeva, Chupor, Valuev, & Plate, 1996) và thể hiện cả hoạt tính giống với trypsin cũng như chymotrypsin (Haard, 1994; Haard & Simp- son, 1994; Zefirova et al., 1996)

Các collagenase đã được chiết tách từ hệ tiêu hoá của nhiều loài động vật thuỷ sản khác nhau, gồm cua kéo đàn (Elsen & Jeffrey, 1969; Grant, Sacchettini, & Walgus, 1983), tôm pan-đan nước ngọt (Baranowski, Nip, & Moy, 1984), tôm đồng (Garcia-Carreno et al., 1994), sam (Gerasimova & Kupina, 1996; Zefirova et al., 1996) và cá tuyết Đại Tây Dương (Krisjansson et al., 1995) Các enzyme này hầu hết hoạt động trong khoảng pH 6.5 – 8.0 và bị vô hoạt ở các giá trị pH thấp hơn 6.0 (Haard & Simpson, 1994) Ngoài ra, Zefirova và các cộng sự (1996) đã ghi nhận rằng việc sử dụng các enzyme này bị hạn chế về nhiệt độ do khả năng bền nhiệt của chúng thấp, chúng có thể mất hoạt tính ở nhiệt độ 40oC

Nhiều nhóm serine protease có khả năng thuỷ phân collagen được xem là nguyên nhân gây ra quá trình tự phân các mô của các loài giáp xác trong quá trình tồn trữ sau thu hoạch (Baranowski et al., 1984; Kawamura et al., 1984; Salem, Youssef, El-Nakkadi, & Bekheti, 1970)

Các elastase thu từ dịch tuỵ cũng thuộc nhóm serine protease (Asgeirsson & Bjarnason, 1993; De-Vecchi & Coppes, 1996) và có khả năng tiêu hoá các protein dạng sợi đàn hồi của các mô liên kết như elastin (Asgeirsson & Bjarnason, 1993) Tuy nhiên, Shotton (1970) lại cho rằng elastase chỉ có thể tiêu hoá các protein có bản chất giống elastin Ngoài ra, các elastase cũng đã được thu nhận từ dạ dày các loài cá biển và cá nước ngọt như cá chép (Cohen & Gertler, 1981), cá trê (Clark, Macdonald, & Stark, 1985) và cá tuyết Đại Tây Dương (Asgeirsson & Bjarnason, 1993; Asgeirsson, Leth-Larsen, Thorolfsson, Nedertoft, & Hojrup, 1998; Gildberg and Overbo, 1990; Raa & Walther, 1989) Hoạt tính elastase tuỵ tạng của một số loài cá biển và cá nước ngọt cũng đã được ghi nhận (Yoshinaka, Sato, Tanaka and Ikeda, 1985) Trong khi đó, Asgeirsson và Bjarnason (1993) đã quan sát được rằng elastase thu từ cá tuyết sẽ thuỷ phân ra được các amino acid có tính kỵ nước trung bình thấp hơn so với các sản phẩm tương ứng sinh ra dưới tác động của elastase thu từ lợn

Các protease trung tính và kiềm ở mô cơ

Các protease nội bào trong các mô cơ chủ yếu định vị tại các kết cấu mô cơ và trong mạng lưới ngoại bào của các mô cơ (Haard, 1994) Trong các kết cấu mô cơ, các enzyme này có thể tìm thấy trong chất lỏng nội bào và trong các thớ thịt hay liên kết với các các bào quan khác (Kolodziejska & Sikorski, 1996) Các protease trong các kết cấu

mô cơ có thể được phân thành các loại: các lysosomal proteinase, các proteinase kiềm, các proteinase trung tính (Haard, 1994) và các metallo-proteinase (Asgeirsson, Hartemink, & Chlebowski, 1995; Kolodziejska & Sikorski, 1996)

Các lysosomal proteinase như cathepsin A (caroxypeptidase A), cathepsin B (caroxypeptidase B), cathepsin D, các cathepsin H và L cũng được thu nhận và xác định

ở động vật thuỷ sản (Benjakul, Morrissey, Seymour, & An, 1997; Benjakul, Seymour, Morrissey, & An, 1996; Capasso et al., 1999; Gildberg, 1988; Hameed & Haard, 1985; Sherekar, Gore, & Ninjoor, 1988; Sukarno, Takahashi, Hatano, & Sakurai, 1995; Zeef

