Nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây mãn đình hồng althaea rosea để thu nhận hợp chất flavonoid có hoạt tính sinh học

Với tình hình được nêu trên, mục tiêu của đề tài nghiên cứu đề ra là “khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô nhằm tăng sinh sinh khối tế bào cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L.. Các nghiên cứ

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHEAE ROSEA L .2

1.1.1 Đặc điểm phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm hình thái 2

1.1.3 Đặc điểm sinh thái 3

1.1.4 Đặc điểm phân bố 4

1.1.5 Các hợp chất có giá trị trong cây Mãn Đình Hồng 4

1.1.6 Giá trị y dược của cây Mãn Đình Hồng 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 4

1.2.1 Cấu tạo và đặc điểm của hợp chất tự nhiên Flavonoid 5

1.2.2 Tác dụng dược lý 6

1.2.2.1 Tác dụng kiểu Vitamine P 6

1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa 6

1.2.2.3Các tác dụng khác 6

1.2.3 Sơ lược về một số hợp chất Flavonoid có trong cây Mãn Đình Hồng 7

1.2.3.2 Hợp chất Quercetin 9

a Đặc điểm hóa lý 9

b Giá trị y dược 9

1.2.3.3 Hợp chất Kaempferol 11

a Đặc điểm hóa lý 11

b Giá trị y dược 11

1.2.3.4 Hợp chất Myricetin 12

a Đặc điểm hóa lý 12

b Giá trị y dược 12

1.2.4 Một số đối tượng chứa hợp chất Flavonoid 13

1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU HỢP CHẤT THỨ CẤP 15

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu 15

1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo 16

1.3.2.1 Khái niệm về mô sẹo 16

1.3.2.2 Phương pháp tạo mô sẹo 16

1.3.2.3 Đường cong tăng trưởng 17

1.3.2.4 Ứng dụng của nuôi cấy mô 18

1.3.3 Nuôi cấy huyền phù tế bào và thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học 18

1.3.4 Các điều kiện nuôi cấy tế bào ảnh hưởng đến sản xuất các chất thứ cấp20 1.3.4.1 Chất điều hòa sinh trưởng 20

1.4 SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID

CHROMATOGRAPHY) 21

1.4.1 Lý thuyết cơ bản về sắc ký lỏng cao áp HPLC 21

1.4.2 Cấu tạo và hoạt động của máy sắc ký lỏng cao áp HPLC 22

CHƯƠNG 2 – MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 27

CHƯƠNG 3 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

A ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28

B TRANG THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 28

C THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 29

3.1 THIẾT LẬP QUI TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO, TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L .29

3.1.1 Vật liệu 29

3.1.1.1 Nguyên liệu nuôi cấy 29

3.1.1.2 Hóa chất khử trùng 29

3.1.1.3 Môi trường nuôi cấy 29

3.1.1.4 Điều kiện nuôi cấy 29

3.1.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 29

3.1.2.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 29

a Mục đích tiến hành 29

b Bố trí thí nghiệm 30

a Mục đích thí nghiệm 31

b Bố trí thí nghiệm 31

c Chỉ tiêu theo dõi 32

d Các bước tiến hành thí nghiệm 32

3.1.2.3 Thí nghiệm 3 Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào cây Mãn Đình Hồng 32

a Mục đích thí nghiệm 32

b Bố trí nghiệm thức 32

c Chỉ tiêu theo dõi 32

d Các bước tiến hành thí nghiệm 33

3.1.2.4 Thí nghiệm 4: Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu được lượng sinh khối cao nhất 33

a Mục đích thí nghiệm 33

b Bố trí nghiệm thức 33

c Chỉ tiêu theo dõi 33

d Các bước tiến hành thí nghiệm 34

3.2 ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG FLAVONOID CÓ TRONG MÔ SẸO DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L 35 3.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavonoid có trong cây Mãn Đình Hồng Althaea

3.2.1.2 Bố trí thí nghiệm 35

3.2.1.5 Phương pháp tiến hành 36

a Xử lý nguyên liệu 36

b Các bước tiến hành thí nghiệm 36

3.2.2 Thí nghiệm 6: Định lượng Flavone 37

3.2.2.1 Mục tiêu thí nghiệm 37

3.2.2.2 Nguyên vật liệu 37

3.2.2.3 Hóa chất 37

3.2.2.4 Điều kiệnchạy HPLC 38

3.2.2.5 Phương pháp tiến hành 38

a Bố trí nghiệm thức 38

b Các bước tiến hành thí nghiệm 38

CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 40

4.1 THIẾT LẬP QUI TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO, TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH HUYỀN PHÙ TẾ BÀO CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L 40

4.1.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 40

4.1.2 Thí nghiệm 2: Aûnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo 41

4.1.3 Thí nghiệm 3: Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào Mãn Đình Hồng Althase Rosea L 47

4.2.1 Thí nghiệm 5: Định tính Flavone có trong cây Mãn Đình Hồng Althaea Rose L.51

4.2.2 Thí nghiệm 6: Định lượng Flavone bằng phương pháp HPLC 51

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

5.1 KẾT LUẬN 53

5.1.1 Thiết lập qui trình nuôi cấy in vitro, tạo mô sẹo và dịch huyền phù tế bào cây Mãn Đình Hồng 53

5.1.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 53

5.1.1.2 Aûnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tạo mô sẹo 53

5.1.1.3 Xác định đường cong tăng trưởng của tế bào cây Mãn Đình Hồng 53

5.1.1.4 Tối ưu hóa nồng độ chất điều hòa sinh trưởng để thu được lượng sinh khối cao nhất 53

5.1.2 Kết quả định tính định lượng Flavone 54

5.1.2.1 Kết quả định tính Flavone 54

5.1.2.2 Kết quả định lượng Flavone 54

5.2 KIẾN NGHỊ 54

5.2.1 Nuôi cấy in vitro 54

5.2.2 Định tính và định lượng các Flavonoid 54

5.2.3 Nghiên cứu ứng dụng .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

• BA : 6–Benzyl–aminopurine

• MS : Murashine & Skoog, 1962

• HPLC : Hight Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng cao áp)

Bảng 3.1 Khảo sát hàm lượng Javel dùng để khử trùng 30

Bảng 3.2 Nghiệm thức được bố trí ở giai đoạn 1 31

Bảng 3.3 Nghiệm thức được bố trí ở giai đoạn 2 31

Bảng 3.4 Nghiệm thức khảo sát đường cong tăng trưởng của tế bào mô sẹo 32

Bảng 3.5 Bố trí nghiệm thức khảo sát điều kiện tối ưu hóa về ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng để thu được lượng sinh khối cao nhất 33

