Khảo sát quá trình lên men bởi corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng lên men thu nhận l lysine

Ứng dụng chế phẩm cố định trên chất mang A-BC trong lên men thu nhận L-lysine theo mẻ: số lần tái sử dụng: 12 lần, và sản lượng L-lysine trong 12 lần tái sử dụng đạt 27,77 g/L không khá

-

TRẦN THỊ MINH TÂM

Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng

dụng lên men thu nhận L-lysine

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2009

Đề tài: “Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự

do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine”

Đề tài thu được các kết quả như sau:

1 Điều kiện tối ưu thu nhận L-lysine là: môi trường lên men: dịch bắp 20%,

glucose 8,35%, biotine 1,57mg/L, urease 0,74%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,025%, thiamine 4mg/L; điều kiện lên men: giống bổ sung 3% (chất lượng giống 2.108 tế bào/mL), pH 7.0, nhiệt độ 300C, lắc 200 vòng/phút; sản lượng L-lysine đạt được là:

28 g/L tăng 5,5 lần so với khảo sát ban đầu ở cùng thời gian lên men (72 giờ)

2 Cũng với điều kiện như trên, khi lên men trong fermentor tự động (khuấy đảo

300 vòng/phút, dO2 = 100%) thì sản lượng L-lysine đạt được là: 32,6 g/L tăng gấp 1,25 lần so với điều kiện lên men theo mẻ và tăng gấp 6,4 lần so với khảo sát ban đầu trong cùng thời gian lên men

3 Trong 3 loại chất mang khảo sát (Alginate, Bacterial Cellulose và phức Alginate

– Bacterial Cellulose), phức chất mang Alginate – Bacterial Cellulose (A-BC) có ưu thế nhất Điều kiện cố định trên chất mang A-BC là: dịch alginate 3% và tế bào

C.glutamicum đồng nhất với mật độ 1010 tế bào/mL; BC hấp phụ dịch giống bằng máy lắc 200 vòng/phút trong 30 phút; bổ sung chất hỗ trợ gel CaCl2 2%; thời gian ủ

3 ngày, nhiệt độ ủ 300C; thì lượng vi khuẩn cố định trên phức chất mang đạt được là: mật độ trung bình: 8,7.109 tế bào/g; mật độ vi khuẩn trên bề mặt ngoài chất mang: 4,8.104 tế bào/cm2; mật độ vi khuẩn bên trong chất mang: 4,2.104 tế bào/cm2

4 Ứng dụng chế phẩm cố định trên chất mang A-BC trong lên men thu nhận

L-lysine theo mẻ: số lần tái sử dụng: 12 lần, và sản lượng L-lysine trong 12 lần tái sử dụng đạt 27,77 g/L không khác biệt lớn so với lên men tế bào tự do (kết quả được

so sánh với phương pháp định lượng lysine bằng đo mật độ quang, sản lượng mẫu đối chứng là 28 g/L)

Một phần các kết quả trên được công bố qua bài báo:

Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Ứng dụng vi khuẩn

Corynebacterium sp cố định trong lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa học và

My thesis: “The survey of fermentation process by free and immobilized

Corynebacterium glutamicum to uptaking L-lysine”

The results are given as follows:

1 Optimal conditions for producing L-lysine in batch: medium: maize juice 20%,

glucose 8,35%, biotine 1,57mg/L, urease 0,74%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,025%, thiamine 4mg/L; cultural conditions: cultural rate 3% (cultural quality 2.108CFU/mL), pH 7.0, 300C, round - shake 200 rpm; the yield is 28 g/L raise 5,5 folds than the first survey in the same fermenting time

2 However, the L-lysine yield, when we fermented it in automatic fermentor

(agitate 300 rpm, dO2 = 100%), is 32,6 g/L raise 1,25 folds than the batch fermentation in the same fermenting time

3 In 3 carriers (A, BC, A-BC), the A-BC is the most advanteged carrier The

optimal conditions of immobilized C glutamicum in A-BC carrier are: Alginate solution 3% and C.glutamicum cells with colony density 1010CFU/mL; BC absorbs

C.glutamicum cells by round – shake 200 rpm in 30 minutes; adding CaCl2 2%; expand conditions:3 days in 300C With these conditions, the immobilized cell in the A-BC carrier is given:

Medium cells density: 8,7.109 CFU/g

Cells density in the surface of the carrier: 4,8.104 CFU/cm2

Cells density in the internal carrier: 4,2.104 CFU/cm2

4 The effect of using C.glutamicum immobilized in A-BC for producing L-lysine

was high; it could be reused about 12 times and lysine yield is 27,77 g/L, the quality

of L-lyine remained rather good against control experiments

Some results are presented in the Journal: Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị

Minh Tâm (2009), “Immobilizing Corynebacterium sp cell and application for producing L-lysine”, Journal of Science & Technology, No 70, pages 96 -100

Đầu tiên, tôi xin gởi lời cảm ơn đến Trường Đại học Bách khoa, Khoa Công nghệ Hóa học và Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Con xin gởi lời tri ân đến Ba, Má đã nuôi dưỡng, dạy bảo con từ những điều nhỏ nhất và ba, má luôn luôn là chỗ dựa vững chắc cho con đi suốt cuộc đời này

Con xin chân thành cảm ơn dì Út đã luôn luôn động viên, chia sẽ và sẵn sàng giúp đỡ con vượt qua những khó khăn trong cuộc sống Hai cảm ơn các em (Bé ba, bốn, năm, Ý, Linh) đã tạo động lực giúp Hai hoàn thành tốt nhiệm vụ to lớn này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy TS Trần Viết Mỹ, người đã động viên, khuyến khích em theo đuổi ước mơ và luôn luôn chỉ bảo em mỗi khi em gặp khó khăn trong học tập và trong cuộc sống

Xin gởi lời cảm ơn đến Thầy TS Nguyễn Quốc Bình và các Thầy cô khác đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Bách khoa

Xin cảm ơn các Thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học

đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn bạn Lê Thị Chi đã luôn luôn bên cạnh tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại học bách khoa Bạn Chi đã giúp đỡ tôi rất nhiều cả về học tập, lẫn tinh thần Xin cảm ơn những người bạn đã cùng tôi học tập, cùng trao đổi, động viên và sẵn sàng giúp đỡ tôi khi cần thiết

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn anh “Ròm” luôn đặt niềm tin ở tôi, luôn động viên, giúp đỡ và điểm tựa cho tôi trong suốt thời gian qua

Trần Thị Minh Tâm

Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc đến

cô TS Nguyễn Thúy Hương Người đã giúp đỡ tôi rất nhiều từ những ngày mới bước chân vào trường Cô đã giúp tôi tự tin để bắt đầu bước vào lĩnh vực mới, một chuyên ngành mới và dấu ngoặc mới về chuyên môn đã thay đổi từ những ngày đầu tiên gặp cô

Trong suốt quá trình học tập tại trường, cô luôn tạo cho tôi nhiều cơ hội để phát huy khả năng của mình, và khắc phục những điểm yếu của bản thân

Cô đã giúp tôi xây dựng phương hướng, mục tiêu cũng như hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại trường Từ những khái niệm sơ khai có được, cô đã giúp tôi nắm bắt kịp cùng bạn bè

Cô đã giành rất nhiều thời gian cho tôi, giúp tôi viết báo, đăng báo và giúp tôi hoàn thành luận văn này

Không những về chuyên môn, cô còn là người mẹ, người bạn của tôi Cô luôn động viên, chia sẽ, giúp tôi vượt qua và hoàn thành nhiệm vụ tốt nhất

Tôi không biết phải viết như thế nào để bày tỏ lòng biết ơn xứng đáng cho những gì cô dành cho tôi Tất cả tôi khắc ghi trong trái tim bé nhỏ của mình Khắc ghi mãi mãi

Tôi xin hứa sẽ chăm lo học tập và xây dựng cho riêng mình một hướng đi như mong ước của cô Tôi sẽ cố gắng hoàn thiện mình, hoàn thiện trong cách học tập, cách sống và cách để sẽ chia

Một lần nữa, tôi xin chân thành biết ơn cô – TS Nguyễn Thúy Hương

Trần Thị Minh Tâm

- -oOo -

Tp HCM, ngày tháng năm

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: TRẦN THỊ MINH TÂM Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh : 30/ 08/ 1983 Nơi sinh : Quảng nam

