Xây dựng quy trình sản xuất và bảo quản chế phẩm bifidobacterina

Hơn nữa, bifidobacteria được xem là phương pháp chữa bệnh bằng probiotic, giúp xây dựng và kích thích cơ thể tạo rào chắn miễn dịch để chống các tác nhân gây hại: chất gây ung thư, vi kh

Đại Học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

************

NGUYỄN MINH KHANG

XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT VÀ BẢO

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI

VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI

TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MNH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH

CÔNG TY CỔ PHẦN VIỆT Á

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS HOÀNG QUỐC KHÁNH

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ, TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngày….tháng….năm 2008

LỜI CẢM ƠN

§ Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường

§ Đặc biệt cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Hoàng Quốc

Khánh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn theo cách tốt nhất

§ Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập

Tôi xin gởi lời chúc sức khỏe đến tất cả các thầy cô và các anh chị

Tp.HCM, Tháng 08 năm 2008

Nguyễn Minh Khang

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGUYỄN MINH KHANG Phái: Nam

Năm trúng tuyển: 2006

1 TÊN ĐỀ TÀI: “Xây dựng qui trình sản xuất và bảo quản chế phẩm bifidobacteria”

2 NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG

• Phân lập chủng vi khuẩn từ nguồn nguyên liệu sữa bột nhập khẩu Nestle

• Định danh chủng vi sinh vật được phân lập bằng phương pháp sinh học phân tử

• Xác định điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn bifidobacteria

• Chọn và tối ưu hóa thành phần môi trường huyết thanh sữa để nuôi cấy

vi khuẩn bifidobacteria

• Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bifidobacteria dạng bột bằng phương pháp sấy phun

TÓM TẮT

Bifidobacteria đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao sức đề kháng của con người Hơn nữa, bifidobacteria được xem là phương pháp chữa bệnh bằng probiotic, giúp xây dựng và kích thích cơ thể tạo rào chắn miễn dịch để chống các tác nhân gây hại: chất gây ung thư, vi khuẩn gây bệnh…

Hiện nay, vi khuẩn bifidobacteria được ứng dụng rất phổ biến trong ngành công nghiệp chế biến sữa, bởi những tác động có lợi cho sức khỏe con người Các chế phẩm probiotic trên thị trường hiện nay, hoàn toàn chưa bổ sung vi khuẩn bifidobacteria và chi phí để nuôi cấy loài vi khuẩn này quá tốn kém

Trong nghiên cứu này, vi khuẩn bifidobacteria được phân lập từ sữa bột nhập khẩu Nestle và được định danh bằng phương pháp PCR Nguồn nguyên liệu rẻ tiền,

dễ kiếm là bột cheese whey (huyết thanh sữa) được sử dụng trong thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn bifidobacteria

Các nhân tố tăng trưởng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp tế bào bifidobacteria bao gồm cao nấm men, peptone, glucosamine, cao thịt bò, trytone và các khoáng chất có trong huyết thanh sữa Trong thí nghiệm này, chúng tôi xây dựng qui trình sản xuất bằng cách chọn và tối ưu hóa ba nhân tố tăng trưởng: cao nấm men, peptone và N – acetyl D Riêng các thành phần khác của môi trường sẽ giữ cố định không đổi

Kết quả thành phần môi trường sau khi tối ưu

Huyết thanh sữa 50 mg ml-1

Kết hợp với các điều kiện nuôi cấy tốt nhất đã khảo sát, chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn bifidobacteria trên máy lắc ổn nhiệt ở 37oC, pH 6,8, tốc độ lắc 60rpm và sau 18 giờ mật độ tế bào đạt 3,8x109 CFU ml-1

Để sản xuất chế phẩm bifidobacteria, chúng tôi thu nhận sinh khối bằng cách

ly tâm dịch khuẩn (5500 vòng/phút, 20 phút), sau đó rửa lại bằng dung dịch điệm phosphate pH 7,0 Tác nhân vi bao được sử dụng là whey protein Quá trình sấy phun được cài đặc nhiệt độ đầu vào 150oC và nhiệt độ đầu ra của dòng sản phẩm đo được là 98oC Kết quả cho thấy, khi sử dụng hàm lượng chất vi bao 20%, hiệu xuất thu hồi đạt 43% và tỷ lệ tế bào sống trong chế phẩm bifidobacteria là 9,747x106 CFU g-1 Sau 10 ngày bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 4oC, khả năng sống của tế bào giảm đáng kể còn 1,28x106 CFU g-1 và ngày thứ 20 chỉ còn 4,75x105 CFU g-1

ABSTRACT

Bifidobacterium play an important role in human heath including the

enhancement of body resistance against the diseases There are some experimental evidences that certain bifidobacteria may actually protect the host from carcinogentic caused by intestinal actions flora Bifidobacteria may exert protective intestinal action through various mechanisms and represent promising advances in the fields of prophylaxis and therapy

In this study, Bifidobacterium were isolated from the Nestle powdered milk

We used the PCR method with different primers (g-Bifid-F and g-Bifid-R) to detect

the Bididobacterium genus We dertermined some potential growth factors affecting

on their bifidus growth such as yeast extract, peptone and glucosamine Cells concentration were determined by measuring the optical density at 600nm (OD600) The effect of the optimal culture conditions on growth in cheese whey was also evaluated Whey supplemented with N-acetyl-D-glucosamine (0,66 mg ml-1), peptone (7,2 mg ml-1) and yeast extract (10,4 mg ml-1) at pH 6,8 and 37oC serves as

an inexpensive medium for the growth of bifidobacteria

The productivity of the cell mass was 3,8x109 CFU ml-1 at 18h after inoculation Comparisons of the effect of carrier concentrations revealed the spay-drying at whey proteins 20% (w/w) resulted the highest survival of bifidobacteria

MỤC LỤC

PHẦN TRANG

Trang bìa i

Trang tựa ii

Lời cảm tạ iii

Tóm Tắt iv

Mục lục vi

Danh sách các bảng xi

Danh sách các hình xiii

Danh sách các biểu đồ xiv

Danh sách các đồ thị xv

Danh sách các sơ đồ xvi

Danh sách các chữ viết tắt xvii

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu 1

1.3 Nội dung 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ BIFIDOBACTERIA .3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Đặc điểm sinh lý 4