Bảng 3.6 Bố trí nghiệm thức định tính Flavone 35

Bảng 3.7 Màu của của Flavonoid dưới ánh đèn tử ngoại có và không có xử lý với kiềm 37

Bảng 3.8 Các nghiệm thức định lượng Rutin bằng phương pháp HPLC 38

Bảng 4.1 Kết quả khử trùng hạt Mãn Đình Hồng 40

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát ở phạm vi rộng 41

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA ở phạm vi hẹp 44

Bảng 4.4 Kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng 47

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu hóa chất điều hòa sinh trưởng 48

Bảng 4.6 Kết quả theo dõi màu định tính Flavone 51

Bảng 4.7 Kết quả định lượng hàm lượng hợp chất Rutin trên mẫu cây thiên nhiên, mô sẹo khô và dịch huyền phù 51

Hình 1.1: Hoa Mãn Đình Hồng mãu đỏ và màu trắng 3

Hình 1.2 Cây hoa Mãn Đình Hồng đang được trồng tại vườn 3

Hình 1.3 Cấu trúc C6-C3-C6 5

Hình 1.4 Cầu trúc Benzo-dihypyran 5

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Rutin 7

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Quercetin 9

Hình 1.7 Dạng glucoside của Quercitin 9

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Kaempferol 11

Hình 1.9 Dạng glycoside của Kaempferol 11

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của chất Myricetin 12

Hình 1.11 Dạng glycoside của Myricetin 12

Hình 1.12 Biểu đồ biểu diễn đường cong tăng trưởng 17

Hình 1.13 a Cấu tạo tổng quá một máy HPLC 24

Hình 1.13 b Sơ đồ khối một máy HPLC 25

Hình 1.13 c Các loại máy HPLC thông dụng trong các phòng thí nghiệm hiện nay 26 Hình 4.1 Mẫu cây Mãn Đình Hồng Khử trùng in vitro 41

Hình 4.2 (a,b)Mẫu mô sẹo hình thành ở giai đoạn 1, khảo sát phạm vi rộng 43

Hình 4.3 (a, b) Mẫu mô sẹo khảo sát giai đoạn 2 ở phạm vi hẹp 46

Hình 4.4 Mẫu nuôi cấy huyền phù tế bào 50

Hình 4.5 Mẫu tế bào cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L 50

Sơ đồ 3.1 Xử lý mẫu định tính 36 Biểu đồ 4.1 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát điều kiện khử trùng 40 Biểu đồ 4.2 Đồ thị biểu diễn kết quả khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA trên phạm vi rộng 43 Biểu đồ 4.3 Biểu diễn kết quả khảo sát điều kiện tạo mô sẹo 46 Biểu đồ 4.4 Biểu diễn đường c4ông tăng trưởng của dịch nuôi cấy huyền phù tế bào 48 Biểu đồ 4.5 Biểu diễn kết quả theo dõi tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 49

Cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L đã du nhập vào Việt Nam trong những năm qua và được trưng bày để làm đẹp trong nhà vào các dịp lễ, tết với giá trị thẳm mỹ Tuy nhiên theo các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước thì cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L còn có các tác dụng dược lý khác như điều trị viêm, viêm cuống phổi, trị ho, đau ruột… [3] và có chứa các hợp chất có giá trị như Rutin (73,28 Đôla/25g), Quercetin (82,82 Đôla/25g), Kaempferol (82,82 Đôla/10 mg)… [3], [12], [34]

Ngoài ra, do hiện trạng diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày càng bị hạn chế như hạn hán, lũ lụt, tăng diện tích đất thổ cư… nên diện tích đất canh tất nông nghiệp nói chung, hay diện tích đất trồng cây dược liệu ngày càng bị thu hẹp Để khắc phục được vấn đề đó và đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng, việc ứng dụng các phương pháp nuôi cấy mô và dịch huyền phù tế bào cũng đang được quan tâm để sản xuất và thu nhận các hợp chất ý dược có giá trị

Với tình hình được nêu trên, mục tiêu của đề tài nghiên cứu đề ra là “khảo sát các điều kiện nuôi cấy mô nhằm tăng sinh sinh khối tế bào cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L và định lượng hợp chất Flavone có trong cây” Các nghiên cứu của đề tài là bước đầu nghiên cứu các điều kiện khử trùng nguồn nguyên liệu thiên nhiên, ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo và tối ưu hóa điều kiện chất điều hòa sinh trưởng trong nuôi cấy huyền phù để thu sinh khối cao nhất, và từ đó xác định hàm lượng hợp chất Flavone có giá trị trong cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L Đề tài mang tính khoa học, thiết thực và cấp thiết để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc thu nhận các hợp chất có giá trị y dược từ cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY MÃN ĐÌNH HỒNG ALTHAEA ROSEA L

1.1.1 Đặc điểm phân loại

- Tên khoa học là: Althaea Rosea (L.) Cav (Alcea rosea L.)[24]

- Tên thông dụng tiếng Anh: Hollyhock, Rose Trémière

- Tên thông thường: Mãn Đình Hồng hay Thục Quỳ Tên gọi Mãn Đình Hồng xuất phát từ đặc điểm của cây có màu hồng đỏ rực rỡ [3]

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Cây cỏ thân to, cao đến 2-3,5m, thân đầy lông đứng Lá có phiến có thùy rộng đến 30cm, bẹ lá đáy rộng Hoa ở phần chót thân, to, rộng 10-12cm, trắng, hường, đỏ, thường đôi; là đài phụ 5-8 lông trắng; đài 2-3cm; ống tiểu nhụy ngắn; noãn sào 25-45 buồng 1 noãn Trái trong đài đậy; phần quả không khai [3]

Cây hoa ít phân cành, khi ra hoa ngọn vươn cao thành bông dài Hoa đơn, mỗi nách lá cho 1 chùm 2 đến 3 hoa, hoa nở từ dưới lên trên, hoa ở dưới nở to hơn và càng lên ngọn càng nhỏ dần đến khi chỉ thấy thành 1 chùm hoa nhỏ Hoa Mãn Đình Hồng nở quanh năm, nhưng thường được trồng và để trưng và vào dịp tết Hạt thường có màu nâu đất, hình hạt đậu, dẹp và các hạt sếp song song với nhau tạo thành trái

Hình 1.1 Hoa Mãn Đình Hồng màu đỏ và màu trắng 1.1.3 Đặc điểm sinh thái

Cây hoa dễ dàng thích hợp với nhiều loại đất, chịu nóng ẩm và nắng, đất ẩm vừa Từ khi trồng đến khi ra hoa khoảng từ 90 đến 100 ngày Hoa nở liên tục và kéo dài hàng tháng

Hạt thường có lượng dầu cao nên khó bảo quản nên thường được hái khi hạt ngã sang màu vàng và phơi khô bảo quản