& Dennison, 1988) (tham khảo Bảng 2 6) Ngoại trừ cathepsin D là một aspartic

proteinase với hoạt động tối thích trong vùng acid (Haard, 1994; Kolodziejska & Sikorski, 1996), tất cả các lysosomal proteinase đều là các serine hay cysteine thiol proteinase với pH hoạt động tối thích trong vùng kiềm Gildberg (1998) đã nghiên cứu

và ghi nhận rằng mô cơ cá chứa một lượng cathepsin D cao gấp 10 lần so với giá trị tương ứng ở mô cơ động vật có vú Các nhà nghiên cứu cho rằng sở dĩ hàm lượng

có liên quan đến quá trình biến tính các protein mô cơ (Ouali, Garrel, Obled, Deval, & Valin, 1987)

Cathepsin C hiện vẫn chưa thể thu nhận được từ mô cơ cá Tuy nhiên, Hameed và Haard (1985) đã tìm thấy enzyme này ở gan tuỵ của mực ống Đại Tây Dương Trong khi đó, Lee, Simpson, và Haard (1982) cũng như Raksakulthai và các cộng sự (1986) cho rằng khả năng chịu được nồng độ muối cao và hoạt tính exopeptidase của enzyme này góp phần tạo ra các mùi vị ưa thích cho các sản phẩm cá lên men

Các proteinase kiềm trong mô cơ cá cũng đã được nghiên cứu một cách kỹ lưỡng

(tham khảo Bảng 2 6) Các enzyme này dường như định vị trong thớ thịt của mô cơ,

trong các ty thể hoặc liên kết với các sợi myo (Makinodan, Kyaw, & Ikeda, 1982; Makinodan et al., 1983) Các enzyme này có một đặc tính riêng là hoạt tính enzyme của chúng không có hoặc có nhưng rất thấp trừ phi dưới nhiệt độ sinh lý cao (60 – 65oC) hay được kích hoạt bởi các tác nhân gây biến tính protein như urea, các acid béo hoặc các tác nhân tẩy rửa (Toyohara, Nomata, Makinodan, & Shimizu, 1987)

Trong những năm gần đây, các proteinase kiềm được xem là tác nhân chính cắt các chuỗi myosin lớn ở gel cá (Kolodziejska & Sikorski, 1996) Trong quy trình sản xuất surimi, chất lượng sản phẩm phụ thuộc rất lớn vào các enzyme này Surimi được hình thành bằng cách lấy phần thịt cá đã tách xương rửa với nước hay dung dịch muối rất loãng ở nhiệt độ 5 – 10oC và kèm theo sự bổ sung các chất bảo vệ khi đông lạnh thích hợp (Shahidi, 1993) Nishimoto và các cộng sự (1987) đã ghi nhận rằng sự yếu đi của gel cá trong quá trình chế biến các sản phẩm surimi là do hoạt tính cao của các proteinase kiềm này trong gel surimi Sự biến tính của các sợi myo protein này tác động xấu đến chất lượng surimi, về cơ bản là làm giảm độ mạnh của gel (Jiang, Lec, Tsao, & Lee, 1997)

Trong số rất nhiều các proteinase có mặt trong mô cơ, các cysteine endoproteinase được xem là tác động mạnh nhất đến cấu trúc do chúng bền nhiệt và có khả năng cắt các liên kết peptide bên trong để tạo ra các chuỗi peptide ngắn hơn (An, Peters, & Seymour, 1996) Hoạt tính athepsin L chủ yếu làm yếu cấu trúc surimi trong quá trình chế biến (An, Seymour, Wu, & Morrissey, 1994; Jiang et al., 1997) Chế biến các sản phẩm dạng gel từ cá ở nhiệt độ khoảng 60oC có thể làm sản phẩm mềm đi thấy rõ và tác

động này được gọi là tác động “modori” Hiện tượng này có liên quan đến sự biến tính các sợi myo protein ở cá và đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo gel (Kolodziejska & Sikorski, 1996) Loại protease tham gia vào tác động “modori” khác nhau tuỳ thuộc vào từng loài cá và trong hầu hết là các serine protease Gần đây, Kinoshita, Toyohara và Shimizu (1990a) đã xác định được bốn loại proteinase trung tính khác nhau có thể gây biến tính chuỗi myosin lớn, được gọi là “các proteinase gây

ra tác động modori” Chúng có bản chất là các metallo-proteinase trung tính

Trong mô cơ cá, quá trình tự phân có thể đạt cực đại một hay hai lần trong các điều kiện pH acid và/hoặc kiềm (Haard, 1994) Tuy nhiên, pH cuối cùng của thịt cá hoặc động vật có vỏ nằm trong 6 – 7 Các nghiên cứu cũng ghi nhận rằng có một số enzyme như các calpain và các proteinase gây ra tác động modori có pH hoạt động tối thích ở vùng gần trung tính Các enzyme này được xếp vào nhóm các proteinase mô cơ trung tính Trong đó, các proteinase trung tính ở mô cơ liên kết với xương thuộc nhóm các proteinase được hoạt hoá bởi ion Ca2+, được gọi là các calpain Các enzyme này dường như nằm trong thớ thịt và được xem là tác nhân giúp giải phóng các filament dày và mỏng bằng cách hoà tan đĩa Z (Haard, 1994)

