Khảo sát phương pháp cố định nấm men saccharomyces cerevisiae 28 trên chất mang cellulose vi khuẩn và ứng dụng

¾ Ứng dụng chế phẩm nấm men để lên men rượu chanh dây, so sánh động học lên men của chế phẩm so với tế bào tự do, đánh giá hiệu quả sử dụng của chế phẩm.. TÓM TẮT Tạo chế phẩm men giống

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày … tháng … năm 2008

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc

- Tp HCM, ngày tháng 8 năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: NGUYỄN AN HUY Giới tính : Nam

Ngày, tháng, năm sinh : 19-10-1982 Nơi sinh : TP Hồ Chí Minh

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2006

1- TÊN ĐỀ TÀI: “KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE 28 TRÊN CHẤT MANG CELLULOSE VI

KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG”

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

¾ Khảo sát các đặc tính sinh học của chủng Saccharomyces cerevisiae 28

¾ Tạo chế phẩm men giống cố định từ chất mang Bacterial Cellulose (BC) và

chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 28

¾ Khảo sát mật độ tế bào nấm men cố định trên BC trong quá trình cố định

¾ Khảo sát thời gian bảo quản của chế phẩm nấm men cố định

¾ Ứng dụng chế phẩm nấm men để lên men rượu chanh dây, so sánh động học lên men của chế phẩm so với tế bào tự do, đánh giá hiệu quả sử dụng của chế phẩm

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 25/02/2008

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30/06/2008

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

để tôi hoàn thành luận văn này

Xin cảm ơn sự giúp đỡ, ủng hộ và động viên của các bạn trong lớp CHCNSH06

Và cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Cha-Mẹ-gia đình tôi đã luôn quan tâm, ủng hộ và giúp sức trong suốt thời gian tôi làm luận văn tốt nghiệp

Tp.HCM, ngày 10 tháng 8 năm 2008

Nguyễn An Huy

TÓM TẮT

Tạo chế phẩm men giống cố định từ chất mang Bacterial Cellulose (BC) và

chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 28 đề tài thu được kết quả sau:

- BC là chất mang phù hợp trong cố định tế bào nấm men Chất mang BC có

ưu điểm hơn các chất mang khác trong kĩ thuật cố định tế bào nấm men: rẻ tiền, cấu trúc bền, có khả năng tái sử dụng nhiều lần

- Chế phẩm S cerevisiae 28 cố định trên BC bằng phương pháp bẫy hấp phụ ở

chế độ lắc 200 vòng/ phút trong thời gian 48 giờ đạt được mật độ tế bào 7,44×106 tb/ cm3 Sau thời gian sấy 20 giờ ở 400C mật độ tế bào đạt được 4,46×106 tb/ cm3 bằng 60% so với ban đầu

- Chế phẩm nấm men cố định bảo quản ở 40C sau 7 tuần có mật độ tế bào nấm men 3,5×106 tb/ cm3 giảm 21,5%

- Khi ứng dụng lên men rượu chanh dây, chế phẩm nấm men cố định có khả năng tái sử dụng 7 lần

ABSTRACT

After creating immobilized yeast cell product from Bacterial Cellulose (BC) and

Saccharomyces cerevisiae 28, the results were given as following:

- The suitable carrier in immobilized cell technology is BC The advantages of

BC carrier to other carriers are having cheap material, having steady structure, being able to recycle many times

- The product made from S cerevisiae 28, which is immobilized in BC by

trap– absorption method in 200 rpm/ minute shake condition and 48 hours, had 7.44×106 cells/ cm3 cell density Immobilized yeast cell product dried in

20 hours at 400C had cell survivor density of 4.46×106 cells/ cm3 (60% of cell density before dried)

- Immobilized yeast cell product stored at 40C in 7 weeks had 3.5×106 cells/

cm3 cell density, decreased 21.5% from beginning

- Utilizing this immobilized yeast cell product to ferment passion fruit alcohol, immobilized yeast cell product can be recycled up to 7 times

MỤC LỤC

MỤC LỤC vi

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG x

LỜI MỞ ĐẦU xi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 Đại cương về lên men rượu 1

