Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân tinh bột sống

Các phương pháp xác định đường khử được sử dụng xuyên suốt quá trình xác định hoạt độ enzym, cũng như đánh giá khả năng thuỷ phân tinh bột sống dựa vào lượng đường khử được tạo thành.. D

-

TRẦN THỊ TRÚC THANH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ

KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN TINH BỘT SỐNG

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ NGÀNH : 604280

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 12 năm 2008

Cán bộ hướng dẫn khoa học : PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Tp HCM, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Trần Thị Trúc Thanh Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh : 24/08/1983 Nơi sinh : Tây Ninh

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học MSHV : 03106683

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2006

1- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THUỶ PHÂN TINH BỘT SỐNG

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

- Phân lập, làm thuần được vi sinh vật có khả năng thuỷ phân tinh bột sống

- Khảo sát hoạt tính enzym α-amylase, glucoamylase, enzym thuỷ phân tinh bột sống, và enzym cellulase; chọn chủng có khả năng thủy phân tinh bột sống tốt nhất

- Dựa trên nguồn cơ chất chính là bã khoai mì, tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy nhằm tối ưu hoá việc thu nhận enzym từ chủng vi sinh vật đã chọn

- Thử nghiệm khả năng thuỷ phân tinh bột sống của chủng đã chọn trên các nguồn tinh bột sống khác nhau, và trên môi trường bã khoai mì sống

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ :

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ :

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

(Họ tên và chữ ký)

Luận văn này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ tận tình, những lời động viên chân thành của những người thân, thầy cô, những anh chị và những người bạn luôn sát cánh bên tôi Xin cho tôi gửi đến mọi người lòng biết ơn chân thành

và sâu sắc!

Con xin cảm ơn mẹ! Tuy không ở cạnh con trong suốt quá trình làm việc nhưng

mẹ luôn dõi theo con với những lo lắng và những lời động viên mộc mạc!

Con xin cảm ơn thầy – PGS TS Nguyễn Đức Lượng đã nhiệt tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báu cho con trong suốt thời gian thực hiện luận văn!

Em xin cảm ơn thầy cô trong bộ môn Công nghệ Sinh học, trường Đại học Bách khoa TP HCM đã cho em những giờ học hữu ích và những kiến thức chuyên môn trong suốt thời gian qua!

Luận văn này cũng sẽ không đạt kết quả nếu không có sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của các cô trong phòng thí nghiệm Em xin chân thành cảm ơn!

Tôi xin cảm ơn chị Phương, chị Như, chị Thúy, chị Huyền, bạn Quang Tâm, bạn Nhã, bé Trúc và các bạn của tôi đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ, động viên tôi những lúc khó khăn trong suốt quá trình thực hiện đề tài! Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn Cao học 2006, và các em sinh viên cùng làm việc trong phòng thí nghiệm!

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn mọi người đã hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn!

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG THỦY

PHÂN TINH BỘT SỐNG Các chủng nấm mốc phân lập được từ môi trường bã khoai mì đã bị lên men được đem xác định hoạt tính enzym Chủng có enzym thuỷ phân tinh bột sống mạnh nhất sẽ được chọn để khảo sát các điều kiện nuôi cấy nhằm tối ưu hoá việc thu nhận enzym Enzym thô sau khi thu nhận được sẽ được dùng để thử khả năng thuỷ phân tinh bột sống trên các nguồn tinh bột sống khác nhau, và trên môi trường bã khoai mì sống Cơ sở: Ở nơi giàu một nguồn cơ chất nào đó, ở đó sẽ có

vi sinh vật tương ứng mang hệ enzym chuyển hoá được cơ chất đó thành thức ăn cho nó Phương pháp: Sử dụng môi trường pepton cao nấm men có bổ sung 1% tinh bột sống để phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng thuỷ phân tinh bột sống Các phương pháp xác định đường khử được sử dụng xuyên suốt quá trình xác định hoạt độ enzym, cũng như đánh giá khả năng thuỷ phân tinh bột sống dựa vào lượng đường khử được tạo thành Kết luận: Trong ba chủng nấm mốc phân lập được, chủng M3 được chọn vì có khả năng sinh tổng hợp enzym thuỷ phân tinh bột sống, glucoamylase, và cellulase mạnh vượt trội hơn hai chủng còn lại, dù khả năng sinh α-amylase không mạnh lắm Trên môi trường nuôi cấy có độ ẩm 55%, pH 6.5, bổ sung 5% cám gạo, 4% tinh bột sắn (bột mì) sống thì chủng này có khả năng sinh tổng hợp enzym mạnh nhất Chủng nấm mốc này có khả năng thuỷ phân được nhiều loại tinh bột sống khác nhau như bột bắp, bột gạo, bột sắn, tinh bột tan, và cả bã khoai mì sống Trong đó, nó thuỷ phân tinh bột sắn sống, và bã khoai mì sống tốt nhất Ứng dụng: Tạo bước khởi đầu cho các nghiên cứu tiếp theo từ chủng nấm mốc này nhằm tiến tới ứng dụng trong công nghệ sản xuất cồn

từ bã khoai mì sống, vừa giảm chi phí sản xuất, vừa đơn giản hoá thiết bị sản xuất,

vừa giải quyết được một phần ô nhiễm môi trường do các nhà máy sản xuất bột mì gây ra

STARCH Objective: Molds, isolated from rotten starch-processing waste from cassava starch plant were used to determine enzyme activity The strain with the best capability of raw starch digetion would be chosen.The optimal culture of production enzymes from this strain was studied The crude enzyme would be used to test its raw starch digesting ability on many sources of raw starch and waste on cassava starch plant Background: It

is the fact that one place having high concentration of one substract always contains the suitable microorganisms which have enzymes can transfom this substract to its food Method: Pepton-Yeast extract-raw starch-agar medium was used as isolated medium Determining reducing sugar methods such as Somogyi-Nelson method, and DNS method were be used to calculate the enzyme activity and determine raw starch hydrolysis extent Conclusion: In three strain of isolated molds, regardless of α-amylase activity is not good, M3 strain was choosen because it can synthesize raw starch digesting enzyme, glucoamylase, and cellulase remarkable stronger than the other strains With the starch-processing waste from cassava starch plant as the main substract, the culture with 55% of moisture, pH 6.5, 5% of mash of rice, 4% of raw cassava starch is good for production enzyme from this mold This mold can hydrolyse many kind of raw starchs such as raw corn starch, raw rice starch, raw cassava starch, soluble starch, and raw starch-processing waste from cassava starch plant Among them, raw cassava starch and raw starch-processing waste from cassava starch plant are the best substracts for this mold Application: This is one of the first steps for after researches on this mold to aim at fermenting ethanol from raw starch-processing waste from cassava starch plant Its advantages are not only reducing production cost, simplifying equipment, but also solving a part of enviroment pollution problem from cassava starch processing factories

Danh mục bảng 1

Danh mục hình 2

Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 4

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 5

1.3 Nội dung nghiên cứu 5

Phần 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 2.1 Tổng quan về tinh bột 6

2.1.1 Cấu tạo, tính chất của tinh bột 6

2.1.2 Tinh bột sắn (khoai mì) 12

2.2 Quá trình thủy phân tinh bột 17

2.2.1 Các enzym thủy phân tinh bột 17

2.2.2 Quá trình thủy phân tinh bột 26

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân tinh bột 32

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về quá trình thủy phân tinh bột sống 36

2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 36

2.3.2.Tình hình nghiên cứu nước ngoài 38

2.4 Nguồn thu nhận enzym amylase 39

2.4.1 Các vi sinh vật 39

2.4.2 Thực vật 45

Phần 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Nguyên liệu 47

3.1.1 Giống vi sinh vật 47

3.1.2 Nguyên vật liệu 47

3.1.3 Môi trường PGA 48

3.1.4 Môi trường giữ giống 48

3.1.5 Dụng cụ thiết bị cơ bản 48

3.2 Phương pháp 48

3.2.1 Phương pháp phân lập nhanh vi sinh vật thủy phân tinh bột sống 48

3.2.2 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 49

3.2.3 Phương pháp xác định hình thái giống 49

3.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính enzym 55

3.2.7.1 Xác định hoạt độ α-amylase theo phương pháp Rukhliadeva Geriacheva 55

3.2.7.2 Glucoamylase 57

3.2.7.3 Enzym thủy phân tinh bột sống 58

3.2.7.4 Cellulase 59

3.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đầu đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 60