Collagenase mô cơ (còn được gọi là collagenase tế bào kế) thuộc họ các metalloproteinase (Bracho & Haard, 1995) còn các collagenase ruột lại thuộc nhóm các serine proteinase (Haard, 1994) Bracho và Haard (1995) cho rằng các enzyme này liên quan đến sự thuỷ phân một phần collagen và các protein ngoại bào khác và thông qua

đó làm hỏng cấu trúc mô cơ của các sản phẩm từ cá biển Các nghiên cứu gần đây của Okamoto, Otsuka-Fuchino, Horiachi, Tamiya, Matsumoto và Tsuchiya (1993) cũng xác định rằng các metalloproteinase từ mô cơ mực ống là hai loại collegenase, gồm mayosinase I và mayosinase II Ngoài ra, các tác giả này cũng ghi nhận các enzyme này hoạt động tối thích ở pH 7.0 và nhiệt độ 40oC (Okamoto et al., 1993) Xét về phân tử lượng, sự phụ thuộc của hoạt tính vào canxi, pH hoạt động tối thích và tính đặc thù về

cơ chất, hai loại collagenase mô cơ chiết tách từ cá rockfish Thái Bình Dương tương tự với các metallo-proteinase (Bracho & Haard, 1995)

Chương 2: TỔNG QUAN

Bảng 2 6: Các proteinase thu từ mô cơ của động vật thuỷ sản [22]

Cathepsin A Cathepsin B Cathepsin H Cathepsin L Cathepsin C Cathepsin D Các proteinase đa xúc tác Các proteinase phụ thuộc canxi Các metallo proteinase trung tính Collagenase từ mô cơ

Cá chép Tilapia

Cá hồi Nước rửa surimi Mực ống

Cá sống vùng băng Bắc Cực

Cá hồi Tilapia

Cá giếc, cá chép Mực ống

2.2.2.2.Các enzyme với hoạt tính chitinolytic

Các enzyme với hoạt tính chitinolytic gồm các chitinase và các lysozyme (Clark, Quayle, Macdonald, & Stark, 1988)

Các chitinase được chia tiếp thành chitinase (E.C.3.2.1.14) và chitobiase (E.C.3.2.1.30) (Danulat & Kausch, 1984; Clark et al., 1988) Chitinase là một endo- β-N-acetylglucosaminidase giúp thuỷ phân một cách ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 trong các poly- và oligo-saccharide của N-acetylglucosamine (Fang, Lundblad, Lind, & Slettengren, 1979; Clark et al., 1988; Flach, Pilet, & Jolles, 1992) Dimer gồm phân tử N-acetylglucosamine liên kết qua β-1,4 (chitobiose) là sản phẩm thuỷ phân chính dưới tác động của chitinase Chitobiase (exo-N-acetyl-b-d-glucosaminidase hay NAGase) thuỷ phân một cách đặc hiệu các liên kết β-1,4 của các dimer này thành các phân tử N-acetylglucosamine (Clark et al., 1988; Flach et al., 1992; Lindsay, 1984)

Các lysozyme về bản chất là các chitinase và thường được gọi là các acetylmuramylhydrolase (E.C.3.2.17), có khả năng phân huỷ thành tế bào của vi khuẩn gram dương (Clark et al., 1988; Fang et al., 1979) do chúng có khả năng thuỷ phân liên kết β-1,4 giữa C-1 của N-acetylmuramic acid và C-4 của N-acetylglucosamine ở thành

N-tế bào (Koga, Mitsutomi, Kono, & Matsumiya, 1999) Trong các loài ở biển, hoạt tính chitinolytic giúp các côn trùng và các loài giáp xác lột xác

Theo một số nghiên cứu khác, hoạt tính chitinase và chitobiase được phát hiện trong đường ruột của một số loài ở biển Các enzyme này cũng được thu nhận từ hệ tiêu hoá

và các cơ quan liên quan ở cá (Danulat, 1986; Danulat & Kausch, 1984; Fang et al., 1979; Kono, Matsui, Shimizu, & Koga, 1990a; Lindsay, 1984; Lindsay & Gooday, 1985; Matsumiya & Mochizuki, 1996; Rehbein, Danulat, & Leineman, 1986), động vật

có vỏ và phế liệu trong quá trình chế biến động vật có vỏ (Koga et al., 1990a, 1990b; Jung, Hsing, Ling, Tien, & Lee, 1991; Suresh & Chandrasekaran, 1998; Wong, Chiou,