1.1.1 Lên men rượu 1

1.1.2 Cơ chế hoá sinh học của lên men rượu 2

1.1.3 Cấu tạo, thành phần hoá học, dinh dưỡng nấm men 4

1.1.4 Nguyên liệu chanh dây sử dụng lên men rượu 10

1.2 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật 13

1.2.1 Chất mang 13

1.2.2 Cấu tạo, đặc tính của Bacterial Cellulose (BC) - chất mang sử dụng trong đề tài 14

1.3 Quá trình tạo chế phẩm men giống bằng cố định nấm men trên BC 18

1.3.1 Các phương pháp cố định 18

1.3.2 Ưu nhược điểm của nấm men cố định so với nấm men tự do 21

1.4 Những nghiên cứu về nấm men cố định trong lên men rượu 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu, hoá chất 24

2.2 Nội dung nghiên cứu 25

2.3.1 Phương pháp vi sinh 33

2.3.2 Phương pháp hoá sinh 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38

3.1 Khảo sát các đặc tính sinh học của chủng Sacharomyces cerevisae 28.38 3.1.1 Quan sát hình thái tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 28.38 3.1.2 Đường cong sinh trưởng của nấm men 39

3.2 Quá trình tạo chế phẩm men giống bằng cố định nấm men trên BC 42

3.2.1 Khảo sát mật độ tế bào trong thời gian cố định 42

3.2.2 Khảo sát thời gian bảo quản chế phẩm 44

3.3 Ứng dụng lên men rượu chanh dây 45

3.3.1 Khảo sát nguyên liệu 45

3.3.2 Lên men rượu chanh dây 46

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quy trình đường phân 3

Hình 1.2 Quy trình biến đổi glucose thành ethanol 3

Hình 1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 6

Hình 1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn 8

Hình 1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn 8

Hình 1.6 Trái chanh dây 11

Hình 1.7 Màng bacterial cellulose 14

Hình 1.8 Tế bào cellulose vi khuẩn(a) và thực vật(b) 15

Hình 1.9 Quá trình tổng hợp BC 18

Hình 3.1 Tiêu bản nhuộm xanh methylen của nấm men 38

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc nấm men trên thạch đĩa 39

Hình 3.3 Đồ thị đường chuẩn giữa OD và sinh khối khô (SKK) của S cerevisiae 28 .40

Hình 3.4 Đồ thị đường chuẩn giữa OD và mật độ tế bào của S cerevisiae 28 40

Hình 3.5 Đồ thị đường cong sinh trưởng, pH, 0Bx của S cerevisiae 28 41

Hình 3.6 Đồ thị so sánh mật độ tế bào S cerevisiae 28 cố định trên BC ở các chế độ lắc 120, 160, 200 vòng/ phút 43

Hình 3.7 Biến thiên mật độ tế bào theo thời gian 44

Hình 3.8 Đồ thị động học quá trình lên men sử dụng tế bào tự do 46

Hình 3.9 Đồ thị động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần 1, lần 2, lần 3, lần 4 48

Hình 3.11 Đồ thị so sánh hàm lượng đường tổng giữa lên men bằng nấm men tự do,

chế phẩm lần 1, lần 7, lần 8 51

Hình 3.12 Đồ thị so sánh độ rượu giữa lên men bằng nấm men tự do, chế phẩm lần 1, lần 7, lần 8 .52

Hình 3.13 BC trước cố định 53

Hình 3.14 Chế phẩm nấm men cố định sau 48 giờ 54

Hình 3.15 Chế phẩm nấm men cố định đạt độ ẩm 10% 54

Hình 1 Đường chuẩn glucose 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của một số axit tới nấm men 9

Bảng 1.2 Thành phần hoá học của chanh dây 12

Bảng 1 Giá trị đo OD theo mật độ tế bào 59

Bảng 2 Giá trị đo OD theo sinh khối khô 59

Bảng 3 Đồ thị đường cong sinh trưởng, pH, 0Bx của Saccharomyces cerevisiae 28 .59

Bảng 4 Biến thiên mật độ tế bào trong thời gian cố định 60

Bảng 5 Động học quá trình lên men của tế bào tự do 60

Bảng 6 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần nhất 60

Bảng 7 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần hai 60

Bảng 8 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần ba 61

Bảng 9 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần tư 61

Bảng 10 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần năm 61

Bảng 11 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần sáu 61

Bảng 12 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần bảy 61

Bảng 13 Động học quá trình lên men sử dụng chế phẩm lần tám 62

Bảng 14 Đường chuẩn glucose xây dựng bằng phương pháp DNS 62

Bảng 15 Giá trị hàm lượng đường tổng đo ở độ pha loãng 220 lần của dịch lên men trong quá trình lên men 63

