Nghiên cứu sử dụng nấm sợi aspergillus SP và trichoderma SP xử lý bã khoai mì để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh

Qua kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm sau phân giải về các chỉ tiêu hóa học và vi sinh vật cho thấy sản phẩm sau khi phân giải bởi Aspergillus sp và Trichoderma sp đạt tiêu chuẩn của

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

  

HUỲNH VĂN HIẾU

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM SỢI

ASPERGILLUS SP VÀ TRICHODERMA SP

XỬ LÝ BÃ KHOAI MÌ ĐỂ SẢN XUẤT PHÂN

BÓN HỮU CƠ VI SINH

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số : 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Đức Lượng

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngày tháng năm 2009

- -oOo -

Tp HCM, ngày tháng năm 2009

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: HUỲNH VĂN HIẾU Phái: Nam

Sinh ngày: 10/05/1982 Nơi sinh: Bình Định Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học MSHV: 03107698

1- TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu sử dụng nấm sợi Aspergillus sp Và Trichoderma sp

Xử lý bã khoai mì để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh”

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

Thu thập và lựa chọn chủng Aspergillus sp có khả năng sinh hoạt tính amylase cao và chủng Trichoderma sp có hoạt tính cellulase cao

Khảo sát điều kiện tối ưu trong nhân giống Aspergillus sp và Trichoderma sp

Khảo sát điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm vi sinh

Ứng dụng chế phẩm vi sinh xử lý bã khoai mì để tạo phân hữu cơ vi sinh

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 02/02/2009

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 03/07/2009

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Nội dung và đề cương Luận Văn Thạc Sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

TRƯỞNG PHÒNG ĐT – SĐH KHOA QL CHUYÊN NGÀNH

LỜI CẢM ƠN



Sau hai năm dài học tập và nghiên cứu, với sự chỉ dẫn tận tình của quý Thầy Cô, đến nay tôi đã hoàn thành luận văn cao học chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học với đề

tài:” Nghiên cứu sử dụng nấm sợi Aspergillus sp và Trichoderma sp xử lý bã khoai

mì để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh”

Tôi xin cảm ơn quý Giáo sư khoa học, Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, quý Thầy Cô phòng đào tạo sau đại học Trường Đại Học Bách Khoa đã dành nhiều tâm huyết truyền đạt kiến thức cho tôi qua các bài giảng, các giáo trình, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn tất khóa học này, giúp tôi trang

bị kiến thức quý báu để tôi vững tin khi tiếp xúc các công trình thực tế cũng như trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học sau này

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Nguyễn Đức Lượng đã

hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện luận văn này Thầy đã hướng dẫn tôi từ những bước đi ban đầu để hình thành đề tài đến nội dung chính yếu của đề tài mà tôi đã thực hiện

Tôi xin chân thành cảm ơn đến cô TS Nguyễn Thúy Hương, cùng quý thầy cô

Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học-Trường Đại Học Bách Khoa đã hết lòng giúp

đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn tất đề tài này

Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn các bạn cùng lớp, các em sinh viên, những người luôn sát cánh, chia sẽ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Một lần nữa tôi xin được tỏ lòng tri ân của tôi đến tất cả mọi người

HUỲNH VĂN HIẾU

Bã khoai mì (bã sắn) được thải ra trong quá trình sản xuất tinh bột khoai mì và tập trung nhiều tại Đồng Nai, Gia Lai, Tây Ninh và Bình Phước Theo ước tính, một nhà máy chế biến có công suất 30-100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5-25 tấn

tinh bột, kèm theo đó là 12-48 tấn bã

Trong bã khoai mì có hàm lượng chất hữu cơ cao (96,76%), trong đó hai thành phần khó phân hủy là tinh bột (67,9%) và cellulose (28,8%), nếu không được xử lý kịp thời, qua vài ngày bã khoai mì thối rữa, bốc mùi hôi thối, nấm mốc độc hại phát triển và theo gió phân tán khắp nơi, ảnh hưởng tới môi trường và sức khoẻ

con người Chúng tôi đã thu thập và chọn lọc chủng Aspergillus sp và

Trichoderma sp có khả năng phân giải một phần chất khó tan điển hình là

cellulose, đẩy nhanh quá trình phân hủy chất hữu cơ và chất xơ làm tăng độ xốp để

lên men làm phân vi sinh

Qua kết quả đánh giá chất lượng sản phẩm sau phân giải về các chỉ tiêu hóa

học và vi sinh vật cho thấy sản phẩm sau khi phân giải bởi Aspergillus sp và

Trichoderma sp đạt tiêu chuẩn của phân hữu cơ vi sinh Đề tài có ý nghĩa trong

việc xử lý phế thải ô nhiễm và tạo sản phẩm xã hội có giá trị, góp phần cải thiện môi trường, tiến đến nền nông nghiệp sinh thái bền vững

Cassava (Manihot esculenta Crantz) pulp is waste in production of the cassava

flour and it concentrates in Dong Nai, Gia Lai, Tay Ninh and Binh Phuoc province Acording to the estimation, the processing of factory with capacity 30 –

100 tons/day, it will be produce 7.5 – 25 tons powder, which is accompanied 12 -

Aspergillus sp and Trichoderma sp are to meet the standard of high qualified

organic fertilizer This thesis has meaningful to reuse polluted wastes to make new social products useful for human- beings It also contributes to improve the environment better for long-lasting ecological argriculture

Bảng 3.2 Thống kê các thiết bị sử dụng trong đề tài 26

Bảng 3.1 Thành phần môi trường thí nghiệm 29

Bảng 3.3 Các bước tiến hành xây dựng đường chuẩn glucose 33

Bảng 4.1 Khả năng phân giải tinh bột của 4 chủng Aspergillus 47

Bảng 4.2 Khả năng phân giải của 4 chủng Trichoderma 49

Bảng 4.3 Các thành phần chính trong bã khoai mì 52

Bảng 4.4 Chỉ tiêu hóa học và vi sinh sau lên men 62

Hình 2.1 Cấu tạo đại thể của nấm sợi 9

Hình 2.2 Aspergillus niger, Read, 1991 12

Hình 2.3 Trichoderma sp .15

Hình 4.1 Aspergillus A1; Aspergillus A2; Aspergillus A3; Aspergillus A4 45

Hình 4.2 Trichoderma T1; Trichoderma T2; Trichoderma T3; Trichoderma T446 Hình 4.3 A: vòng tròn phân giải tinh bột; B: khuẩn lạc Aspergillus A2 48

Hình 4.4 A: Vòng tròn phân giải cellelose; B: khuẩn lạc Trichoderma T3 50

Hình 4.5 Chế phẩm Aspergillus 56

Hình 4.6 Chế phẩm Trichoderma 56

Đồ thị 4.1 Hoạt tính amylase của 4 chủng Aspergillus 48

Đồ thị 4.2 Hoạt tính cellulase của 4 chủng Trichoderma 49

Đồ thị 4.3 Hàm lượng sinh khối Aspergillus và Trichoderma 51

Đồ thị 4.4 Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp amylase của A A2 53

Đồ thị 4.5 Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp cellulase T T3 54

Đồ thị 4.6 Ảnh hưởng độ ẩm đến sinh tổng hơp amylase 55

Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng độ ẩm đến sinh tổng hơp cellulase 55

Đồ thị 4.8 Sự thay đổi độ ẩm theo thời gian 57

Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả năng phân hủy tinh bột 58

Đồ thị 4.10 Ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả năng phân hủy cellulose 59