2.1.4 Đặc điểm di truyền 6

2.1.5 Đặc điểm sinh hóa và nhu cầu dinh dưỡng 8

2.1.5.1 Đặc điểm sinh hóa 8

2.1.5.2 Nhu cầu dinh dưỡng 8

2.1.5.3 Chuyển hóa sắt 10

2.1.5.4 Chuyển hóa vitamin 10

2.1.5.5 Sản xuất acid amin 10

2.1.5.6 Sản xuất chất kháng sinh và kháng khuẩn .10

2.2 ĐẶC ĐIỂM ENZYME VÀ CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA ĐƯỜNG HEXOSE 11

2.2.1 Đặc điểm enzym 11

2.2.2 Con đường chuyển hoá các hexose 11

2.3 SỰ PHÂN BỐ CỦA GIỐNG BIFIDOBACTERIA 13

2.3.1 Tồn tại trong ruột người 13

2.3.2 Tồn tại trong động vật 15

2.3.3 Trong môi trường xung quanh 16

2.4 ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA 16

2.4.1 Probiotic 16

2.4.2 Prebiotic 16

2.4.3 Synbiotic 17

2.5 CÁC ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA 18

2.5.1 Tăng cường hệ miễn dịch 18

2.5.2 Giảm bớt triệu chứng dị ứng lactose 19

2.5.3 Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy 19

2.5.4 Ngăn ngừa ưng thu 20

2.5.5 Kháng lại vi khuẩn gây bệnh 20

2.6 PHÂN LẬP VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA 21

2.6.1 Môi trường không chọn lọc 22

2.6.2 Các môi trường chọn lọc 22

2.6.3 Môi trường phân biệt 24

2.7 PHÁT HIỆN BIFIDOBACTERIA THEO HÌNH THÁI TẾ BÀO 25

2.7.1 Thử nghiệm fructose-6-phosphate phosphoketolase (F-6-ppk) 26

2.7.2 Xác định giống bifidobacteria bằng phương pháp PCR 27

2.8 GIỚI THIỆU KỸ THUẬT VI BAO .30

2.8.1 Định nghĩa .30

2.8.2 Tác nhân vi bao 30

2.8.2.1.Sấy thăng hoa 31

2.8.2.2 Sấy phun 32

PHẦN 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 35

3.1.1 Giống và môi trường phân lập 35

3.1.2 Hóa chất 35

3.1.3 Thiết bị 37

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 38

3.2.2 Phân lập vi sinh vật kỵ khí 39

3.2.2.1 Tạo khuẩn lạc đơn trên các môi trường 39

3.2.2.2 Cấy chuyền vi khuẩn và làm thuần chủng 40

3.2.2.3 Cấy chuyền giữ giống trong ống thạch sâu 40

3.2.3 Xác định giống bifidobacteria 40

3.2.3.1 Quan sát hình thái, khả năng di động và xác định gram của vi sinh vật 40

3.2.3.2 Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn cacbonhydrat 40

3.2.4 Xác định giống bifidobacteria bằng phương pháp PCR 41

3.2.4.1 Tách DNA (Tủa bằng isopropanol) 41

3.2.4.2 Phản ứng PCR 41

3.2.4.3 Điện di 42

3.3 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 43

3.3.1 Xác định pH ban đầu của quá trình nuôi cấy 43

3.3.2 Xác định nhiệt độ của quá trình nuôi cấy 44

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ lắc đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn

bifidobacteria 44

3.3.4 Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa số khuẩn lạc vi khuẩn và độ đục bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 45

3.4 TỐI ƯU HOÁ THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG HUYẾT THANH SỮA BẰNG PHƯƠNG PHÁP TUYẾN TÍNH 46

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của glucosamine đến tốc độ tăng trưởng 46

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của cao nấm men đến tốc độ tăng trưởng 47

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của peptone đến tốc độ tăng trưởng 47

3.5 PHƯƠNG PHÁP QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM 47

3.5.1 Mục đích 47

3.5.2 Phương pháp xử lý số liệu 47

3.6 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM BIFIDOBACTERIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHUN 50

3.6.1 Sản xuất chế phẩm bifidobacteria bằng phương pháp sấy phun 50

3.6.2 Đánh giá khả năng sống của vi khuẩn sau quá trình sấy phun 50

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 PHÂP LẬP VÀ TUYỂN CHỌN GIỐNG BIFIDOBACTERIA 52

4.1.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa 52

4.1.2 Đặc điểm hình thái tế bào, khả năng di động, cách sắp sếp tế bào và trạng thái gram của chủng được phân lập 53

4.1.3 Khả năng ảnh hưởng của oxy lên chủng vi sinh vật được phân lập 54

4.2 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA 55

4.2.1 Khả năng tạo enzyme catalase 55

4.2.2 Khảo sát khả năng sinh acid 56

4.2.3 Thử nghiệm lên men các nguồn hyratcacbon 56

4.3 XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 57

4.4 ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN

BIFIDOBACTERIA 59

4.5 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ 61

4.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 61

4.5.2 Ảnh hưởng của pH 63

4.5.3 Khảo sát tốc độ lắc 65

4.6 TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY .67

4.6.1 Xác định hàm lượng cao nấm men thích hợp trong môi trường huyết thanh sữa 67

4.6.2 Xác định hàm lượng peptone thích hợp trong môi trường huyết thanh sữa 69

4.6.3 Xác định hàm lượng N – acetyl D glucosamine thích hợp trong môi trường huyết thanh sữa 71

4.7 TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG HUYẾT THANH SỮA NUÔI CẤY BIFIDOBACTERIA BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 73

4.8 TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG HUYẾT THANH SỮA THEO PHƯƠNG PHÁP ĐƯỜNG DỐC NHẤT 79

4.9 ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA PHƯƠNG PHÁP SẤY PHUN 82

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 87

5.2 KIẾN NGHỊ 88

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Khả năng lên men các nguồn đường ở các loài Bifidobacterium 9

Bảng 2.2 Các loài Bifidobacterium tồn tại trong hệ đường ruột ở người 14

Bảng 2.3 Các loài Bifidobacterium tồn tại trong hệ đường ruột động vật 15

Bảng 2.4 Trình tự mồi (primer) ở một số chủng bifidobacteria 27

Bảng 3.1 Các hóa chất được dùng trong quá trình thí nghiệm 36

Bảng 3.2 Các thiết bị dùng trong quá trình thí nghiệm 37

Bảng 3.3 Các yếu tố thí nghiệm 49

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 49

Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái tế bào vi khuẩn bifidobacteria 54