LỜI MỞ ĐẦU

Rượu có nguồn gốc lịch sử lâu đời cách đây khoảng 7000 năm Người ta cho rằng rượu vang xuất hiện lần đầu ở các nước Ả rập vào khoảng thế kỉ 18 hoặc 19 trước Công Nguyên Ngày nay rượu vang được phổ biến trên toàn thế giới, và là thức uống quan trọng trong các dịp lễ tết Công nghệ sản xuất rượu đem lại nguồn lợi lớn về kinh tế Rượu vang có nguuồn gốc từ quả nho nên có tên gọi là “Vin” hay

“Wine” Ngày nay “rượu vang” được hiểu theo nghĩa rộng hơn là rượu lên men trực tiếp từ nước quả [23]

Trong công nghệ sản xuất rượu vang truyền thống, quá trình lên men được thực nhờ tế bào nấm men tự do Tuy nhiên việc sử dụng nấm men tự do còn tồn tại nhiều nhược điểm:

- Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp

- Sử dụng một lần nên làm giảm tính kinh tế nếu lên men ở qui mô công nghiệp

- Khó bảo quản, dễ thoái hóa giống

- Khó tự động quá trình lên men [11, 12, 24]

Do đó các nghiên cứu về nấm men cố định được thực hiện nhằm khắc phục những nhược điểm trên Các nghiên cứu chỉ ra rằng, nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do:

- Tốc độ sử dụng cơ chất lớn, năng suất lên men cao, chất lượng sản phẩm đồng đều, rút ngắn thời gian lên men

- Tái sử dụng nấm men cố định nhiều lần, góp phần giảm chi phí sản xuất

- Hoạt tính ổn định, tạo sản phẩm có chất lượng đồng đều [6, 11]

Từ những ưu điểm của nấm men cố định chúng tôi đã tiến hành đề tài “Khảo sát

phương pháp cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae 28 trên chất mang

cellulose vi khuẩn và ứng dụng ” Nội dung của đề tài gồm:

- Tạo chế phẩm men giống cố định từ chất mang Bacterial Cellulose (BC) và

chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae 28

- Khảo sát mật độ tế bào nấm men cố định trên BC trong quá trình cố định

- Khảo sát thời gian bảo quản của chế phẩm nấm men cố định

- Ứng dụng chế phẩm nấm men để lên men rượu chanh dây, so sánh động học lên men của chế phẩm so với tế bào tự do, đánh giá hiệu quả sử dụng của chế phẩm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1

1.1.1

Đại cương về lên men rượu

Lên men rượu

Lý thuyết về lên men rượu đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ lâu Năm

1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy, khi lên men đường không chỉ biến thành rượu mà còn tạo ra axit axetic Năm 1810, Gaylussac nghiên cứu và thấy rằng, cứ 45 phần khối lượng đường glucoza khi lên men sẽ tạo ra 23 phần alcol etylic và 22 phần khí cacbonic Trên cơ sở đó ông đưa ra phương trình tổng quát về lên men rượu như sau:

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + Q

Năm 1875, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thấy rằng, sự lên men chỉ xảy ra khi có mặt của vi sinh vật Nếu ngăn ngừa không cho vi sinh vật tiếp xúc với dịch đường thì hiện tượng lên men sẽ không xảy ra Ông kết luận “Sự lên men rượu là một quá trình sinh học có liên hệ mật thiết tới hoạt động của tế bào nấm men” Dịch lên men gồm rất nhiều tế bào men riêng biệt, 1gam men ướt có độ ẩm khoảng 70-75% chứa tới 14 tỉ tế bào, bề mặt mỗi tế bào chiếm 5.10-5 mm2 Như vậy