3.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đầu đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 61

3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của việc thay thế thành phần bã khoai mì bằng cám gạo đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 61

3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung cơ chất cảm ứng đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 62

3.7 Phương pháp khảo sát thời gian nuôi cấy thu nhận enzym 62

3.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước và cơ chất trong lên men tinh bột sống đến việc nuôi cấy thu nhận enzym 62

3.9 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chế phẩm enzym và cơ chất để thu được lượng đường khử cao nhất 63

3.10 Thử khả năng thủy phân tinh bột sống trên các nguồn cơ chất khác nhau 64

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN A Kết quả phân lập vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym thủy phân tinh bột sống 65

1 Kết quả khảo sát hoạt tính enzym 68

1.1 Enzym α-amylase 69

1.2 Enzym glucoamylase 69

1.3 Enzym thủy phân tinh bột sống 70

1.4 Enzym cellulase 71

2 Xác định hình thái giống M3 73

B Kết quả về nuôi cấy để thu nhận enzym Amylase 74

1 Ảnh hưởng của pH đầu 75

2 Ảnh hưởng của độ ẩm 77

C Kết quả nuôi cấy thu nhận enzym amylase trên các nguồn cơ chất khác nhau 84

1 Tỉ lệ cơ chất và nước 85

1.1 Cơ chất là bã khoai mì khô 85

1.2 Cơ chất là bã khoai mì ướt 86

2 Tỉ lệ enzym : cơ chất và lượng đường khử tạo thành theo thời gian 87

3 Khảo sát trên các nguồn cơ chất khác nhau 88

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ A Kết luận 90

B Đề nghị 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93 Phần 6: PHỤ LỤC

1 Phụ lục kết quả

2 Phiếu kết quả kiểm nghiệm thành phần bã khoai mì thu từ Lò mì số 2, Ấp Giồng Tre,

xã Bình Minh, Thị xã Tây Ninh

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1: Nhiệt độ hồ hóa của một số loại tinh bột 11

Bảng 2.2: Các nhóm vi sinh vật tìm thấy trong nước thải của nhà máy chế biến tinh bột sắn 16

Bảng 2.3: Tổng vi sinh vật trong nước thải từ nhà máy chế biến tinh bột sắn 16

Bảng 2.4: Quá trình dịch hóa tinh bột trong công nghiệp 28

Bảng 3.1: Kết quả phân tích thành phần bã khoai mì ướt 47

Bảng 4.1: Kết quả đường chuẩn theo phương pháp Somogyi-Nelson 68

Bảng 4.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đầu đến sự sinh tổng hợp 75

Bảng 4.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đầu đến khả năng sinh tổng hợp enzym 77

Bảng 4.4: Kết quả khảo sát việc bổ sung, thay thế một phần bã khoai mì bằng cám gạo 78

Bảng 4.5: Kết quả khảo sát việc cảm ứng tạo enzym thủy phân tinh bột sống 80

Bảng 4.6: Kết quả khảo sát thời gian thu nhận enzym 81

Bảng 4.7: Kết quả đường chuẩn theo phương pháp DNS 84

Bảng 4.8: Kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất (bã khoai mì khô) và nước 85

Bảng 4.9: Kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất (bã khoai mì ướt) và nước 86

Bảng 4.10: Kết quả khảo sát tỉ lệ enzym cơ chất và lượng đường khử tạo thành theo thời gian 87

Bảng 4.11: Kết quả khảo sát trên các nguồn cơ chất khác nhau 88

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cấu tạo tinh bột 6

Hình 2.2: Cấu trúc phân tử amylose 7

Hình 2.3: Cấu trúc phân tử amylopectin 7

Hình 2.4: Amylose và amylopectin 7

Hình 2.5: Phản ứng thủy phân của tinh bột 8

Hình 2.6: Cấu trúc hạt tinh bột sắn quan sát trên kính hiển vi điện tử quét 13

Hình 3.1: Mẫu bã khoai mì thu trực tiếp từ Lò mì số 2 47

Hình 4.1: Một số vi sinh vật mọc trên môi trường có tinh bột sống ở đĩa thứ nhất 65

Hình 4.2: Một số chủng vi sinh vật mọc được trên môi trường có tinh bột sống ở đĩa thứ hai 66

Hình 4.3: Chủng M1 đã được làm thuần với bào tử màu xanh lá cây 66

Hình 4.4: Chủng M2 đã được làm thuần với bào tử màu kem 66

Hình 4.5: Chủng M3 đã được làm thuần với bào tử có màu trắng xám ánh vàng cam 67 Hình 4.6: Mặt sau của khuẩn lạc chủng M3 67

Hình 4.7: Khuẩn lạc chủng M3 trong ống thạch nghiêng trên môi trường PGA 67

Hình 4.8: Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp Somogyi-Nelson 68

Hình 4.9: Đồ thị khảo sát hoạt tính α-amylase của 3 chủng nấm mốc 69

Hình 4.10: Đồ thị khảo sát hoạt tính glucoamylase của 3 chủng nấm mốc 70

Hình 4.11: Đồ thị khảo sát hoạt tính enzym thủy phân tinh bột sống của 3 chủng nấm mốc 71

Hình 4.12: Đồ thị khảo sát hoạt tính enzym cellulase của 3 chủng nấm mốc 72

Hình 4.13: Hình dạng sợi nấm và kiểu tạo bào tử của chủng M3 73

Hình 4.14: Sợi mốc M3 được nhuộm màu 74

Hình 4.15: Đồ thị ảnh hưởng của pH đầu đến sự sinh tổng hợp enzym 76

Hình 4.16: Đồ thị ảnh hưởng của độ ẩm đầu đến sự tổng hợp enzym 77

Hình 4.17: Đồ thị ảnh hưởng của tỷ lệ thay thế bã khoai mì bằng cám gạo đến sự sinh tổng hợp enzym 79

Hình 4.18: Đồ thị khảo sát % cơ chất cảm ứng bổ sung 80

Hình 4.19: Đồ thị khảo sát thời gian thu nhận enzym 82

Hình 4.20: Chủng mốc M3 sau khi nuôi cấy 84 giờ 83

Hình 4.21: Có hiện tương tỏa nhiệt và tạo nhiều giọt nước trên thành và nấp hộp nuôi cấy sau 4 ngày 83

Hình 4.22: Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp DNS 84

Hình 4.23: Đồ thị khảo sát tỷ lệ cơ chất (bã khoai mì khô) và nước 85

Hình 4.24: Đồ thị khảo sát tỷ lệ cơ chất (bã khoai mì ướt) và nước 86

Hình 4.25: Đồ thị khảo sát tỷ lệ enzym cơ chất và đường khử tạo thành theo thời gian 87

Hình 4.26: Đồ thị khảo sát lượng đường khử đối với các nguồn cơ chất 89

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay, trong công nghệ sản xuất cồn, rượu từ nguồn nguyên liệu là tinh bột đều phải qua giai đoạn nấu nguyên liệu (còn được gọi là quá trình hồ hóa tinh bột) Mục đích chính của việc nấu nguyên liệu là nhằm phá vỡ màng tế bào của tinh bột, tạo điều kiện biến chúng thành trạng thái hòa tan trong dung dịch [15] Dịch cháo này sau

đó được đường hóa bằng acid hay hệ enzym amylase trước khi lên men Quá trình hồ hóa đòi hỏi phải cung cấp năng lượng để gia nhiệt Để đạt được yêu cầu phá vỡ hoàn toàn hạt tinh bột, nhiệt độ nấu không thấp hơn 145-155oC trong thời gian dài, và ở 170-

180oC trong thời gian ngắn (2-4 phút) [17] Vì vậy, công đoạn này chiếm rất nhiều chi phí cho quá trình gia nhiệt Và đây được xem là một trong những nguyên nhân chính làm tăng chí phí sản xuất, ảnh hưởng đền giá thành sản phẩm

Do đó, việc tìm ra được chủng vi sinh vật với hệ enzym amylase có khả năng thủy phân trực tiếp hạt tinh bột sống sẽ giúp giảm chi phí cho quá trình gia nhiệt, đồng thời đơn giản hóa thiết bị sản xuất Từ đó giúp giảm đáng kể chi phí sản xuất, góp phần

hạ giá thành sản phẩm Và điều này đặt biệt có ý nghĩa trong việc sử dụng cồn làm nhiên liệu sinh học trong tình hình giá xăng dầu tăng cao