Hình 1.2 Cây hoa Mãn Đình Hồng đang được trồng tại vườn

1.1.4 Đặc điểm phân bố:

- Cây được trồng trồng phổ biến từ Châu Âu đến Trung Quốc từ những thế kỹ thứ

16 Theo William Turner, nó được liệt vào danh sách các cây thuốc từ thời điểm này và có tên tiếng Anh là holyoke

- Thường được trồng ở Châu Âu, Tây Nam và Trung Á

- Tại Việt Nam: cây thường được trồng vào dịp tết tập trung tại Sài Gòn và Đà Lạt.[24]

1.1.5 Các hợp chất có giá trị trong cây Mãn Đình Hồng

Những nghiên cứu gần đây nhất cho thấy các hợp chất chính trong cây Mãn Đình Hồng gồm lượng lớn các polysaccharide, flavonoid mà thành phần chính là Kaeempferol, quercetin, luteolin và myricetin, anthocyanhdin, delphindin và một vài hormone estrogen có hoạt tính chưa được biết đến [3], [12],[14],[16],[17]

Theo phân tích của Marlena Dudek và cộng sự [15] thì thành phần tách chiết của cao khô Mãn đình Hồng dịch Metanol gồm: syringic (47.10 mg), p-hydroxybenzoic (18.27 mg), p-coumaric (14.06 mg) và acid ferulic (2.35 mg)

1.1.6 Giá trị y dược của cây Mãn Đình Hồng

Rễ hoạt nhuận, giúp nhẹ đau khi đau cổ, đau nướu, nhọt, sưng vết thương, tê thấp, đau ruột Lá, hoa trị ho; hoa chứa rutin, crinin, kaemferol, phloretin…, chống viêm, trị viêm cuống phổi, là tăng sự tuần hoàn, cầm máu, trị kinh nguỵêt đau Chức altein, hoạt động giống oestron, chống viêm khuẩn trái rạ, thủy bào chẩn (Fortin) [3]

1.2 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID [4]

Flavonol là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn và rất phổ biến Chúng là một nhóm các hợp chất dị vòng có oxy và là thành phần chính tạo nên sự đa dạng về màu sắc của các loài hoa lá cây cỏ

Vào năm 1952, Flavonol được Geissman và Hinreiner sử dụng lần đầu tiên có cấu trúc cơ bản là flavon (2 –phenylchromone), về sau khái niệm này được mở

1.2.1 Cấu tạo và đặc điểm của hợp chất tự nhiên Flavonoid

Khung cơ bản của Flavonoid gồm có 2 vòng (vòng A và vòng B) nối với nhau qua một mạch carbon (cấu trúc 1.3 – diphenylpropan C6-C3-C6)

Hình 1.3 Cấu trúc C6-C3-C6.

Mạch 3 carbon thường ngưng tụ với vòng A qua cầu nói oxy tạo nên một dị vòng

C thường là 6 cạnh Cấu trúc ngưng tụ của vòng A và C có tên là nhân Chroman (benzo-dihypyran)

Hình 1.4 Cấu trúc benzo-dihypyran

Các cấu trúc của flavonoid khác nhau bởi:

- Vị trí của nhân phenyl gắn lên dị vòng C

- Mức độ oxy hóa của dị vòng C

- Bản chất, số lượng và vị trí của các nhóm thế gắn trên khung cơ bản

Người ta chia flavonoid thành 3 nhóm chính là Euflavonoid, Isoflavonoid và Neoflavonoid

Trong nhóm Euflavonoid là những hợp chất có cấu trúc cơ bản là 2 phenylchroman, dựa vào mức độ oxy hóa chia làm sáu phân nhóm: Flavone (gồm Apigenin, Luteolin) và Flavonol (gồm Rutin, kaempferol, quercetin, Myricetin);

Flavonon (gồm Maringenin, Eriodictol) và Flavanonol (gồm Aromadendrin, Fustin, Taxifolin); Anthocyanindin; Chalocon và dihydrochalcon; Auron (gồm Sulfurcetin, Bracreatin); Catechin và leucoanthocyanidin

Nhóm Isoflavonoid là những hợp chất có cấu trúc cơ bản là isoflavan, gồm nhiều phân nhóm: Isoflavon (gồm Igrigenin, Daizein, Genistein); Isoflavanon, Rotenoid, nhóm các cấu trúc khác : Coumaranocoumarin, Coumaranochroman, Coumaroflavone

Nhóm Neoflavonoid là những hợp chất có cấu tạo cơ bản là neoflavan phenyl-chroman

(4-1.2.2 Tác dụng dược lý

1.2.2.1 Tác dụng kiểu Vitamin P

Các hợp chất flavonoid có tác dụng làm bền, tăng sức chịu đựng của thành mạch máu và hồng cầu; làm giải tính thấm của thành mạch Có tác dụng hỗ trợ vitamin C trong điều trị bệnh Sacorbut

Các nhóm flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, catechin leycoanthocyanidin, anthocyanidin mang tính chất này và được sử dụng nhiều trong biệt dược

1.2.2.2 Tác dụng chống oxy hóa

Các flavonoid do có nhiều nhóm OH phenol nên có tác dụng chống oxy hóa in vitro, chúng được dùng làm chất chống oxy hóa chất béo, dược phẩm, mỹ phẩm Invivo, chúng ức chế Enzyme Catechin-O-methyl transferase làm bền vững chất adrenalin, chống sự oxy hóa của Vitamin C và một só chất khác do ức chế cytochrom oxydase của chu trình hô hấp của tế bào

1.2.2.3 Các tác dụng khác

Ngoài ra chúng còn có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, dị ứng, tác dụng

chống co thắt làm giảm đau và có tác dụng giãn mạch

Ngoài ra một số hợp chất flavonoid có nhiều nhóm OH có tác dụng lợi tiểu, hạ ure huyết nên được dùng trong điều trị bệnh thận, bí tiểu như quercetin,

gan, kích thích nhẹ tim và có tác dụng chống ung thư như eupatin, eupatorin Các rotenoid có tác dụng độc với cá và côn trùng, được dùng làm thuốc trừ sâu trong nông nghiệp

1.2.3 Sơ lược về một số hợp chất Flavonoid có trong cây Mãn Đình Hồng

1.2.3.1 Hợp chất Rutin

a Đặc điểm hóa lý

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Rutin

- Công thức phân tư:û là C27H30O16 có trọng lượng phân tử là 610.52 dalton (g/mol)

- Tên hóa học: 3, 3’, 4’, 5, 7-pentahydroxyflavon 3-rutinosid, hay dihydroxyphenyl)-4,5-dihydroxy-3-[3,4,5-trihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxy-6-ethyl-oxan-2-yl)oxymethyl]oxan-2-yl]oxy-chromen-7-one