Đồ thị 4.11 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phân hủy tinh bột 60

Đồ thị 4.12 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng phân hủy cellulose 61

CHỮ VIẾT TẮT

CIAT Trung tâm nông nghiệp thế giới

FAO Tổ chức nông lương thế giới

IFPRI Viện nghiên cứu chính sách lương thực thế giới

UI/g MT Đơn vị hoạt độ enzyme theo chuẩn quốc tế trên một

gam môi trường

MỤC LỤC

Chương 1:MỞ ĐẦU 1

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 VÀI NÉT VỀ CÂY MÌ 3

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại, vùng phân bố và lịch sử phát triển 3

2.1.2 Cấu tạo, thành phần hóa học củ sắn 3

2.1.4 Chất thải từ qui trình sản xuất tinh bột sắn 7

2.1.5 Tác động của bã thải rắn đối với môi trường 8

2.2 GIỐNG VI SINH VẬT 8

2.2.1 Tổng quan về nấm mốc 8

2.2.2 Qui trình phát triển và thu nhận chế phẩm từ nấm mốc 10

2.2.3 Tổng quan về Aspergillus 11

2.2.4 Tổng quan về Trichoderma 14

2.3 TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN 21

2.3.1 Phân hóa học 21

2.3.2 Phân hữu cơ sinh học 21

2.3.3 Phân vi sinh 22

2.3.4 Phân phức hợp hữu cơ vi sinh 24

Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG 25

3.1.1 Giống Vi sinh vật 25

3.1.2 Môi trường nuôi cấy 25

3.1.3 Vật liệu, hóa chất 277

3.1.4 Dụng cụ - Thiết bị 28

3.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 29

3.2.1 Phân lập và lựa chọn chủng Aspergillus có hoạt tính enzyme amylase cao và Trichoderma có khả năng tổng hợp enzyme cellulase cao 29

3.2.2 Phân tích thành phần bã khoai mì 36

3.3 Thử nghiệm và đánh giá sản phẩm bã khoai mì sau khi phân giải bởi

Aspergillus sp và Trichoderma sp 43

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 44

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45

4.1 Kết quả chọn lọc chủng vi sinh có hoạt lực enzyme cao 45

4.1.1 Phân lập và sưu tầm giống 45

4.1.2 Khả năng phân giải tinh bột của Aspergillus 47

4.1.3 Khả năng phân giải cellulase của Trichoderma 49

4.2 Khảo sát thời gian sinh trưởng của nấm mốc trên môi trường lỏng 50

4.3 Khảo sát thành phần bã khoai mì 51

4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên quá trình sinh tổng hợp enzyme 52

4.5 Nghiên cứu ảnh hưởng độ ẩm lên quá trình sinh tổng hợp enzyme 54

4.6 Nghiên cứu quá trình xử lý bã khoai mì 56

4.6.1 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường theo thời gian nuôi cấy 57

4.6.2 Ảnh hưởng của lượng giống đến quá trình phân hủy bã khoai mì 58 4.6.3 Ảnh hưởng thời gian đến quá trình phân hủy của bã khoai mì 61

4.7 Thử nghiện và đánh giá chất lượng phân được sản xuất 62

Chương 5: KẾT LUẬN 64

5.1 KẾT LUẬN 64

5.2 ĐỀ NGHỊ 65

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nông nghiệp với sự canh tác chủ yếu là cây lương thực và các

loại cây màu lấy củ Cây sắn (khoai mì) đang là cây trồng chuyển đổi từ cây lương thực

truyền thống sang cây công nghiệp Ở nhiều địa phương, người dân trồng khoai mì lấy củ

sơ chế thành sắn lát phơi khô dùng xuất khẩu, chế biến tinh bột làm lương thực, làm thức

ăn cho gia súc….[28]

Hiện nay trên thị trường thế giới đang có xu hướng sử dụng nhiều hơn nguồn nguyên

liệu chế biến từ khoai mì, đặt biệt là tinh bột Với kỹ thuật chế biến tinh bột khoai mì như

hiện nay thì lượng bã thải ngày càng nhiều, thành phần chủ yếu là tinh bột, cellulose Việc

tận dụng phế liệu này để sản xuất các chất có giá trị là một trong những vấn đề được quan

tâm nhiều Việc làm này, không những tận dụng phế liệu một cách khoa học và triệt để

mà còn góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường, khép kín quy trình sản xuất.[36]

Việc lạm dụng phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật đang đẩy ngành nông

nghiệp Việt Nam phải đối diện: ô nhiễm môi trường đất, đất đai bị chai cứng, bạc màu,

diệt hệ vi sinh có lợi trong đất….Ứng dụng quá trình sản xuất theo hướng hữu cơ, tạo sản

phẩm sạch và an toàn sinh thái đang là vấn đề đặt lên hàng đầu

Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu sử dụng nấm sợi

Aspergillus sp và Trichoderma sp xử lý bã khoai mì để sản xuất phân bón hữu cơ vi

sinh”

Thu thập và lựa chọn chủng Aspergillus sp có khả năng sinh hoạt tính amylase cao

và chủng Trichoderma sp có hoạt tính cellulase cao

Khảo sát các điều kiện tối ưu của Aspergillus sp và Trichoderma sp để sản xuất

chế phẩm vi sinh

Ứng dụng chế phẩm vi sinh xử lý bã khoai mì để tạo phân hữu cơ vi sinh

Nhằm rút ngắn thời gian phân giải chất thải hữu cơ, tăng lượng vi sinh có ích cho đất,

giúp cây trồng tăng khả năng chống chịu bệnh, tăng năng suất, tạo sản phẩm nông nghiệp

an toàn

Bên cạnh đó có thể bổ sung các vi sinh vật có lợi cho đất và cây trồng như: vi sinh vật

cố định đạm, phân giải lân, vi sinh vật có khả năng đối kháng bệnh

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 VÀI NÉT VỀ CÂY MÌ

2.1.1 Nguồn gốc, phân loại, vùng phân bố và lịch sử phát triển [1]

Tên gọi, mô tả, phân loại: Sắn (khoai mì) hay còn một số tên khác như: Manihot

esculenta Crantz, cassava, tapioca, yuca, mandioca, manioc…) là cây lương thực ăn củ

hàng năm, có thể sống lâu năm, thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae Cây sắn cao 2 - 3m,

đường kính tán 50 - 100 cm Lá khía thành nhiều thùy, có thể dùng để làm thức ăn chăn

nuôi gia súc Rễ ngang phát triển thành củ và tích lũy tinh bột Củ sắn dài 20 - 50 cm, khi

luộc chín có màu trắng đục, hàm lượng tinh bột cao Sắn luộc chín có vị dẻo, thơm đặc

trưng Sắn có thời gian sinh trưởng thay đổi từ 6 đến 12 tháng, có nơi tới 18 tháng, tùy

thuộc giống, vụ trồng, địa bàn trồng và mục đích sử dụng

Nguồn gốc: Cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của Châu Mỹ La tinh (Crantz,

1976) và được trồng cách đây khoảng 5000 năm (CIAT, 1993) Trung tâm phát sinh cây

sắn được giả thiết tại vùng Đông Bắc của nước Brazin thuộc lưu vực sông Amazon, nơi

có nhiều chủng loại sắn trồng và hoang dại (De Candolle 1886; Rogers, 1965)