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học MSHV: 0310.7771

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2007

1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự

do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu, thiết lập các thí

nghiệm tối ưu để thu được sản lượng lysine cao nhất, ứng dụng lên men trên

fermentor bởi tế bào tự do và chế phẩm cố định Nội dung nghiên cứu bao gồm: Khảo sát các điều kiện tối ưu lên men thu nhận lysine

Ứng dụng điều kiện tối ưu lên men trên fermentor

Khảo sát điều kiện cố định tế bào trên một số chất mang

Ứng dụng chế phẩm cố định lên men trong điều kiện tối ưu theo mẻ

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 6/2008

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 8/2009

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

(Họ tên và chữ ký) QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh

-

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG -

Cán bộ chấm nhận xét 1: -

-

Cán bộ chấm nhận xét 2: -

-

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày …… tháng …… năm ……

-

TRẦN THỊ MINH TÂM

Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng

dụng lên men thu nhận L-lysine

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ Hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THUÝ HƯƠNG

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2009

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 2

1.1.1 Lịch sử và phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn C glutamicum 2

1.1.3 Đặc điểm di truyền của vi khuẩn C glutamicum 3

1.1.4 Sự chuyển hóa vật chất trong C glutamicum 3

1.2 AMINO ACID LYSINE 6

1.2.1 Giới thiệu 6

1.2.2 Đặc điểm 7

1.2.3 Sinh tổng hợp L-lysine 7

1.2.3.1 Cụm gen sinh tổng hợp L-lysine 7

1.2.3.2 Quá trình tổng hợp và điều hòa sinh amino acid lysine 8

1.2.4 Lên men thu nhận L-lysine 10

1.2.4.1 Ảnh hưởng của chủng sản xuất 10

1.2.4.2 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng 12

1.2.4.3 Ảnh hưởng của một số điều kiện ngoại cảnh 12

1.2.4.4 Kỹ thuật lên men thu nhận amino acid lysine 13

1.3 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT 14

1.3.1 Định nghĩa cố định tế bào vi sinh vật 14

1.3.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 14

1.3.2.1 Phân loại phương pháp cố định tế bào 14

1.3.2.2 Chất mang cố định tế bào vi sinh vật 15

1.3.3 Những chất mang sử dụng liên quan đến đề tài 16

1.3.3.1 Chất mang Alginate 16

1.3.3.2 Chất mang Bacterial Cellulose (BC) 17

1.4.1 Khái niệm và phương pháp 18

1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình sấy khô 20

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI 21

1.5.1 Những nghiên cứu trong nước 21

1.5.2 Những nghiên cứu ngoài nước 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG 27

2.1.1 Giống vi sinh vật 27

2.1.2 Môi trường nuôi cấy 27

2.1.3 Vật liệu, hóa chất 28

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 28

2.2 NỘI DUNG THÍ NGHIỆM 28

2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 30

2.3.1 Kiểm tra và chọn giống 30

2.3.2 Tối ưu các điều kiện lên men 31

2.3.2.1 Khảo sát các điều kiện lên men 31

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbon 32

2.3.2.3 Tối ưu các thành phần môi trường bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 33

2.3.3 Khảo sát các điều kiện lên men trên fermentor 35

2.3.4 Tăng hiệu suất lên men bằng phương pháp cố định tế bào 36

2.3.4.1 Cố định tế bào trên chất mang Alginate : phương pháp nhốt 36

2.3.4.2 Cố định tế bào trên chất mang Bacterial Cellulose (BC): phương pháp bẫy – bẫy hấp phụ 37

2.4.1 Phương pháp vi sinh 39

2.4.1.1 Kiểm tra hình thái vi sinh vật [10] 39

2.4.1.2 Kiểm tra mật độ tế bào 39

2.4.1.3 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang 40

2.4.2 Phương pháp hóa sinh 40

2.4.2.1 Kiểm tra giống bằng phương pháp sinh hóa 40

2.4.2.2 Phân tích định tính amino acid trong dịch lên men bằng phương pháp sắc ký giấy: phương pháp Lumir Macholan và cs (1962) 40

2.4.2.3 Phân tích định lượng sơ bộ amino acid trong dịch lên men bằng phương pháp đo mật độ quang: phương pháp của Vogel và Shimura (1968) 41

2.4.2.4 Phân tích định lượng lysine bằng phương pháp GC EZ faast: 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 GIỐNG VI SINH VẬT 43

3.1.1 Nguồn giống vi sinh vật 43

3.1.2 Đặc điểm sinh học của chủng Corynebacterium glutamicum 43

3.2 TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN L-LYSINE 46

3.2.1 Khảo sát các các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 46

3.2.2 Ảnh hưởng các nguồn cacbon đến quá trình lên men 50

3.2.3 Tối ưu thành phần môi trường bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 51 3.3 LÊN MEN TRÊN FERMENTOR 56

3.3.1 Ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine 56

3.3.2 Ảnh hưởng của lượng oxy cung cấp đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine 57

3.4 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO C.GLUTAMICUM TRÊN CÁC CHẤT MANG 58

3.4.1 Cố định tế bào C.glutamicum trên chất mang Na-Alginate bằng phương pháp nhốt tạo gel 58

3.4.1.1 Khảo sát nồng độ Na-Alginate ảnh hưởng đến quá trình cố định 58

3.4.1.2 Khảo sát nồng độ CaCl2 ảnh hưởng đến khả năng tạo hạt Alginate 59

3.4.2 Cố định trên chất mang Bacterial Cellulose (BC) bằng phương pháp bẫy –

bẫy hấp phụ 61

3.4.2.1 Khảo sát chế độ khuấy đảo ảnh hưởng đến quá trình cố định 61

3.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình cố định 62

3.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình cố định 62

3.4.3 Cố định trên phức chất mang A - BC bằng phương pháp kết hợp nhốt và bẫy bẫy hấp phụ 63

3.4.4 Năng suất L-lysine sau những lần tái sử dụng và tỷ lệ rửa trôi của các chế phẩm so sánh với sản lượng lysine được định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang (mục 3.2) 65

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 68

4.2 KIẾN NGHỊ 69

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các chủng đã nghiên cứu lên men thu nhận lysine 11

Bảng 1.2 Các chủng C.glutamicum tái tổ hợp đã nghiên cứu lên men để thu nhận lysine 11

Bảng 2.1 Thành phần môi trường 27

Bảng 2.2 Thống kê các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong đề tài 28

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng và tăng lysine của C.glutamicum theo thời gian 31

Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện lên men 32

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng các nồng độ cacbon 33

Bảng 2.6 Bố trí các mức thí nghiệm tối ưu 34

Bảng 2.7 Bố trí ma trận thí nghiệm tối ưu 34

Bảng 2.8 Bố trí thí nghiệm khảo sát lượng oxy hòa tan 35

Bảng 2.9 Bố trí thí nghiệm tối ưu cố định tế bào trên chất mang Alginate 36

Bảng 2.9 (tiếp theo) Bố trí thí nghiệm tối ưu cố định tế bào trên chất mang Alginate 37

Bảng 2.10 Bố trí thí nghiệm tối ưu cố định tế bào trên chất mang BC 38

Bảng 3.1 Đặc điểm sinh học của chủng C glutamicum VTCC-B-656 43

Bảng 3.2 Ma trận tối ưu toàn phần và chỉ tiêu theo dõi là lượng lysine sinh ra sau 72 giờ lên men 52

Bảng 3.3 Phân tích thí nghiệm ở tâm phương án 52

Bảng 3.4 So sánh tính ý nghĩa của các hằng số hồi quy theo tiêu chuẩn Student 53

Bảng 3.5 Số liệu kiểm định sự tương thích với thực nghiệm 54

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng C glutamicum VTCC-B-656 với dO2 = 100% theo thời gian lên men 56

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của oxy cung cấp đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng C.glutamicum VTCC-B-656 theo thời gian lên men 57

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ Na-Alginate đến quá trình cố định 59

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ tế bào đến quá trình cố định 60 Bảng 3.11 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau mỗi lần tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) 66

Hình 1.1 Hệ thống phân loại vi khuẩn C.glutamicum[54] 2

Hình 1.2 Bộ gen C.glutamicum ATCC 13032 (DSM 20300, IMET 10482, NCBI 10025)[43, 64] .3

Hình 1.3 Sơ đồ tóm lược quá trình chuyển hóa các chất ở C.glutamicum [18] .4

Hình 1.4 Động học phản ứng xảy ra bên ngoài môi trường nuôi cấy và bên trong Cytosol [18] 4