2-(3,4 Đặc tính: Bột màu vàng nhạt, không mùi Nó chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng Hòa tan trong pyridine, trong methanol và dung dịch gazo yếu, hòa tan trong glycerin, ít tan trong ethanol và chloroform, dầu ete, benzen, benzene và carbodisulfide

- Điểm nóng chảy: 2100C [27]

b Giá trị y dược

Rutin có tác dụng làm giảm sự dễ vỡ của các vi mạnh và giảm độ thẩm thấu của mạnh máu, gia tăng sự bền chắc của mạnh máu do đó có tác động bảo vệ ngăn ngừa huyết áp cao, cầm máu Một số nghiên cứu khoa học cho thấy rutin có tác dụng bảo

vệ cơ thể chống lại tác hại của asbestos, giúp cơ thể chống tác dụng gây hại cho tế bào của LDL đã bị oxy hóa, bảo vệ bao tử chống tác động của ethanol Khi dùng thêm trong chế độ ăn uống, Rutin cho thấy có tác dụng bảo vệ DNA chống lại các

hư hại gây bởi các hóa chất gây ung thư gan Ngoài ra rutin còn được dùng chung với trysin và bromelain để trị sưng xương khớp (osteoarthritis), bệnh nhân bị sưng và đau đầu gối loạn osteoarthritis

Các hợp chất rutin, hesperidinm quercitrin và naringin có tác dụng lâm sàng rõ rệt trong điều trị, tăng tính thấm thành mạch, dễ bị vết thăm bằm dưới da, trĩ và các trường hợp giãn mạch Dịch trích hoa hòe có chứa thành phần rutin có tác dụng hạ triglycerid trong máu [20]

Ngoài ra hợp chất Rutin còn có tác dụng làm bền và giảm tính thấm của mao mạch, tăng sự bền vững của hồng cầu, hạ thấp trương lực cơ và chống co thắt Trong điều trị bệnh, hợp chất rutin được chỉ định để tăng sức bền và giảm tính thấm của mao mạch Điều trị hội chứng chảy máu, xơ cứng, tăng huyết áp, ban xuất huyết, chứng giãn tĩnh mạnh (phù, đau, nặng chân, bệnh trĩ…)

Rutin đươc xem là một chất chống oxy hóa, một chất thu nhặt các gốc tự do và là một chất phức hóa sắt (Iron chelator) Khi thủy giảm Rutin thì được một genin là Quercetin và phần tử glucose và một phần tử fhamnose Quercetin cá tác dụng làm chậm nhịp tim, gây giãn nỡ động mạnh vành và tăng thể tích tâm thu Quercetin còn có hoạt tính chống ung thư bằng cách ức chế sự tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư như ung thư bao tử, ung thư máu Liều tác động của Quercetin được ghi nhận là 1-50mM [27]

1.2.3.2 Hợp chất Quercetin

a Đặc điểm hóa lý [25]

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Quercetin

- Công thức phân tử : C15H10O7.

- Trọng lượng phân tử: 302.236 g/mol

- Tỉ trọng: 1.799g/cm3

- Nhiệt độ nóng chảy: 3160C

Hình 1.7 Dạng glucoside của Quercitin

b Giá trị y dược

Quercetin thường có các tính chất đặc trưng của nhóm flavonoid Nhiều cây thuốc thường có hàm lượng quercetin rất cao Quercetin được chứng minh là có khả năng kháng viêm do có thể ức chế trực tiếp phản ứng viêm Nó hạn chế cả hai quá

trình sản xuất và phát tán của histamine cũng như các chất gây viêm khác Ngoài

ra, nó còn có tính chống oxy hóa và bảo vệ Vitamine không bị phân hủy

Quercetin cũng cho thấy có tác dụng kháng tế bào ung thư Trong nghiêm cứu tại viện nghiêm cứu ung thư British Joural, khi điều trị tổng hợp lượng quercetin và xử lý sóng âm 20kHz trong vòng 1 phút, tế bào ung thư da và tuyến tiền liệt chết 90% trong vòng 48h mà không có tác dụng gây chết đối với tế bào bình thường Trong những nghiên cứu gần đây, chất quercetin giúp đàn ông cảm thấy dể chịu hơn trong các căn bệnh liên quan đến tuyến tiền liệt, do nó ức chế các đại thực bào Quercetin có khả năng ngăn ngừa ung thư, tiến tiền liệt, bệnh tim, bệnh đục nhãn mắt, dị ứng, viêm và các căn bệnh liên quan đế hô hấp như viêm cuống phổi và hen suyễn

Thức ăn giàu Quercetin gồm có cây Bạch Hoa (1800mg/Kg), Lovage (1700mg/Kg) táo (440mg/kg), trà…Ngoài ra Quercetin còn được tiềm thấy trong mật ong mà được lấy từ hoa cây Khuyên diệp và hoa trà [9],[11]

Ngoài ra, quercetin còn có tính kháng sinh, tác dung hợp trợ với các chất fluoroquinolone, quercetin gắn vào enzyme DNA gyrase của vi khuẩn vì thế ngăn chặn khả năng phát triển của vi khuẩn

Do Quercetin có khả năng chống oxy hóa Vitamin C, do nó tác dụng ức chế men aldose reductase rất mạnh, mà chất này có tác dụng chuyển glucose thành sorbitol

- một chất có liên quan chặt chẽ với tiến triển của bệnh đái tháo đường và các biến chứng của bệnh đái tháo đường (đục thủy tinh thể, thương tổn thần kinh, bệnh võng mạc )[17],[18],[21],[ 30]

1.2.3.3 Hợp chất Kaempferol

a Đặc điểm hóa lý[24]

Hình 1.8 công thức cấu tạo của Kaempferol

- Tên khoa học: 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one

- Công thức phân tử : C15H10O6

- Trọng lượng phân tử: 286.23 g/mol

- Tỉ trọng: 1.799g/cm3

- Nhiệt độ nóng chảy: 276-2780C

Hình 1.9 Dạng glycoside của Kaempferol

b Giá trị y dược

Kaempferol là một flavonoid tự nhiên được cô lập từ trà, vi khuẩn Broccoli,Delphinium, nước ép nho Kaempferol có màu vàng khi ở nhiệt độ nóng chảy Ít tan trong nước nhưng tan nhiều trong ethanol nóng và diethyl ether

Dạng glucoside của Kaempferol có ở 2 dạng kaemferitrin và astragalin

Kaempferol trong trà được chứng mình là có khả năng giảm thiểu các nguy cơ tim mạch

Kaempferol thường có nhiều trong hoa của cây Acacia decurrens và Acacia longifolia [13]

1.2.3.4 Hợp chất Myricetin

a Đặc điểm hóa lý [26]