Bảng 4.2 Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria thay đổi theo thời gian nuôi cấy trên môi trường huyết thanh sữa 59

Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tốc độ tạo sinh khối của vi khuẩn bifidobacteria 61

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của pH lên tốc độ tạo sinh khối của vi khuẩn bifidobacteria 63

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến tốc độ tạo sinh khối 65

Bảng 4.6 Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria khi thay đổi thành phần cao nấm men trong môi trường huyết thanh sữa 68

Bảng 4.7 Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria khi thay đổi hàm lượng peptone trong môi trường huyết thanh sữa 70

Bảng 4.8 Ảnh hưởng hàm lượng N-Acetyl D glucosamine đến tốc độ tạo sinh khối vi khuẩn bifidobacteria 72

Bảng 4.9 Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng 74

Bảng 4.10 Kết quả bố trí và kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm 75

Bảng 4.11 Chuyển sang hệ trục tọa độ không thứ nguyên 76

Bảng 4.12 Kết quả thí nghiệm tại tâm phương án trung tâm 77

Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi qui 78

Bảng 4.14 Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy theo phương pháp

leo dốc 80 Bảng 4.15 Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria sau quá trình sấy phun 84

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cây phát sinh loài cùa các loài Bifidobacterium được xây dựng dựa vào

16S rDNA 7

Hình 2.2 Các kiểu hình thái tế bào vi khuẩn bifidobacteria 25

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc bifidobacteria trên môi trường RCA 52

Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc bifidobacteria trên môi trường thạch MRS 52

Hình 4.3 Hình thái vi khuẩn bifidobacteria dưới vật kính dầu (x 100) 53

Hình 4.4 Ảnh hưởng của oxy lên sự phát triển vi khuẩn bifidobacteria 55

Hình 4.5 Sự phân giải CaCO3 của vi khuẩn bifidobacteria 56

Hình 4.6 Khả năng lên men các nguồn cacbon của vi khuẩn bifidobacteria 56

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của chủng vi khuẩn bifidobacteria phân lập từ sữa bột Nestle 58

Hình 4.8 Sản phẩm bột bifidobacteria sau quá trình sấy phun 84

DACH SÁCH CÁC BIỀU ĐỒ

Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn bifidobacteria

trên môi trường huyết thanh sữa 62 Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn bifidobacteria trên

môi trường huyết thanh sữa 64 Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến tốc độ phát triển của vi khuẩn

bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa 66 Biểu đồ 4.4 Ảnh hưởng hàm lượng cao nấm men đến sự tăng trưởng của vi

khuẩn bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa .68 Biểu đồ 4.5 Ảnh hưởng hàm lượng peptone đến sự tăng trưởng của vi khuẩn

bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa 70 Biểu đồ 4.6 Ảnh hưởng hàm lượng N-Acetyl D glucosamine đến sự tăng trưởng

của vi khuẩn bifidobacteria trên môi trường huyết thanh sữa 72 Biểu đồ 4.7 Mật độ tế bào vi khuẩn bifidobacteria trong thí nghiệm leo dốc 81 Biểu đồ 4.8 Hiệu suất thu hồi sản phẩm bột chế phẩm bifidobacteria 83 Biểu đồ 4.9 Ảnh hưởng của hàm lượng chất vi bao trong quá trình sấy phun lên

khả năng sống của vi khuẩn bifidobacteria theo thời gian bảo quản 85

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.8 Đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn bifidobacteria trong môi

trường huyết thanh sữa 60

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacterium bifidum 4

Sơ đồ 2.2 Đồng hóa oxygen của Bifidobacterium 5

Sơ đồ 2.3 Cây phát sinh loài của các loài Bifidobacterium được xây dựng dựa

vào 16S rDNA 7

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

• dNTP: Deoxynucleoside 5’triphosphate

• F-6-PPK: Fructose-6-phosphate phosphoketolase

• GL: Galactose Agar

• LP: Lithium chloride – Sodium propionate Agar

• MRS: De Man Rogosa Sharpe Agar

• mMRS: Modified De Man Rogosa Sharpe Agar

• mCol: Modified Columbia Agar

• NPNL: Neomycin sulfate – Paromomycin sulfate – Nalidixic acid – Lithium

chloride Agar

• OD: Opical density (mật độ quang)

• pCMB: Acid p-chloromercuribenzoic

• RAF 5,1: Môi trường Modified Columbia được bổ sung raffinose, lithium

chloride và sodium propionate và có pH 5,1

• RB: Raffinose Bifidobacterium

• RCA: Reinforced Clostridium Agar

• AMC: Arroyo, Martin and Cotton Agar

• BBM: Bifidobacterium selective medium

• BFM: Bifidobacterium medium

• BIM-25: Bifidobacterium iodoacetate medium

• BL: Blood Glucose Liver Agar

• BL-OG: Blood Glucose Liver Agar + Oxgall + Gentamycin

• CTAB: Hexadexyltrimethylammonium bromide

• EDTA: Ethylenediaminetetraacetate

Phần 1: MỞ ĐẦU

1.1 GIỚI THIỆU

Trong những thập niên gần đây, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát minh ra nhiều sản phẩm sinh học có chức năng probiotic Chúng là các vi sinh vật sống, có vai trò tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật đường ruột và gián tiếp cải thiện tình trạng sức khỏe của con người

Vi khuẩn bifidobacteria là một trong những nhóm vi sinh vật quan trọng đối

với sức khỏe của con người Bifidobacterium được tìm thấy trong các mẫu phân của

trẻ sơ sinh trong tuần đầu tiên còn bú sữa mẹ Chính những tác động theo hướng có lợi cho cơ thể mà trên thị trường đã xuất hiện hàng loạt những sản phẩm chức năng liên quan đến bifidobacteria, với mục đích tăng cường sức khỏe của con người và động vật

Ngày nay, các sản phẩm thực phẩm chứa vi sinh vật này rất phổ biến như sữa chua, sữa bột dành cho trẻ em, sản phẩm về phomai,… Trong đó, loài