1 gam men ép có bề mặt tổng cộng khoảng 7.000 cm2 Nhờ có bề mặt này nên nấm men hấp thụ đường và các chất dinh dưỡng rất nhanh Cơ chế lên men rượu xảy ra như sau: Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thu qua bề mặt tế bào rồi thẩm thấu vào bên trong Ở đó các enzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo sản phẩm chính là rượu và khí cacbonic Hai chất này đều khuyếch tán và tan vào môi trường xung quanh Rượu do rất linh động nên hoà tan nhanh vào trong dịch lên men, còn khí cacbonic hoà tan kém và khuyếch tán chậm Lúc đầu hoà tan hoàn toàn, dần dần tạo thành các bọt khí bám quanh tế bào nấm men và lớn dần tới mức lực đẩy Archimedes lớn hơn khối lượng tế bào nấm men cộng bọt khí, lúc đó tế bào cùng bọt khí nổi dần lên, khi tới bề mặt các bọt khí sẽ tan vỡ và

hợp thành tiếng rào rào Bọt khí tan, tế bào nấm men lại chìm dần, tiếp xúc với dịch đường để hấp thu và lên men rồi lại sản xuất ra rượu và khí cacbonic

Nấm men có thể lên men trong dịch đường có nồng độ 25 đến 30%, nhưng chậm Nồng độ thích hợp cho đa số nấm men dùng trong sản xuất rượu là 15 đến 18% Nồng độ cao thì áp suất thẩm thấu lớn, do đó ảnh hưởng xấu đến hiệu quả lên men, lên men sẽ kéo dài, đường sót trong giấm chín sẽ tăng Nếu lên men ở nồng độ đường thấp dẫn đến không đủ cơ chất cho quá trình lên men nên hiệu quả lên men thấp [8, 12]

1.1.2 Cơ chế hoá sinh học của lên men rượu

Phương trình tổng quát lên men rượu như sau

C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 + 28 Kcal

Gồm các giai đoạn

• Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân)

Phân tử đường glucose trải qua một loạt phản ứng phức tạp dưới xúc tác của một loạt hệ thống enzym, phân tử glucose ban đầu được chuyển hoá thành 2 phân tử axit pyruvic

Hình 1.1 Quy trình đường phân [25]

Hình 1.2 Quy trình biến đổi glucose thành ethanol [25]

1.1.3 Cấu tạo, thành phần hoá học, dinh dưỡng nấm men

1.1.3.1 Cấu tạo của tế bào nấm men

Tế bào nấm men có cấu tạo rất phức tạp Người ta chia thành hai phần chính: vỏ

tế bào và phần trong của nội bào (vỏ và protoplasma)

Vỏ tế bào là một thành mỏng, trong suốt và có tính đàn hồi, có nhiệm vụ bảo vệ

tế bào khỏi tác động bên ngoài, đồng thời điều chỉnh mức độ thẩm thấu chất dinh dưỡng và thải ra ngoài các sản phẩm trao đổi chất

Vỏ tế bào được cấu tạo chủ yếu từ polysaccarit kiểu hemixenluloza gồm glucan

và manan Ngoài ra thành vỏ tế bào còn chứa một lượng rất nhỏ chất béo, protit, chất khoáng và xitin Thành tế bào gồm ba lớp: lớp ngoài là màng nhẵn dày 10 đến

30 nm gồm chủ yếu lypoprotein Lớp tiếp theo chứa phức hợp manan protein dày

100 nm Lớp trong cùng có thể là chất keo hoặc sợi li ti dày từ 10 đến 250 nm, cấu tạo từ những gốc glucan gồm 94% glucoza và khoảng 6% hexoamin

Vỏ tế bào được phát hiện có hai vùng mang tính thẩm thấu có chọn lọc đối với các chất khác nhau Vỏ tế bào chứa các lỗ có đường kính đến 3,6 nm, qua đó nước

và các chất dinh dưỡng cần thiết cho tế bào được đi vào bên trong

Các enzym được tách ra từ tế bào tập trung ở các lớp này, chúng phân ly các đường có phân tử lớn (maltoza, saccaroza) không có khả năng thẩm thấu vào trong được Nhờ đó các đường maltoza, saccaroza được đồng hoá

Vỏ trong của tế bào là màng plasma rất mỏng, dày khoảng 8nm và cũng gồm ba lớp, được cấu tạo từ phức hợp lypoprotein, canxi và ribonucleoprotein Chức năng chủ yếu của màng là điều chỉnh vận chuyển chất dinh dưỡng vào tế bào

Xitoplasma là hệ thống keo, độ nhớt của nó phụ thuộc vào thời kì sinh trưởng và

các yếu tố sinh lý Ở các tế bào non trẻ, độ nhớt của xitoplasma nhỏ hơn ở tế bào già, bảo đảm cho việc vận chuyển sản phẩm trao đổi chất được tốt hơn