Ai cũng biết rằng nguồn liệu chính hiện nay từ dầu mỏ sẽ dần cạn kiệt trong tương lai không xa Vì vậy từ những thập niên đầu của thế kỉ 20, nguồn nhiên liệu sinh học thay thế đã bắt đầu được nghiên cứu trong đó nổi bật là cồn sinh học Đặc biệt là từ khi giá xăng dầu tăng cao, xăng pha cồn được đẩy mạnh nghiên cứu và rất nhiều quốc gia đã đưa vào sử dụng nguồn nhiên liệu này Tuy nhiên, hiện nay cồn sinh học được sản xuất chủ yếu từ mía, bắp (ngô), khoai mì (sắn), tấm gạo vốn là những nguồn lương thực chính của con người Tại Diễn đàn Năng lượng quốc tế vừa diễn ra ở Roma (Italia) vào tháng 04/2008, các đại biểu tham dự cho rằng "thủ phạm" chính đứng đằng sau cuộc khủng hoảng lương thực toàn cầu hiện nay không phải giá dầu cao, mà chủ yếu do xu hướng phát triển ồ ạt nhiên liệu sinh học

Nhưng điều đó không có nghĩa là từ bỏ việc phát triển nguồn nhiên liệu cồn sinh học mà cần chuyển hướng sử dụng nguồn nguyên liệu để sản xuất cồn Thay vì sử dụng các sản phẩm chính từ nông nghiệp, ta cần tập trung vào sử dụng nguồn phụ phế phẩm nông nghiệp, và của ngành sản xuất tinh bột Vì vậy, đề tài này không chỉ nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân các nguồn tinh bột sống khác nhau, mà còn dựa vào nguồn cơ chất chính là bã khoai mì (một nguồn phụ phế phẩm của ngành công nghiệp sản xuất bột mì) để khảo sát việc thu nhận enzym và thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột sống Nếu thành công sẽ vừa góp một phần giải quyết vấn đề nhiên liệu, vừa giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do các nhà máy sản xuất bột mì gây ra

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Phân lập và ổn định được chủng vi sinh vật với hệ enzym có khả năng thủy phân nguồn tinh bột sống với hiệu suất cao

- Thu nhận địch đường từ các nguồn tinh bột sống khác nhau, và trên môi trường bã khoai mì sống

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá thành phần bã khoai mì

- Phân lập và chọn giống vi sinh vật có khả năng thủy phân tinh bột sống

- Khảo sát đặc điểm hình thái của chủng vi sinh vật vừa phân lập được

- Kiểm tra hoạt tính của các enzym α-amylase, glucoamylase, cellulase, và hoạt tính enzym thủy phân tinh bột sống

- Khảo sát môi trường thu nhận enzym

- Khảo sát hiệu quả thủy phân trên các nguồn tinh bột sống khác nhau như: bã khoai mì, tinh bột sắn, bột bắp, tinh bột tan, bột gạo

Tinh bột là loại polysaccaharide khối lượng phân tử cao gồm các đơn vị glucose được nối với nhau bởi các liên kết α-glucoside, có công thức phân tử là (C6H10O5)n, ở đây n có thể từ vài trăm đến hơn 1 triệu

Thành phần cấu trúc amylose

Amylose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500 – 2000 đơn vị glucose, liên kết nhau bởi liên kết α-1,4 glucoside Amylose “nguyên thủy” có mức độ trùng hợp không phải hàng trăm mà là hàng ngàn Có hai loại amylose:

Amylose có mức độ trùng hợp tương đối thấp (kho

t thường và bị phân ly hoàn toàn bởi β-amylase

Amylose có mức độ trùng hợp lớn hơn, có cấu trúc án ng

phân hủy 60%

t tinh bột hoặc trong dung dịch hoặc ở trạng thái thoái hóa, amylose

u hình mạch giãn, khi thêm tác nhân kết tủa vào, amylose m

c Mỗi vòng xoắn ốc là 12.97 A0, chiều cao củ

ủa các gốc glucose được bố trí ở phía ngoài xo

Hình 2.2: Cấu trúc phân tử amyloseThành phần cấu trúc amylopectin

Amylopectin là polyme mạch nhánh, ngoài mạch chính b

u trúc phân tử amylopectin Hình 2.4: Amylose và amylopectin

p (khoảng 2000) thường amylase

u trúc án ngữ đối với

β-ng thái thoái hóa, amylose

a vào, amylose mới chuyển

ủa vòng xoắn là 7.91A0 phía ngoài xoắn ốc, bên trong là

amylose

ch chính bẳng liên kết α-1,6

mylose và amylopectin

Mối liên kết nhánh này làm cho phân tử cồng kềnh hơn, chiều dài chuỗi mạch nhánh này khoảng 25 – 30 đơn vị glucose Phân tử amylopectin có thể chứa tới 100,000 đơn vị glucose

Sự khác biệt giữa amylose và amylopectin không phải luôn luôn rõ nét Bởi lẽ ở các phân tử amylose cũng thường có một phần nhỏ phân nhánh do đó cũng có những tính chất giống như amylopectin

Cấu tạo của amylopectin còn lớn và dị thể hơn amylose nhiều Trong tinh bột tỷ

lệ amylose/amylopectin khoảng ¼ Tỷ lệ này có thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa

hồ hóa Một số enzym thường dùng là α-amylase, β-amylase Acid và enzym giống nhau là đều thủy phân các phân tử tinh bột bằng cách thủy phân liên kết α-D (1,4) glucoside Đặc trưng của phản ứng này là sự giảm nhanh độ nhớt và sinh ra đường

Hình 2.5: Phản ứng thủy phân của tinh bột

Các nhóm hydroxyl trong tinh bột có thể bị oxy hóa tạo thành andehyt, xeton và tạo thành các nhóm cacboxyl Quá trình oxy hóa thay đổi tùy thuộc vào tác nhân oxy hóa và điều kiện tiến hành phản ứng Quá trình oxy hóa tinh bột trong môi trường kiềm bằng hypoclorit là một trong những phản ứng hay dùng, tạo ra nhóm cacboxyl trên tinh bột và một số lượng nhóm cacbonyl Quá trình này còn làm giảm chiều dài mạch tinh bột và tăng khả năng hòa tan trong nước, đặc biệt trong môi trường loãng

Các nhóm hydroxyl trong tinh bột có thể tiến hành ete hóa, este hóa Một số monome vinyl đã được dùng để ghép lên tinh bột Quá trình ghép được thực hiện khi các gốc tự do tấn công lên tinh bột và tạo ra các gốc tự do trên tinh bột ở các nhóm hydroxyl Những nhóm hydroxyl trong tinh bột có khả năng phản ứng với andehyt trong môi trường acid Khi đó xảy ra phản ứng ngưng tụ tạo liên kết ngang giữa các phân tử tinh bột gần nhau Sản phẩm tạo thành không có khả năng tan trong nước

Phản ứng tạo phức

Phản ứng rất đặc trưng của tinh bột là phản ứng với iodine Khi tương tác với iodine, amylose sẽ cho phức màu xanh đặc trưng Vì vậy, iodine có thể coi là thuốc thử đặc trưng để xác định hàm lượng amylose trong tinh bột bằng phương pháp trắc quan

Để phản ứng được thì các phân tử amylose phải có dạng xoắn ốc để hình thành đường xoắn ốc đơn của amylose bao quanh phân tử iodine Các dextrin có ít hơn 6 gốc glucose không cho phản ứng với iodine vì không tạo được một vòng xoắn ốc hoàn chỉnh Acid và một số muối như KI, Na

2SO

4 tăng cường độ phản ứng

Amylose với cấu hình xoắn ốc hấp thụ được 20% khối lượng iodine, tương ứng với một vòng xoắn một phân tử iodine Amylopectin tương tác với iodine cho màu nâu tím Về bản chất phản ứng màu với iodine là hình thành nên hợp chất hấp thụ

Ngoài khả năng tạo phức với iodine, amylose còn có khả năng tạo phức với nhiều chất hữu cơ có cực cũng như không cực như: các rượu no, các rượu thơm, phenol, các xeton phân tử lượng thấp