Bifidobacterium bifidum, B breve, B longum đang được ứng dụng phổ biến trong

các sản phẩm sữa giàu dinh dưỡng và sản phẩm sữa lên men

Ở Việt Nam, có rất ít công trình nghiên cứu về bifidobacteria Mức độ đa dạng về các sản phẩm liên quan đến bifidobacteria còn rất hạn chế Thực tế, các probiotic ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm đa phần được nhập khẩu

từ nhiều nước trên thế giới Tại Việt Nam, chế phẩm bifidobacteria hoàn toàn chưa được sản xuất theo một qui trình cụ thể Để khắc phục phần nào của vấn đề trên, chúng tôi bước đầu xây dựng qui trình sản xuất và bảo quản chế phẩm bifidobacteria Kết quả nghiên cứu này, là cơ sở để sản xuất chế phẩm bifidobacteria, phục vụ cho các đơn vị sản xuất có nhu cầu

1.2 MỤC TIÊU

• Phân lập và xác định vi khuẩn có nguồn gốc từ sữa bột nhập khẩu Nestle

• Xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm bifidobacteria dạng bột

1.3 NỘI DUNG

• Phân lập chủng vi khuẩn từ nguồn nguyên liệu sữa bột nhập khẩu Nestle

• Định danh chủng vi sinh vật được phân lập bằng phương pháp sinh học phân tử

• Xác định điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho sự phát triển của vi khuẩn bifidobacteria

• Chọn và tối ưu hóa thành phần môi trường huyết thanh sữa để nuôi cấy vi khuẩn bifidobacteria

• Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bifidobacteria dạng bột bằng phương pháp sấy phun

• Kiểm tra khả năng sống của chế phẩm theo thời gian bảo quản

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1.3.2 Đặc điểm hình thái [18]

Vi khuẩn Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, hình que với

nhiều dạng khác nhau như dạng cong, dạng móc câu, dạng hình cây gậy đánh gôn, dạng phân nhánh,… và cũng thường xuất hiện ở dạng chữ “Y”

Các tế bào vi khuẩn bifidobacteria thường đứng riêng lẻ, xếp thành cặp hoặc xếp thành hình chữ “V” Kích thước tế bào vi khuẩn khoảng 0,5 – 1,3mm

Bifidobacterium có dạng hình que chẻ đôi hoặc que phân nhiều nhánh và

dưới điều kiện tăng trưởng khác nhau thì các tế bào ở nhiều hình dạng khác nhau (Tisser, 1990) Khi sử dụng N – Acetyl D – glucosaminde, alamine, acid aspartic, acid glutamic, Serine và Ca2+ trong môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến hình dạng của tế bào vi khuẩn bifidobacteria [18]

Tế bào bifidobacteria không có vỏ bao và không có hệ thống tiêm mao bao quanh Vách tế bào được cấu tạo bởi 3 thành phần chính

+ Peptidoglycan (murein) + Polysaccharide

+ Acid lipoteichoic

Peptidoglycan của vi khuẩn bifidobacteria được cấu tạo từ acid N – acetylmuramic và N – acetylglucosamine Các phân tử này kết hợp với nhau tạo

thành chuổi oligopeptide Ngoài ra, vách tế bào vi khuẩn bifidobacteria còn chứa

nhiều polysaccharide gồm các phân tử đường glucose, galactose, rhamnose,… liên kết với nhau (Lauer và Kandler, 1983)

Sơ đồ 2.1 Cấu trúc peptidoglycan của Bifidobacterium bifidum

2.1.3 Đặc điểm sinh lý [9], [10], [18], [25]

Bifidobacterium cư trú trong ruột của cơ thể người và động vật Chúng đóng

vai trò quan trọng trong việc kiểm soát pH ở đường ruột và kết tràng Chúng được phát hiện từ phân của trẻ sơ sinh còn bú sữa mẹ Lượng vi khuẩn này phổ biến trong đường ruột, tính ổn định của chúng liên quan đến tuổi tác, tuổi càng lớn thì lượng vi khuẩn càng giảm Lượng vi khuẩn bifidobacteria trong cơ thể bị tác động bởi nhiều yếu tố như thức ăn, thức thuốc, sử dụng kháng sinh và tình trạng cơ thể

2.1.3.1 Dạng hô hấp

Bifidobacterium là vi sinh vật kỵ khí bắt buộc Tuy nhiên, tính nhạy cảm với

oxy thay đổi tuỳ theo loài và các giống khác nhau của mỗi loài Một số loài có thể chịu được oxy khi có sự hiện diện của CO2 Bifidobacterium có nhiều dạng hô hấp

khác nhau, bao gồm

ü Tăng trưởng hiếu khí không có sự tích lũy H2O2: một dòng vi khuẩn

B.bifidum chịu được điều kiện hiếu khí, tạo ra một lượng nhỏ H2O2 bởi quá trình oxy hóa NADH

ü Tăng trưởng giới hạn với sự tích lũy H2O2: sự tích lũy hydrogen peroxide là một độc tố đối với enzyme frutose-6-phosphate phosphoketolase trong quá

trình chuyển hóa đường của giống Bifidobacterium

ü Tăng trưởng không có sự tích lũy H2O2: một số dòng vi khuẩn bifidobacteria

có mức oxy hóa khử thấp trong quá trình chuyển hóa các chất và không tạo

H2O2

Khi có mặt CO2, tính nhạy cảm với oxygen khác nhau đáng kể, phụ thuộc vào các dòng Một số dòng có thể phát triển trong sự hiện diện của oxy, một vài dòng âm tính với catalase và dương tính với catalase Một số dòng khác phát triển trong sự có mặt đồng thời của catalase và hemin trong môi trường

Sơ đồ 2.2 Đồng hóa oxigen của Bifidobacterium

2.1.3.3 Nhiệt độ [15]

Nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn Bifidobacterium là 37 oC –

41oC Tế bào không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC Tuy nhiên

Bifidobacterium thermaciddophilum có khả năng phát triển ở nhiệt độ 49,5oC Phần lớn các chủng có nguồn gốc từ động vật đều có thể phát triển ở nhiệt độ 45oC Riêng các chủng có nguồn gốc từ người thì không có khả năng phát triển ở nhiệt độ này