Hình 1.10 Công thức cấu tạo của chất Myricetin

- Tên khoa học: 3,5,7-Trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-4-chromenone

- Tên gọi khác: Cannabiscetin, Myricetol, Myricitin

- Công thức phân tử : C15H10O8

- Trọng lượng phân tử: 318.2351 g/mol

Hình 1.11 Dạng glycoside của Myricetin

b Giá trị y dược

Myricetin là một lại flavonoid tự nhiên được tìm thấy trong nho, dâu, trái cây, rau, các loài cỏ và trong các loại cây khác Quả cây óc chó là nguồn cung cấp

giàu Myricetin Chất Myricetin được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa Nó thường được tìm thấy trong dạng glycoside như Myricitrin

Trong các nhiên cứu in vitro, cho thấy Myrcicetin ở nồng độ cao có khả năng hỗ trợ LDL cholesterol do làm tăng lượng tế bào bạch cầu Và các nghiên cứu gần đây cho thấy lượng Myricerin ở nồng độ cao có khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư tuyến tiền liệt [16]

1.2.4 Một số đối tượng chứa hợp chất Flavonoid

- Dâm Dương Hoắc, tên khoa học là Epimedium brevicorum., E Koreapum, E.sagitatum Cây Dâm Dương Hoắc có chứa các hoạt chất glucoside, icariin, noricariin, dầu thơm và một số acid béo, flavonol… Cây được sử dụng để điều trị thiểu năng vành, viêm phế quản mãn, suy nhược thần kinh, cây có tác dụng sinh học trên hệ tim mạch làm giãn mạch nên có tác dụng làm tăng cường lưu lượng máu vành , giảm huyết áo Cây có thể dùng dưới dạng chè thuốc và dùng lâu dài Ngoài ra, còn có tác dụng giảm ho, long đồm và kháng khuẩn.[28]

- Bạch quả: còn có tên là Ngân hạnh Lá Bạch quả có chức nhiều flavonoid công hiệu đặc biệt là bisflavon và các heterrozit của flavon và flavonol Hai chất này có tính chất chống oxy hóa, do bắt các gốc tự do của võng mạc và não làm chạm quá trình lão hóa của võng mạc, não và làm giảm các rối loạn liên quan đến sự lão hóa, có tác dụng điều hoà tính thấm mao mạch, làm giãn mạch và làm giảm tính nhớt của máu Bạch quả được dùng để điều trị bệnh lão hóa não, cải thiện trí nhớ và điều trị các rỗi loạn bằng cách can thiệp vào sự truyền dẫn thần kinh giác quan, ngoài ra còn được dùng trong điều trị suy động mạch ngoại biên và rối loại tuần hoàn [22]

- Nụ cây Hoa Hòe, tên khoa học là Sophora japonica L., có chứa các hợp chất sau: Quinolizidin (0-0.04%) như Cytisine, N-methyl cytisine, Matrine, Sophocarpine Flavonoids (1.75%) như Rutin (có thể đến 0.5%), Sophorine Các Polysaccharides như galactomannans : thành phần của các galactomannan thay đổi tuỳ theo phương pháp, dầu béo ( 6.9-12.1%), protein (17.2-23%) các chất khoáng Calcium,

phosphoris, Potassiuma Hoa Hòe có chức nhiều Rutin (có thể đến 34%) ngoài ra còn có các saponin Tác dụng của hoa hòe làm tăng lượng fibrinogen, tăng tiểu cầu, có tác dụng chống ung thư cổ tử cung trên chuột liều lượng 60g/kg thể trọng Có tách dụng kháng sinh, chống lại các vi trùng lao Mycobacterium tuberculosis,Staphylococcus (đặc biệt là Staphylococ cus aureus đã kháng methicillin; chống siêu

vi trùng Coxsackievirus B3 (CVB3); ngoài ra còn có tác dụng chống loại nhịp tim bằng cách làm chậm nhịp tim, gia tăng thời gian chuyển dẫn nới tim và gây giảm phản ứng kích ứng cơ tim hoạt tính này không bị ảnh hưởng bởi atropin nor-beta-adrenergic [4]

- Diếp Cá Herba Houttuyniae, cây còn được gọi là cây dắp cá được dùng toàn thân Thành phần hóa học của cây gồm có quercitrin, và iso-quercitrin, tinh dầu_ đây là thành phần chủ yếu tạo mùi cho dược liệu, một số acetaldehyd, alcaloid… Cây có tác dụng kháng nhiều loại virus đã dược nhiên cứu, thành phần có tác dụng là quercitrin và tinh dầu Cây còn có tác dụng kháng viêm, thông tiểu, làm bền thành mạch của quercitrin Trong dân gian người ta dùng cây diếp cá để trị đau mắt có tụ máu, bệnh trĩ (chiết lấy nước uống và rữa), ngoài ra Diếp cá còn là nguồn cung cấp Vitamin P tốt cho cơ thể [4]

- Cây Actisô Folium Cynarae, Bộ phận dùng thuốc là lá và hoa của Actisô Chất Cynarin được coi là hoạt chất chính của cây, ngoài ra còn có các thành phần có công dụng khác như các flavonoid luteolin, cynarosid và cynatriosid Tác dụng dược lý: Cây được dùng từ lâu để chữa các bệnh sỏi bàng quan, phù thủng, các bệnh về gan Tác dụng tăng tiết mật (được chứng minh năm 1931), nhiều công trình nghiên cứu chứng minh tác dung phục hồi tế bào gan, tăng chức năng chống chất độc của gan, phòng ngừa bệnh xơ vữa động mạch, làm hạ cholesterol, thông tiểu [4]

1.3 NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu

- Năm 1902, Haberlandt đã đưa ra ý kiến cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thể,

trong ống nghiệm (in vitro) đã được thử nghiệm nhưng khơng được thành cơng

- do dùng tế bào quá chuyên biệt

- Năm 1919 Mơ động vật được A.Carrel cấy trước tiên Đến năm 1934 mơ thực vật được cấy thành cơng

- Năm 1934 White đã thành cơng trong việc phát hiện ra sự sống vơ hạn của việc nuơi cấy tế bào rễ cà chua

- Năm 1947, James đã tiến hành nuơi cấy tế bào và một vài cơ quan của thực vật

- Từ năm 1960-1970, các nhà khoa học Nhật bản chủ yếu nghiên cứu các điều kiện nuối cấy, trong đĩ các điều kiện tự động và ảnh hưởng cá loại muối dinh dưỡng được đặc biệt chú ý