Hình 1.5 Quy trình chuyển hóa các chất trong C.glutamicum sinh amino acid lysine bắt đầu từ trung tâm phản ứng Phosphoenolpyruvate [18]……….5

Hình 1.6 Công thức cấu tạo amino acid L-lysine [65] .7

Hình 1.7 Cụm gen sinh tổng hợp lysine [43] 8

Hình 1.8 Sơ đồ điều hòa ngược từng chặng trong quá trình sinh tổng hợp amino acid ở chủng C.glutamicum [8] 9

Hình 1.9 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật [26] 15

Hình 1.10 Cấu tạo Alginate và các mạch polymer MM, MG, GG [20] 16

Hình 1.11 Cấu trúc gel hình “hộp trứng” [20] 17

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung thực hiện đề tài ……… 29

Hình 2.2 Hệ thống lên men fermentor Bioflo 110 sử dụng trong luận văn 35

Hình 3.1 Hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc C glutamicum ………… 44

Hình 3.2: Hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC B-656 44

Hình 3.3.Các chế phẩm C.glutamicum cố định A: chế phẩm cố định trên chất mang Na-Alginate; B: chế phẩm cố định trên chất mang BC; C: chế phẩm cố định trên phức chất mang A - BC 64

Đồ thị 1 Đường cong tăng trưởng, biến động pH môi trường, sản lượng L-lysine của chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-656 theo thời gian ………… 45

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của tốc độ lắc vòng đến năng suất lysine 46 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường lên men đến năng suất lysine 47 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống bổ sung vào canh trường đến năng suất lysine 48 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến năng suất lysine 49 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của hai nguồn cacbon glucose và sucrose đến năng suất lysine 50 Biểu đồ 3.6 Ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo đến quá trình bẫy – hấp phụ tế bào

C.glutamicum trên giá thể BC 61

Biểu đồ 3.7 Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình bẫy tăng sinh tế bào

C.glutamicum ở nhiệt độ ủ 300C 62 Biểu đồ 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến quá trình bẫy – bẫy hấp phụ tế bào

C.glutamicum trên giá thể BC trong thời gian ủ 3 ngày 63

Biểu đồ 3.9 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng chế phẩm vi khuẩn cố định (ĐC: đối chứng lên men bằng tế bào tự do) 65

MỞ ĐẦU

L-lysine là một trong 9 amino acid cần thiết mà cơ thể người và động vật không tự tổng hợp được L-lysine được ứng dụng bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm và cho người dưới dạng thực phẩm, dược phẩm L-lysine được tổng hợp bằng hóa học và phương pháp sinh học như tách chiết từ dịch thủy phân protein động vật, thực vật và lên men vi sinh vật, nhưng ưu thế thuộc về phương pháp lên men Kỹ thuật lên men tuy phức tạp, nhưng có nhiều ưu điểm nổi trội như có thể điều khiển quá trình theo ý muốn, hiệu suất thu hồi cao Giống vi sinh vật chuyên dùng để lên men sản xuất L-lysine thuộc về dòng Gram (+) Corynebacteria, đặc biệt là

Corynebacterium glutamicum đã được sử dụng trong công nghiệp sản xuất amino

tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine”

Nội dung chính của đề tài:

1 Khảo sát các điều kiện tối ưu lên men thu nhận lysine

2 Ứng dụng điều kiện tối ưu lên men trên fermentor

3 Khảo sát điều kiện cố định tế bào trên một số chất mang

4 Ứng dụng chế phẩm cố định lên men trong điều kiện tối ưu theo mẻ

Giới hạn đề tài:

Các thí nghiệm khảo sát ở quy mô phòng thí nghiệm

1.1 VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM

1.1.1 Lịch sử và phân loại

Cuối thế kỷ XIX, năm 1896 Lehmann và Neumann đã tìm ra giống (genus)

Corynebacterium Mãi đến giữa thế kỷ XX, Kinoshita và cộng sự (1957) mới tìm ra

chính danh loài (species) Glutamicum với tên gọi trước đây là Micrococus

glutamicus – một loài vi khuẩn sinh lượng lớn aminoacid [43] Nhưng Stackebrandt

E và cs (1997) đưa ra hệ thống phân loại C glutamicum dựa trên taxa của

Actinomycetables [43, 54, 55] (hình 1.1) Năm 2002, Oberreuter và cộng sự cho

biết, trước khi định danh chính xác chủng C.glutamicum, tiến hành phân tích yếu tố

vật lý dựa trên các bộ Kit như: hệ thống API CORYNE (BioMerieux), hệ thống định danh BIOLOG (Biolog) và hệ thống RapIDCB Plus (Remel) Sau đó, phân tích

số lượng amino acid tạo thành bằng FT-IR Spectroscopy và phân tích trình tự 16S

rDNA trên các loài C glutamicum [43, 48, 49].

Glutamicum

Hình 1.1 Hệ thống phân loại vi khuẩn C.glutamicum[54]

1.1.2 Đặc điểm vi khuẩn C glutamicum

Hầu hết loài Corynebacteria được tìm thấy từ những triệu chứng lâm sàng

khác nhau của người và một số nguồn khác như môi trường đất, cây trồng, nước thải, chất thải hằng ngày[41, 43]

C glutamicum là vi khuẩn Gram biến đổi, khi về già thì Gram (+), hiếu khí

hoặc yếm khí tùy ý, không di động, không có bào tử, tế bào hình que tròn hay gọi trực cầu khuẩn, có hoạt tính glucose hydrogenaza cao [54] Trong quá trình sinh

trưởng Corynebacteria cần bổ sung nguồn dinh dưỡng cơ bản như cacbon, nitơ, các

(Kanzaki và cs., 1969) [43] Corynebacteria có giới hạn nhiệt rộng từ 200C đến

400C, đa số sinh trưởng tốt ở 28 - 300C trên môi trường chuẩn (DSMZ, Deutsche Sammmlung von Mikioorganismen und Zellkulturen GmbH) bao gồm: 1% peptone,

0,5% yeast extract, 2% glucose, 0,5% NaCl ở pH 7.2-7.4 [43] Corynebacterium

glutamicum là vi khuẩn quan trọng trong công nghiệp rộng lớn [17, 18]chuyên sử dụng lên men thu nhận acid glutamic và amino acid lysine Trong quá trình lên men, chúng ta cần chú ý bổ sung lượng biotine, thiamine hoặc acid p-amino benzoic sự tích lũy sản phẩm bậc hai được cải thiện [43]

1.1.3 Đặc điểm di truyền của vi khuẩn C glutamicum

Bộ gen di truyền C.glutamicum được xác minh vào giữa thập niên 80 thế kỷ

XIX Các nhà khoa học đã tìm thấy rất nhiều gen tham gia trong chu trình sản xuất amino acid và đã nhân dòng, phân tích vai trò các gen liên quan đến năng suất thu

nhận amino acid [43] Vi khuẩn C glutamicum mang vật chất di truyền cấp độ phân

tử là DNA, dạng vòng, chiều dài sợi DNA khoảng 3,3 Mb, tỷ lệ GC là 53%, có

3138 gen khác nhau và có đến 3057 mã protein[36] Nhiều plasmid dạng vòng hay thẳng được tạo ra từ chủng này như pCG2, pCG4, pCGR1, pAG1, pAG2, pAG3, pBIl (dạng ds DNA), pXZ10142, pXZ10145.1, pAM330, pSR1, pTET3 [43]

Hình 1.2 Bộ gen C.glutamicum ATCC 13032 (DSM 20300, IMET 10482, NCBI

10025)[43, 64]

1.1.4 Sự chuyển hóa vật chất trong C glutamicum

Vi khuẩn C.glutamicum sinh trưởng trên môi trường thích hợp, chúng hấp thụ

các chất dinh dưỡng và khoáng chất qua các kênh xuyên màng (kênh Porin) Hàng

loạt các phản ứng xảy ra bên trong màng (cytosol) nhờ chuỗi gen hoạt động, gen

điều hòa biểu hiện (ppc, asp, lys, ddh ) sản sinh ra một số sản phẩm bậc hai quan

trọng Một trong những sản phẩm đó là amino acid lysine [18, 36, 41, 43]

lysine glutamate

Màng Cytoplasma

Lớp Peptidoglycan

Lớp Arabinogalactan

Lớp Mycolic acid

kênh Porin Môi trường

Hình 1.3 Sơ đồ tóm lược quá trình chuyển hóa các chất ở C.glutamicum [18]