2.1.3.4 pH

pH tối ưu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn này là 6,5 ÷ 7,0 Tế bào vi khuẩn bifidobacteria không tăng trưởng ở pH thấp hơn 4,5 và pH trên 8,5 Ngoại trừ,

Bifidobacterium thermacidophilum có thể tăng trưởng ở pH 4,0 Bifidobacterium là

loài chịu được acid nhưng không là vi sinh vật ưa acid

2.1.4 Đặc điểm di truyền [13], [14], [24], [25]

Các nhà nghiên cứu sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử dựa vào 16S rRNA và

23 rRNA trong việc phát hiện vi khuẩn Bifidobacterium Dựa vào trình tự 16S rRNA của 31 loài Bifidobacterium và 13 loài vi khuẩn khác, Miyake và cộng sự đã

thiết lập cây phát sinh loài

Kết quả có năm nhóm được thiết lập, chiếm tỷ lệ 97% tổng số các loài

Bifidobacterium và tất cả đều có trình tự 16S rRNA giống nhau (>98,9%) Bao

gồm

ü Bifibobacterium catenulatum và B pseudocatenulatum có trình tự 16S rRNA

giống nhau 99,5%

ü B indicum và B coryneforme có trình tự 16S rRNA giống nhau 99,1%

ü B longum, B infantis và B suis có trình tự 16S rDNA giống nhau đến 99,3 –

99,9%

ü B animalis và B lactis có trình tự 16S rDNA giống nhau 98,9%

Các nhóm này có DNA lai DNA ở mức độ trung bình từ 40 – 60% và mức

độ cao là trên 70% Riêng B lactis và B animalis có mức độ lai từ 85,5 – 92,3%

Hình 2.1 Cây phát sinh loài của các loài Bifidobacterium được xây dựng dựa

vào 16S rDNA

2.1.5. Đặc điểm sinh hóa và nhu cầu dinh dưỡng của Bifidobacterium

2.1.5.1 Đặc điểm sinh hóa [18], [21], [23]

Tế bào cho phản ứng âm tính với indol, không tham gia phản ứng phân giải

gelatin, catalase, oxidase và phản ứng khử nitrate Tuy nhiên, loài Bifidobacterium indicum và Bifidobacterium asteroides cho phản ứng dương tính với catalase khi

chúng tăng trưởng được trong không khí

Hoạt tính phân giải urê hầu như chỉ được tìm thấy ở các chủng của loài

Bifidobacterium breve, Bifidobacterium magnum và Bifidobacterium subtile

2.1.5.2 Nhu cầu dinh dưỡng [9], [10], [18], [21], [23], [25]

Bifidobacteria là vi sinh vật hoá dị dưỡng, có khả năng lên men nhiều nguồn cacbon Sản phẩm chính của quá trình này chủ yếu là acid lactic và acid acetic với tỉ

lệ 2:3 và một số sản phẩm phụ là acid formic, ethanol, acid succinic, acid butyric, acid propionic,… không tạo CO2 Hầu hết các loài Bifidobacterium đều có thể

chuyển hoá được các nguồn đường lactose, sucrose, galactose và giới hạn một số loài không lên men được manitol và sorbitol Vi khuẩn bifidobacteria có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và luôn cần nhiều vitamin khác nhau Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn bifidobacteria không cần CO2, nhưng nếu môi trường có thêm CO2 thì sự tăng trưởng có thể tăng lên

Hai nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng trưởng của bifidobacteria

ü Nhân tố tăng trưởng: threonin, dịch chiết nấm men, cystein, peptone,

dextrin, maltose và alphal glycerolphosphate

ü Nhân tố bifidogenic (những cơ chất thích hợp cho sự phát triển của

bifidobacteria): N – acetyl glycosamine, fructo – oligosaccharide, lactoferrin, lactulose, oligoholoside, polyholoside (raffinose, stachyose và inulin), xylo – oligosaccharide, transgalactosylate – oligosaccharide

d: 11 – 89% các loài lên men; ND: không xác định; ±: Khả năng lên men yếu

Bảng 2.1 Khả năng lên men các nguồn đường ở các loài Bifidobacterium

2.1.5.3 Chuyển hóa sắt [25]

Sắt và một số ion kim loại hóa trị hai rất cần thiết cho sự tăng trưởng của

nhóm vi khuẩn Bifidobacterium Sự hiện diện của Fe có thể làm hạn chế sinh trưởng của các loài sinh vật khác Vi khuẩn Bifidobacterium có khả năng chuyển hóa Fe từ

Fe3+ thành dạng Fe liên kết ở bề mặt của tế bào và liên quan đến quá trình sản sinh

acid acetic của B.bifidum qua trung gian các ferroenzyme

2.1.5.4 Chuyển hóa vitamin [25]

Vi khuẩn Bifidobacterium có khả năng sản xuất nhiều loại vitamin khác

nhau, bao gồm vitamin B1, vitamin B6, acid folic và acid nicotinic Loài B.breve và

B infantis sản xuất lượng cao acid nicotinic và vitamin H Loài B bifidum và B infantis có thể tạo ra lượng lớn các vitamin B1, vitamin B9, acid nicotinic Hầu hết

vi khuẩn bifidobacteria có nguồn gốc từ người luôn cần nguồn vitamin B2 và acid panthotenic cho sự tăng trưởng

2.1.5.5 Sản xuất acid amin [25]

Bifidobacterium thermophilum, B adolescentis, B dentium, B animalis và

B infantis có khả năng tạo ra một số lượng lớn amino acid như alamine, valine, acid aspartic Đặc biệt, B bifidum có thể tạo ra 150mg/l threonine (Matteuzzi và

Cộng sự, 1978)

Vào 1977, Crociani phát hiện khi có sự hiện diện của acid aminoisobutyric

(tiền chất của isoleucine) thì các chủng B thermophilum đều có khả năng tạo ra rất

nhiều sản phẩm isoleucine và valine.