- Năm 1962, Muashige và Skoog đã cải tiến mơi trường nuơi cấy đánh dấu một bước tiến trong kỹ thuật nuơi cấy mơ Mơi trường này được dùng làm mơi trường

cơ bản cho việc nuơi cấy nhiều loại cây và vẫn được sử dụng rộng rãi cho đến nay

- Từ năm 1960-1964, Mỏel cho rằng cĩ thể nhân giống vơ tính lan bằng nuơi cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết quả đĩ lan được xem là cây nuơi cấy mơ đầu tiên được thương mại hĩa

- Từ những năm 1970, các nhà khoa học Nhật Bản đã thành cơng trong việc thu nhận hàng loại các sản phẩm trao đổi chất thứ cáp phục vụ cho sản xuất các dược phẩm

- Từ năm 1980 trở về sau, Nhật Bản đã đưa ra mơ hình kết hợp giữa các trường đại học, viện nghiên cứu và các cơ sở sản xuất để tạo điều kiện cho hàng loạt các hợp chất thứ cấp được sản xuất theo qui mơ cơng nghiệp [1], [8]

1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

1.3.2.1 Khái niệm về mô sẹo [5]

Mô sẹo là khối tế bào gắn với nhau vô tổ chức, có hình dạng không ổn định Mô sẹo hình thành trên cây tại những vị bị côn trùng cắn hoặc vết thương Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin

Mô sẹo có thể hình thành trong phòng thí nghiệm bằng cách đưa một mẫu nhỏ của cây (đã khử trùng) lên môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, hay còn gọi là hormone thực vật Dưới tác dụng của các hormone khác nhau, quá trình trao đổi chất sẽ thay đổi và bắt đầu hoạt động phân bào, vì vậy khi sự mất cân bằng về nồng độ các hormone thực vật trong tế bào thì mô sẹo sẽ hình thành Trong điều kiện thích hợp khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh

Trên từng môi trường nuôi cấy khác nhau, mô sẹo hình thành với màu sắc, hình dạnh kích thước khác nhau Hoặc trên những bộ phận nuôi cấy khác nhau cũng hình thành các dạng mô sẹo khác nhau Các tế bào mô sẹo trong những điều kiện khác nhauu có thể hình thành những biến đổi di truyền tạo nhiều dạng tế bào khác nhau Thường hình thành thành 2 dạng tế bào mô sẹo chính:

- Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân tế bào nhỏ và tế bào chất loãng

- Loại tế bào chặt, có không bào nhỏ, nhân tế bào to và tế bào chất đậm đặc Mô sẹo cấy truyền nhiều lần thì khả năng tái sinh càng giảm

1.3.2.2 Phương pháp tạo mô sẹo

Đây là bước đầu tiên trong nhiều thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Mẫu cấy ban đầu có thể lấy từ cây con vô trùng trong ống nghiệm hoặc rễ, thân, lá của cây bên ngoài đã được vô trùng Mô sẹo là khối tế bào vô tổ chức, phát sinh từ vết thương đáp ứng lại sự tổn thương Không phải tất cả mọi tế bào trong mẫu cấy

định mới có khả năng tái tạo lại cơ quan có tổ chức (biệt hóa) Nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật trong môi trường nuôi cấy là yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành và phát triển mô sẹo.[5]

1.3.2.3 Đường cong tăng trưởng

Sự tăng sinh của mô sẹo thường theo đường cong sigma Có 5 pha: pha lag, tăng trưởng nhanh, tăng trưởng tuyến tính, tăng trưởng chậm và thời kỳ cân bằng

Hình 1.12 Biểu đồ biểu diễn đường cong tăng trưởng

- Pha lag: tế bào chuẩn bị phân chia

- Thời kỳ tăng trưởng nhanh, tế bào phân chia cực đại ( exponential phase)

- Thời kỳ tăng trưởng tuyến tính, sự phân chia chậm dần và tế bào tăng kích thước (linear stage)

- Thời kỳ tăng trưởng chậm (decelerting growth)

- Thời kỳ cân bằng, số lượng tế bào là hằng số

Trong mỗi pha, các tế bào mô sẹo đáp ứng khác nhau Môi trường cũng có thể ảnh hưởng làm kéo dài một giai đoạn cụ thể nào đó trong quá trình phát triển của khối mô sẹo

Trên thực nghiệm, người ta cần thu sinh khối mô sẹo với lượng nhiều nhất ở một thời điểm nào đó trên đường cong tăng trưởng Khi quan sát nhiễm sắc thể thì người

ta thấy lượng lớn nhất tế bào ở pha tăng dần,và quan sát rò rành nhất ở pha linear Khi sự nuôi cấy chuyển qua pha bão hòa thì nên chuyển sang môi trường mới Ngoài

ra, khi cầm kiểm soát sự tổng hợp các hợp chất thứ cấp, cần xác định pha tăng trưởng để có thể thu được sản phẩm với năng suất cao nhất [5]

1.3.2.4 Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo [5]

Nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong các trường hợp sau:

- Nhân giống những loại cây thực vật in vitro mà phương pháp nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng ít có hiệu quả hoặc khó thực hiện Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây bộ mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo thì có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng những biến dị tế bào soma lại cao hơn

- Nghiên cứu quá trình hình thành tế bào

- Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn, thu các sản phẩm thứ cấp có hoạt tính sinh học cao…

- Làm nguồn nguyên liệu cho chọn lọc dòng tế bào có đặc tính mong muốn như dòng có năng suất cao, dòng chịu phèn, chịu mặn…

1.3.3 Nuôi cấy huyền phù tế bào và thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học

Các mô sẹo rời thường được chọn để nuôi cấy tế bào đơn Các tế bào từ mô sẹo có thể phát triển khi phân tán tự do trong môi trường lỏng chuyển động gọi là dịch nuôi cấy tế bào hay huyền phù tế bào

Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù tế là một hỗn hợp các tế bào đơn, các tế bào liên kết với nhau với các kích thước khác nhau, các tế bào đang phân chia và các tế bào chết Sự hình thành dịch huyền phù hoàn hảo có tỉ lệ tế bào đơn và các cụm tế bào nhỏ cao là một phức hợp có thể thực hiện được hơn là tìm điều kiện tách rời tế bào [King, 1980] Mức độ tách rời tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào khả năng tạo nhiều tế bào xốp và được điều khiển bởi môi trường

chọn môi trường và nuôi cấy thích hợp là nghiên cứu đầu tiên trong nuôi cấy tế bào đơn [King và Street, 1977]

Huyền phù tế bào là nguồn thích hợp cung cấp tế bào trần cho quá trình dung hợp hay các thao tác di truyền và cho sự phát sinh phôi cao, đặc biệt là cung cấp các hợp chất thứ cấp có giá trị cho thị trường tiêu dùng và nghiên cứu

Sự phát triển của tế bào thực vật trong dịch nuôi cấy tế bào nhanh hơn và dễ dàng hơn điều khiển hơn so với việc nuôi cấy sẹo Nhiều phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào khác nhau đã được phát triển, nhưng có hai phương pháp chính như sau:

- Nuôi cấy gián đoạn: tế bào thực vật được nuôi cấy trong một thể tích (100ml-10lít) hỗn hợp môi trường Trong giai đoạn phát triển của tế bào, số lượng tế bào ban đầu gia tăng cho đế khi dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt hoặc có sự tích lũy chất trao đỗi đến mức kiềm hãm Các môi trường nuôi cấy qui mô nhỏ được chuyển động liên tục trên máy lắc hay trong bình phản ứng được phối trộn đều Môi trường trong bình chứa thường chiếm 1/5 thể tích Máy lắc được điều chỉnh ở vận tốc 30-180vòng/phút với biên độ 3cm Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm Nhược điểm của phương pháp này là không sử dụng được trong nghiên cứu dài hạn về sự phát triển tế bào và sự trao đổi chất, khó nhận được sự ổn định trong sản xuất Các tế bào nuôi cấy gián đoạn không đồng nhất về kích thước và cấu tạo Để đảm bảo yêu cầu nuôi cấy phải nuôi cấy chuyền thường xuyên quần thể tế bào vào môi trường mới sau những khoảng thời gian bằng nhau Vì thế, muốn có sự phát triển cân bằng đầy đủ trong điều kiện là nuôi cấy liên tục

- Nuôi cấy liên tục: đây là phương pháp quan trọng được dùng để sản xuất chất trao đổi sơ cấp hay thứ cấp trên qui mô lớn Kỹ thuật này đòi hỏi phải có hệ thống thiết bị phức tạp Sự chuyển động của môi trường nuôi cấy lớn trong các bồn phản ứng sinh học được thực hiện bằng cách khuấy với một turbin và (hoặc) sục không khí vô trùng vào môi trường từ dưới đáy Bình phản ứng với hệ thống khuấy

trón cô hóc deê daøng caĩt, phaù vôõ teâ baøo nuođi caây Phöông phaùp nuođi caùy naøy cho pheùp giöõ vođ truøng cạ heô thoâng trong moôt thôøi gian daøi

Heô thoâng nuođi caây teâ baøo ñôn gioâng nhö heô thoâng nuođi caây vi sinh vaôt Quaù trình nuođi caây baĩt ñaău baỉng caùch ñaịt mođ séo vaøo mođi tröôøng loûng tređn moôt maùy laĩc coù ñieău chưnh toâc ñoô thích hôïp Döôùi söï taùc ñoông cô hóc vaø caùc loái hoùa chaât trong mođi tröôøng, khoâi mođ séo seõ taùch ra thaønh nhöõng teâ baøo rieđng lẹ gói laø teâ baøo ñôn Caùc teâ baøo ñôn phađn chia táo caùc chuoêi vaø caùc cúm teâ baøo Caùc chuoêi vaø caùc cúm naøy lái tieâp túc bò ñaùnh rôøi ra ñeơ táo thaønh nhöõng teâ baøo rieđng bieôt Vôùi caùc cô chaât thích hôïp ñöôïc boơ sung vaøo mođi tröôøng, teâ baøo coù khạ naíng sạn xuaât caùc hoát chaât coù hoát tính sinh hóc (acid höõu cô, alkaloid, enzyme, steroid…)

1.3.4 Caùc ñieău kieôn nuođi caây teâ baøo ạnh höôûng ñeân vieôc sạn xuaât caùc chaât thöù caâp 1.3.4.1 Chaât ñieău hoøa sinh tröôûng (hormone thöïc vaôt)

Nghieđn cöùu caùc ạnh höôûng cụa caùc hormone ñeân quaù trình nuođi caây teâ baøo cho thaây :

- Chaât sinh tröôûng caăn thieât cho nuođi caây

- Chaât sinh tröôûng ạnh höôûng ñeân quaù trình bieôt hoùa teâ baøo hình thaønh cô quan nhö choăi, thađn, laù, reê

- Chaât sinh tröôûng ạnh höôûng ñeân söï toơng hôïp caùc chaât thöù caâp vaø caâu truùc teâ baøo

Auxin caăn thieât cho nuođi caây teẫ baøo nhö: IAA (Indole-3-3acetic acid), NAA vaø 2,4-D vaø cytokinin nhö: BAP, Kinetin, 2iP (6-isopentenyladnine) Chaât sinh tröôûng taùc ñoông rieđng lẹ hay phoâi hôïp trong cuøng moôt nhoùm hay cạ hai nhoùm ñeân söï sinh tröôûng teâ baøo vaø toơng hôïp caùc chaât thöù caâp Noăng ñoô chaât sinh tröôûng teâ baøo ñöôïc söû dúng töø 1 ñeân 10mg/l [7]

1.3.4.2 Nguoăn ñám

Chụ yeâu laø ñám hoøa tan, ñám dáng nitrat hay hoên hôïp ñám nitrat vaø amonium Ñođi khi söû dúng casein hydrolysate hay cạ nguoăn ñám töï nhieđn

1.3.4.3 Nguồn carbon

Sucrose là nguồn carbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng Đôi khi phụ thuộc vào các loại cây trồng mà sử dụng mannose, galactose hay glucose Loại đường và nồng độ đường được sử dụng ảnh hưởng đến nồng độ các chất thứ cập được thu nhận

1.3.4.4 Aùnh sáng

Các hợp chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối hay có ánh sáng phụ thuộc vào từng loại thực vật và trong quá trình dinh dưỡng ở nuôi cấy in vitro là quá trình tự dưỡng

1.3.4.5 Các chất khác

Đôi khi trong quá trình nuôi cấy tế bào còn chịu tác động bởi pH của môi trường, nồng độ phosphat, các loại khí như: oxy, carbonic hay ethylen va được bổ sung dịch chiết nấm men hay nước dừa

Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng các cơ chất trong quá trình nuôi cấy là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp Điều này cho phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các hợp chất thức cấp mới mà bản thân tế bào thực vật không có Việc sản xuất các hợp chất thứ cấp có trong tự nhiên hay các chất mới bằng phương pháp nuôi cấy tế bào và có sự tham gia của các cơ chất là điều hiện thực [6]

1.4 SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

1.4.1 Lý thuyết cơ bản về sắc ký lỏng cao áp HPLC

Cùng với sự ra đời của các vật liệu hiệu quả cao, cũng như sự tiến bộ về trang thiết bị cho phép thực hiện đầy đủ năng lực của các vật liệu này, kỹ thuật HPLC đã phát triển vô cùng mạnh mẽ và vững chắc hơn so với các phương pháp sắc ký khác

⇒ Định nghĩa: HPLC là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi bằng các hạt có kích thước ≤ 10μm Trong đó, người ta dùng một bơm có áp suất cao ≈ 300

atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/ phút và cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ khoảng 20μg