Nhân tế bào: tế bào nấm men đã có nhân thật, nhân thường có dạng hình bầu dục

hay hình cầu Nhân được bao bọc bởi một lớp màng, bên trong là lớp dịch nhân và

có trong đó một thể rắn gọi là hạch nhân

Không bào: chứa đầy dịch tế bào, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp màng

hypoproteit gọi là màng không bào Không bào là nơi chứa đựng các proteaza

Ty thể: tham gia như là một nhà máy cung cấp năng lượng cho tế bào hoạt động Riboxom: tham gia mọi quá trình tổng hợp các hợp chất trong cơ thể

Valutin gồm các chất chứa nitơ, dẫn xuất của axit nucleic Nó có quan hệ tới sinh

trưởng của nấm men và xuất hiện trong thời kỳ sinh trưởng, nẩy chồi hay tạo nang bào Vaulutin nằm bên trong không bào, ở dạng hạt to (valutin nằm yên) hoặc nhiều hạt nhỏ phân bố xung quanh mặt bên trong của không bào (valutin hoạt động) Khi tiếp xúc với xanh metylen, valutin ở tế bào sống sẽ biến thành màu đỏ, còn ở tế bào chết sẽ biến thành màu xanh nhưng bản thân nấm men không đổi màu

Nhiệt độ sinh trưởng tốt nhất ở 27-33oC pH tối ưu 4,5-5,5 Tốc độ tăng trưởng, sinh sản nhanh Ở tế bào nấm men có một loại plasmid được gọi là “2µm plasmid”, quan trọng trong thao tác chuyển gen [5, 8, 11, 19, 21]

1.1.3.2 Thành phần hoá học và dinh dưỡng của nấm men

Thành phần hóa học và dinh dưỡng nấm men phụ thuộc chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy Men ép chứa trung bình 75% nước và 25% chất khô Các chất khô của nấm men bao gồm các thành phần sau: Protid 30 – 50%, (trung bình 40%)

đầu của lên men nồng độ đường còn cao, nên nấm men chứa nhiều glucogen Khi lượng đường giảm, nấm men sử dụng glucogen để duy trì sự sống

Protid chứa trong nấm men thường khoảng 35 đến 40% và có đủ các axit amin không thay thế Ở nhiệt độ cao và bình thường dưới tác dụng của proteaza có sẵn trong nấm men, protid sẽ biến thành pepton, peptid và axit amin

Chất béo là thức ăn dự trữ của nấm men và chứa chủ yếu trong nguyên sinh chất, hàm lượng khoảng 2 đến 5% khối lượng chất khô Ở nấm men gia súc, hàm lượng chất béo có thể đạt 10 đến 20% Trong nấm men còn chứa các chất tương tự chất béo như lơxitin, sterin và ecgosterin

Chất khoáng chiếm từ 5 đến 11% đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của tế bào nấm men đặc biệt là photpho Photpho thường ở dạng liên kết hữu cơ và có trong thành phần của photphatit, nucleoproteit cũng như axit nucleic

Để đảm bảo sự sống, nấm men cần các vitamin B1 có trong thành phần của coenzym cacboxylaza B2 có ở dạng photphoric, axit nicotin có trong cozymara v.v Biotin và axit paraminobenzoic là những chất kích thích cho sinh trưởng của nấm men [4, 8]

Hình 1.3 Nấm men Saccharomyces cerevisiae [29]

1.1.3.3 Các yếu tố hoá học, lý học ảnh hưởng tới sự sinh trưởng,

phát triển và lên men

• Ảnh hưởng nhiệt độ

Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong giới hạn 28-320C Nếu có điều kiện làm lạnh dịch đường tới 20-220C sẽ hạn chế được phát triển của tạp khuẩn Sau 8 đến 10 giờ nhiệt độ lên men sẽ tăng đến 28-300C, tiếp đó cần làm lạnh để ổn định nhiệt độ trong giới hạn tối ưu

Ở nhiệt độ cao, hoạt tính nấm men sẽ giảm nhanh nhưng chủ yếu là bị nhiễm lactic và nấm men hoang dại Ở nhiệt độ 300C, men hoang dại phát triển nhanh hơn

Saccharomyces 2 đến 3 lần, còn ở nhiệt độ 35-380C chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần [20, 22]