& Chang, 1997), gan của mực ống (Matsumiya & Mochizuki, 1997) và nước bọt bạch tuột (Grisley & Boyle, 1990) Tuy nhiên, nguồn gốc của các chitinase vẫn còn là một vấn đề tranh cãi Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng chúng là các enzyme nội bào sản sinh

ở cá nhưng một số khác lại cho rằng các enzyme này có nguồn gốc từ hệ vi thực vật của thức ăn hay hệ vi thực vật trong chính hệ tiêu hoá của cá (Clark et al., 1988; James, Probyn, & Seiderer, 1989; Lindsay & Gooday, 1985)

Goodrich và Morita (1977) đã tìm thấy có sự tương quan trực tiếp giữa hàm lượng chitin trong chế độ ăn tự nhiên và hoạt tính chitinase trong dạ dày của một số loài cá

biển như Enophrys bison và Platichthys flesus Ngoài ra, các tác giả cũng kết luận rằng

chitinase của hai loài cá này có nguồn gốc từ vi khuẩn Theo một nghiên cứu tương tự

của Sugita, Yamada, Konagaya và Deguchi (1999), các loài vi khuẩn Aeromonas chiếm

Chương 2: TỔNG QUAN

ưu thế trong đường ruột của các loài cá nước ngọt đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hoá của các sinh vật có thể tiêu hoá chitin Tuy nhiên, Lindsay (1984) đã tìm hiểu về các enzyme trong bao tử hay ruột trước của 29 loài cá nước ngọt và cá nước mặn và không phát hiện thấy có bất kỳ mối liên hệ giữa hoạt tính chitinase với thói quen sử dụng chitin của chúng Các nghiên cứu về cá tuyết của Lindsay và Gooday (1985) đã cho thấy hàm lượng chitinase không có liên quan đến lượng chitin sử dụng cũng như số lượng vi khuẩn chitinolytic Qua đó, các nhà nghiên cứu đã kết luận rằng các chitinase trong cá tuyết Đại Tây Dương là các enzyme nội bào chủ yếu được tiết ra

từ các tuyến tiêu hoá Điều này cũng đã được chứng tỏ qua một nghiên cứu khác của Danulat (1986) Theo đó, hoạt tính chitinase vẫn có thể phát hiện trong mô dạ dày, manh tràng môn vị và mô ruột của cá tuyết Đại Tây Dương sau khi chúng bị bỏ đói 3 tuần Các chitinase này (chitinase, chitobiase và các lysozyme) cũng có chức năng gián tiếp trong quá trình tiêu hoá, giúp phá vỡ cấu trúc xương ngoài của con mồi khi không

có mặt các cấu trúc cơ học, qua đó giúp dịch tiêu hoá của cá xâm nhập vào các mô mềm bên trong (Koga, Mizuki, Ide, Kono, Matsui, & Shimizu, 1990; Lindsay & Gooday, 1985; Matsumiya & Mochizyki, 1997) Ở các loài thực vật bậc cao hơn, cá và động vật

có vú, các chitinase thường được sử dụng để chống lại các sinh vật và côn trùng gây bệnh (Flach et al., 1992; Koga et al., 1999; Kono et al., 1990a) Hơn nữa, các vi sinh vật sản sinh ra chitinase để tiêu hoá các thành phần dinh dưỡng có chứa chitin hay để thuỷ phân một phần thành tế bào chitin trong quá trình phát triển tế bào (Alexander & Ingram, 1992; Koga et al., 1999)

Các chitinase được phát hiện ở các vi sinh vật, rong biển và các thực vật bậc cao hơn có phân tử lượng dao động trong khoảng rộng, từ 25–120 KDa (Koga et al., 1999) Nhìn chung, các chitinase thu từ thực vật là các protein nhỏ và phân tử lượng từ 25 và

40 KDa (Flach et al., 1992) Các chitinase cũng có điểm đẳng điện dao động trong khoảng rộng (Flach et al., 1992; Koga et al., 1999): 3.0 – 10.0 ở các loài thực vật bậc cao; 4.7 – 9.3 ở côn trùng, các loài giáp xác, động vật có vỏ và cá; và 3.5 – 8.8 ở các loài vi sinh vật (Koga et al., 1999) Như vậy, sinh vật chứa chủ yếu các chitinase acid Các chitinolytic enzyme là một công cụ cơ bản để chuyển hoá chitin thành các đơn