2.1.5.6 Sản xuất chất kháng sinh và kháng khuẩn [25]

16 chủng bifidobacteria đều có khả năng sản xuất ra chất kháng sinh (Chartensis và cộng sự, 1998) Phần lớn chúng đều kháng với kanamycin, aztreonam, cefoxitin, amikacin, gentamycin, acid fusidic Nhưng chúng dễ bị tổn thương với penicillin, choloramphenicol, erythromycin, bacitracin, rifampicin và nitrofurantoin

Yildirim và Johson (1998) đã miêu tả bacteriocin được sản xuất bởi B bifidum NCFB1454 kháng các loài Listeria, Bacillus, Enterococcus, Pediococcus và Leuconostoc và bacteriocin mã hóa bởi plasmid 8,4 Kb

2.2 ĐẶC ĐIỂM ENZYME VÀ CON ĐƯỜNG CHUYỂN HÓA ĐƯỜNG HEXOSE

2.2.1 Đặc điểm enzym [21]

Bifidobacteria có khả năng tạo ra enzym ngoại bào, giúp xúc tác các phản ứng phân giải những polysaccharide phức tạp như amylase, amylopectin, xylan và gum arabic (salyers cùng cộng sự, 1978) Mucin từ dạ dày của heo được phân huỷ

bởi các enzyme ngoại bào của vi khuẩn B.bifidum, B.infantis và Bifidobacterium longum (hoskin cùng cộng sự, 1985)

Enzym glutamate dehydrogenase và enzym glutamine synthetase tham gia

quá trình đồng hoá ammoniac, chỉ được tìm thấy ở loài B.bifidum, B.infantis, B.breve, B.adolescentis, B.thermophilum, B.longum và Bifidobacterium pseudolongum (hatanaka cùng cộng sự, 1987)

2.2.2 Con đường chuyển hoá các hexose [10], [15], [21], [25]

Enzym chính của quá trình này là fructose-6-phosphate phosphoketolase 6-ppk) Enzym này cắt hexose phosphate thành erythrose-4-phosphate và acetyl phosphate Pentose phosphate được hình thành từ tetrose phosphate và hexose phosphate thông qua enzym transaldolase và transketolase Sau đó, pentose phosphate được phân li thành acid acetic và acid lactic theo tỉ lệ 3:2 Cân bằng của phản ứng bị thay đổi bởi sự chuyển hoá pyruvate thành acid formic và acid acetic hoặc sự khử acetate thành ethanol Trong suốt quá trình chuyển hoá hexose, CO2không được sinh ra (ngoại trừ quá trình chuyển hoá gluconate)

(F-Các loài bifidobacteria khác nhau sẽ tạo ra một lượng acetate, lactate, ethanol

và formate khác nhau trong cùng một điều kiện Hơn nữa, trong những điều kiện tăng trưởng khác nhau về số lượng và chất lượng của các nguồn cacbon thì số lượng sản phẩm của quá trình chuyển hoá cũng khác nhau

5 = ribulose 5 phosphate epimerase

6 = xylulose 5 phosphate phosphoketolase

2.3 SỰ PHÂN BỐ CỦA GIỐNG BIFIDOBACTERIA

2.3.1 Tồn tại trong ruột người [18], [25]

Bifidobacteria hiện diện thường xuyên trong khoang miệng của trẻ em và chúng có thể trở thành vi sinh vật thường trú trong các mảng bám trên răng của người trưởng thành Chúng cũng được tìm thấy trong nước bọt và trên lợi Các loài

được tìm thấy trong các lỗ sâu răng là B.dentium, Bifidobacterium denticolens và Bifidobacterium inopinatum

Ngoài ra, bifidobacteria còn được tìm thấy trên các mẫu phân của trẻ sơ sinh

trong tuần tuổi đầu sau khi sinh Các loài B breve, B infantis, B longum và B bifidum thường xuyên được tìm thấy trong các mẫu phân của trẻ sơ sinh Trước khi

sinh, bào thai được bao bọc bởi một môi trường vô trùng tuyệt đối Sau khi đứa bé được sinh ra, đường tiêu hóa bị xâm nhiễm bởi một số nhóm vi khuẩn đường ruột Hai ngày sau khi sinh, ruột kết chứa khoảng 109 -1010 vi khuẩn/gram phân, chủ yếu

là enterobacteria, staphylococcus, và streptococcus Bifidobacteria chỉ xuất hiện ở

ngày thứ hai đến ngày thứ năm (1010-1011/gram phân) và chiếm ưu thế hoàn toàn trong một tuần sau khi sinh Chúng đạt đến 99 % vi khuẩn trong đường ruột Trái lại, các loại vi khuẩn khác (E.coli, lactobacilli, enterococci) giảm nhanh đến 1000

lần, vi khuẩn kỵ khí như Bacterioides, Clostridium và các vi khuẩn gây thối giảm

đáng kể hoặc có thể biến mất Trong các mẫu phân của người trưởng thành thường

xuất hiện nhiều nhất là B adolsecentis và B catenulatum

Trong âm đạo của những người phụ nữ khoẻ mạnh, Bifidobacterium hiện diện khoảng từ 22-26% Trong đó, B.breve và B.adiolessentis là loài hiện diện thường xuyên, còn B.longum và B.bifidum thì hiện diện với phạm vi nhỏ hơn Vi

khuẩn bifidobacteria còn có vai trò duy trì tính nội cân bằng của âm đạo bằng cách tạo ra các acid hữu cơ, các chất diệt khuẩn chống lại các mầm bệnh Do vậy, các

chủng Bifidobacterium thường được dùng như là một probiotic để hiệu chỉnh hệ vi

sinh vật trong ống niệu sinh dục của phụ nữ

Bảng 2.2 Các loài Bifidobacterium tồn tại trong hệ đường ruột ở người

Nơi cư trú Các loài Bifidobacterium

Trẻ sơ sinh

B.breve B.infantis

Trẻ sơ sinh và người trưởng thành

B.bifidum B.catenulatum B.longum B.pseudocatenulatum

Người trưởng thành

B.adolescentis B.angulatum B.dentium

Lỗ sâu răng

B.denticolens B.dentium B.inopinatum

Dạ dày giảm tiết acid hydrochloric

B.denticolens B.dentium B.inopinatum B.infantis-longum

Âm đạo của người

B.breve B.dentium B.longum

2.3.2 Tồn tại trong động vật [18], [25]

Vi khuẩn bifidobacteria có mặt trong hầu hết các con gà, chó, heo, chuột nhưng với số lượng ít hơn lactobacilli Riêng ở chuột lang thì bifidobacteria có số lượng nhiều hơn lactobacilli Ở thỏ và ngựa thì hiếm có bifidobacteria, còn ở mèo