Hình 1.4 Động học phản ứng xảy ra bên ngoài môi trường nuôi cấy và bên trong

Cytosol [18]

Các phản ứng xảy ra trong Cytosol được Eggeling minh họa dưới dạng sơ đồ hình 1.5

Hình 1.5 Quy trình chuyển hóa các chất trong C.glutamicum sinh amino acid lysine

bắt đầu từ trung tâm phản ứng Phosphoenolpyruvate [18]

Dựa trên quy trình này, nhiều nhà khoa học như Burkovski (2002), Eggeling

(2005), Kramer R (1994), Cremer (1991) đã nhân dòng, phân tích các gen asp,

lysC và operon asd

asd và operon lysC

hom dapA, operon dapB

(dapB, operon dapA

ddh

lysA và operon args

lys (lysC, lysE, lysA), asd, hom, dap (dapA, dapB) và nhiều gen khác nhằm mục

đích tạo chủng vi khuẩn siêu sản xuất amino acid ở quy mô công nghiệp [18, 41]

1.2 AMINO ACID LYSINE

1.2.1 Giới thiệu

Amino acid lysine thuộc lớp aspartate nằm trong họ oxaloacetate Codon mã hóa là AAA và AAG Lysine là một trong số amino acid mà cơ thể người, động vật không tự tổng hợp được mà phải nhận từ nguồn bổ sung bên ngoài Hoạt tính sinh học chỉ biểu hiện ở dạng đồng phân L-lysine mới có giá trị dinh dưỡng với người và động vật L-lysine được ứng dụng khá rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Bổ sung vào thức ăn gia súc làm tăng chất lượng và sản lượng thịt của động vật nuôi Trong dược phẩm, L-lysine sử dụng như một chất dinh dưỡng kích thích sự ngon miệng, chống nhiễm trùng máu, giảm stress Trong thực phẩm, L-lysine là chất bổ sung làm giàu thực phẩm, nâng cao chất lượng hạt (lúa mì, bắp, gạo) Trong công nghiệp, L-lysine được sản sinh từ quá trình lên men vi sinh vật chủ yếu là nhóm Corynebacteria (+) hoặc thu nhận từ dịch thuỷ phân protein động vật, thực vật [30] Trên thế giới, L-lysine được sản xuất từ đầu thế kỷ 20 Nhật Bản đã có 50 năm sản xuất L-lysine và áp dụng ở quy mô công nghiệp, chủ yếu hai nhà máy lớn Kiowa Hakko và Ajinamoto Ở Pháp, có nhà máy Eurolysin công suất 20 000 tấn/năm Còn nhiều nhà máy sản xuất L-lysine được đặt ở các nước Mỹ, Tây Ban Nha, Nga Ở Việt nam, nhu cầu sử dụng lysine cho thực phẩm con người và thức

ăn chăn nuôi tăng nhanh chóng, nhưng hoàn toàn nhập khẩu từ nước ngoài, có một

số nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm về lysine từ vi khuẩn như Hồ Sưởng (1980), Vũ Kim Thoa (2003), Nguyễn Thuỳ Châu và cs (2007), Trần Thị Mai và

cs (2008), sản lượng lysine đạt được nằm trong khoảng 15 – 30 g/L Tuy nhiên, rất

ít nghiên cứu hoàn chỉnh về quy trình sản xuất lysine và chưa có cơ sở sản xuất lysine ở quy mô lớn

Xu hướng chung các nước sử dụng các chủng có hoạt tính cao và ứng dụng

để sản xuất amino acid đều là các chủng đột biến Đặc biệt, các chủng

C.glutamicum có khả năng phát triển tốt trong môi trường giàu nguồn cacbon, ít

nguồn nitơ Do mất cân bằng giữa quá trình trao đổi chất cacbon và đồng hoá nitơ dẫn đến sự hình thành amino acid với số lượng lớn so với nhu cầu của tế bào và tích luỹ ở tế bào hay thoát ra ngoài môi trường Hiện tượng này gọi là siêu tổng hợp (overproducing) amino acid của vi sinh vật và thường do tác động của con người bằng phương pháp đột biến gen

1.2.3.1 Cụm gen sinh tổng hợp L-lysine

Lysine được thu từ những chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh acid aspatate

và chuỗi gen như hình 1.7 Gen lysC sản sinh enzyme aspatatokinase, gen asd sản sinh aspartate semi – dehyde dehydrogenase Hai enzyme này gây ức chế ngược

phản ứng tạo thành lysine Một chuỗi gen dapA, dapB, ddh sản sinh các enzyme

tham gia chu trình Dihydrodipicolinate xảy ra bên trong tế bào Nhờ gen lysA sinh

Diaminopimelate decarboxylase thủy phân D, L – Diaminopimelate tạo lysine bên

trong tế bào Cuối cùng lysine bên trong tế bào được giải phóng ra ngoài nhờ gen

lysE tiết enzyme permease [43].

Hình 1.7 Cụm gen sinh tổng hợp lysine [43]

1.2.3.2 Quá trình tổng hợp và điều hòa sinh amino acid lysine

Quá trình điều hòa tổng hợp amino acid được điều hòa theo cơ chế feedback Sản phẩm cuối cùng của quá trình ức chế lại enzyme xúc tác cho phản ứng đầu tiên; các enzyme này thường là enzyme dị lập thể và sản phẩm của quá trình ở nồng độ cao đóng vai trò là các chất ức chế dị lập thể Trong các tế bào phát triển thì sự tổng hợp amino acid không chỉ là tổng hợp các amino acid đơn lẻ mà nó còn tổng hợp amino acid cho tổng hợp protein Sự phối hợp nhịp nhàng giữa quá trình sinh tổng hợp amino acid và quá trình sinh tổng hợp protein là yếu tố làm cho các tế bào vi khuẩn phát triển nhanh Quá trình sinh tổng hợp amino acid có thể qua nhiều bước trung gian Các chất trung gian này đóng vai trò ức chế ngược theo từng chặng và điều hòa này gọi là điều hòa theo cơ chế feedback kế tiếp nhau [8]

L-lysine chỉ điều chỉnh ngược enzyme aspactokinaza mà không ức chế ngược enzyme dehydropicolinatsyntetaza Enzyme aspactokinaza chịu ức chế ngược của L-lysine và threonine Enzyme homoserindehydrogenaza chịu ức chế ngược của threonine Ở chủng hoang dại L-lysine và threoine cùng gây ra một sự ức chế phối hợp đối với aspactokinaza Do khuyết homoserin dehydrogenaza mà không có sự tạo thành threonine Dihydropicolinatsythase không mẫn cảm dị lập thể Hậu quả là

sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng bị triệt tiêu và có sự tổng hợp L-lysine [8] Hình 1.8 tóm lược sơ đồ sự điều hoà ngược từng chặng trong quá trình sinh tổng hợp

amino acid ở vi khuẩn C glutamicum, dựa trên quy trình này chúng ta xác định sản

phẩm mục tiêu và điều khiển quá trình theo ý muốn

Lysine cellular

lysC asd dapA

dapB

Lysine external

ddh (dapC, dapD, dapE, dap F)

Hình 1.8 Sơ đồ điều hòa ngược từng chặng trong quá trình sinh tổng hợp amino

acid ở chủng C.glutamicum [8].