vị oligomer mà không cần đến quá trình khử polymer hoá học - vốn cần đến nồng độ cao của acid hydrochloric và do đó gây ra sự không đồng nhất về các đặc tính hoá lý của các sản phẩm này ở dạng thương mại Nghiên cứu về chế phẩm cũng như các tính chất sinh lý của chitin and chitosan oligomer vẫn được xem là một chủ đề rất đáng quan tâm trong lĩnh vực thực phẩm và y học do chúng có khả năng kháng khuẩn và chống lại các khối u, cải thiện khả năng miễn dịch và tránh các bệnh truyền nhiễm (Shahidi, Kamil, & Jeon, 1999) Do đó, các chitinolytic enzyme từ động vật thuỷ sản có tiềm năng ứng dụng rất rộng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Ngoài ra, các enzyme này cũng

có thể được sử dụng thay cho các enzyme vi khuẩn, chủ yếu là nhờ vào khả năng thuỷ phân các thành phần peptidoglycan (một bộ khung carbohydrate chứa các phân tử N-acetyl-δ-glucosamine và N-acetylmuramic acid liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 và các liên kết ngang giữa các peptide) chứa trong thành tế bào vi khuẩn

Gần đây, các enzyme và các lysozyme với tính kháng khuẩn cũng được thu nhận từ

sò điệp Bắc Cực (Chlamys islandica) (Raa, 1997) và một số loài cá Nói chung, các

lysozyme tách chiết từ các động vật thuỷ sinh không xương sống và cá khác với các lysozyme thu từ động vật máu nóng và thực vật, và tại các giá trị nhiệt độ thấp, chúng

có thể có hoạt tính cao hơn gấp 100 lần hoạt tính của enzyme tương ứng của động vật máu nóng như gà Các lysozyme từ các loài ở biển cũng có tính kháng khuẩn tiềm tàng

do phân tử của chúng có bản chất hơi acid (Raa, 1990)

2.2.2.3.Các lipase

Các enzyme lipase hay các acylglycerol acylhydrolase (E.C 3.1.1.3) được định nghĩa như là các enzyme thuỷ phân các liên kết ester giữa các acid béo mạch dài và glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân chia pha dầu-nước (Jensen, 1983) Sự hiện diện, các tính chất và vai trò sinh lý của các lipase ở các động vật thuỷ sản đã được rất nhiều nhà nghiên cứu ghi nhận (Borlongan, 1990; Brockerho & Hoyle, 1965; Divakaran, Kim, & Ostrowski, 1999; Gonzalez-Baro, Heras, & Pollero, 2000; Patton & Quinn, 1973; Senthilvel, Strikar, & Reddy, 1994; Tengjaroenkul, Smith, Caceci, & Smith, 2000; Lie and Lambertsen, 1985) Các lipid acylhydrolase không đặc thù hiểu hiện tác động của nhiều loại lipase khác nhau như các phospholipase cũng được phát hiện ở các sinh vật sống dưới nước (Audrey, Shetty, & Kinsella, 1978; Chawla & Ablett, 1987; Izquierdo & Henderson, 1998)

Các lipase đóng vai trò sinh lý quan trọng trong quá trình tạo thành các acid béo của các dung dịch triacylglycerol (TAG) không tan trong nước, giúp cho quá trình hấp thu

và chuyển hoá qua màng bằng cách chuyển TAG thành các diacylglycerol, các monoacylglycerol phân cực hơn cũng như các acid béo và glycerol (Jensen, 1983) Trừ các trường hợp ngoại lệ, pH hoạt động tối thích cho hầu hết các lipase nằm trong khoảng 7 – 9 Các lipase hoạt động trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 20 – 65oC, nhưng thông dụng nhất là từ 30 – 45oC (Jensen, 1983)

Patton và Nevenzel (1974) cũng tìm thấy hai loại lipase gan tuỵ ở dạng hoạt hoá ở

cá mập, một loại lipase được hoạt hoá một cách không đặc hiệu bởi muối mật có thể đặc hiệu cho các acid béo không bão hoà bất kể vị trí cũng như tính đặc hiệu nhóm cho các ester cơ bản Điều này sau đó cũng được Tocher và Sargent (1984) tìm hiểu sâu hơn trong một nghiên cứu được thực hiện ở loài cá hồi có đốm đen và hai vệt hơi đỏ kéo từ

Chương 2: TỔNG QUAN

mõm đến đuôi (Salmo gairdnerii) Các nhà nghiên cứu cho rằng có hai loại enzyme với

hoạt tính lipase khác nhau trong đường ruột của loài cá này

Gần đây, các loại dầu thu từ các loài ở biển đang rất được quan tâm do chúng có khả năng tác động chống lại bệnh đau động mạch vành tim (Kinsella, 1986; Strom & Raa, 1993) Các tác động có lợi này có được là nhờ vào các poly-acid béo ω-3 không bão hoà (PUFA) – được biết đến với các tên gọi như acid eicosapentaenoic (EPA), acid docosapentaenoic (DPA) và acid docosahexaenoic (DHA) – vốn có mặt trong các loài ở biển Các khía cạnh về dinh dưỡng cũng như công nghệ sản xuất dung dịch acid béo ω-