⇒ Ưu điểm: + Trong sắc ký khí, các hỗn hợp được khảo sát trong pha hơi, vì vậy cần phải tạo một chất hơi ổn định từ hỗn hợp cần phân tích, hoặc chuyển các chất có trong hỗn hợp thành các dẫn chất bền với nhiệt Chỉ có khoảng 20% các hợp chất hoá học thích hợp cho sắc ký khí mà không cần phải biến đổi mẫu thành một dạng khác; số còn lại đều không bền với nhiệt và không bay hơi Hơn nữa, các chất có các nhóm chức rất phân cực hay có thể ion hóa thường có khuynh hướng kéo đuôi, không thích hợp khi áp dụng sắc ký khí Vì thế HPLC là một kỹ thuật tốt hơn đối với các đại phân tử, các loại chất vô cơ và ion hóa, các hợp chất thiên nhiên không bền, các hỗn hợp thuốc và các chất hóa sinh

+ Trong sắc ký khí chỉ có một pha (pha tĩnh lỏng hay rắn) là sẵn sàng tương tác với các phân tử của mẫu Vì pha động là một chất khí, tất cả hơi của mẫu đều tan trong chất khí này Trong HPLC, cả pha tĩnh và pha động có thể tương tác một cách chọn lọc với mẫu Các tương tác như tạo phức hay liên kết hydrogen không có trong pha động của sắc ký khí có thể xảy ra trong pha động của HPLC Nhiều loại tương tác chọn lọc khác nhau này cũng có thể được gia tăng bởi sự biến đổi hoá học thích hợp của bề mặt silica, vì thế HPLC là một kỹ thuật linh hoạt hơn sắc ký khí, và thường có thể thực hiện được trên các phân tử tách khó hơn

⇒ Nhược điểm: + Xét cả về đầu tư trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kỹ thuật đắt tiền, hơn cả sắc ký khí

1.4.2 Cấu tạo và hoạt động của máy sắc ký lỏng cao áp HPLC

Thiết bị cơ bản máy HPLC bao gồm (hình 1.13):

− Bình chứa pha động (solvent reservoir)

− Bơm tạo áp lực cao và hệ thống tạo ra việc rửa giải đẳng môi hay rửa giải tiệm tiến (pump + gradient system)

− Bộ phận tiêm mẫu (injection unit) để đưa mẫu vào cột

− Cột (column) được nhồi với pha tĩnh có hiệu quả cao Cột có thể được đặt trong một bộ phận điều nhiệt

− Bộ phận phát hiện (bộ phận phát hiện) và hệ thống xử lý số liệu (data processing system)

− Máy ghi (recorder) hoặc máy vi tính (computer) để ghi hặc lưu giữ sắc ký đồ, in ra hoặc biên tập lại sau này

Pha tĩnh trong HPLC là các phân tử có kích thước rất nhỏ, được gọi là các chất nhồi vi tiểu phân, chúng thường đồng dạng, có hình cầu hoặc hình dạng bất định, đường kính 10, 5, hay 3μm Cơ chế phân tách có thể được thực hiện bằng các nhóm hóa học liên kết vào bề mặt của các tiểu phân silica để tạo ra các pha liên kết Hiện nay, pha liên kết thông dụng nhất được sử dụng trong HPLC là ODS, trong đó nhóm alkyl 18 carbon được gắn vào bề mặt của các tiểu phân silica

Khi được nhồi vào cột, kích thước nhỏ của các vi tiểu phân dẫn đến sự đề kháng đáng kể với sự chảy của dung môi, vì thế pha động phải được bơm qua cột bằng một áp lực cao Cột và toàn bộ hệ thống ống phải chịu được áp suất sử dụng và cũng phải đề kháng về mặt hóa học với các dung môi pha di động, chúng thường phải được chế tạo bằng thép không gỉ

Pha động được bơm qua cột với vận tốc vài ml/ phút Nếu thành phần pha động không đổi, phương pháp được gọi là rửa giải đẳng môi (isocratic elution) Ngược lại, nếu thành phần của pha động có thể được làm thay đổi theo một cách đã định trước trong lúc phân tách, phương pháp được gọi là rửa giải tiệm tiến (gradient elution) Rửa giải tiệm tiến thích hợp cho các mẫu thử nghiệm chứa các chất có độ phân cực khác nhau nhiều, cần đến sự thay đổi độ phân cực của hỗn hợp dung môi trong quá trình tách

Sau khi qua cột, các chất tan tách ra được ghi nhận bằng một bộ phận phát hiện lắp đặt trong hệ thống Thông tin đưa ra của bộ phận phát hiện là một tín hiệu điện, sự biến đổi của tín hiệu này được biểu hiện trên một máy đo thế năng, một dụng cụ tích phân vi tính, hoặc một màn hình của máy tính Phần lớn các bộ phận

phát hiện phổ biến trong HPLC là bộ phận phát hiện chọn lọc, chúng không thể đáp ứng với tất cả các chất tan có trong hỗn hợp Do vậy, sẽ có một số chất tan không được phát hiện trong HPLC, chúng cần phải được chuyển thành một dạng khác có thể phát hiện được sau khi ra khỏi cột, phương pháp này gọi là phương pháp tạo dẫn chất sau cột (post-column derivatisation)

Hình 1.13a Cấu tạo tổng quát một máy HPLC [2]

Hình 1.13 b Sơ đồ khối một máy HPLC

Hình 1.13c Các loại máy HPLC thông dụng trong các phòng thí nghiệm hiện nay.[19]

- Xác định được điều kiện nuôi cấy in vitro tạo mô sẹo và dịch huyền phù cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L.

- Xác định được hàm lượng hợp chất Flavone có trong mẫu cây ngoài thiên nhiên và mẫu nuôi cấy in vitro

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

• Xác định các điều kiện nuôi cấy in vitro cây Mãn Đình Hồng Althaea Rosea L:

- Tiến hành khảo sát điều kiện khử trùng hạt Mãn Đình Hồng Althaea Rosea

L nhằm tạo nguyên liệu ban đầu nuôi cấy in vitro

- Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên khả tao tạo mô sẹo từ mẫu cây in vitro

- Tiến hành khảo sát điều kiện tối ưu hóa chất điều hòa sinh trưởng để tạo sinh khối cao nhất

• Định tính và định lượng Hợp chất Flavone:

- Tiến hành định tính trong các mẫu cây ngoài thiên nhiên và mẫu mô sẹo in vitro để xác định sự có mặt của nhóm Flavone

- Tiến hành định lượng các mẫu cây ngoài thiên nhiên, mẫu mô sẹo và mẫu nuôi cấy huyền phù bằng phương pháp HPLC