Những phương pháp được dùng để loại sự điều chỉnh ngược:

 Sử dụng chủng đột biến trợ dưỡng cần homoserin Chủng này phát triển khi trong môi trường có threonine và L-methionine Với nồng độ amino acid này thấp thì aspatokinaza sẽ không bị ức chế và L-lysine sẽ tạo thành nhiều hơn

 Sử dụng các chủng đột biến có khả năng kháng một chất tương đồng của enzyme Chủng này có enzyme aspatokinaza không bị ức chế ngược bởi L-lysine và threonine Sử dụng các chủng đột biến mẫn cảm cao với threonine Enzyme

Glucose

Aspatate Oxalaxetate Pyruvate

homoserindehydrogenaza có thể bị ức chế bởi nồng độ threonine thấp và aspatokinaza sẽ không bị ức chế [25]

Nhân tố quan trọng khác trong sản xuất amino acid là sự bài tiết Sinh vật thì không bài tiết amino acid, do có sự ức chế ngược hay kìm hãm trong đột biến bình

thường không xảy ra trong tế bào Vi khuẩn C.glutamicum dùng sản xuất công

nghiệp amino acid cần biotine Thiếu hụt biotine dẫn tới sự tổn thương màng tế bào

và dưới điều kiện nội bào amino acid được bài tiết Môi trường sử dụng để sản xuất amino acid chứa đầy đủ biotine trong giai đoạn sinh trưởng, sau đó biotine bị thiếu hụt và bài tiết amino acid [3]

1.2.4 Lên men thu nhận L-lysine

1.2.4.1 Ảnh hưởng của chủng sản xuất

Tất cả các chủng vi sinh vật có chu trình aspatate đều có thể dùng lên men thu nhận amino acid lysine Ngày nay, lysine đã sản xuất ở dạng quy mô công nghiệp nên cần tổng quan lại những chủng đã nghiên cứu cho sản xuất lysine Những ảnh hưởng điều kiện thích nghi với quy mô lớn và năng suất cạnh tranh công nghiệp Hàng loạt chủng liệt kê trong bảng 1.1 đã nghiên cứu để thu nhận lysine, nhiều chủng được tuyển chọn qua bước làm đột biến và thu được những chủng mới có hoạt lực cao hơn nhiều so với chủng gốc ban đầu Đặc điểm khác biệt của các chủng này là cần biotine với lượng cao hơn sao với chủng gốc, chịu được ở nồng độ đường lớn hơn tới 10% hoặc cao hơn và đặc biệt cần một số amino acid cho tăng trưởng

cũng như sinh tổng hợp L-lysine Tuy nhiên, C.glutamicum là chủng ưu thế công

nghiệp hơn do điều kiện nuôi cấy phù hợp với quy mô lớn, chúng không có enzyme L-homoleucine dehydrogenaza nhưng chúng có giai đoạn cân bằng sinh khối và thời gian thu nhận sản phẩm bậc hai dài [18] Chúng tôi đã thống kê một số chủng

vi sinh vật điển hình có khả năng sản sinh amino acid L-lysine, được sử dụng

nghiên cứu sâu (bảng 1.1) và một số dòng C.glutamicum tái tổ hợp có khả năng sản

sinh L-lysine cao (bảng 1.2)

Bảng 1.1 Các chủng đã nghiên cứu lên men thu nhận lysine

NTU-2

42 g/L Su và cs., 1990 [57]

Ghi chú: - : Không xác định ; ***: xem bảng 1.2

Bảng 1.2 Các chủng C.glutamicum tái tổ hợp đã nghiên cứu lên men để thu nhận

lysine

01 C+ đột biến hom Gly378 G -> A + Dieter, 1991 [22]

02 C+ plasmid pJC50, promoter asd 68 ± 5

g/L

Josef Cremer, 1991 [34]

03 C+ khuếch đại gen leuA + 50% Miroslaw và cs., 1994

[47]

04 C+ nhân dòng gen gltA-malE + 20% Ohnishi và cs., 2003 [48]

05 C+ đột biến gnd Ser361-> Phe + 15% Ohnishi và cs., 2005 [49]

06 C+ đột biến leuC Gly456 -_ áp,

hom59 -> lysT311I, operon

1.2.4.2 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng

Quá trình nuôi cấy C.glutamicum được thực hiện trên môi trường thạch nghiêng, thạch đĩa hay môi trường dịch thể C.glutamicum sử dụng các môi trường

nhiều đường, đạm vô cơ, ít đạm hữu cơ và các muối khoáng khác [18]

Nhu cầu chung

Nguồn cacbon: C.glutamicum sử dụng nguồn cacbon chính là đường glucose,

sucrose ngoài ra có nhiều nghiên cứu cho thấy trên môi trường đường frutose,

mantose C.glutamicum cũng sinh trưởng nhưng năng suất sinh lysine không đáng

quan tâm Nồng độ cacbon thích hợp nhất là 10%, hàm lượng lớn hơn không những hao phí cacbon mà sự sinh amino acid giảm đi rất nhiều [18] Nhiều cơ chất thay thế

mà các nhà máy sản xuất ở Châu âu, Trung quốc, Đài loan, Nhật đã sử dụng như dịch chiết bắp, rỉ đường mía, rỉ đường củ cải, [18, 43]

Nguồn nitơ: trong nghiên cứu quy mô phòng thí nghiệm C.glutamicum sử

dụng peptone, cao nấm men làm nguồn nitơ chính Tuy nhiên, trong công nghiệp sử dụng thay thế urease (NH2)2CO, nồng độ nitơ thích hợp trong dịch lên men là 1 -3% [18]

Khoáng: C.glutamicum cần nguồn khoáng vô cơ như K, Mn, Fe, P, S, Na

các nguồn này được bổ sung từ chất vô cơ như K2HPO4, KH2PO4, MnSO4, FeSO4, NaCl

Nhu cầu khác

C.glutamicum cần cung cấp thêm biotine, thiamine hỗ trợ điều hòa phản ứng

thu nhận sản phẩm bậc hai Lượng biotine được thêm vào môi trường lên men 2µg/mL; thiamine 4µg/mL [18, 43] Trong công nghệ lên men, có thể thay thế biotine nguyên chất bằng cao bắp, rỉ đường mía

1.2.4.3 Ảnh hưởng của một số điều kiện ngoại cảnh

Nhiệt độ nuôi cấy: C.glutamicum có giới hạn nhiệt rộng từ 20 - 400C, sinh trưởng tốt ở 28 - 300C đây là ưu thế trội thích nghi với điều kiện sản xuất quy mô công nghiệp ở khí hậu nhiệt đới đặc biệt là ở Việt nam

pH: pH môi trường tác động trực tiếp lên sự trao đổi chất của vi sinh vật, pH không thích hợp gây ức chế quá trình sinh tổng hợp lysine của chủng nghiên cứu Các khảo sát trước đây về pH ban đầu trong canh trường lên men cho thấy

C.glutamicum sinh trưởng thích hợp trên môi trường pH trung tính hoặc pH kiềm

nằm trong giới hạn pH từ 6,8 – 8,0 [30]

Lượng oxy hòa tan: giữ lượng oxy trong canh trường đạt mức tiêu chuẩn trong suốt quá trình nuôi cấy, chú ý cung cấp đủ oxy trong giai đoạn pha lag do tế bào tăng sinh mạnh Nếu lượng oxy hòa tan quá lớn làm giảm quá trình phát triển tạo thành sinh khối, nếu thiếu oxy hoà tan thì quá trình trao đổi chất bị phá vỡ Nuôi cấy

C.glutamicum trong thể tích nhỏ (erlen, lọ) chú ý lắc tròn đều từ 100 – 250

vòng/phút, tối ưu là 200 vòng/phút Lên men fermentor lớn điều chỉnh đầu dò O2giữ ổn định, không khí được bơm vào bình lên men từ 0,12 – 0,2/phút/lít môi trường lên men [53]

1.2.4.4 Kỹ thuật lên men thu nhận amino acid lysine

Quá trình lên men thu nhận thu nhận sản phẩm bậc hai từ vi khuẩn có thể lên men dạng batch, fed-batch hay liên tục; tuy nhiên thu nhận amino acid lysine cần vô trùng tuyệt đối nên quá trình lên men fed – batch là lợi nhất [53] Sau đây là tổng hợp một số yếu tố liên quan:

Giống vi sinh vật: C.glutamicum từ Trung tâm lưu trữ giống vi sinh vật, giữ

trong môi trường thạch nghiêng có thành phần: peptone 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%, glucose 0,5%, agar 2%, pH ~ 7,2, bảo quản ở 40C, 1 tháng cấy chuyền

Nhân giống cấp 1: thành phần môi trường: glucose 2%, dịch chiết bắp 5%,

peptone 1%, cao nấm men 0,5%, NaCl 0,5%, pH ~ 7,2 Điều kiện nhân giống: erlen 100mL chứa 20mL môi trường, lắc 200vòng/phút, nhiệt độ 28 ~ 300C trong thời gian 16 ~ 18 giờ

Nhân giống cấp 2: môi trường nhân giống cấp 1 Dùng erlen 500mL đựng 200

mL môi trường, lượng giống cấy 2%, nhiệt độ nuôi cấy 28 ~ 300C, lắc 200 vòng/phút, thời gian nhân giống 8 ~ 9 giờ

Nhân giống cấp 3: môi trường nhân giống cấp 1 Dùng bình lên men 1 lít

chứa 500mL môi trường, lượng giống cấy 2%, nhiệt độ nuôi cấy 28 ~ 300C, lắc 300vòng/phút, thời gian nhân giống 8 ~ 9 giờ