3 dạng cô đặc đã được Shahidi và Wanasundara (1998) xem xét Các lipase có thể xúc tác cho quá trình ester hoá, thuỷ phân hay trao đổi các acid béo trong các ester (Wanasundara & Shahidi, 1997) Điều này mở ra một khả năng mới cho ngành công nghiệp dầu mỡ trong việc tạo ra các triacylglycerol, các ester và các acid béo mới và trong việc cải tiến chất lượng của những sản phẩm hiện có bằng cách sử dụng các kỹ thuật trao đổi acid béo có lợi Do đó, việc tìm hiểu hoạt tính lipase của các sinh vật sống dưới nước để ứng dụng làm chất xúc tác cho quá trình ester hoá trung gian của dầu cá nhằm sản xuất các triacylglycerol giàu ω-3 PUFA (Simpson et al., 1991)

Trong một phản ứng thuỷ phân dưới tác động xúc tác của lipase điển hình, lipase hoà tan trong một dung dịch đệm nhất định, sau đó dầu được bổ sung vào và được khuấy đều tại một giá trị nhiệt độ định trước Các mẫu sẽ được lấy ra tại những khoảng thời gian cố định cho đến khi mức độ thuỷ phân đạt yêu cầu Cồn được bổ sung để vô hoạt nhanh enzyme và mẫu sẽ được đem định phân để xác định lượng acid béo đã được giải phóng ra Theo đó, mức độ thuỷ phân được xác định (Shahidi & Wanasundara, 1998)

Các nghiên cứu trong những năm gần đây tập trung nhiều vào các lipase vi sinh vật

để ứng dụng trong sản xuất các dung dịch giàu ω-3 PUFA dạng cô đặc thông qua quá trình thuỷ phân dầu cá Tuy nhiên, các PUFA mạch dài là các cơ chất không thích hợp cho hầu hết các lipase thương phẩm trên thị trường do tính đặc hiệu về acid béo (Vilhelmsson, 1997) Các enzyme lipase thu được từ ruột cá tuyết Đại Tây Dương

(Gadus morhua) thuỷ phân chủ yếu các PUFA thành các acid béo mạch ngắn hơn và

cho thấy chúng có tính đặc hiệu acid béo hoàn toàn đối lập với tính chất tương ứng của các enzyme lipase vi sinh vật (Lie & Lambertsen, 1985)

Gần đây, He và Shahidi (1997) cũng như Wanasundara và Shahidi (1997) đã tiến hành quá trình thuỷ phân mỡ hải cẩu và dầu cá hồi dầu dưới tác động xúc tác của lipase-nhằm làm giàu hàm lượng ω-3 PUFA ở dạng các acylglycerol

2.2.2.4.Transglutaminase

Transglutaminase (E.C 2.3.2.13) là một loại enzyme nội bào ở cá, giữ vai trò trong việc tạo thành các liên kết ngang giữa các protein trong quy trình sản xuất surimi (An et al., 1996; Ashie & Lanier, 2000; Nakahara, Nozawa, & Seki, 1999) Nó giúp cải thiện quá trình đông tụ myosin xuất hiện khi tiến hành sản xuất surimi thông qua việc hình thành các liên kết ngang nội bào và ngoại bào giữa các myosin phân tử lượng lớn như mong muốn (Lee, Lanier, Hamann, & Knopp, 1997; Nakahara et al., 1999; Seki et al., 1990) Sự bố trí này (được gọi là “suwari”) là một trong những quá trình quan trọng trong sản xuất các sản phẩm từ surimi Transglutaminase xúc tác cho phản ứng chuyển acyl giữa các nhóm γ-carboxamide của các phần glutamine trong các phân tử protein, các polypeptide và nhiều loại amin cơ bản Khi nhóm ε-amino của lysine và phần lysyl đóng vai trò như một chất nhận acyl, các liên kết ngang giữa các ε-(γ-glutamyl) lysine được hình thành (Kumazawa, Nakanishi, Yasueda, & Motoki, 1996) (Hình 2 4)

Hoạt tính transglutaminase cũng được phát hiện có mặt ở cá tráp đỏ (Pagrus major),

cá hồi có đốm đen và hai vệt hơi đỏ kéo từ mõm đến đuôi (Oncorhynchus mykiss), Pleurogrammus azonus (Muruyama, Nozawa, Kimura, Satake, & Seki, 1995; Yasueda,