Tính hấp thụ của tinh bột

Hạt tinh bột có cấu tạo lỗ xốp nên khi tương tác với các chất bị hấp thụ thì bề mặt trong và ngoài của tinh bột đều tham dự Vì vậy trong quá trình bảo quản, sấy và chế biến cần phải hết sức quan tâm tính chất này Các ion liên kết với tinh bột thường ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ của tinh bột Khả năng hấp thụ của các loại tinh bột phụ thuộc cấu trúc bên trong của hạt và khả năng trương nở của chúng

Khả năng hấp thụ nước và khả năng hòa tan của tinh bột

Xác định khả năng hấp thụ nước và khả năng hòa tan của tinh bột cho phép điều chỉnh được tỉ lệ dung dịch tinh bột và nhiệt độ cần thiết trong quá trình công nghiệp, còn có ý nghĩa trong quá trình bảo quản, sấy và chế biến thủy nhiệt Rất nhiều tính chất chức năng của tinh bột phụ thuộc vào tương tác của tinh bột và nước (tính chất thủy nhiệt, sự hồ hóa, tạo gel, tạo màng) Ngoài ra, nó cũng là cơ sở để lựa chọn tinh bột biến hình thích hợp cho từng ứng dụng cụ thể Ví dụ: Để sản xuất các sản phẩm nước uống hòa tan như cà phê, trà hòa tan thì nên chọn tinh bột biến hình nào có độ hòa tan cao nhất

2.1.1.3 Những tính chất vật lí của huyền phù tinh bột trong nước

Độ tan của tinh bột

Amylose mới tách từ tinh bột có độ tan cao hơn song không bền nên nhanh chóng bị thoái hóa trở nên không hòa tan trong nước Amylopectin khó tan trong nước

ở nhiệt độ thường mà chỉ tan trong nước nóng Tinh bột bị kết tủa trong cồn, vì vậy cồn

là một tác nhân tốt để tăng hiệu quả thu hồi tinh bột

Sự trương nở

Khi ngâm tinh bột vào nước thì thể tích hạt tăng do sự hấp thụ nước, làm cho hạt tinh bột trương phồng lên Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của hạt tinh bột Độ tăng kích thước trung bình của một số loại tinh bột khi ngâm vào nước như sau: tinh bột bắp: 9.1%, tinh bột khoai tây: 12.7%, tinh bột sắn: 28.4%

Tính chất hồ hóa của tinh bột

Nhiệt độ để phá vỡ hạt chuyển tinh bột từ trạng thái đầu có mức độ oxy hóa khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt độ hồ hóa Phần lớn tinh bột bị hồ hóa khi nấu và trạng thái trương nở được sử dụng nhiều hơn ở trạng thái tự nhiên Các biến đổi hóa lý khi hồ hóa như sau: hạt tinh bột trương lên, tăng độ trong suốt và độ nhớt, các phân tử mạch thẳng và nhỏ thì hòa tan và sau đó tự liên hợp với nhau để tạo thành gel Nhiệt độ hồ hóa không phải là một điểm mà là một khoảng nhiệt độ nhất định Tùy điều kiện hồ hóa như nhiệt độ, nguồn gốc tinh bột, kich thước hạt và pH mà nhiệt độ phá vỡ và trương nở của tinh bột biến đổi một cách rộng lớn

Bảng 2.1: Nhiệt độ hồ hóa của một số loại tinh bột Tinh bột tự nhiên Nhiệt độ hồ hóa (t0C)

Độ nhớt của hồ tinh bột

Một trong những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hưởng đến chất lượng

và kết cấu của nhiều sản phẩm thực phẩm đó là độ nhớt và độ dẻo Phân tử tinh bột có nhiều nhóm hydroxyl có khả năng liên kết được với nhau làm cho phân tử tinh bột tập hợp lại, giữ nhiều nước hơn khiến cho dung dịch có độ đặc, độ dính, độ dẻo và độ nhớt cao hơn Yếu tố chính ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch tinh bột là đường kính biểu kiến của các phân tử hoặc của các hạt phân tán, đặc tính bên trong của tinh bột như kích thước, thể tích, cấu trúc, và sự bất đối xứng của phân tử Nồng độ tinh bột, pH, nhiệt độ, tác nhân oxy hóa, các thuốc thử phá hủy liên kết hydro đều làm cho tương tác của các phân tử tinh bột thay đổi do đó làm thay đổi độ nhớt của dung dịch tinh bột

Khả năng tạo gel và sự thoái hóa gel

Tinh bột sau khi hồ hóa và để nguội, các phân tử sẽ tương tác nhau và sắp xếp lại một cách có trật tự để tạo thành gel tinh bột với cấu trúc mạng 3 chiều Để tạo được gel thì dung dịch tinh bột phải có nồng độ đậm đặc vừa phải, phải được hồ hóa để chuyển tinh bột thành trạng thái hòa tan và sau đó được để nguội ở trạng thái yên tĩnh Trong gel tinh bột chỉ có các liên kết hydro tham gia, có thể nối trực tiếp các mạch polyglucoside hoặc gián tiếp qua phân tử nước

Khi gel tinh bột để nguội một thời gian dài sẽ co lại và lượng dịch thể sẽ thoát ra, gọi là

sự thoái hóa Quá trình này sẽ càng tăng mạnh nếu gel để ở lạnh đông rồi sau đó cho tan giá

2.1.2 Tinh bột sắn (khoai mì) [1]

2.1.2.1 Tính chất tinh bột sắn

Tinh bột sắn có màu rất trắng Trong quá trình sản xuất nếu củ được nghiền khi chưa bóc vỏ, tinh bột thu được thường có màu tối Màu xám của tinh bột sắn ảnh hưởng đến chất lượng cũng như giá cả của sản phẩm Củ sắn và tinh bột sắn thường có

pH trong khoảng 6.0 – 6.3 Theo tiêu chuẩn của viện Tiêu Chuẩn Ấn Độ, các loại sắn

ăn được có pH trong khoảng 4.7 – 7.0 Còn theo tiêu chuẩn của Mỹ, các loại sắn tốt có

pH từ 4.5 – 6.5 và độ acid thấp Tinh bột sắn được sấy khô tốt cũng có tính di động tốt

Hình 2.6: Cấu trúc hạt tinh bột sắn quan sát trên kính hiển vi điện tử quét

Quan sát bằng SEM, hạt tinh bột sắn có kích thước từ 5 đến 40µm với những hạt lớn 25 – 35µm, hạt nhỏ 5 – 15µm và nhiều hình dạng, chủ yếu là hình tròn, bề mặt nhẵn, một bên mặt có chỗ lõm hình nón và một núm nhỏ ở giữa Dưới ánh sáng phân cực, các liên kết ngang với mật độ trung bình tới dày đặc có thể thấy rõ Các nghiên cứu siêu cấu trúc bằng tia X cho thấy tinh bột sắn có cấu trúc tinh thể dạng A và hỗn hợp A, B

Khi hạt tinh bột sắn bị vỡ, có thể quan sát được các rãnh tạo cấu trúc xốp của hạt Các rãnh vô định hình kéo dài từ bề mặt tới tâm của hạt tạo thành các lỗ xốp Chính các lỗ xốp này giúp nước thâm nhập làm trương nở tinh bột, phá vỡ các liên kết hydro giữa các phân tử trong cấu trúc tinh thể, tạo điều kiện cho tác dụng phân hủy của enzym Tinh bột sắn có cấu trúc hạt tương đối xốp, liên kết giữa các phần tử trong cấu trúc tinh thể yếu, vì vậy nó dễ bị phân hủy bởi các tác nhân như acid và enzym hơn so với các loại tinh bột khác như bắp, gạo

Tinh bột sắn có hàm lượng amylopectin và phân tử lượng trung bình tương đối cao 215,000 g/mol so với 30,500; 130,000; 224,500 và 276,000 tương ứng ở amylose

của bắp, tinh bột lúa mì, tinh bột khoai tây và tinh bột bắp sáp Hàm lượng amylose nằm trong khoảng 8 – 29%, nhưng nói chung đa số các giống sắn có tỷ lệ amylose 16 - 18% Tinh bột sắn có những tính chất tương tự các loại tinh bột chứa nhiều amylopectin như độ nhớt cao, xu hướng thoái hóa thấp và độ bền gel cao Hàm lượng amylopectin và amylose trong tinh bột sắn liên quan đến độ dính của củ nấu chín và nhiều tính chất trong các ứng dụng công nghiệp