Quy trình lên men: môi trường lên men glucose (khử trùng riêng) 10%, dịch

chiết bắp 200 g/L, KH2PO4 0,1%, (NH2)2CO (khử trùng riêng) 0,5%, MgSO4.7H2O 0,025%, biotine 2mg/L và thiamine 4mg/L (lọc bằng phễu lọc vô trùng) Điều kiện lên men: fermentor lên men 10 lít, đựng 7 lít môi trường, lượng giống 2 – 10%, không khí được bơm vào bình lên men từ 0,12 – 0,2/phút/lít môi trường lên men; sử dụng cánh khuấy 100 – 180 vòng/phút, nhiệt độ ổn định 28 – 300C trong thời gian

120 giờ, điều chỉnh pH tự động bằng khí NH3 và luôn giữ ổn định 7 – 7,2 Thu dịch lên men, ly tâm siêu tốc, cô đặc dịch và chỉnh pH dịch lên men 4,5 – 5,5 bằng HCl Bảo quản dịch lên men hoặc cô đặc thu lysine thô [8, 52, 53]

1.3 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT

1.3.1 Định nghĩa cố định tế bào vi sinh vật

Cố định tế bào có nghĩa là các tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay định vị trong một khu vực không gian nhất định mà các tế bào đó vẫn giữ được tính chất xúc tác sinh học và có thể sử dụng nhiều lần [5] Hay cố định tế bào có nghĩa là gắn

tế bào vào chất mang không hòa tan trong nước Tế bào sau khi cố định được tái sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm

1.3.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật

1.3.2.1 Phân loại phương pháp cố định tế bào

Có nhiều cách để phân loại phương pháp cố định tế bào Gordon (1997) đã liệt

kê được rất nhiều phương pháp cố định tế bào trên các chất mang phù hợp với từng phương pháp khác nhau Trên nền tảng của Gordon (1997), chúng tôi phác hoạ các phương pháp cố định tế bào dưới dạng sơ đồ hình 1.9

Hình 1.9 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật [26]

1.3.2.2 Chất mang cố định tế bào vi sinh vật

a Chất mang vô cơ

Thông dụng là vật liệu thủy tinh xốp, vật liệu oxit kim loại (nhôm oxit, mangan oxit, magie oxit, titan oxit), diatomite (celit) và gốm

Đặc điểm: cấu trúc lỗ xốp, kích thước các lỗ này có thể điều chỉnh được Có khả năng hấp thụ tốt các enzyme và tế bào

b Chất mang hữu cơ

Polymer tổng hợp: gồm một số polymer như polystyren, polyvinylalcol,

polyacrylamid, polyvinylacetate, polyacrylic dùng cố định enzyme và tế bào bằng phương pháp nhốt trong lòng chất mang

Polymer sinh học: chất mang protein: gellatin, keratin, albumin Cố định tế

bào bằng phương pháp nhốt trong cấu trúc gel

Chất mang polysaccharid: cellulose, agarose, sephadex, và dẫn xuất Ngoài ra, còn có nhiều vật liệu khác như tinh bột, chitin, chitosan, alginate, carrageenan

c Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào

Khả năng sống của tế bào trong chất mang: lượng tế bào còn sống sót và hoạt động sau một thời gian nhất định; khả năng chuyển hóa cơ chất và thành phần dinh dưỡng đi vào; sản phẩm trao đổi chất đi ra Độ bền cơ học của chất mang: sức chịu

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT

Trên bề mặt

chất mang

Trong lòng chất mang

Không mang chất mang

hệ sợi tổng hợp

Nhốt trong cấu trúc gel

Liên kết chéo

Màng mem- brane

Gel lạnh sâu

Cố định liên hợp

Nhờ photo - polimer

đựng của chất mang ở pH, nhiệt độ, lực tác động của môi trường và của lực khuấy, lực thổi của không khí đưa vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật Khả năng bảo vệ vi sinh vật trong chất mang, tính đến yếu tố bất lợi với điều kiện ngoại cảnh Khả năng tái sử dụng nhiều lần, quá trình sản xuất liên tục vi sinh vật không bị rửa trôi [10]

1.3.3 Những chất mang sử dụng liên quan đến đề tài

1.3.3.1 Chất mang Alginate

a Cấu tạo: Alginate là một polymer mạch thẳng gồm hai loại monomer:

1,4--D-mannuronic acid (M) và -L-guluronic acid (G) Cấu tạo Alginate và các mạch polymer được minh họa ở hình 1.10

Hình 1.10 Cấu tạo Alginate và các mạch polymer MM, MG, GG [20]

Alginate được hình thành từ sự liên kết giữa các monomer ở vị trí C-1 và C-4 Mạch polymer gồm ba khối: G, M, MG Vị trí, số lượng, tương quan của các khối này tùy thuộc vào nguồn gốc của Alginate

b Tính chất

Độ nhớt của dung dịch: phụ thuộc vào các yếu tố:

Nguồn gốc của loại tảo để chiết xuất: tảo ôn đới có độ nhớt cao hơn tảo nhiệt đới; trọng lượng phân tử Alginate: trọng lượng phân tử Alginate và độ nhớt tỷ lệ thuận, trọng lượng càng cao độ nhớt càng lớn và ngược lại; nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng 10C thì độ nhớt tăng lên 25%, khi tăng nhiệt độ rồi hạ nhiệt độ thì độ nhớt của dung dịch Alginate giảm thấp hơn so với ban đầu [20]

pH của dung dịch: pH > 11 Alginate bị khử polymer hóa làm giảm độ nhớt pH~5,5 độ nhớt Alginate tăng; pH tiếp tục giảm (3 - 4) chúng sẽ tạo thành gel Tuy nhiên, lượng thừa Ca2+ trong dung dịch Alginate thì gel đông đặc ở pH gần bằng 5 [20]

Khả năng tạo gel: Khi kết hợp Alginate với cation hóa trị II, III thường dùng

Ca2+ sẽ xuất hiện cầu nối giữa các phân tử alginate và tạo gel theo hình “hộp trứng”, gel này được hình thành ở nhiệt độ phòng và không tan chảy khi bị nung nóng Dung dịch alginate cũng hình thành gel khi bị acid hóa nhưng gel này mềm hơn gel calcium Cơ chế tạo gel hình “hộp trứng”: do chuỗi phân tử alginate cấu tạo từ các đơn vị acid guluronic có cấu trúc nếp gấp và khe hở mà Ca2+ có thể chui vào, định

vị và liên kết Ion Ca2+ giữ các chuỗi alginate hình thành liên kết calcium alginate chắc hơn Cấu trúc này có hình dạng như hộp trứng

Hình 1.11 Cấu trúc gel hình “hộp trứng” [20]

c Phương pháp cố định tế bào trên chất mang Alginate

Dùng phương pháp bẫy tế bào trong lòng chất mang Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinh vật vào chất mang alginate được nhỏ vào dung dịch đệm Ca2+ để thực hiện phản ứng tạo gel Nhờ phản ứng này tế bào vi sinh vật được cố định trong hệ thống mạng lưới [20]

1.3.3.2 Chất mang Bacterial Cellulose (BC)

a Cấu tạo

BC là chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết -1,4 glucan; gồm các sợi cấu trúc dạng dải ruy băng Khi quan sát dưới kính hiển vi điện

tử người ta thấy cấu trúc xoắn của dải sợi Dải sợi cellulose có chiều rộng khoảng 100nm, dày 3-8 nm Trong quá trình hình thành BC, các sợi mới của BC sinh ra tạo thành các sợi sơ cấp có chiều rộng khoảng 1,5 nm; các sợi sơ cấp này kết hợp lại tạo thành vi sợi, các vi sợi nằm trong các bó sợi, cuối cùng các bó sợi liên kết với nhau tạo thành các dải ruy băng dài, tạo nên lớp BC

b Tính chất

Độ bền hóa học, độ bền cơ học, sức căng cao, khả năng chịu nhiệt tốt, trọng lượng nhẹ Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, có thể điều chỉnh được độ xốp Khả năng hình thành màng Cấu trúc cellulose có khả năng biến đổi do đó cần kiểm soát

lý tính của cellulose trong suốt quá trình nuôi cấy vi sinh vật Cellulose có thể kết tinh dị hình nên cần kiểm soát kích thước, cấu trúc, chất lượng của cellulose