Kumazawa, & Motoki, 1994), gan cá minh thái (Theragra cHogramma) (Kumazawa et al., 1996), mô cơ của loài Patinopecten yessoensis, Pandalus nipponensis và mực ống (Todarodes pacificus) (Nozawa, Mamegoshi, & Seki, 1997)

Hình 2 4: Sự hình thành các protein dưới tác động xúc tác của transglutaminase

Do hoạt tính transglutaminase nội sinh ở cá giảm nhanh sau khi đánh bắt và hầu như

bị phá huỷ hoàn toàn trong quá trình lạnh đông nên để đạt được chất lượng surimi cao, quá trình sản xuất nên được thực hiện ngay trên biển Tuy nhiên, chi phí sản xuất khi đó

sẽ cao hơn rất nhiều so với chi phí trên đất liền (An et al., 1996) Để khắc phục vấn đề

Chương 2: TỔNG QUAN

này, các chế phẩm transglutaminase thương mại có thể được sử dụng trong công nghiệp sản xuất surimi

Actival là một chế phẩm transglutaminase hiện có trên thị trường, có thể được dùng

để bổ sung vào các sản phẩm surimi cấp thấp để cải thiện các tính chất đàn hồi của sản phẩm kamaboko thông qua việc tạo thành các liên kết ngang giữa các ε-(γ-glutamyl) lysine trong gel (Oshima, 1996) Gần đây, Ashie và Lanier (2000) cũng đã xem xét tính đặc hiệu của transglutaminase ở cá Các tác động của transglutaminase đến sự hình thành các liên kết ngang được tìm hiểu một cách sâu hơn thông qua việc sử dụng các chất ức chế transglutaminase (Kumazawa, Numazawa, Seguro, & Motoki, 1995) Nói chung, transglutaminase đòi hỏi sự có mặt của canxi để thể hiện hoàn toàn hoạt tính, trong khi đó ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) và NH4Cl là các chất ức chế transglutaminase còn EDTA là một tác nhân tạo phức sự bố trí của các phân tử protein (Kumazawa et al., 1995)

2.2.3 Các enzyme tiêu hoá của cá da trơn

Hiện nay, các nghiên cứu về hệ tiêu hóa của các loài cá nói chung và cá da trơn nói riêng chủ yếu tập trung vào việc khảo sát thói quen về ăn uống của chúng Các hiểu biết

về hệ enzyme tiêu hóa của chúng vẫn còn khá hạn chế

Quá trình tiêu hóa cụ thể của cá da trơn vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ Tuy nhiên, theo Edwin H Robinson (2001), cá da trơn có quá trình tiêu hóa giống với những động vật có cấu tạo dạ dày đơn giản Bộ phận tiêu hóa của cá da trơn gồm có miệng, họng , thực quản, dạ dày, ruột và những bộ phận khác như tụy tạng, gan, và túi mật pH trong dạ dày của cá da trơn thì thay đổi trong khoảng từ 2-4 còn pH trong ruột dao động từ 7-9 Ruột cá có chứa hệ enzyme tiêu hóa gồm các enzyme trypsin, chymotrypsin, lipase và amylase [21]

Kết quả của một nghiên cứu thu nhận protease từ nội tạng của cá ba sa (Pangasius bocourti) cho thấy dịch chiết protease kiềm thu được có tổng hoạt tính cao nhất là 15.79 UI/g chất khô nội tạng khi tiến hành trích ly trong điều kiện là tỷ lệ mẫu/ dung môi trích ly: 1/1, pH: 9.5, nhiệt độ 35oC và thời gian chiết 10 phút [10]

Một nghiên cứu khác được thực hiện trên cá da trơn răng nhọn đã cho thấy hoạt tính

amylase và protease ở các phần khác nhau của nội tạng cá (Hình 2 5 và Hình 2 6)

[32] Theo kết quả này, ta có thể thấy chủ yếu có mặt trong tuỵ tạng còn protease lại phân bố ở cả tuỵ tạng, ruột trước và ruột giữa của loài cá này

Hình 2 5: Hoạt tính amylase ở các phần của nội tạng cá da trơn răng nhọn [32]

Hình 2 6: Hoạt tính protease ở các phần của nội tạng cá da trơn răng nhọn [32]

Khi tiến hành khảo sát hoạt tính của các enzyme có mặt trong các phần khác nhau

của nội tạng cá da trơn Brazil (Pseudoplatystoma coniscans) [28], các nhà nghiên cứu

đã ghi nhận được kết quả như Bảng 2 7 Theo đó, hoạt tính protease và amylase cao nhất là ở bao tử cá còn ruột cá là nơi chứa lượng lipase nhiều nhất

Chương 2: TỔNG QUAN

Bảng 2 7: Hoạt tính của các enzyme có mặt trong các phần khác nhau của nội tạng cá da trơn Brazil (Pseudoplatystoma coniscans)