và chồn thì hoàn toàn không có bifidobacteria

Một vài loài có tính chuyên biệt với vật chủ như B.magnum, B.pollorum B.gallinarum chỉ ở trong ruột gà; B.suis chỉ có ở trong ruột heo và B.asteroides là

loài duy nhất được tìm thấy trong ong mật

Thành phần các loài bifidobacteria trong động vật thay đổi theo độ tuổi, loài

và chế độ ăn uống của động vật

Bảng 2.3 Các loài Bifidobacterium tồn tại trong hệ đường ruột động vật

Nơi cư trú Các loài Bifidobacterium

Dạ cỏ bò B.merycicum, B.ruminantium, B.pseudolongum, B.pseudolongum

subsp globosum, B.thermophilum, B.boum

Bò con B.bifidum, B.breve, B.infantis, B.longum, B.pseudolongum,

B.pseudolongum subsp globosum, B.thermophilum, B.animalis

Cừu con B.pseudolongum, B.pseudolongum subsp globosum

Thỏ B.cuniculi, B.magnum, B.saaculare, B.pseudolongum subsp

globosum, B.thermophilum, B.animalis

Gà B.gallinarum, B.pullorum, B.pseudolongum, B.pseudolongum

subsp globosum, B.thermophilum

Ông mật B.asteroides, B.coryneforme, B.indicum

Chuột B.pseudolongum, B.pseudolongum subsp globosum, B.animalis

Heo B.choerinum, B.suis, B.pseudolongum, B.globosum,

B.thermophilum, B.boum

2.3.3 Trong môi trường xung quanh [25]

Bifidobacteria được xem là vi sinh vật chỉ thị cho sự ô nhiễm từ phân người

và động vật Một cuộc nghiên cứu từ 75 mẫu trong một con suối bị ô nhiễm nặng

gần bologna (ở ý) đã cho thấy là B.longum, B.adolescentis, B.pseudocatenulatum, B.catenalum và B.thermophilum là loài tiêu biểu Riêng B.globosum, B.angulatum, B.breve, B.animalis, B.choerinum, B.subtile và B.minimum chỉ hiện diện với số

lượng thấp

Bifidobacteria cũng được xem là vi sinh vật chỉ thị sự ô nhiễm trong thịt và các sản phẩm từ thịt Sự ô nhiễm này là do con người gây ra thông qua sự vận chuyển hoặc thao tác bằng tay lên sản phẩm

Mười một loài bifidobacteria được tìm thấy trong rác thải cống Trong đó, 5

loài có nguồn gốc từ con người bao gồm B.adolescentis, B.angulatum, B.breve, B.longum và B.pseudocatenulatum và 4 loài có nguồn gốc từ động vật là B.animalis, B.choerinum, B.pseudolongum subsp.globosum; B.thermophilum Các loài B.minimum và B.subtile chỉ được tìm thấy chủ yếu trong rác thải cống Ngoài

ra, bifidobacteria còn được phân lập từ các sản phẩm bơ sữa

2.4 ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA [16], [17], [18], [25]

2.4.1 Probiotic

Probiotic là những vi sinh vật sống, chủ yếu là vi khuẩn lactic và bifidobacteria được sử dụng để cải thiện tình trạng sức khoẻ của con người và động vật Sử dụng chế phẩm probiotic sẽ cải thiện tính chất của hệ vi sinh vật bản địa trong ống dạ dày – ruột, ống niệu sinh dục, ống hô hấp và có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh

2.4.2 Prebiotic

Hiện nay có hai hướng làm tăng số lượng vi sinh vật có lợi trong ống dạ dày – ruột là bổ sung những sinh vật sống có lợi (probiotic) và chất hổ trợ tiêu hóa (prebiotic) để biến đổi có chọn lọc thành phần hệ vi sinh đường ruột Prebiotic được định nghĩa là những nguyên liệu thực phẩm không thể tiêu hóa, tác động có lợi đối

với vật chủ bằng các kích thích có chọn lọc sự tăng trưởng và kích thích hoạt tính của một hoặc một số lượng giới hạn các vi khuẩn trong kết tràng để cải thiện sức khỏe của vật chủ

Prebiotic kích thích sự tăng trưởng của hệ vi sinh vật thường trú trong vật chủ Tạo điều kiện cho các chủng vi khuẩn chuyên biệt với vật chủ có thể sinh sản

và phát triển nhanh chóng Prebiotic giúp những vi khuẩn có lợi tăng số lượng và tăng hoạt tính chuyển hóa các cơ chất có thể lên men

Các prebiotic bao gồm disaccharide, oligosaccharide, fructose và oligosaccharide, soybean-oligosaccharide, inulin và những oligosaccharide không thể tiêu hoá khác

galacto-Những tác động của prebiotic lên vật chủ

ü Tăng khả năng kháng lại những tác nhân gây bệnh cho vật chủ

ü Làm giảm các nhân tố nguy hiểm liên quan đến bệnh ung thư kết tràng

ü Làm giảm lượng lipid huyết thanh

ü Làm tăng việc sử dụng các khoáng chất

Theo các nghiên cứu khi thay đổi nhỏ trong chế độ ăn uống bằng việc bổ sung sucrose (15g/ngày) và oligofructose (15g/ngày) hoặc inulin có thể làm tăng số lượng bifidobacteria một cách đáng kể Đặc biệt là khi bổ sung oligofructose thì làm giảm được các tác nhân gây bệnh tiềm tàng Ngoài ra, soybean-oligosaccharide và transgalacto - oligosaccharide làm tăng số lượng bifidobacteria trong phân

2.5 CÁC ỨNG DỤNG CỦA VI KHUẨN BIFIDOBACTERIA [18], [25], [27]

Hệ đường ruột đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển, hấp thu các chất dinh dưỡng Thành phần vi sinh vật bản địa trong đường ruột là hàng rào bảo

vệ chống lại các nhân tố gây hại Chính vì thế, probiotic tác động một cách trực tiếp hoặc gián tiếp đến hệ thống miễn dịch của vật chủ Hiện nay, ngoài nhóm vi khuẩn lactic được ứng dụng sản xuất làm chế phẩm probiotic, mà các thành viên của giống