• Ảnh hưởng pH

Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo etylic là 4,5-5 Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8-5,2 nhằm kết hợp giữ cho amylaza tiếp tục chuyển hoá tinh bột và dextrin thành đường lên men được Nếu tăng pH thì dễ bị nhiễm khuẩn, glyxerin sẽ tạo nhiều hơn và do đó làm giảm hiệu suất lên men

Hình 1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn [8]

Hình 1.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phát triển của nấm men và tạp khuẩn [8]

• Ảnh hưởng của nồng độ dịch lên men

Nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả là rượu nhiều sẽ ức chế không những tạp khuẩn mà cả nấm men

Đường nhiều sẽ dẫn đến tổn thất hoặc sẽ kéo dài thời gian lên men Nồng độ dịch đường quá thấp sẽ không kinh tế vì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men Bình thường người ta khống chế nồng độ chất khô của dịch đường từ 16 đến

18% (tuỳ theo mức độ thuần khiết), tương đương 13-15% đường, để sau lên men

sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8,5 đến 9,5%V [4, 8, 24]

• Ảnh hưởng của một số hoá chất và chất sát trùng

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của một số axit tới nấm men

Nồng độ Làm ngừng sinh trưởng Tiêu diệt men Axit

Thời gian làm tiêu diệt(giờ) Clohydric

0,038 0,039 0.031 0,125 0,100

0,72 1,30 2,00 3,00 3,00

0,195 0,132 0,204 0,500 0,333

0,46 2,04 1,28 1,25 1,27

[8] Trong điều kiện sản xuất người ta cần dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn Có thể dùng nhiều hoá chất khác nhau như clorua vôi, formalin hay fluosilicat natri, tuy nhiên hàm lượng những chất sát trùng phải trong giới hạn cho phép, nếu vượt quá giới hạn sẽ ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men

Trong dịch đường lên men luôn chứa một lượng furfurol, melanoidin ít nhiều ảnh hưởng tới nấm men

Với nồng độ 0,002% thể tích dịch, furfurol ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng và trạng thái sinh lý của dịch lên men khi chứa 4 đến 6 triệu tế bào trong 1 ml, nhưng khi dịch lên men chứa 90 triệu tb/ml nồng độ furfurol 0,006% mới ảnh hưởng tới sinh lý nấm men

Caramelan không bị hấp thụ trên bề mặt nấm men nhưng với nồng độ 0,005% sẽ làm nhiều tế bào chết [4,8]

1.1.3.4 Các vi khuẩn có hại cho nấm men

Dịch đường lên men không chỉ là môi trường dinh dưỡng tốt cho nấm men mà còn cho các vi sinh vật khác Các vi sinh vật nếu lẫn vào dịch đường, chúng sẽ biến đường thành các sản phẩm khác và do đó làm giảm hiệu suất lên men rượu Trong điều kiện lên men rượu, thường gặp nhất là các vi khuẩn sau đây:

Vi khuẩn latic: Đây là loại vi khuẩn yếm khí, có nhiệt độ tối ưu 37- 380C Chúng biến đường thành sản phẩm là axit lactic (chủ yếu), tạo một lượng đáng kể các chất khác như alcol, axit axetic, cacbonic, diaxetyl, axetoin

Vi khuẩn axetic: là vi khuẩn hiếu khí, không tạo bào tử, có nhiệt độ tối ưu

khoảng 20 - 350C Chúng phát triển tốt trong canh trường có nồng độ alcol thấp, oxy hóa alcol thành axit axetic Vi khuẩn axetic thường phát triển trên bề mặt dịch lên men để lâu ngày [4, 8]

1.1.4 Nguyên liệu chanh dây sử dụng lên men rượu

Tên khoa học: Passiflora edulis, Sims thuộc họ Passifloraceae (họ Chùm Bao),

bộ Violales Chi Passiflora hiện có 400 loài, trong đó có khỏang 60 loài cho trái ăn

được

Tên thường gọi: Dây mát, Mát Mát, Chanh Dây/Chanh Sô-đa, trái MêLy

Tiếng Anh: Passion fruit/ passion vine, purple granadilla

Hình 1.6 Trái chanh dây [28]

• Đặc tính của chanh dây

Trái chanh dây chứa protein 1,2-2,4%, đường 5-8%, vitamin C 70 mg, carotenoid (chủ yếu là beta-caroten), tinh dầu, muối khoáng, các acid amin như leucin, valin, tyrosin, prolin, treonin, arginin, glycin, acid aspartic Hạt có nhiều dầu béo