Tinh bột sắn có nhiệt độ hồ hóa trong khoảng 58,5 – 700C so với 56 – 660C ở khoai tây và 62 – 720C ở tinh bột bắp Việc tạo ra các dẫn xuất của tinh bột nhờ các liên kết ngang hay việc thêm các chất có hoạt tính bề mặt có thể thay đổi nhiệt độ hồ hóa Nhiệt độ hồ hóa cũng ảnh hưởng đến chất lượng nấu của tinh bột, nhiệt độ hồ hóa thấp thường làm chất lượng nấu thấp do tinh bột dễ bị phá vỡ

Độ nhớt là tính chất quan trọng giúp tinh bột có nhiều ứng dụng như chất làm đặc trưng trong công nghiệp thực phẩm, chất hồ vải trong công nghiệp dệt hay chất phủ trong công nghiệp giấy Tinh bột lúa mì, bắp và tinh bột gạo có độ nhớt thấp hơn so với tinh bột sắn và tinh bột khoai tây Khả năng hồ hóa sớm, độ nhớt cao của tinh bột sắn thể hiện lực liên kết yếu giữa các phân tử tinh bột trong cấu trúc hạt Xử lý hóa học và vật lý (gia nhiệt, xử lý bằng áp suất hơi, thêm các chất hóa học, thay đổi pH của môi trường) cũng như sự có mặt của các chất như protein, chất béo, chất có hoạt tính bề mặt đều có ảnh hưởng tới độ nhớt của tinh bột sắn

Độ nở và độ hòa tan của tinh bột cũng là những tính chất quan trọng và cũng rất khác nhau giữa các loại tinh bột Lực nở được hiểu là thể tích và khối lượng lớn nhất

mà tinh bột có thể đạt được khi nở tự do trong nước Khả năng nở và hòa tan cao của tinh bột sắn một lần nữa lại thể hiện lực liên kết yếu trong cấu trúc hạt Sự có mặt của các gốc ester có khả năng ion hóa, các chất phụ gia như chất có hoạt tính bề mặt, những biến tính về mặt hóa học… đều có ảnh hưởng đến khả năng trương nở và hòa tan của tinh bột Tính chất này của tinh bột sắn phụ thuộc rất nhiều vào giống sắn, điều

kiện môi trường sống, thời điểm thu hoạch nhưng lại không có liên quan tới kích thước hạt hay trọng lượng phân tử của tinh bột Tinh bột sắn dạng paste có độ trong cao do có khả năng trương nở tốt và xu thế thoái hóa thấp Độ trong cao và tính không vị của tinh bột sắn được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để làm nhân bánh, nước sốt trong các món salad, tráng miệng… Khi làm nguội hồ tinh bột ở nồng độ cao, các phân tử polysaccharide có thể tạo ra một dạng cấu trúc gel Cấu trúc gel của tinh bột sắn có độ bền cao hơn so với nhiều loại tinh bột ngũ cốc khác nên có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, đặc biệt đối với các sản phẩm phải bảo quản trong thời gian dài

2.1.2.2 Chất thải của các nhà máy sản xuất tinh bột sắn và vấn đề môi trường

Chất thải của nhà máy sản xuất tinh bột sắn chủ yếu là bã sắn và nước thải Trong thực tế sản xuất, 1 tấn củ sắn tươi sản xuất ra được khoảng 400 kg bột và 200 kg

bã sắn Và trong quy trình sản xuất từ công đoạn rửa củ đến quá trình tách tinh bột khỏi

củ sắn cần một lượng nước lớn, tính trung bình thì để sản xuất ra một tấn tinh bột sắn

sẽ tạo ra 15m3 nước thải có chỉ số COD, BOD cao

Một trong những điểm cần chú ý là nước thải từ các nhà máy chế biến tinh bột sắn có chứa hàm lượng cyanide cao Cyanide là một hợp chất độc hại gây nhiều khó khăn trong quá trình xử lý nước thải Do là chất độc đối với người và động vật (giới hạn cho phép 0.5 – 3.5 mgCN-/kg thể trọng) nên nồng độ cyanide cho phép trong nước sạch không vượt quá 0,01ppm

Ngoài ra, trong nước thải còn có hàm lượng chất rắn cao, một lượng đường khử, nitrogen và phosphorus đáng kể Lượng acid HCN giải phóng ra trong quá trình tách tinh bột sắn làm pH của nước thải có giá trị acid trong khoảng 4.5 – 4.7

Nhiều dạng vi sinh vật cũng được tìm thấy trong nước thải của các nhà máy sản xuất tinh bột sắn như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và Actinomycetes (bảng 2.2) Lượng vi khuẩn và nấm men được tìm thấy nhiều hơn trong nước thải ở những giai

đoạn sau của quá trình sản xuất, trong khi nấm mốc và Actinomycetes lại xuất hiện nhiều trong nước thải chính của nhà máy Nguyên nhân do sự có mặt của các chất xơ cellulose trong nước thải ở những giai đoạn sản xuất đầu tiên đã kích thích sự phát triển của loại vi sinh vật này

Bảng 2.2: Các nhóm vi sinh vật tìm thấy trong nước thải của nhà máy chế biến tinh bột

sắn

Vi sinh vật Nước thải chính

(nhà máy sx lớn)

Nước thải phụ (nhà máy sx lớn)

Nước thải phụ (nhà máy sx nhỏ)

Vi khuẩn tạo bào tử

Vi khuẩn không tạo bào tử

- + +

- + +

+ + + + + +

- + + + + + Nấm mốc

- + +

+ + +

- +

+ +

-

- +

+ + +

+ + +

Bảng 2.3: Tổng vi sinh vật trong nước thải từ nhà máy chế biến tinh bột sắn

Nước thải trong sản xuất tinh bột và tinh bột biến tính thường chứa hàm lượng đường tương đối cao và được tận dụng trong sản xuất ethanol, acid citric nhờ A niger Protein đơn bào cũng được sản xuất bằng cách lên men hỗn hợp Candida utilis và Endomycopsis fibuliger Nước thải ở các nhà máy lớn sản xuất tinh bột và đường thường có chỉ số BOD 13.200 – 14.300 mg/l Tại sao cơ sở sản xuất nhỏ, mức BOD và COD thấp hơn, tương ứng là 3.600 – 7.050 mg/l và 3.800 – 9.050 mg/l nhờ lên men phối hợp hai chủng nấm men với các chế độ khuấy trộn, sục khí ở pH và nhiệt độ thích hợp, COD, BOD giảm tương ứng 94% và 91% Hàm lượng protein đạt maximum sau

69 giờ lên men

Bã thải rắn trong công nghiệp sản xuất tinh bột sắn (thường chiếm khoảng 20% trọng lượng củ) còn được sử dụng rộng rãi làm thức ăn gia súc Nhờ lên men bằng một

số chủng như Cephalosporium eichhorniae hoặc Trichoderma harzianum, lượng protein thô trong bã có thể đạt tới trên 20% Phương pháp chủ yếu được sử dụng tại một số nước Đông Nam Á và Ấn Độ là phương pháp lên men trên môi trường bán rắn SSF (Solid State Fermentation) do đơn giản, dễ áp dụng tại các vùng nông thôn, giá thành sản phẩm thấp

2 2 Quá trình thủy phân tinh bột

2.2.1 Các enzym thủy phân tinh bột [3],[14]

2.2.1.1 α-amylase: (α-1,4 glucan-4-glucanhydrolase, 3.2.1.1)

α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm rất giống nhau, α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4 glucoside nằm ở phía trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polylose đồng loại) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào

cả Vì thế mà người ta gọi nó là enzym amylase nội phân (endoamylase) Khi tác dụng lên tinh bột enzym này giải phóng ra glucose ở dạng α-mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ rất chậm

Đặc tính của α-amylase

- α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzym α-amylase có ít methionine và có khoảng 7 – 10 gốc cysteine

- Tâm hoạt động của α-amylase có chứa các nhóm –COOH và NH3 amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng Protein của các α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globulin

α Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4.2 – 5.7

- Phân tử lượng của các α-amylase từ các nguồn khác nhau rất gần nhau: của nấm mốc 45,000 – 50,000, của malt: 59,000

- α-amylase là một metaloenzym (enzym cơ kim) Các α-amylase đều chứa từ 1 – 30 nguyên tử gam Ca/mol, song không ít hơn 1 – 6 nguyên tử gam Ca/mol Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzym thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất

Vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc của enzym, duy trì cấu hình hoạt động của enzym Ca còn có tác dụng bảo đảm cho α-amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzym phân giải protein