Vùng phân bố: Hiện tại, sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt

đới, tập trung nhiều ở Châu Phi, Châu Á và Nam Mỹ, là nguồn thực phẩm của hơn 500

triệu người (CIAT, 1993)

Lịch sử phát triển: Cây sắn được người Bồ Đào Nha đưa đến Congo của Châu Phi

vào thế kỷ 16 (Barre, Thevet, 1558) Ở Châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế

kỷ 17 (P.G Rajendran et al, 1995) và SriLanka đầu thế kỷ 18 (W.M.S.M Bandara và M

Sikurajapathy, 1992) Sau đó, sắn được trồng ở Trung Quốc, Myamar và các nước Châu

Á khác Cây sắn được du nhập vào Việt Nam khoảng giữa thế kỷ 18, (Phạm Văn Biên,

Hoàng Kim, 1991) Hiện chưa có tài liệu chắc chắn về nơi trồng và năm trồng đầu tiên

Sắn được canh tác phổ biến tại hầu hết các tỉnh của Việt Nam từ Bắc đến Nam Diện tích

sắn trồng nhiều nhất ở vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi và trung du phía

bắc, vùng ven biển Nam Trung Bộ và vùng ven biển Bắc Trung Bộ

2.1.2 Cấu tạo, thành phần hóa học củ sắn [1]

Vỏ: gồm vỏ gỗ và vỏ cùi

Vỏ gỗ: cấu tạo chủ yếu là cellulose Vỏ gỗ có tác dụng bảo vệ củ khỏi tác động bên

ngoài; đồng thời hạn chế mất nước của củ Bản thân của vỏ củ cứng nhưng liên kết không

bền với vỏ cùi, do đó dễ mất khi thu hoạch và vận chuyển Tỷ lệ vỏ gỗ phụ thuộc giống

sắn, độ già và khối lượng củ - thường vào khoảng 1,5 đến 2%

Vỏ cùi: dày khoảng 1 đến 3 mm và chiếm 8 - 15% khối lượng củ Vỏ cùi gồm lớp tế

bào mô cứng phủ ngoài Thành phần lớp này cũng chủ yếu là cellulose, hầu như không

chứa tinh bột nhưng chứa nhiều dịch bào (mủ sắn) Trong thành phần dịch bào có chứa

các polyphenol Tiếp theo là lớp tế bào mô mềm, lớp này ngoài dịch bào còn chứa khoảng

5% tinh bột Các polyphenol, enzyme và linamarin có tác dụng bảo vệ củ phát triển bình

thường trước thu hoạch, nhưng khi đã đào bới củ khỏi đất chúng lại gây trở ngại cho bảo

quản và chế biến Tổng lượng các chất polyphenol trong sắn khoảng 0,1 đến 0,3%, trong

đó có đến 85 - 90% tập trung ở vỏ cùi

Thịt củ: Tiếp theo tầng sinh gỗ là thịt sắn chứa nhiều tinh bột, protein và các chất dầu

Đây là phần dự trữ chủ yếu chất dinh dưỡng của củ Các chất polyphenol, độc tố và

enzyme chứa ở thịt củ nhưng không nhiều, chỉ 10 - 15% so với chúng có trong củ nhưng

vẫn gây trở ngại khi chế biến như làm biến màu, sắn bị chảy mủ sẽ khó thoát nước khi sấy

hoặc phơi khô

Lỏi sắn: nằm ở trung tâm củ, dọc suốt chiều dài Thành phần lõi chủ yếu là cellulose

Lõi có chức năng dẫn nước và các chất dinh dưỡng giữa cây và củ, đồng thời giúp thoát

nước khi sấy hoặc phơi khô

Thành phần hóa học của củ sắn tươi: dao động trong giới hạn khá lớn: tinh bột 20

-34%, protein 0,8 - 1,2%, chất béo 0,3 - 0,4%, cellulose 1 - 3,1%, chất tro 0,54%,

polyphenol 0,1 - 0,3% và nước 60,0 - 74,2%

Ngoài các chất kể trên trong sắn còn chứa một lượng vitamin và độc tố Vitamin trong sắn

thuộc nhóm B, trong đó B1 và B2 mỗi loại chiếm 0,03 mg, còn B6 0,06 mg Các vitamin

này sẽ mất một phần khi chế biến và nhất là khi nấu trong sản xuất rượu

Độc tố trong sắn có tên chung là phazéolunatin gồm 2 glucozit Linamarin và

Lotaustralin Hàm lượng chung của phazéolunatin chỉ vào khoảng 0,001 - 0,04 mg và

chứa nhiều trong sắn đắng, tập trung chủ yếu của vỏ cùi Bình thường phazéolunatin

không độc nhưng khi bị thủy phân thì các glucozit này giải phóng hidro cyanide (HCN)

thì gây độc đối với người và gia súc khi ăn vượt quá ngưỡng

2.1.3 Tình hình sản xuất, tiêu thụ sắn trên thế giới và Việt Nam [1]

Sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới: Sản lượng sắn thế giới năm 2006/07 đạt 226,34

triệu tấn củ tươi so với 2005/06 là 211,26 triệu tấn và 1961 là 71,26 triệu tấn Nước có sản

lượng sắn nhiều nhất thế giới là Nigeria (45,72 triệu tấn), kế đến là Thái Lan (22,58 triệu

tấn) và Indonesia (19,92 triệu tấn) Việt Nam đứng thứ mười trên thế giới về sản lượng

sắn (7,71 triệu tấn) Nước có năng suất sắn cao nhất hiện nay là Ấn Độ (31,43 tấn/ha), kế

đến là Thái Lan (21,09 tấn/ha), so với năng suất sắn bình quân của thế giới là 12,16 tấn/ha

(FAO, 2008)

Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn thế giới khoảng 18 kg/người/năm Sản lượng sắn của

thế giới được tiêu dùng trong nước khoảng 85% (lương thực 58%, thức ăn gia súc 28%,

chế biến công nghiệp 3%, hao hụt 11%), còn lại 15% (gần 30 triệu tấn) được xuất khẩu

dưới dạng sắn lát khô, sắn viên và tinh bột (CIAT, 1993) Nhu cầu sắn làm thức ăn gia súc

trên toàn cầu đang giữ mức độ ổn định trong năm 2006 (FAO, 2007)

Sắn chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu lương thực ở Châu Phi, bình quân khoảng 96

kg/người/năm Nhu cầu sắn làm lương thực chủ yếu tại vùng Saharan châu Phi cả hai

dạng củ tươi và sản phẩm chế biến ước tính khoảng 115 triệu tấn, tăng hơn năm 2005

khoảng 1 triệu tấn

Trung Quốc hiện là nước nhập khẩu sắn nhiều nhất thế giới để làm cồn sinh học (bio

ethanol), tinh bột biến tính (modify starch), thức ăn gia súc và dùng trong công nghiệp

thực phẩm dược liệu

Thái Lan chiếm trên 85% lượng xuất khẩu sắn toàn cầu, kế đến là Indonesia và Việt

Nam Thị trường xuất khẩu sắn chủ yếu của Thái Lan là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản

và cộng đồng châu Âu với tỷ trọng xuất khẩu sắn khoảng 40% bột và tinh bột sắn, 25% là

sắn lát và sắn viên (FAO, 2007)

Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI) đã tính toán nhiều mặt và dự

báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu với tầm nhìn đến năm 2020 Cây sắn tiếp

tục giữ vai trò quan trọng trong nhiều nước Châu Á, đặc biệt là các nước vùng Đông Nam