Thịt quả chanh dây chín có vị chua ngọt, màu vàng nhạt, thường được dùng dưới dạng nước uống giải khát bằng cách bổ quả, lấy hết thịt bên trong, chà nhẹ rồi ép lọc lấy dịch quả Thêm đường trắng và nước sôi để nguội, khuấy đều để được một cốc Nước này có tác dụng bổ, mát, thanh nhiệt, tiêu khát, an thần, nhuận tràng, lợi tiểu

Có thể phối hợp với các loại quả khác như dứa, mãng cầu xiêm, sầu riêng làm thành nước sinh tố hỗn hợp cũng rất tốt Ngoài ra, ngọn non chanh dây luộc ăn hoặc

lá nấu thành cao lỏng cũng có tác dụng an thần trị mất ngủ như cây lạc tiên thường

(Passiflora foetida L.) [27]

Bảng 1.2 Thành phần hoá học của chanh dây

Đơn vị Trong

100g

Vitamin C (mg) 20.00 Vitamin E (mg) 3.00 B-Carotene Eq (ug) 10.00 Total A Eq (ug) 2.00 Sodium(Na) (mg) 28.00 Potassium(Ka) (mg) 350.00 Magnesium(Mg) (mg) 39.00 Calcium(Ca) (mg) 16.00 Phosphorus(P) (mg) 54.00

Zinc (Zn) (mg) 0.80 Manganese(Mn) (ug) 94.00 Copper (Cu) (mg) 0.12

Fructose (g) 2.20

[28]

1.2

1.2.1

Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật

Chất mang

• Vật liệu vô cơ

- Chất mang vô cơ tự nhiên

Zeolit: là các aluminosilcat có cấu trúc tinh thể theo không gian ba chiều, hình thành các cửa sổ và các lỗ xốp có kích thước cỡ phân tử Cấu trúc lỗ xốp bao gồm khoang lớn bên ngoài và khoang nhỏ bên trong hình thành các bát diện cụt [10] Các chất mang vô cơ tự nhiên khác còn được sử dụng là than hoạt tính, cát, silicate…

- Chất mang vô cơ tổng hợp

Alluminiu oxide, silicum oxide, sợi bông thuỷ tinh thuộc nhóm chất mang vô cơ tổng hợp

• Vật liệu hữu cơ

Vật liệu hữu cơ gồm polymer sinh học và polymer tổng hợp hoá học

1.2.2 Cấu tạo, đặc tính của Bacterial Cellulose (BC) - chất mang sử dụng trong đề tài

Sợi cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định và sức căng cao BC có độ bền sinh học cao

Màng cellulose được tổng hợp trực tiếp do đó sản xuất các sản phẩm mong muốn không cần qua các bước trung gian

Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose ( kiểm soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose

Có thể tác động lên các yếu tố liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose Do đó

có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử của cellulose

Xét trên tất cả các tính chất trên, BC hoàn toàn phù hợp là chất mang để cố định

tế bào vi sinh vật [14 ,30]

1.2.2.3 Quá trình tổng hợp BC

Ngày nay con đường sinh tổng hợp BC ở vi khuẩn A.xylinum được nghiên cứu

rất rõ Nó bao gồm nhiều bước, dưới sự xúc tác của nhiều enzym đặc hiệu, protein điều hoà Quá trình bao gồm sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDPGlc) là cấu trúc tiền cellulose sau đó được polyme hoá vào chuỗi 1,4 β- glucan [Hình 19]

• Tổng hợp cấu trúc tiền cellulose

A.xylinum biến đổi hợp chất của cacbon, như hexose, glycerol,

dihydroxy-aceton, pyruvate, và dicarboxylic acid thành cellulose với hiệu xuất chuyển hoá khoảng 50%

Đầu tiên, glucose nguyên liệu bị phosphoryl hoá thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P) dưới sự xúc tác của enzym glucokinase (GK) Tiếp theo Glc-6-P bị đồng phân hoá thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzym phosphoglucosemutyesa (PGM) Glc-1-P được chuyển hoá thành UDPGlc (uridine diphosphoglucose) do enzym xúc tác UGP (pyrophosphorylase uridine diphosphoglucose) Sau cùng UDPGlc được tạo thành cellulose dưới sự xúc tác của enzym celulose synthase (CS)