[28]

Phần xử lý

Hoạt tính protease không đặc hiệu (U/mg protein)

0.60±0.017 1.03±0.022 0.43±0.022 0.46±0.059

0.24±0.11 0.24±0.04 0.33±0.18 0.41±1.47

0.75±0.23 0.56±0.22 0.61±0.25 0.22±0.08

0.60±0.50 0.53±0.45 0.41±0.24 0.19±0.09 Hoạt tính chymotrypsin (U/mg protein)

0.48±0.31 0.40±0.09 0.58±0.27 0.62±0.11

0.83±0.17 1.34±0.33 1.51±0.18 0.97±0.16

1.18±0.41 0.97±0.18 1.21±0.23 0.96±0.18 Hoạt tính lipase (U/mg protein)

5.53±1.04 6.68±1.36 5.89±2.34 14.49±4.80

12.52±1.42 15.05±5.31 28.14±20.66 26.04±13.28

4.96±2.18 8.04±1.24 9.11±7.08 5.78±1.37 Hoạt tính amylase (U/mg protein)

0.023±0.008 0.053±0.010 0.032±0.007 0.027±0.008

0.013±0.005 0.022±0.014 0.021±0.009 0.020±0.016

0.012±0.008 0.029±0.019 0.011±0.004 0.003±0.002

2.3 Các ứng dụng của các enzyme từ động vật thuỷ sản [22]

Cho đến gần đây, việc sử dụng các enzyme thương mại trong công nghiệp thực phẩm vẫn còn rất hạn chế, như trong quá trình lên men cá, trong sản xuất các protein hydrolysate từ cá làm thức ăn chăn nuôi và trong việc làm giảm độ nhớt dính ướt của ngành công nghiệp thịt cá (Borresen, 1992; Haard, 1992; Stenfansson & Steingrimsdottir, 1990)

Mặc dù các ứng dụng truyền thống của các enzyme từ cá đã trở nên thông dụng nhưng một số ứng dụng mới trong thực phẩm đã được nghiên cứu tại nhiều quốc gia như Canada, Đan Mạch, Ai-len, Nhật Bản, Hàn Quốc, Na Uy và Hoa Kỳ Việc tách chiết các enzyme như các deoxyribonuclease, lipase, carboxypeptidase A và B, trypsin, chymotrypsin và elastase từ cá tuyết Đại Tây Dương và tiềm năng ứng dụng chúng vào công nghiệp thực phẩm cũng đã được xem xét (Dixon, 1990)

Việc lựa chọn các enzyme cho một ứng dụng cụ thể được dựa trên giá thành và tính sẵn có cũng như nhiệt độ và pH hoạt động tối thích, tính đặc hiệu cơ chất, độ bền và độ nhạy cảm với các tác nhân ức chế hay hoạt hoá (Simpson & Haard, 1984a) Tuy nhiên, việc sử dụng các phụ phẩm từ biển như các nguồn cung cấp enzyme công nghiệp gặp hạn chế do tính sẵn có theo mùa vụ, sự khác biệt về hàm lượng và/hoặc hoạt tính do tình trạng dinh dưỡng và bản chất dễ hư hỏng của nguyên liệu thô (Simpson et al., 1991) Tuy nhiên, tính sẵn có của rDNA chymosin với giá thành thấp trên thị trường là nguyên nhân làm cho hướng nghiên cứu enzyme thay thế rennet bị loại bỏ

Bảng 2 8 tóm tắt các ứng dụng thực phẩm và các lĩnh vực khác của các enzyme

của một số loài động vật thuỷ sản

2.3.1 Biến tính có chọn lọc các mô của cá và các động vật không xương sống

Do các khác biệt cơ về thành phần hoá sinh của da và mô cơ, việc dùng enzyme để loại bỏ lớp da và vẫn giữ nguyên vẹn phần mô cơ là một hướng nghiên cứu khả thi (Raa, 1985; Raa & Gildberg, 1976; Raa, Hjelmeland, & Gildberg, 1985; Strom & Raa,

1982, 1993) Điều này có thể cho phép các enzyme được sử dụng như là một công cụ đặc hiệu trong các quy trình chế biến thực phẩm nhằm loại bỏ hoặc điều chỉnh cấu trúc một số mô nhất định (Gildberg, 1993)

2.3.1.1.Tách loại da cá bằng kỹ thuật enzyme

Các enzyme có hoạt tính protease nội bào thu từ cá có thể sử dụng để tách bỏ da cá Đây có thể được xem là một phương pháp thay thế cho các phương pháp xử lý cơ học hoặc hoá học vốn thường gây tổn hại hoặc làm giảm khả năng thu hồi sản phẩm (Haard