Bifidobacterium thường được kết hợp trong việc sản xuất các sản phẩm liên quan

đến sữa lên men hoặc sữa bột dinh dưỡng cho trẻ em

Bifidobacterium chiếm khoảng 90% tổng số vi sinh có ở trẻ sơ sinh bú bằng sữa mẹ Số lượng Bifidobacterium giảm ở người trưởng thành, nhưng luôn chiếm số

lượng khoảng 3 – 6 % tổng vi sinh vật trong phân Sự hiện diện của bifidobacteria trong hệ thống đường ruột gắn liền với lợi ích sức khỏe của vật chủ

2.5.1 Tăng cường hệ miễn dịch

Hoạt động của hệ vi sinh vật có lợi đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và kích thích hệ thống miễn dịch đường ruột Bifidobacteria được xem là phương thức chữa bệnh bằng probiotic, giúp xây dựng và kích thích hệ thống miễn dịch để chống lại các tác nhân gây hại Các nghiên cứu cho thấy

ü B infantis kích thích sự sản sinh cytokine để tăng cường đáp ứng miễn

dịch Cytokine là protein trung gian liên quan đến tất cả các mặt của hệ đều hòa miễn dịch Khả năng tăng cường tạo cytokine phụ thuộc vào các chủng khác nhau

ü B bifidum kích thích miễn dịch cùng với sự kết hợp với một số vi khuẩn

lên men lactic

ü B lactis có thể làm tăng chức năng miễn dịch tự nhiên thông qua việc bổ

sung vào chế độ ăn

ü Bifidobacteria có khả năng hoạt hóa tế bào lympho và các đại thực bào, kích thích sự tạo kháng thể

2.5.2 Giảm bớt triệu chứng dị ứng lactose [18], [25]

Triệu chứng khó tiêu lactose thường xuất hiện ở những người bị viêm ruột mãn tính hay cấp tính và những người phẫu thuật ruột Các triệu chứng bao gồm phân lỏng, bụng sung phù, đau bụng, buồn nôn và đầy hơi Lactose có trong sữa tươi khó được tiêu hóa hơn lactose trong các sản phẩm sữa lên men, nhờ enzyme

lactase có khả năng chuyển hóa lactose Bifidobacterium longum được chứng minh

là có khả năng probiotic và có tác dụng làm giảm triệu chứng dị ứng lactose

Bifidobacteria làm giảm triệu chứng dị ứng lactose bằng cách trực tiếp cung

cấp β-galactosidase và gián tiếp làm giảm pH của môi trường để kích thích sự tăng trưởng của hệ vi sinh vật đường ruột nhằm tạo ra β-galactosidase

2.5.3 Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy [18]

Trong ruột già của con người, các vi sinh vật cùng tồn tại trong một hệ cân bằng không thay đổi Khi hệ nội cân bằng này bị rối loạn sẽ gây ra bệnh tiêu chảy, triệu chứng thường gặp là sự viêm cấp tính Hệ vi sinh vật có ích trong đường ruột

sẽ bảo vệ vật chủ tránh khỏi những tác nhân gây bệnh nhờ vào sự hình thành ranh giới màng nhầy Những vi sinh vật bản địa giúp ngăn ngừa sự hình thành tập đoàn những vi khuẩn gây bệnh bằng cách trực tiếp cạnh tranh những chất dinh dưỡng thiết yếu hoặc những vị trí trên biểu mô với những vi khuẩn gây bệnh Nhờ khả năng tạo ra những hợp chất kháng khuẩn và những acid béo bay hơi mà bifidobacteria có thể tạo ra môi trường không thuận lợi đối với sự tăng trưởng của những vi sinh vật gây bệnh đường ruột Bifidobacteria có thể tiết ra vài nhân tố ức chế, có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng gram âm và gram dương

Các chế phẩm lactobacilli và bifidobacteria có khả năng giúp phòng ngừa bệnh tiêu chảy B.longum làm giảm lượng Clostridium trong phân và làm giảm bệnh tiêu chảy do Erythriomycin gây ra Khi dùng hỗn hợp B.longum và Lactobacillus acidophilus thì sẽ làm giảm những thay đổi về sinh thái của hệ vi sinh đường ruột do sử dụng clindamycin Một số chủng Bifidobacterium spp Có thể ức chế sự tăng lên của loài Clostridium difficile Khi bổ sung B.bifidum và

Streptococcus themophilus vào thực phẩm có thể làm giảm tỉ lệ mắc phải bệnh tiêu

chảy ở trẻ sơ sinh

2.5.4 Ngăn ngừa ung thư [18]

Các nhà nghiên cứu đã nhận thấy ở bifidobacteria có tính kháng đột biến và kháng ung thư Những động vật bị ung thư kết tràng khi được cho sử dụng

B.longum như một chế phẩm dễ hoà tan thì có thể giảm được bệnh ung thư do sự

tăng chất azoxymethane gây ra

Ngày nay, ung thư sắc tố (colorectal cancer – CRC) là bệnh phổ biến nhất ở các nước phương tây Việc thay đổi khẩu phần ăn hằng ngày cũng có tác dụng làm giảm nguy cơ bị ung thư Nhân tố quan trọng góp phần vào việc làm giảm tác nhân ung thư bằng cách sử dụng chế phẩm probiotic Sự thay đổi hệ vi khuẩn đường ruột dẫn đến việc gia tăng hoạt động của các enzyme beta – glucuronidase, azoreductase, urease và nitroreductase, các enzyme này biến đổi các tác nhân tiền gây ung thư và

vì thế có thể làm gia tăng nguy cơ CRC

Cơ chế ngăn chặn đột biến có thể bao gồm một hoặc nhiều hoạt động sau

• Tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ

• Kết nối và phân huỷ trực tiếp các tác nhân gây ung thư tiềm tàng

• Thay đổi hệ vi sinh gây ra các tác nhân ung thư

• Thay đổi môi trường hoá lý trong kết tràng

• Tạo ra các chất kháng ung thư

2.5.5 Kháng lại vi khuẩn gây bệnh [18]

Bifidobacteria có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh đường ruột như vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy và có tính kháng với các vi sinh vật gây bệnh khác Các nghiên cứu đã chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn bifidobacteria sẽ làm giảm

đáng kể số lượng Clostridium

ü B longum có khả năng kháng Samonella typhimurium; Listeria monocytogenes; Campylobacter jejuni và Bacteroides vulgatus