BC hình thành không gắn ligin, không chứa hemi-cellulose, có độ tinh sạch cao, dễ dàng bị phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Nên BC được xem là nguyên liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai

c Phương pháp cố định tế bào trên chất mang BC

Cố định chất mang BC bằng phương pháp bẫy-hấp phụ gồm hai giai đoạn:

Giai đoạn hấp phụ: BC đóng vai trò là chất nền (matrix) để hấp phụ vi sinh vật cần cố định Ngâm BC trong dịch giống vi sinh vật, BC trương nở Vi sinh vật theo dịch trong quá trình trương nở sẽ bám vào xung quanh mặt ngoài và len lỏi vào bên trong mạng cellulose

Giai đoạn bẫy: BC đóng vai trò là giá đỡ (supporter) để bẫy vi sinh vật

Do đó, tế bào cố định trên chất mang BC gồm các tế bào hấp phụ và các tế bào bẫy tăng sinh [5]

1.4 BẢO QUẢN VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

1.4.1 Khái niệm và phương pháp

Sự bảo vệ vi sinh vật bằng phương pháp sấy khô đã được sử dụng phổ biến trong những thập niên qua, thường sử dụng phương pháp đông khô Phương pháp này thích hợp cho việc vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn vi sinh vật Ứng

dụng trong công nghệ thực phẩm, dược phẩm và áp dụng cho nhiều loài vi sinh vật khác nhau

Đông khô (freeze-drying) là phương pháp làm thăng hoa phần nước có trong môi trường nhũ hóa trong điều kiện chân không từ những nguyên liệu lạnh đông

Có thể tách ẩm ra khỏi vật liệu bằng cách thăng hoa, nghĩa là chuyển ẩm thẳng từ pha rắn sang pha hơi, không qua trạng thái lỏng, để sấy vật liệu bằng cách đó cần thiết phải tạo được hiệu số nhiệt độ lớn giữa vật liệu và nguồn nhiệt bên ngoài, muốn vậy phải sấy vật liệu ở trạng thái đóng rắn ở độ chân không cao 0.1-1.0 mmHg, ở áp suất này có thể sấy ở nhiệt độ 0oC, nước khi đó sẽ ở trạng thái nước đá, thí dụ khi sấy vật liệu ở nhiệt độ -15oC thì áp suất dư tương ứng sẽ là 1.4 mmHg, nghĩa là tương ứng với áp suất hơi của nước cân bằng với nước đá Khi nhiệt độ là -

50oC thì áp suất dư tương ứng là 0,03 mmHg Nhiệt lượng cần thiết để làm bay hơi

ẩm qua thiết bị đốt nóng đặc biệt

Chu kỳ sấy khô lạnh đông mẫu gồm hai phần chính Đầu tiên là nơi mà độ ẩm đông khô được loại bỏ nước bằng sự thăng hoa phần nước có trong môi trường nhũ hóa vi sinh vật trong điều kiện chân không Điểm kết thúc của chu trình sấy khô thường được xác định bằng cách phân tích duy trì độ ẩm còn sót lại trong sản phẩm đông khô sau khi nó được loại bỏ ra khỏi buồng chân không

Về mặt bản chất, quá trình đông khô được thực hiện trong những sản phẩm hòa tan hoàn toàn, nhưng lại khử nước một cách dễ dàng Do quá trình đông khô thực hiện ở nhiệt độ thấp nên sự thay đổi tính chất hóa học là rất nhỏ

Đông khô là phương pháp thích hợp để bảo quản vi sinh vật trong một thời gian dài, tỉ lệ tế bào sống sau đông khô cao hơn sấy phun Một trong những nguyên nhân gây ra số tế bào sống bị chết sau đông khô là do quá trình tiền đông khô mẫu, trước khi đặt vào máy đông khô Sự tạo thành những tinh thể đá lớn có thể tổn thương màng tế bào và không thể phục hồi lại sau đông khô Phương pháp lạnh đông tốt nhất là khi nhiệt độ xuống – 200C, tốc độ làm lạnh phải hạ xuống từ từ để tránh tế bào vi sinh vật bị tổn thương

1.4.2 Yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình sấy khô

Pha phát triển và mật độ tế bào

Sự phát triển của vi sinh vật gồm 4 pha: pha thích nghi, pha phát triển, pha ổn định và pha suy tàn Pha ổn định gồm nhiều trạng thái sinh lý khác nhau trong tế bào, thông thường sự thiếu nguồn cacbon và sự cạn kiệt những nguồn dinh dưỡng gây nên trở ngại cho sự sống sót của tế bào Sự sống sót trong pha ổn định có thể bảo vệ tế bào trong những điều kiện không thuận lợi khác như quá trình sấy khô và nhiệt độ không thuận lợi Mật độ tế bào khi đem sấy khô nên lớn hơn 1x108 tế bào/mL Tuy nhiên, theo Costa (2000) đã cho rằng nồng độ tế bào ban đầu tối ưu phụ thuộc vào môi trường bảo vệ sử dụng Khi sử dụng sucrose thì mật độ tế bào

1010CFU/mL

Chất bảo vệ tế bào

Cho tới nay chưa có quan điểm rõ ràng môi trường phát triển ảnh hưởng lên sự sống sót của vi sinh vật Những nghiên cứu tập trung vào cơ chất được bổ sung vào Nghiên cứu của Streeter và cs (2003) cho rằng khi thêm trehalose vào môi trường phát triển cho phép tế bào gia tăng khối lượng của trehalose trong tế bào chất làm chắc rắn màng tế bào chất trong suốt quá trình sấy khô

Môi trường sấy khô là yếu tố quan trọng nhất Sự lựa chọn môi trường sấy khô thích hợp cho vi sinh vật là rất quan trọng Nó có thể gia tăng tỉ lệ sống sót trong quá trình làm khô và bảo quản Những chất bảo vệ có thể phụ thuộc vào mỗi chủng

vi sinh vật khác nhau Tuy nhiên có những chất bảo vệ thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật như sữa gầy, huyết thanh, trehalose, glycerol, betaine, adonitol, sucrose, glucose, lactose và những polymer như dextran và polyethyleneglycol

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Những nghiên cứu trong nước

Hồ Sưởng (1980 – 1985) (Viện công nghệ thực phẩm) đã sản xuất L-lysine từ chủng tự nhiên (không có tên chi và tên loài) ở quy mô 5000L/mẻ với sản lượng 30-

35 g/L[3]

Vũ Kim Thoa và cs (2003) cũng đã phân lập từ 454 mẫu đất thu thập từ nhiều

địa điểm khác nhau được 264 chủng Corynebacterium sp., nhóm đã tuyển chọn được 23 chủng Corynebacterium sp có khả năng sinh tổng hợp L-lysine trong đó

có 2 chủng Corynebacterium sp lys 73 và lys86 có khả năng sinh tổng hợp L-lysine

cao nhất đạt mức 28 -30 g/L trong điều kiện phòng thí nghiệm [14]

Tiếp cận những nhóm nghiên cứu trước, Nguyễn Thuỳ Châu và cs (2007) đã phân lập từ 908 mẫu đất từ các tỉnh miền Bắc Việt nam được 200 chủng

Corynebacterium sp có khả năng sinh tổng hợp L-lysine Các chủng này tập trung

chủ yếu các vùng đất nông nghiệp tơi xốp, có độ thoáng khí cao thích hợp cho khả

năng sinh L-lysine của chủng Từ 200 chủng nghiên Corynebacterium sp nhóm đã

tuyển chọn được 160 chủng có khả năng sinh L-lysine ở mức 1 - 2 g/L; 16 chủng có khả năng sinh L-lysine ở mức 3 - 9 g/L; 16 chủng có khả năng sinh tổng hợp L-lysine ở mức 10 - 12 g/L; 8 chủng có khả năng sinh tổng hợp L-lysine ở mức 13 -

15 g/L trong đó có hai chủng đạt 15 g/L Nhóm đã nghiên cứu thành công 2 chủng đột biến dị dưỡng với threonine (cần 0,2 - 0,8 mg/L threonine) khi xử lý 0,01% nitrosoguanidine; với nồng độ 0,05% nitrosoduanidine thì cũng thu được 2 chủng đột biến dị dưỡng với threonine (cần 0,5 - 0,1 mg/L threonine) và 2 chủng đột biến

dị dưỡng với homoserine Chủng đột biến dị dưỡng homoserine có khả năng sản sinh L-lysine 30 g/L cao gấp 20 lần so với chủng tự nhiên ban đầu 1,5 g/L