- α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác Người ta cho rằng đặc tính này của α-amylase có liên quan đến hàm lượng calcium trong phân tử của nó (α-amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt chứa canxi nhiều hơn amylase của nấm mốc 3 –

4 lần nên nó bền nhiệt hơn)

- Về cơ chế tác dụng, trong một thời gian khá dài người ta cho rằng amylase là enzym dextrin hóa điển hình, thủy phân tinh bột thành dextrin và chỉ tạo rất

α-ít đường Tuy nhiên gần đây người ta thấy trong nấm mốc có α-amylase vừa biểu lộ hoạt tính dextrin hóa cao vừa tạo ra một lượng lớn glucose và maltose

- Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4.5 – 4.8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH 4.5 – 5.8), của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5.3 (hoạt động tốt trong vùng pH từ 4.7 – 5.4) và của vi khuẩn là 5.8 – 6.0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5.8 – 7.0)

Cơ chế tác dụng của α-amylase

Sự thủy phân tinh bột của α-amylase trải qua nhiều giai đoạn:

- Trước tiên enzym này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh) Sau đó các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di- và monosaccharide

- Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 – 7 gốc glucose, (vì vậy mà người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 – 7 gốc glucopiranose một) Sau đó các polyglucose này lại bị phân cắt tiếp tục nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần

và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose, và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose

- Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự, nhưng

vì α-amylase không phân cắt được liên kết α-1,6 glucoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì trong sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose (8%)

Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase

- Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột α-amylase dextrin phân tử thấp

- Giai đoạn đường hóa:

Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa 2.2.1.2 β-amylase (α-1,4 glucan-mantohidrolase 3.2.1.2)

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, glycogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi là β-amylase

Đặc tính:

- β-amylase là một albumin Tâm xúc tác của nó chứa các nhóm –SH và nhóm –COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin β-amylase là enzym ngoại phân (enxoenzym), có ái lực với các liên kết α-1,4 glucoside cách đầu không khử của mạch một liên kết α-1,4

- Khác với α-amylase, nó rất bền khi không có Ca2+, β-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea, iodoacetamide, iodine, ozon,…

- pH tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β-amylase là 4.6 còn trong dung dịch nấu (không sôi) là 5.6

- β-amylase chịu nhiệt kém hơn α-amylase Nhiệt độ tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết 40 – 500C, song trong dịch nấu lại là 60 – 650C, β-amylase bị

vô hoạt hóa ở nhiệt độ 700C

Dextrin

Amylose

Maltose

α-amylase α-amylase

tetra- và trimaltose oligosaccharide maltotriose

di- và monosaccharide polyglucose

maltotetrose

Cơ chế tác dụng của β-amylase

Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng của cơ chất β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside

và được gọi là β-dextrin

Tác dụng của β-amylase lên tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau:

Nếu cho cả α-amylase và β-amylase cùng đồng thời tác dụng lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95%

Sự khác nhau giữa α-amylase và β-amylase khi xúc tác sự thủy phân tinh bột:

- β-amylase hầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bộ

- β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose

- β-amylase phân giải 54 – 58% amylopectin thành maltose

2.2.1.3 Glucoamylase (α-1,4 glucan-glucohydrolase,3.2.1.3)

Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân đã liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan Vì thế các nhà nghiên cứu Nhật Bản

đề nghị đặt cho nó một tên phân loại khác là α-1,4:1,6 glucan-4:6-glucohydrolase Nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ đề nghị này Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ Asp awamori Sau đó nó được tìm thấy Rhizopus delemar, Asp niger, Asp oryzae rồi ở các nhóm vi sinh vật khác và ở mô động vật Enzym mang

β-amylase

Tinh bột 54 – 58% maltose + 42 – 46% β-dextrin

(glucogen)

nhiều tên gọi khác nhau: glucoamylase, amyloglucozidase, taka-amylase Bac, amylase, matulase…

Đặc tính của glucoamylase

- Glucoamylase là enzym ngoại phân (enxoenzym) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide

- Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside nữa

- Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomaltose tới glucose Các cơ chất có cấu tạo phân nhánh (amylopectin, glycogen, β-dextrin) bị glucoamylase tấn công với vận tốc khá lớn

So với vận tốc thủy phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy rằng các polysaccharide phân tử lớn hơn bị thủy phân nhanh hơn là các chất phân tử thấp

- Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzym “acid” Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3.5 – 5.5 So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo vệ bằng

Ca2+

- Điều kiện hoạt động của các chế phẩm glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không giống nhau Các chế phẩm glucoamylase tách từ nấm sợi được nghiên cứu khá đầy đủ về ảnh hưởng của pH và nhiệt độ Đặc tính của glucoamylase tinh thể tách từ Asp awamori đã được xác định, khi so sánh tính chất của glucoamylase

từ Rh delemar và Asp niger ở dạng liên kết tinh, ta thấy chúng có những khác biệt lớn

- Tuy thế, glucoamylase của các giống nấm sợi Rhizopus và Aspergillus đều có độ ổn định cao đối với ion hydro Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất: glucoamylase từ Asp niger là 6.5; của glucoamylase từ Asp awamori là 7.5; của glucoamylase từ Rh delemar là 7.4

- Đa số các chế phẩm của glucoamylase của vi sinh vật (vi khuẩn, nấm sợi, nấm men) và của mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ở vùng acid trừ glucoamylase của Saccharomyces italicus và một số mô động vật (gan chuột, niêm mạc ruột non chuột) có pH hoạt động tối thích ở vùng trung tính Vì vậy, người ta phân loại glucoamylase có nguồn gốc động vật theo pH tối thích mà không theo đặc điểm tác dụng lên cơ chất; glucoamylase acid có pH hoạt động tối thích là 4.0 – 5.0; glucoamylase trung tính pH tối thích là 6.0 – 7.5

Cơ chế thủy phân của glucoamylase

Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng tác viên thấy rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” mà không phải theo cơ chế

“đơn mạch” Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzym glucoamylase như sau:

Khả năng thủy phân mạnh mẽ cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 và thậm chí cả liên kết α-1,3 glucoside nữa của glucoamylase để tạo thành glucose đã đưa enzym này lên vị trí hàng đầu về hiệu lực thủy phân tinh bột Vì thế việc dùng các chế phẩm glucoamylase tách từ các chủng vi sinh vật trong sản xuất rượu, bia, mật, tinh bột, glucose,… có một

ý nghĩa triển vọng vô cùng lớn lao

2.2.1.4 oligo-1,6-glucosilase hay dextrinnase tới hạn

Enzym này thủy phân các loại liên kết α-1,6 glucoside trong isomaltose, panose

và các dextrin tới hạn và có thể chuyển hóa các cơ chất này đến các đường lên men được

Tinh bột hay oligosaccharide

Có tác giả thu enzym này dưới dạng kết tinh , nhưng sự tồn tại của nó vẫn chưa được chứng minh triệt để Ngoài oligo-1,6-glucosilase ra, phức hệ dextrinnase của hạt cốc nảy mầm, của mô động vật và nấm men, còn có chứa amylopectin-6-glucosidase hay R-enzym (amylopectin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.9) và dextrin-1,6-glucosidase hay amylose-1,6-glucosidase (dextrin-6-glucanhydrolase, 3.2.1.3.3), cả hai enzym này đều phân cắt các liên kết α-1,6 glucoside trong amylopectin, glycogen và dextrin tới hạn Chúng thủy phân dextrin sâu sắc hơn là α,β-amylase, do vậy mà maltose tích tụ nhiều trong dịch thủy phân Các dextrinnase hoạt động tối thích ở nhiệt độ 400C và pH 5.1

Ngoài các enzym được kể trên, trong họ hàng amylase còn có các enzym đồng loại nữa Dưới đây sẽ điểm qua một vài enzym đó

2.2.1.5 Pullulanase

Ở vi khuẩn Aerobacter aerogenes người ta tìm thấy các enzym có khả năng thủy phân liên kết α-1,6 glucoside trong các polyose và oligosaccharide kiểu tinh bột và glycogen Cơ chất đặc thù của enzym này là pullulan – một polysacharide được tách ra

từ giả nấm men Aureobasidium pullulana sym Pullulasia pullulans Vì vậy mà enzym này được gọi là pullulanase Phân tử lượng của nó là 145,000, chế phẩm enzym thu được khi kết tủa bằng acetone có pH hoạt động tối thích là 5.0 và nhiệt độ tối thích là 47.50C Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside

2.2.1.6 α-glucosidase hay maltose (α-D,glucoside-glucohydrolase,3.2.1.20)

Nhiều loại nấm sợi sản sinh enzym này Giống như glucoamylase, nó thủy phân maltose thành glucose nhưng không thủy phân tinh bột Một số tác giả cho rằng nó còn

có hoạt tính glucosyltransferase, tức là có khả năng chuyển các gốc glucosyl sang đường và rượu Khi nghiên cứu cặn kẽ về tính chất của maltase tách từ canh trường bề mặt của Asp oryzae, các nhà nghiên cứu Nhật cho biết rằng maltase và

glucozyltransferase là một enzym đồng nhất vừa có khả năng thủy phân liên kết α-1,4, trong các glucopiranoside vừa có khả năng chuyển các gốc glucose sang đường và rượu

2.2.1.7 Transglucosyldase

Ở nhiều loại nấm sợi Aspergillus, transglucosyldase luôn luôn tương tác với glucoamylase Nó có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân Vì thế sự có mặt của nó thường gây nhằm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase Transglucosyldase thực hiện việc chuyển các gốc glucosyl sang các nhóm mono, di- và oligosaccharide, xúc tác tạo thành các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside Pazur đã tách được enzym này từ Asp niger bằng phương pháp sắc ký hấp thụ trên DEAE-cellulose và cho biết cơ chế tác dụng của nó Transglucosyldase không những chỉ thủy phân maltose thành glucose

mà còn tổng hợp izomaltose, izotriose và panose, tức là có khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết α-1,6 để tạo thành panose hoặc izomaltose

Rodzevit và Butova (1965) tìm thấy canh trường nấm sợi Asp niger và Asp oryzae, Asp awamori có glucosyltransferase, đồng thời cho biết rằng này xúc tác sự tổng hợp các oligosaccharide với các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ maltose Các tác giả cho rằng, trong các vi sinh vật trên có hai hệ transglucosyldase Một hệ tổng hợp các sản phẩm có liên kết α-1,4 glucoside kiểu maltose và chuyển các gốc glucose

từ maltose tới vị trí C thứ 4 của gốc glucose cuối: n-maltose-(1,4-α-glucose)n + glucose Một hệ chuyển các gốc glucose tới vị trí C thứ 6 khi tổng hợp các sản phẩm kiểu isomaltose: n-maltose-(1,6-glucose)n + n-glucose Hệ thứ nhất bền ở pH 8.5 còn

n-hệ thứ hai vô hoạt hoàn toàn ở pH này trong hai giờ Ở pH 3.3 trong thời gian một giờ, hoạt lực transglucosyldase của cả hai hệ đều không thay đổi Transglucosyldase của nấm sợi bị vô hoạt hoàn toàn ở pH = 1.9 – 2.0 sau 24h Các chủng nấm sợi khác nhau

thì khác về hoạt lực transglucosyldase, các loài Rhizopus có ưu thế hơn các loài Aspergillus là không tạo transglucosyldase

Sự có mặt của transglucosyldase trong các chế phẩm amylase (dùng trong công nghiệp mật, tinh bột, đường glucose, công nghiệp rượu,…) là điều không mong muốn Glucoamylase xúc tiến thủy phân tinh bột, còn transglucosyldase lại tổng hợp các isosaccharide từ các sản phẩm thủy phân này, do đó nó làm giảm bớt mức độ thủy phân sâu sắc tinh bột và làm cho dịch thủy phân có vị đắng

2.2.2 Quá trình thủy phân tinh bột [1]

2.2.2.1 Thủy phân tinh bột bằng acid

Acid được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất dextrin (rang khô tinh bột với acid), maltodextrin và một vài loại xi-rô có giá trị DE khoảng 40 Sản phẩm có DE thấp thường bị thoái hóa do thủy phân không hoàn hảo, còn sản phẩm có DE cao hơn lại có

độ ổn định màu và vị kém Quá trình được tiến hành trong thiết bị liên tục hoặc gián đoạn trong 15 – 20 phút, nồng độ tinh bột 35 – 40%, nồng độ HCl 0.015 – 0.2N, nhiệt

độ 140 – 1600C Sau khi giá trị DE đạt giá trị DE yêu cầu, sản phẩm được trung hòa bằng carbonate sodium

Sử dụng acid để thủy phân tinh bột có một số hạn chế như hiệu suất thủy phân thấp, dung dịch sau thủy phân bị nâu hóa mạnh và có nhiều sản phẩm phụ không mong muốn dẫn đến chi phí để tinh sạch cao

Ngoài ra, việc sử dụng các chất hóa học như acid mạnh còn gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái và gây ra nhiều khó khăn trong việc xử lý nước thải

2.2.2.2 Thủy phân tinh bột bằng enzym

Dịch hóa tinh bột

Quá trình dịch hóa tinh bột được thực hiện hoàn toàn bằng acid cho tới những năm 60 – 70 của thế kỷ 20 Cho đến khi α-amylase bền nhiệt được sản xuất, dịch hóa tinh bột bằng enzym được nghiên cứu và sử dụng trong phần lớn các quy trình công

nghiệp sản xuất đường glucose và fructose Cho đến nay, dịch hóa bằng acid vẫn tiếp tục được sử dụng trong sản xuất maltodextrin và một vài loại xi-rô

Mục đích của quá trình dịch hóa là chuyển hệ huyền phù các hạt tinh bột thành dạng dung dịch hòa tan chứa các dextrin có chiều dài mạch ngắn hơn Để đảm bảo loại

bỏ hoàn toàn các phức lipid-amylose, nhiệt độ hồ hóa tinh bột phải vượt quá 1000C Việc tìm ra các enzym bền nhiệt có thể chịu được nhiệt độ 1050C như α-amylase của Bacillus licheniformis đã giúp giảm chi phí gia nhiệt cho quá trình gia nhiệt và thủy phân lần 2, tuy nhiên các enzym này có nhược điểm là không thể hoạt động ở độ pH thấp hơn 5.9 do độ bền nhiệt của chúng giảm ở pH thấp

Trong quá trình dịch hóa, độ pH của dịch tinh bột cần phải được điều chỉnh về vùng trung tính, thêm Ca2+ để tăng độ bền của enzym, sau đó độ pH lại được điều chỉnh về vùng acid phù hợp với pHopt của quá trình đường hóa, do đó sẽ làm tăng chi phí tinh sạch sản phẩm bằng sắc ký trao đổi ion để loại bớt các ion kim loại

Một α-amylase có khả năng thủy phân tinh bột ở nhiệt độ cao, pH thấp là giải pháp giảm giá thành, đơn giản hóa quá trình và giảm các sản phẩm phụ tạo ra ở pH cao (như maltulose) Hiện nay các nghiên cứu về amylase từ các chủng bền nhiệt, đặc biệt các chủng vừa bền nhiệt vừa bền acid (thermoacidophile) có rất nhiều triển vọng Tuy nhiên chưa có một sản phẩm enzym nào vừa bền nhiệt vừa bền acid được sản xuất dưới dạng thương phẩm

Các phương pháp sử dụng enzym trong dịch hóa tinh bột được tổng kết trong bảng 2.4 dưới đây

Thủy phân – gia nhiệt – thủy phân là quá trình dịch hóa được sử dụng đầu tiên trong công nghiệp với α-amylase từ B subtilis Sau khi thủy phân sơ bộ ở nhiệt độ 85 –

880C tới giá trị DE 4 – 8, dung dịch thu được cần gia nhiệt tới 130 – 1400C để hòa tan hoàn toàn các gốc tinh bột như phức acid béo/amylase Do α-amylase từ B subtilis chỉ

có khả năng chịu nhiệt tới 900C, việc gia nhiệt sẽ gây mất hoạt tính enzym nên sau đó, một lượng enzym khác phải thêm vào để tiếp tục quá trình thủy phân

Bảng 2.4: Quá trình dịch hóa tinh bột trong công nghiệp Quá trình Chuẩn bị Gia nhiệt 1 Thủy phân 1 Gia nhiệt 2 Thủy phân 2

145 – 1500C

15 – 60 giây

95 – 1000C Alpha – L/St

85 – 950C Alpha – L/St

Dịch hóa ở

nhiệt độ cao

[S] 30 – 35%

thêm calcium nếu cần, không điều chỉnh pH

150 – 1600C

4 – 8 phút

95 – 1000C

pH 5,6 – 6,2 Alpha – L/St

Chú thích:

[S]: nồng độ cơ chất; [Ca]: nồng độ ion calcium

Alpha-S: α-amylase của B subtilis

Alpha-L/St: α-amylase của B licheniformis hoặc B stearthermophilus

Quá trình thủy phân ở nhiệt độ cao 95 – 1000C được tiến hành khi α-amylase của B lincheniformis và B stearothermophilus được thương mại hóa Các enzym này

có khả năng chịu nhiệt và acid cao hơn, sự phụ thuộc vào Ca2+ cũng thấp hơn so với

α-amylase từ B subtilis Hiện nay, đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm tinh bột thủy phân và được coi là phương pháp hữu hiệu để sản xuất đường glucose

Phương pháp thủy phân 2 lần được sử dụng ở Châu Âu trong một số trường hợp sản xuất xi-rô với mục đích tăng khả năng lọc của sản phẩm Enzym bền nhiệt được sử dụng để thủy phân tinh bột tới DE 4 – 8, sau đó đun nóng tới nhiệt độ khoảng 1400C, làm nguội, thêm enzym và thủy phân tiếp bước 2 Phương pháp dịch hóa ở nhiệt độ cao được thực hiện bằng việc hồ hóa tinh bột trước ở nhiệt độ cao để giảm độ nhớt, sau đó enzym được thêm vào và quá trình thủy phân xảy ra ở nhiệt độ 95 – 1000C tới khi đạt giá trị DE yêu cầu

Sản phẩm của quá trình dịch hóa là các maltodextrin được lọc, tẩy màu, sau đó

cô đặc hoặc sấy phun Dung dịch dextrin cũng có thể tiếp tục được đường hóa để thu các sản phẩm khác

Đường hóa tinh bột

Trong giai đoạn đường hóa, dịch thu được sau quá trình dịch hóa được tiếp tục thủy phân tới glucose, maltose hay các oligosaccharide Tùy thuộc vào tính chất sản phẩm của sản phẩm cuối cùng mà các enzym được sử dụng có thể là GA, β-amylase, α-amylase tạo maltose từ nấm mốc hay amylase tạo oligosaccharide…

Cơ chất tối ưu hóa cho quá trình đường hóa là các dextrin DP 8 – 12 Để đường hóa tiếp tục bằng GA, pH của dung dịch được giảm xuống 4.2 – 4.5 Việc thay đổi pH

có hai mục đích: ngừng phản ứng của α-amylase để giữ chiều dài mạch tối ưu và đưa

pH về giá trị pHopt của enzym đường hóa Dịch thu được sau quá trình dịch hóa cũng cần được làm nguội tới nhiệt độ tối ưu của enzym đường hóa (đối với GA là 600C)

Khó khăn thường gặp trong quá trình này là khả năng thủy phân kém các liên kết α-1,6 của các enzym đường hóa làm hiệu suất thủy phân thấp và hiện tượng chuyển gốc glucose (transglucosidation) tạo ra các sản phẩm phụ như isomaltose Chìa khóa

thành công là sử dụng kết hợp các enzym thủy phân liên kết nhánh có pH và nhiệt độ tối ưu giống với enzym đường hóa Trong trường hợp này, hiệu suất của quá trình có thể tăng lên 94 – 95.5% Để đảm bảo tính kinh tế, nồng độ cơ chất ban đầu thường vào khoảng 30 – 35% dẫn tới nồng độ sản phẩm glucose cao (có thể đạt 95%) Ở nồng độ này, GA có xu hướng xúc tác phản ứng tạo các sản phẩm ngược Giải pháp của vấn đề này là lựa chọn nồng độ enzym, nhiệt độ và thời gian phản ứng phù hợp Khi đó hiện tượng biến tính enzym do nhiệt (dẫn tới còn ít hoạt tính enzym trong giai đoạn cuối của quá trình đường hóa) sẽ hạn chế phản ứng ngược tạo các sản phẩm phụ không mong muốn Tăng độ bền nhiệt của enzym đường hóa cho phép quá trình tiến hành trong thời gian ngắn ở nhiệt độ và nồng độ cơ chất cao là mục đích của các nghiên cứu trong tương lai

2.2.2.3 Thủy phân tinh bột sống chưa hồ hóa

Khi chưa hồ hóa tinh bột tồn tại dưới dạng các hạt có cấu trúc bán tinh thể Các hạt tinh bột này không tan trong nước và bền vững với nhiều chất hóa học cũng như enzym Hồ hóa trước tinh bột bằng nhiệt giúp các phản ứng dịch hóa, đường hóa xảy ra

dễ dàng hơn và được dùng như một quá trình bắt buộc trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm tinh bột thủy phân Tuy nhiên chhi phí cho việc hồ hóa tinh bột bằng nhiệt rất tốn kém nên việc sử dụng các enzym thủy phân tinh bột ở dạng hạt chưa hồ hóa đang rất được quan tâm

Aspergillus sp K-27 sản xuất một hệ α-amylase và GA ngoại bào tác dụng đồng thời lên tinh bột bắp và tinh bột khoai tây sống Hệ amyloglucosidase của A awamori

có hoạt tính cắt liên kết nhánh, có khả năng hấp thụ trên bề mặt hạt tinh bột và thủy phân chúng Khả năng hấp thụ lên tinh bột thường phụ thuộc vào pH, đối với enzym này, tại pH đẳng điện (pI = 3.4) khả năng gắn lên hạt tinh bột là lớn nhất một vài nghiên cứu đã thử nghiệm sản xuất cồn từ tinh bột sống bằng quá trình một bước bao gồm cả dịch hóa, hồ hóa và lên men nhờ sử dụng enzym từ A niger và Rhizopus sp

α-Αmylase từ một số vi khuẩn cũng có thể thủy phân tinh bột sống Amylase từ chủng Lactobacillus amylovorus có thể hấp phụ lên bề mặt hạt tinh bột khoai tây và thủy phân chúng α-Amylase của Clostridium butyricum ở nhiệt độ 500C, pH 5.0 bắt đầu thủy phân bằng việc tạo những chỗ lõm ở các vùng ngoại vi của bề mặt hạt tinh bột sau đó tấn công sâu dần vào bên trong

Những thay đổi hình thái của hạt tinh bột đã được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Sự thay đổi trên bề mặt hạt dường như có liên quan đến cấu trúc xốp và kích thước các lỗ cho phép sự thâm nhập của enzym Khả năng thủy phân hạt tinh bột sống phụ thuộc vào nguồn tinh bột cũng như enzym Sự liên kết giữa hai thành phần amylose, amylopectin và cấu trúc tinh thể là những yếu tố ảnh hưởng tới khả năng thủy phân tinh bột sống của amylose

Quan sát trên SEM cũng có thể thấy được một phần cơ chế tấn công và thủy phân hạt tinh bột sắn sống α-amylase từ vi khuẩn B subtilis SH1 tấn công hạt tinh bột sắn theo diện rộng bằng cách tạo nhiều lỗ nhỏ còn GA từ nấm mốc A kawasaki lại có

xu hướng tạo những lỗ lớn và sâu trên bề mặt hạt tinh bột Lượng đường khử tạo ra trong dung dịch hạt đạt mức cao nhất 5.5 mg/ml khi sử dụng GA từ A kawasaki

Trong những nghiên cứu từ cuối những năm 1990, Colonna cho rằng, enzym tấn công tinh bột từ hạt một còn acid thì lại tấn công đồng thời tất cả các hạt Trong điều kiện thực nghiệm, các quan sát trên kính hiển vi điện tử cũng cho thấy, dường như các amylase không tấn công các hạt tinh bột sắn đồng thời cùng một lúc Có thể thấy nhiều hạt tinh bột với những dấu hiệu bị thủy phân rõ ràng bên cạnh những hạt tinh bột còn gần như nguyên vẹn Hiện tượng trên có thể giải thích bởi bản chất của “tính tiếp cận”, hay sự tiếp cận chưa đồng đều trong dung dịch; do phân tử lượng của amylase lớn hơn acid quá nhiều nên sự tiếp cận của phân tử enzym với cơ chất bị hạn chế

Khi sử dụng đồng thời cả hai enzym, α-amylase sẽ cắt mạch tinh bột tại một số điểm ngẫu nhiên làm lộ ra các đầu không khử, tạo điều kiện dễ dàng cho sự tấn công