Á nơi cây sắn có tổng diện tích đứng thứ ba sau lúa và ngô và tổng sản lượng đứng thứ ba

sau lúa và mía Chiều hướng sản xuất sắn phụ thuộc vào khả năng cạnh tranh cây trồng

Giải pháp chính là tăng năng suất sắn bằng cách áp dụng giống mới và các biện pháp kỹ

thuật tiến bộ

Sản xuất và tiêu thụ sắn tại Việt Nam: Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia

súc quan trọng sau lúa và ngô Năm 2005, cây sắn có diện tích thu hoạch 432 nghìn ha,

năng suất 15,35 tấn/ha, sản lượng 6,6 triệu tấn, so với cây lúa có diện tích 7.326 ha, năng

suất 4,88 tấn/ha, sản lượng 35,8 triệu tấn, cây ngô có diện tích 995 ha, năng suất 3,51

tấn/ha, sản lượng gần một triệu tấn (FAO, 2007) Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng

của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và

điều kiện kinh tế nông hộ Vì vậy, chỉ tính đến năm 2007 diện tích trồng sắn của Việt

Nam đã lên tới 497 nghìn hecta, với sản lượng 7984,9 nghìn tấn (Thống kê Việt Nam,

2007) Sắn chủ yếu dùng để bán (48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế

biến thủ công (16,8%), chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi

Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước Sắn là nguyên

liệu chính để chế biến bột ngọt, bio- ethanol, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước giải khát,

bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ ẩm cho đất Toàn quốc

hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ

tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ công rãi rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn Việt

Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.0 - 2.200 nghìn tấn tinh bột sắn, trong đó trên

70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam

chủ yếu là tinh bột, sắn lát và bột sắn Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật

Bản, Singapo, Hàn Quốc Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của

Việt Nam tầm nhìn đến năm 2020 Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất

lúa, ngô và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có điều kiện

phát triển Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự báo thuận lợi và có

lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc

và những sản phẩm tinh bột biến tính Diện tích sắn của Việt Nam dự kiến ổn định

khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo và

phát triển các giống sắn tốt có năng suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và

hoàn thiện quy trình kỹ thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh thái

2.1.4 Chất thải từ qui trình sản xuất tinh bột sắn

Chất thải rắn sinh ra trong quá trình sản xuất tinh bột sắn chủ yếu bao gồm:

Vỏ gỗ và vỏ củ, chiếm khoảng 2 - 3% lượng sắn củ tươi, được loại bỏ ngay từ khâu bóc

vỏ Phế liệu này có thể được sử dụng làm thức ăn gia súc ở dạng khô hoặc ướt

Xơ và bã sắn được thu nhận sau khi đã lọc hết tinh bột Loại chất thải rắn này thường

chiếm 15 - 20% lượng sắn tươi, gây ô nhiễm môi trường nếu không được xử lý kịp thời

Xơ và bã sắn sau khi trích ly được tách nước làm thức ăn gia súc

Mủ: lượng mủ khô chiếm khoảng 3,5 - 5% sắn củ tươi Mủ được tách ra từ dịch sữa, có

hàm lượng chất hữu cơ cao (2.500 - 2.000 mg/100g) và xơ (12.800 - 14.500 mg/100g) nên

gây mùi rất khó chịu do quá trình phân hủy sinh học, cần được làm khô ngay Tuy nhiên,

thực hành tại nhiều doanh nghiệp sản xuất thường để mủ dưới dạng ướt Lượng tinh bột

chứa trong mủ là 52.800 - 63.000 mg/100g, gấp đôi lượng tinh bột có trong vỏ gỗ và vỏ

củ Mủ được sử dụng làm thức ăn gia súc

Bùn lắng sinh ta từ hệ thống xử lý nước thải

Tổng lượng bã sắn thải ra hàng năm [28]

Thế giới: 106 triệu tấn

Nam phi: 42 triệu tấn

Châu Mỹ La Tinh: 33 triệu tấn

Châu Á: 30 triệu tấn

Bã thải rắn của ngành sản xuất tinh bột sắn thường được các doanh nghiệp sản xuất tận

dụng làm sản phẩm phụ dưới dạng thức ăn gia súc Nguồn thu từ sản phẩm phụ này là

không đáng kể, cần có các biện pháp sử dụng và quản lý bã thải rắn hiệu quả hơn

2.1.5 Tác động của bã thải rắn đối với môi trường

Chất thải rắn có khối lượng rất lớn Với công suất 60 tấn tinh bột/ngày, tải lượng phần

vỏ gỗ chiếm khoảng 4.800 kg/ngày, phần vỏ củ 8.000 kg/ngày, bã sắn nhiều nhất 16.800

kg/ngày Nếu không thu gom và xử lý ngay trong ngày thì quá trình phân hủy các hợp

chất hữu cơ trong chất thải rắn sau 48 giờ sẽ tạo ra các khí H2S, NH4… gây mùi hôi thối

làm ô nhiễm môi trường.[36]

Phần bã lâu nay vẫn chưa được sử dụng một cách hợp lý đồng thời cũng là một yếu tố

làm ô nhiễm môi trường sống của dân cư vùng chế biến Với số lượng lớn như vậy, việc

xử lý và sử dụng có hiệu quả nguồn bã thải này sẽ có ý nghĩa kinh tế xã hội đáng kể Tuy

nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy có thể tận dụng bã sắn có hàm lượng chất hữu cơ

và chất xơ cao làm tăng độ xốp để lên men làm phân vi sinh Các nghiên cứu trên đối

tượng bã khoai mì chủ yếu: làm giàu protein, tăng chất dinh dưỡng, thu enzyme amylase

và cellulase trong sản xuất thức ăn bổ sung cho gia súc, gia cầm, sản xuất cồn Chúng tôi

đưa ra một hướng mới về ứng dụng vi sinh trong xử lý chất thải hữu cơ, sử dụng

Aspergillus sp và Trichoderma sp xử lý bã khoai mì để sản xuất phân hữu cơ vi sinh

2.2 GIỐNG VI SINH VẬT

2.2.1 Tổng quan về nấm mốc [4]

Định nghĩa: Nấm sợi còn gọi là nấm mốc, tức là chỉ các mốc mọc trên thực phẩm,

trên chiếu, trên quần áo, trên giầy dép, trên sách vở…Chúng phát triển rất nhanh trên

nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm Trên nhiều vật liệu vô cơ do dính

bụi bậm (như các thấu kính ở ống nhòm, máy ảnh, kính hiển vi…) nấm mốc vẫn phát

triển, sinh acid và làm mờ các vật liệu này

Nhiều nấm sợi mọc trên người, trên động vật, thực vật và gây các bệnh nấm khá nguy

hiểm Chúng sinh ra các độc tố có thể gây ra bệnh ung thư và nhiều bệnh tật khác

Trong tự nhiên nấm sợi phân bố rất rộng rãi và tham gia tích cực vào các vòng tuần

hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất mùn

Hình thái và cấu trúc của sợi nấm

Bên ngoài có thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bên trong là tế bào chất với nhân

phân hóa Màng nhân có cấu tạo hai lớp và trên màng có nhiều lỗ nhỏ Trong nhân có

hạch nhân Bên trong tế bào nấm còn có không bào, ti thể, mạng lưới nội chất, bào nang,

thể màng biên…Thể màng biên là một kết cấu màng đặc biệt, nằm ở giữa thành tế bào và

màng tế bào chất, bao bọc bởi một lớp màng đơn và có hình dạng biến hóa rất nhiều (hình