Bên cạnh đó, Nguyễn Thuỳ Châu và cs (2007) đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất L-lysine bằng phương pháp lên men chìm sục khí với quy

mô 50 L/mẻ, 150L/mẻ, 1500L/mẻ Kết quả quy trình đạt được: môi trường lên men

(thể tích 1 lít) gồm rỉ đường 130g; NH4Cl 20g; urease 5g; KH2PO4 1g; MgSO4.7H2O 0,4g; FeSO4.7H2O 10 mg; MnSO4.4H2O 8 mg; đậu tương thuỷ phân 10g; thiamine 0,1 mg; biotine 0,3 mg), pH ~ 7.0, tỷ lệ tiếp giống 10%, lắc vòng 200 vòng/phút, dO2 = 100%, 300C và năng suất thu được 30 g/L [6] Nguyễn Duy Lâm

và Trần Thị Mai (2008) cũng nghiên cứu lên men thu L-lysine từ Corynebacterium

glutamicum với sản lượng 28 g/L [13 ]

Tóm lại, những nghiên cứu trong nước về lĩnh vực này chưa nhiều, chủng giống chưa đạt chuẩn Các nghiên cứu tiếp cận theo hướng phân lập, cải thiện và tuyển chọn chủng cho năng suất cao Kết quả đạt được tương đương nhau, nằm mức

70 - 80 % so các báo cáo nước ngoài song chưa có quy trình hoàn thiện và chưa tuyển chọn được chủng giống siêu sản xuất L-lysine Kết quả nghiên cứu đã mở đường cho hướng cải thiện chủng giống bằng phương pháp đột biến dị dưỡng, tạo dòng gen cũng như cải thiện môi trường lên men, chuẩn hoá điều kiện lên men cho chủng siêu sản xuất L-lysine tiến gần với quy mô sản xuất công nghiệp

1.5.2 Những nghiên cứu ngoài nước

Về các chủng vi khuẩn

Từ năm 1956 nhà khoa học Kinoshita phân lập chủng C.glutamicum có khả

năng sinh acid glutamic lớn Kể từ đó đến nay hàng loạt những nghiên cứu đã tạo ra cho nhân loại khá nhiều chủng vi sinh vật quan trọng có khả năng sản sinh amino acid nói chung và L-lysine nói riêng từ nhiều loại cơ chất rẽ tiền, dễ kiếm Với mỗi

cơ chất khác nhau có nhiều chủng giống sản sinh amino acid L-lysine từ 10 g/L –

100 g/L; ưu thế là những chủng tái tổ hợp cho hiệu suất khá cao Đặc biệt,

C.glutamicum vẫn là chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh amino acid với hiệu suất

thu hồi cao nhất và phù hợp với quy mô sản xuất công nghiệp Điển hình những nghiên cứu dưới đây, cho thấy vi sinh vật có khả năng sinh amino acid rất phong phú và đa dạng

Kinoshita và cs (1957) đã thí nghiệm trên 175 chủng nấm mốc, 468 chủng nấm men, 372 chủng xạ khuẩn và 650 chủng vi khuẩn, thấy rằng có 22% trong số

đó có khả năng sinh amino acid, ít nhất là nấm mốc (10%), nhiều nhất là xạ khuẩn (30%), trung bình là vi khuẩn (20%) Tuy nhiên, hiệu suất lên men chỉ đạt 1 - 2 g/L

môi trường, riêng C.glutamicum cho 30 g/L môi trường ở điều kiện tối ưu [38] Kishimoto và cs (1974) dùng chủng Brevibacterium divaricatum NRRRL

2311 lên men lysine trong điều kiện tối ưu, năng suất thu hồi đạt 26 g/L môi trường

Năm 1993, Motoyama và cs tìm ra giống Methylhomoserin glucogenes lên men

lysine năng suất thấp đạt 5 g/L môi trường

Tsunoda và Shiio (1961) đã chọn Brevibacterium flavum lên men lysine sản lượng thu được ở dạng vết Gunji và Yasueda năm 2006, lên men với Methylophilus

methylotrophus và đạt hiệu suất < 2 g/L môi trường Nhiều nghiên cứu khác tiến

hành lên men với chủng Brevibacterium lactofermentum cũng cho hiệu suất lên men

đạt khoảng 30 – 36 g/L môi trường, điển hình như: Ko, Chipley (1984), Yamamoto, Ogawa, Shinmogi [39, 59, 63]

Tóm lại, các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp lysine đã nghiên cứu, tuy khác nhau về đặc điểm nguồn gốc, màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, kích thước tế bào, tính chất sinh lý nhưng chúng giống nhau về nhiều điểm như: hình dạng tế bào từ hình que tròn đến que ngắn, Gram dương, không tạo bào tử, không chuyển động, sinh catalaza Các chủng này có quan hệ gần nhau, chúng đều có chu trình acetate

Tuy nhiên, ưu thế vẫn thuộc về chủng Corynebacterium glutamicum có khả năng

sản sinh L-lysine cao

Về cải thiện chất lượng giống với đối tượng Corynebacterium glutamicum

Các chủng có nguồn gốc tự nhiên sản sinh lượng sản phẩm bậc hai đủ để sử dụng lại cho chu trình sinh trưởng và phát triển Do đó, để điều khiển quá trình sinh tổng hợp thừa, chúng ta cần tạo ra những chủng siêu sản xuất, người ta gọi những chủng này là chủng đột biến gen Nhiều phương pháp gây đột biến bằng tia cực tím, các hóa chất (HNO2, lyzozyme, kháng sinh .), tạo dòng gen đã tạo ra các chủng mới có nhiều đặc điểm quý mà các chủng gốc không có được Nhiều nghiên cứu

thành công tiến hành với chủng Corynebacterium glutamicum được thống kê bên

dưới đều cho hiệu suất thu hồi amino acid lysine cao hơn chủng hoang dại rất nhiều lần, tuy nhiên các chủng đột biến không có tính ổn định cao

Năm 1991, Dieter gây đột biến điểm định hướng trên chủng Corynebacterium

glutamicum hom Gly378 gen G > A (tại vị trí nucleotic 1133) (GGG -> GAG)

Ông xác nhận chủng đột biến này gây ức chế ngược tạo thành L-threonine nên năng

suất lysine đáng kể được thu nhận Năm 2005, Ohnishi gây đột biến điểm trên chủng C.glutamicum ở vị trí Ser361 trên gen gnd thành Phe năng suất lysine tăng lên 15% so với chủng gốc Năm 2006, Hayashi gây đột biến điểm trên gen leuC Gly456 > asp, hom 59, lysCT3111 của chủng C glutamicum, sử dụng operon

lysC-asd năng suất thu nhận lysine lên 14% so với chủng gốc Năm 2007, Becker

gây đột biến điểm gen zwf (G6P dehydrogenase) ở vị trí A243 trên chủng

C.glutamicum năng suất lysine tăng lên 70% so với chủng gốc Đồng quan điểm

này, nhưng Josef (1991) tạo dòng gen lysCα- lysCβ- asd từ C.glutamicum, dùng

promoter asd, plasmid pJC50 năng suất lysine 685 g/L nuôi cấy 48 giờ [21, 22, 28]

Năm 2003, Ohnish, Hayash, Mitsuhashi, Ikeda tạo được chủng C.glutamicum

sinh trưởng ở nhiệt độ cao 400C, năng suất lysine tăng lên 20% so với chủng gốc

Ông xác minh ở nhiệt độ này gen gltA làm giảm sự biểu hiện citrate synthase, gen

malE làm tăng sự biểu hiện yếu tố này đồng thời tái sinh pyruvate và NADPH do

đó, năng suất lysine được tăng lên Miroslav (2004) thu được chủng C.glutamicum

tái tổ hợp cho năng suất tăng 50% so với chủng gốc ở cùng điều kiện bằng cách

khuếch đại hai đoạn gen leuA [47, 48]

Vào năm 2006, Gunji và Yasueda tiến hành chuyển gen lysE từ C.glutamicum vào Methylophilus methylotrophus AS1 kích thích biểu hiện đột biến dapA24 sẵn

có trên Methylophilus methylotrophus kết quả cho thấy năng suất lysine được tăng

kên đáng kể [27]

Tsụimoto, Yasueda và cs (2006) tiến hành khảo sát những gen quan trọng liên quan đến chu trình chuyển hóa tạo amino acid L-lysine bằng kỹ thuật nhân dòng