ống, hình túi, hình cầu, hình trứng hoặc hình nhiều lớp…) Công dụng của thể màng biên

còn chưa được làm sáng tỏ, có thể là có liên quan đến sự hình thành tế bào

Hình 2.1 Cấu tạo đại thể của nấm sợi Các dạng biến hóa của sợi nấm

Lúc bào tử nấm rơi vào một điều kiện môi trường thích hợp nó sẽ nảy mầm mọc ra

theo cả 3 chiều thành một hệ sợi nấm hay gọi là khuẩn ti thể Khuẩn ti cơ chất cấm sâu

vào môi trường còn khuẩn ti khí sinh phát triển tự do trong không khí Hệ sợi nấm có thể

biến hóa để thích nghi với các điều kiện sống khác nhau thành các dạng đặc biệt như: rễ

giả, sợi hút, sợi áp, sợi bò hay thân bò, vòng nấm hay mạng nấm, đầu bào tử trần, nang

bào tử kín, đảm, túi giá…

2.2.2 Qui trình phát triển và thu nhận chế phẩm từ nấm mốc

Nấm mốc phát triển trên môi trường bán rắn trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy, ở giai

đoạn này có những thay đổi sau:

Nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi, khối môi trường còn rời rạc, enzyme mới

bắt đầu hình thành Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ, tuyệt

đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt

độ

Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 - 18 giờ Trong giai đoạn này có những thay

đổi cơ bản sau Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển

rất mạnh, các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt trên các hạt môi trường, ta có

thể nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường Môi trường kết lại rất chặt,

độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường tăng nhanh lên 40 - 450C Các chất dinh

dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hóa mạnh của sợi nấm, enzyme được tổng hợp

mạnh Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần

phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29 - 300C là tốt nhất

Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10 - 20 giờ, giai đoạn này có một số thay đổi như

sau: quá trình trao đổi yếu dần, do đó làm giảm chất dinh dưỡng chậm lại Nhiệt độ nuôi

cấy duy trì ở 300C Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng

enzyme tạo ra sẽ giảm xuống Chính vì thế việc xác định thời điểm để thu nhận enzyme là

rất cần thiết

Thu nhận sản phẩm: Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme

thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi

trường và nước trong môi trường) Để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không bị mất

hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm đến một độ ẩm thấp Độ ẩm cần đạt

được sau quá trình sấy là nhỏ hơn 10% Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi

người ta thường sấy ở nhiệt độ 38 - 400C Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng ngay

sản phẩm thô này ngay mà không cần thêm bước tinh sạch

Ứng dụng:

Rất nhiều loài nấm sợi đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực

phẩm (làm tương, nước chấm, nấu rượu, sản xuất acid citric…), trong công nghiệp

enzyme (sản xuất amylase, proteinase, cellulase, pectinase…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh

học, kích thích tố sinh trưởng thực vật (gibberellin…), độ phì nhiêu và định lượng các

hoạt động sinh học bằng các loài nấm chỉ thị, sản xuất sinh khối nấm sợi phục vụ chăn

nuôi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), sử dụng nấm sợi trong xử lý ô nhiễm môi

trường…

Do đó chúng ta phải tìm hiểu rõ từng chủng nấm mốc nghiên cứu về sinh trưởng, phát

triển, hay khả năng tổng hợp enzyme Trong đề tài này chúng tôi tiến hành tìm hiểu

Aspergillus sp và Trichoderma sp

2.2.3 Tổng quan về Aspergillus

Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào tử

bụi phồng lên ở ngọn Các chuỗi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng Bào

tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger) Nấm

Aspergillus oryzae là loài mốc chính trong quá trình chế tạo tương và tương do

Aspergillus oryzae lên men ngon hơn các tương khác vì loại mốc này có khả năng biến

đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm cho tương có vị ngọt Hai loài không độc làm

tương là Aspergillus oryzae và Aspergillus sojae có hình thái và màu sắc rất giống với 2

loài rất nguy hiểm là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra độc tố

Aflatoxin gây bệnh ung thư

Hình 2.2 Aspergillus niger, Read, 1991

Trước hết phải nói đến cách phát triển bằng khuẩn ty tức sinh sản sinh dưỡng Từ một

đoạn khuẩn ty riêng rẽ có thể phát triển dễ dàng thành một khuẩn ty thể Khuẩn ty của

nấm mốc có thể lẫn vào bụi, không khí bay khắp nơi, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhanh

chóng phát triển thành một cơ thể mới

Sinh sản vô tính: Raper, Thom (1968) cho rằng A niger sinh sản vô tính bằng bào tử

trần và cơ quan sinh ra bào tử đó Các bào tử trần được sinh ra trực tiếp trên khuẩn ty

hoặc từ các khuẩn ty đặc biệt gọi là cuống bào tử trần

A niger thuộc nhóm nấm bất toàn nên không có hình thức sinh sản hữu tính

2.2.3.2 Đặc tính sinh học của Aspergillus

Khả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau: đối với các loại đường như glucose,

fructose, saccharose hoặc maltose nấm đồng hóa rất tốt, đối với đường lactose thì ở mức

trung bình

Khả năng sinh tổng hợp amylase: Aspergillus có khả năng sinh tổng hợp 2 loại

amylase: α - amylase và glucoamylase nhưng khả năng tổng hợp nhiều glucoamylase hơn

Aspergillus tạo thành những enzyme có tính bền vững với acid, pH tối ưu cho enzyme α -

amylase và glucoamylase ở nấm A niger trong khoảng 4,7 - 6

Khả năng sinh tổng hợp cellulase: A niger là một trong nhiều loại nấm mốc có khả

năng sinh trưởng dễ dàng trên các bã cellulose pH thích hợp cho sự tích tụ enzyme

cellulase là 4, nhiệt độ thích hợp là 28 - 300C

2.2.3.3 Ứng dụng [25]

Hiện nay loài A niger được sử dụng rộng rãi phổ biến trong một số ngành nông

nghiệp, công nghiệp thực phẩm và các ngành kinh tế khác để thu nhận các chế phẩm sinh

học như protein, acid hữu cơ, enzyme…

Ở Nhật, A niger là đối tượng sản xuất cellulase quan trọng nhất với quy mô công

nghiệp từ năm 1961 đến nay Bên cạnh đó, ưu điểm nổi bật của A niger là không sinh ra

độc tố như những loài Aspergillus khác nên khả năng sử dụng A niger làm nguồn protein

đơn bào tỏ ra đầy hứa hẹn và đang bắt đầu triển khai ở một số nước như Nhật và Pháp

Năm 1975, Venosa-CMS, Leser-EW, Martin –VMNC, Schmidell-Netto-W đã nghiên

cứu nuôi cấy A niger để sản xuất microbial protein từ môi trường chứa tinh bột khoai mì,

phụ phẩm của các nhà máy chế biến bột mì

Năm 1988 M.J.A Villaralvo và R.C Mabesa đã nghiên cứu làm giàu protein trên môi

trường khoai mì dạng dịch thể bởi nấm mốc A niger

Ở Việt Nam, các nghiên cứu của Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp sử dụng

glucoamylase từ A niger trong lên men cồn từ tinh bột sắn sống năm 1990

Vào năm 2005, kỹ sư Lê Bích Phượng và các cộng sự (Viện Sinh học Nhiệt đới

TP.HCM) nuôi A niger trên bã khoai mì để sản xuất chế phẩm bột Bio-E Chế phẩm này

chứa enzym glucoamylase, cellulase và α - amylase giúp kích thích sự tiêu hóa cho vật

nuôi

Năm 2005, Lữ Thị Bích Thủy, “nghiên cứu sử dụng nấm sợi làm giàu đạm trên bã

khoai mì”, khoa công nghệ thực phẩm, đại học bách khoa Tp.HCM [25]

Hiện nay, các nghiên cứu chủ yếu là tận bã khoai làm thức ăn gia súc, sản xuất cồn

sinh học, thu nhận một số loại enzyme… nhưng chưa nghiên cứu tận dụng triệt để nguồn

bã thải này để làm chế phẩm phân hữu cơ vi sinh Đây là vấn đề được đặt ra trong đề tài

Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc họ

Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes; các loài Trichodema được phân thành 5 nhóm:

Trichodema, Longibrachiatum, Saturisporum, Pachbasium và Hypocreanum Trong đó:

Trichodema, Longibrachiatum, Saturisporum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai

đoạn sinh sản hữu tính)

2.2.4.1 Đặc điểm sinh thái

Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử khuẩn ty

Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuối nhánh

phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, không màu, liên

kết với nhau thành chùm nho ở đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử của Trichoderma có màu

xanh đặc trưng, nhưng cũng có thể màu trắng, vàng hay xanh xám tùy theo loài, bào tử

luôn đơn bào, bào tử hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn Các chủng của Trichoderma có

tốc độ phát triển nhanh, chúng có thể đạt đường kính khuẩn lạc từ 2-9 cm sau 4 ngày nuôi

cấy ở 20°C

Hình 2.3 Trichoderma sp

2.2.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Đặc điểm hình thái: Đa số Trichoderma phát triển nhanh ở nhiệt độ 25 - 300C, một

vài loài phát triển ở 350C Phát triển chậm ở 35 - 370C Thêm vào đó hình thái khác nhau

cũng xuất hiện ở các mức nhiệt độ khác nhau Ở 350C chúng tạo những khuẩn lạc rắn dị

thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường Trong khi ở 370C thậm chí

không tạo bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Môi trường sống: Trichodema là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ,

rừng, đầm muối và sa mạc Hầu hết chúng là những vi sinh vật hoại sinh, nhưng cũng có

khả năng tấn công các loại nấm khác Trichodema rất ít tìm thấy trên thực vật sống và

không sống nội ký sinh với thực vật Chúng có mặt khắp mọi nơi trừ những vĩ độ cực

Nam và cực Bắc Chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới

hơn là những khu rừng ôn đới hay rừng phương Bắc Chúng tồn tại trong những môi

trường như rễ, lá cây, trong đất hay sống trên những vật đã chết, xác hữu cơ hay ký sinh

trên những loài nấm khác

Các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất acid Gochenaur (1970) cho rằng có thể

có tương quan giữa sự hiện diện của T viride với đất acid trong vùng khí hậu rất lạnh ở

Peru Trichoderma phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và có thể phát triển tốt ở đất

kiềm nếu như ở đó có sự tập trung một lượng CO2 và bicarbonat Trichoderma có thể sử

dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat, amoni acid đến ammonia

Trichoderma là vi nấm ưa ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm ướt,

những khu rừng khác nhau T hamatum và T pseudokoningii có thể chịu điều kiện có độ

ẩm cao hơn so với các loài khác Tuy nhiên Trichoderma thường không chịu được độ ẩm

thấp và điều này là một yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt trong

những nơi có độ ẩm thấp, song các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về nhiệt độ và

độ ẩm cũng khác nhau

Trichoderma có thể được phát hiện trong đất bởi mùi hương của chúng, hương dừa

(6-pentyl-pyrone đã bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng của

Trichoderma

Với phương pháp pha loãng người ta ước tính Trichoderma có thể đạt đến 3% tổng số

vi nấm hiện diện trong các loại đất rừng và 1,5% số lượng nấm trong đất đồng cỏ

Turner và cộng sự (1997) chỉ ra T longibrachiatum và T.citrinoviride có nhiều sự

trùng nhau về khu vực phân bố địa lí Sự phân bố rộng khắp này có lẽ do sự phát tán hiệu

quả (nhờ gió hoặc côn trùng) hoặc biểu hiện một quá trình tiến hóa rất sớm

Môi trường nhân sinh khối: Kết quả thí nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy

nấm Trichoderma có khả năng ức chế một số nấm bệnh và sinh tổng hợp nhiều enzyme

trong đó có enzyme cellulase phân giải cellulose rất tốt Để mở rộng khả năng ứng dụng

của chúng trong sản xuất thì vấn đề nhân sinh khối để tạo lượng lớn chế phẩm đã được

đặt ra

Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều cellulose

như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia…Đặc biệt là trên môi trường bã đậu phụ

nấm phát triển tốt nhất với lượng bào tử sản sinh 7,5.109 bào tử/ gam môi trường Tuy

nhiên việc bảo quản chế phẩm này gặp rất nhiều khó khăn do độ ẩm Thay vào đó có môi

trường thóc tuy lượng bào tử sản sinh thấp hơn khoảng 3,2.109 bào tử/gam môi trường

nhưng việc bảo quản thì dễ dàng hơn

Trong điều kiện nuôi cần điều kiện thoáng khí, sau khi vô trùng cần làm cho môi

trường xốp bằng cách lắc, không để chúng kết lại thành màng, nếu bị kết màng bào tử

hình thành rất ít thậm chí sợi nấm không lan vào được

2.2.4.3 Ứng dụng

Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma[30]

Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác nhau được phân loại

như sau: tiết ra các chất kháng nấm bệnh (mycoparasitism), cạnh tranh dinh dưỡng với

nấm (competitionfor nutrient) Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối

kháng thực tế có thể là một trong những loại cơ chế này Ví dụ, sự kiểm soát botryis trên

nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự ký sinh lên hạch nấm,

cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh Cả cơ chế tạo ra các chất kháng nấm và cơ

chế ký sinh có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, thật ra sự sản xuất ra các chất

độc được biết có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường tăng trưởng

Chứng cớ gần đây chỉ ra rằng các chất kháng sinh và các enzyme thủy phân không chỉ

được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng ký sinh [32]

Trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và cải thiện năng suất cây trồng [30]

Bảo vệ thực vật: Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp được

quan tâm nhiều nhất, đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một

số nấm bệnh ở thực vật Các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại Trichoderma spp khác

nhau để kiểm soát nhiều loại nấm gây bệnh khác nhau Kết quả là các loài Trichoderma

spp kiểm soát có hiệu quả các nấm gây bệnh như sau:

Rhizoctonia sp.: gây mục rễ, thân và hạt…

Sclerotium rolfsii: xơ cứng ở cà chua và khoai tây

Pythium spp.: gây úng thối ở đậu, thuốc lá, cây non…

Armillaria mellea: mục rễ ở cây rừng, cao su, thông

Botrytis cinerea: mốc xám gây hỏng dâu và nho

Pennicillium diditatum: hỏng trái ở chanh và chuối

Phytophtora spp.: mục rễ, hỏng trái ở ca cao

Chondeosterreum purpureum: bạc lá ở đào và mận

Hiện nay các chủng Trichoderma spp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm

sinh học thương mại như: GlioGard - một chế phẩm với thành phần chủ yếu là

Trichoderma virens ngăn chặn sự úng thối của cây con Chế phẩm Trichodex với

Trichoderma harzium là thành phần chính được sử dụng để chống lại sự thối rữa của táo

sau thu hoạch Trichoderma harzium còn kết hợp với Trichoderma polysporum trong việc

sản xuất Binabt được dùng chữa trị các vết thương bị nhiễm trùng cây trồng

Trichoderma harzium AG2 được dung hợp với tế bào trần để phòng các bệnh cây

trồng

Ngoài ra, người dân New Zealand còn trộn nhiều chủng Trichoderma khác nhau để

kiểm soát trên cây nho và các cây dạng quả hạch Ở Mỹ người ta rắc bột bào tử hay phủ

gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên

khắp cánh đồng trước khi trồng trọt

Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng các chủng nấm Trichoderma

xử lý đất trước khi trồng bắp hay trộn nấm mốc với phân chuồng hoai mục trước khi bón

ruộng 5 - 10 ngày, rồi rải trên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn

hại bắp

Cải thiện năng suất cây trồng: Cũng như thuốc trừ sâu, phân bón hóa học lâu ngày

sẽ làm cho đất canh tác bị thoái hóa, chai sạn: các loại giun đất không phát triển được,

làm hạn chế độ xốp, đồng thời độ thông khí cần thiết cho cây trồng thiếu hụt Vì vậy các

nước có nền nông nghiệp phát triển trên thế giới có xu hướng sử dụng các phân bón hữu

cơ thế hệ mới, thực chất là sự kết hợp giữa phân bón vi sinh và thuốc trừ sâu sinh học,

dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học Các loại phân bón vi sinh này có tác dụng như sau:

Phòng trừ các bệnh gây thối mốc, bệnh héo rũ, bệnh chết co, bệnh nấm sương mai,

bệnh đốm nâu…và hạn chế các tác hại nguy hiểm do các nấm gây mục gỗ nhờ khả năng

bất hoạt enzyme của các nấm gây bệnh, đồng thời bảo vệ cây trồng khỏi các côn trùng

đục phá thân

Đẩy mạnh tốc độ tăng trưởng của cây trồng nhờ khả năng giúp cây trồng tạo ra hệ rễ

cứng cáp hơn Gần đây, khi khảo sát ở các lớp đất sâu, người ta còn tìm thấy Trichoderma

sp làm tăng số lượng các rễ sâu Điều này góp phần giúp cho các cây lương thực như ngô

hay các loài dùng để trang trí như cỏ lát có khả năng chống chịu tốt với hạn hán Một

nghiên cứu gần đây còn cho biết nếu ngô có Trichoderma harzianum T-22 ký sinh ở rễ thì

cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có T-22 (G.E.Harman Cornle

University, Geneve NY 14456)

Vài loại Trichoderma có khả năng kích thích sự nảy mầm và sự ra hoa Đã có nhiều

công trình khoa học chứng minh rằng Trichoderma harzianum và Trichoderma koningii

kích thích sự nảy mầm và tăng trưởng của cây trồng Đối với các loài hoa được trồng

trong nhà kính Trichoderma harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách rút ngắn ngày ra

hoa hay tăng số lượng hoa

Cải thiện cấu trúc và thành phần của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi sinh vật nốt

sần cố định nitơ trong đất, duy trì sự cân bằng của các vi sinh vật hữu ích trong đất, bảo

toàn và tăng độ phì nhiêu, dinh dưỡng cho cây trồng

Phân giải từ từ cellulose có trong phân hữu cơ và đất trồng nên tăng cường dinh dưỡng

và kích thích sinh trưởng của cây

Tăng sức đề kháng của cây trồng, một số chủng Trichoderma harzianum còn có thể

xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng

Như vậy, các chủng nấm Trichoderma sp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh

không những cung cấp một nguồn phân bón an toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các

bệnh gây hại cây trồng và tạo được những ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên

Ở Việt Nam việc nghiên cứu nấm Trichoderma được bắt đầu từ năm 1987 đến năm

1990, bộ môn bệnh cây Viện Bảo Vệ Thực Vật đã tiến hành phân lập các chủng

Trichoderma từ các nguồn khác nhau và xác định khả năng ức chế của nấm Trichoderma

đối với một số nấm gây bệnh, tìm phương pháp nuôi cấy để tạo chế phẩm đưa ra sản xuất

trên qui mô lớn Các chủng nấm Trichoderma đã thu thập có hiệu quả ức chế cao từ 67,7 -

85,5% đối với các nấm gây bệnh như: Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfssi, Fusarium

ssp.…

Nhóm nghiên cứu Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng (Trường ĐHBK Tp.HCM,

2003) đã: “Khảo sát quá trình cảm ứng Enzyme kitinase và cellulose của Trichoderma

harzianum - ảnh hưởng của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfssi” bài viết đã

chứng minh hai enzyme trên có tác động phân hủy vách khuẩn ty của nấm Sclerotium

rolfssi làm khuẩn ty nhăn nheo, đứt vụn và biến dạng Trichoderma harzianum có khả

năng kháng nấm bệnh là nhờ tiết enzyme ngoại bào trong đó đặc biệt quan trọng là

cellulose và chitinase

Nhiều công trình nghiên cứu đã đem lại kết quả tốt trong việc dùng nấm Trichoderma

chống bệnh cho nhiều loại cây trồng: thối rễ ở cây hòa thảo, thối đen ở bắp cải, cà chua,

dưa leo, bầu bí, bệnh chết rệp ở cây thuốc lá…và hàng loạt các bệnh khác do nấm gây ra

Theo nhóm Phan Thị Hoài Thanh và cộng tác viên (Đại học Tây Nguyên, 2004) nấm

Trichoderma khi phối hợp với vỏ cà phê, vôi, phân lân, phân ure, phân chuồng và xạ

khuẩn sẽ thành phân hữu cơ vi sinh giúp tăng năng suất đậu phộng, cải ngọt lên 30%,

giảm sâu bệnh, giảm chi phí phân bón, đồng thời giải quyết vấn đề ô nhiễm do vỏ cà phê

gây ra

Nguyễn Xuân Thành (2003), nấm Trichoderma phân giải mạnh cellulose nhờ tiết vào

môi trường hệ thống cellulase hoàn chỉnh, và chúng có thể tổng hợp các enzyme bền nhiệt

hơn vi khuẩn, có thể phát triển ở pH 3,5 - 6,6 Chúng được sử dụng để phân giải rác sinh

hoạt và các phế thải nông nghiệp

2.3 TỔNG QUAN VỀ PHÂN BÓN [30]

Hiện nay có các loại phân bón như: phân vô cơ, phân hữu cơ, phân vi lượng và phân vi

sinh

2.3.1 Phân hóa học

Là những hóa chất chứa các chất dinh dưỡng thiết yếu cho cây được bón vào cây

nhằm tăng năng suất, có các loại phân bón hóa học chính: phân urea, sulphate amon (SA),

chlorua kali (KCl), hay phân hỗn hợp (cung cấp ít nhất hai trong ba loại nguyên tố đa

lượng N.P.K) như amonium phosphate (DAP), phân N.P.K v.v…

2.3.2 Phân hữu cơ sinh học

Là sản phẩm phân bón được tạo thành thông qua quá trình lên men vi sinh vật các hợp

chất hữu cơ có nguồn gốc khác nhau, có sự tác động của vi sinh vật hoặc các hợp chất

sinh học được chuyển hóa thành mùn Trong loại phân này có đầy đủ thành phần là chất

hữu cơ, có phối chế thêm tác nhân sinh học (vi sinh, nấm đối kháng) bổ sung thêm thành

phần vô cơ đa lượng (N.P.K) và vi lượng Tuỳ thuộc vào nhu cầu của sản xuất mà có thể

cân đối phối trộn các loại phân nguyên liệu sao cho cây trồng phát triển tốt nhất mà không

cần phải bón bất kỳ các loại phân đơn nào Phân phức hợp hữu cơ sinh học có thể dùng để

bón lót hoặc bón thúc Loại phân này có hàm lượng dinh dưỡng cao nên khi bón trộn đều

với đất Nếu sản xuất phù hợp cho từng loại cây trồng thì đây là loại phân hữu cơ tốt nhất

Phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh được sự trợ giúp của vi sinh vật

chuyên biệt có khả năng thúc đẩy nhanh quá trình chuyển hóa các phế thải hữu cơ thành

phân bón

Thông thường các nhóm vi sinh vật chuyển hóa cellulose là các lòai Aspegillus niger,

Trichoderma reesei, Aspegillus sp., Penicillium sp., Paeceilomyces sp., Trichurus

spiralis, Chetomium sp.,

Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng dụng rất rộng rãi trong

công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học ở Việt Nam Phân hữu cơ sinh học có phối trộn

thêm nấm đối kháng Trichoderma là loại phân có tác dụng rất tốt trong việc phòng trừ các

bệnh vàng lá chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm Phytophthora palmirova gây ra,

hay bệnh vàng héo rũ do một số nấm bệnh gây ra: Furasium solari, Pythium sp.,

Sclerotium rolfosii…

Nhóm phân hữu cơ sinh học có bổ sung vi sinh vật trợ giúp và làm giàu dinh dưỡng

(phân hữu cơ vi sinh) thường được chế biến bằng cách đưa thêm một số vi sinh vật có ích

khác vào sau khi nhiệt độ đống ủ đã ổn định (300C) Như nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự

do (Azotobacter), vi khuẩn hoặc nấm sợi phân giải photphát khó tan (Bacillus polymixa,

Bacillus megaterium, Pseudomonas striata; Aspergillus awamori ), xạ khuẩn

Streptomyces Rất nhiều lọai phân hữu cơ vi sinh, phân lân vi sinh đang lưu thông trong

sản xuất tại Việt nam

2.3.3 Phân vi sinh

Là những chế phẩm trong đó có chứa các loài vi sinh vật có ích Có nhiều nhóm vi

sinh vật có ích bao gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn được sử dụng để làm phân bón Trong

số đó quan trọng là các nhóm vi sinh vật cố định đạm, hoà tan lân, phân giải chất hữu cơ,

kích thích sinh trưởng cây trồng, v.v…Chúng ta có thể chia vi sinh vật thành các nhóm:

Vi sinh vật cộng sinh

Vi sinh vật vùng rễ

Vi sinh vật tự do trong đất

Vi sinh vật sống tự do trên thân cây và không khí

Từ các môi quan hệ sinh vật - đất - không khí - cây trồng các nhà nghiên cứu đã định

hướng sản xuất các phân vi sinh có tính năng cơ bản như sau:

Phân vi sinh vật cố định đạm: Có nhiều loài vi sinh vật có khả năng cố định N từ

không khí Đáng chú ý có các loài: tảo lam (Cyanobacterium), vi khuẩn Azotobacter,

Bradyrhizobium, Rhyzobium; xạ khuẩn Actinomyces, Klebsiella

Vi sinh vật hòa tan lân: Cây chỉ có thể hút được lân từ đất dưới dạng hòa tan trong

đất Có nhiều loại đất như đất đỏ bazan, đất đen, v.v hàm lượng lân trong đất khá cao

nhưng cây trồng không hút được Vì vậy, bổ sung vi sinh vật có khả năng hòa tan lân là

cần thiết Nhóm hoà tan lân bao gồm: Aspergillus niger, một số loài thuộc các chi vi

khuẩn Pseudomonas, Bacillus, Micrococens Nhóm vi sinh vật này dễ dàng nuôi cấy trên

môi trường nhân tạo Nhiều nơi người ta đã đưa trộn sinh khối hoặc bào tử các loại vi sinh

vật hoà tan lân sau khi nuôi cấy và nhân lên trong phòng thí nghiệm với bột phosphorit

hoặc apatit rồi bón cho cây Sử dụng các chế phẩm vi sinh vật hòa tan lân đem lại hiệu

quả cao ở những vùng đất cây bị thiếu lân

Vi sinh vật tăng trưởng cây trồng: Gồm một nhóm nhiều loài vi sinh vật khác nhau,

trong đó có vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, v.v Nhóm này được các nhà khoa học phân lập ra

từ tập đoàn vi sinh vật đất

Người ta còn sử dụng những chế phẩm gồm tập đoàn vi sinh vật được chọn lọc để

phun lên cây hoặc bón vào đất làm cho cây sinh trưởng và phát triển tốt, ít sâu bệnh, nâng

cao năng suất cây trồng Chế phẩm này còn làm tăng khả năng nảy mầm của hạt, tăng

trọng lượng hạt, thúc đẩy bộ rễ cây phát triển mạnh Như vậy, chế phẩm này có tác động

tương đối tổng hợp lên cây trồng

2.3.4 Phân phức hợp hữu cơ vi sinh

Là một loại phân mới có chứa đầy đủ các vi sinh vật hữu ích để phân giải mùn hữu cơ,

các vi lượng cần thiết cho cây trồng phát triển, cho năng suất và chất lượng cao

Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu ứng dụng nấm sợi Aspergillus sp và

Trichoderma sp xử lý bã khoai mì để sản xuất phân hữu cơ vi sinh Trong đó Aspergillus

sp có chung Trichoderma có khả năng đối kháng nấm bệnh, tác dụng đẩy nhanh sự sinh

trưởng và phát triển của các vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất, cung cấp chất

dinh dưỡng cho cây trồng, giúp bảo vệ môi trường sinh thái bền vững

Xử lý triệt để hơn rác thải hữu cơ trả lại môi trường tự nhiên, cung cấp lượng vi sinh

vật hữu ích để cải tạo đất, cân đối dinh dưỡng cho cây trồng

Hạn chế dùng vô cơ, tăng cường dùng hữu cơ, dẫn tới hạn chế rửa trôi dinh dưỡng,

chống hiện tượng xói mòn và chai cứng đât

CHƯƠNG 3

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG

3.1.1 Giống Vi sinh vật

Vi sinh vật gồm Aspergillus sp và Trichoderma sp nhận được từ phòng thí nghiệm bộ

môn công nghệ sinh học trường đại học bách khoa thành phố Hồ Chí Minh và phân lập

các chủng đang sử dụng làm phân vi sinh đang lưu hành trên thị trường năm 2009

3.1.2 Môi trường nuôi cấy

Chúng tôi sử dụng một số nguồn dinh dưỡng sau đây làm môi trường nuôi cấy chung cho

Aspergillus và Trichoderma Nguồn cacbon, khoáng chất (Trung quốc), Agar (Hạ Long,

Việt Nam), các cơ chất làm môi trường: cám, trấu, khoai tây (Việt Nam)

Bảng 3.1 Thành phần môi trường thí nghiệm STT Môi trường Thành phần