Một số vi khuẩn còn có khả năng sử dụng fructose để tạo cellulose Fructose

phosphate ( Fru-bi P) nhờ enzyme fructose-1-phosphatekinase (1PFK) Fru-bi P được biến đổi thành Fructose-6-phosphate (Fru-6-P)

Fructose-6-phosphate được chuyển thành glucose-6-phosphate nhờ enzym đồng phân phosphoglucoisomerase (PGI).Tiếp theo sau đó glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hoá tương tự như trên để tạo ra cellulose [Hình 19]

• Giai đoạn kết tinh

Các phân tử UDPGL được polyme hoá thành chuỗi 1,4-β-glucan Sau đó các chuỗi 1,4-β-glucan kết hợp với nhau tạo thành cấu trúc dạng dải ruy băng gồm hàng Trong đó các chuỗi glucan kết hợp với nhau nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals Các chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi cuối cùng tạo thành các sợi cellulose [14, 30]

1.3.1.1 Gắn tế bào bằng liên kết cộng hoá trị, ion:

Dựa trên sự tạo thành liên kết hoá trị (ion) giữa các chất mang được hoạt hoá thông qua các nhóm hoạt động của amino acid và các chất khác có mặt trong vách tế bào với các chất hai chức năng như glutaraldehyde

Quá trình gắn vào bên trong gel lỏng, trơ về mặt sinh hoá là phương pháp thông dụng nhất để cố định tế bào Tế bào có thể gắn vào gel nhờ tạo liên kết hoá trị, thí

dụ polymer hoá acrylamide, nhờ lực ion, khi polymer hoá trong alginate-Ca

Còn quá trình gắn tế bào vào các gel, màng sợi, thì được coi là phương pháp cơ học, mặc dầu bản chất của nó cũng chính là các tương tác vật lý và hoá học

1.3.1.2 Cố định tế bào bằng nguyên liệu cellulose

Nguyên liệu dạng sợi để làm chất mang cho quá trình cố định tế bào vi sinh vật rất được quan tâm trong thời gian gần đây Nhìn chung sợi có diện tích bề mặt riêng cao, có độ bền cơ học lớn và có thể được tạo ở bất kì dạng hình học nào Sợi có đặc tính thuỷ lực học rất tốt điều này cho phép sử dụng chúng trong các thiết bị khác nhau, trong đó có thiết bị kiểu cột, kiểu hoạt động liên tục

Cho đến nay người ta đã biết 4 phương pháp chủ yếu để thu nhận sợi cơ học chứa các tế bào vi sinh vật cố định:

- Đưa sinh khối chứa tế bào vi sinh vật vào cấu trúc của sợi trong quá trình hình thành chúng

- Gắn tế bào vi sinh vật nhờ các liên kết hoá học

- Hấp phụ tế bào vi sinh vật lên các sợi mang

Trong đó phương pháp đưa sinh khối chứa vi sinh vật vào sợi trong quá trình hình thành sợi (quá trình polymer hoá sợi) là một trong những phương pháp triển vọng nhất, phương pháp này đơn giản trong thao tác hoạt động, không đòi hỏi cải tiến hoá học đối với chất mang polymer

• Quá trình polymer hoá sợi

- Vật liệu

Cellulose, các ester đơn và các ester phức của cellulose, polycarbonate…

Dung môi cho polymer: Methylenechloride, toluol, dichloroethane, chloroform Chất tạo cặn: toluol, petroleum ether, glycerine, methanol

- Tiến hành

Bổ sung vào dung dịch chứa polymer tạo sợi trong dung môi hữu cơ không phân cực dung dịch nước hoặc huyền phù tế bào cần cố định Sau đó nhũ hoá hỗn hợp bằng cách khuấy Nhũ tạo thành thuộc loại “nước trong mỡ” với kích thước hạt của phase nước không lớn hơn 5 µm được trộn với dung dịch đậm đặc của chính polymer tạo sợi cùng trong dung môi nói trên

Điều chỉnh nồng độ polymer đến giá trị mà ở đó nó tạo được sợi

Ép chúng qua thiết bị ép đùn vào bể lắng chứa dung môi hữu cơ trộn lẫn với dung môi của polymer tạo sợi

• Gắn tế bào vi sinh vật nhờ liên kết hoá trị:

- Vật liệu

Ester phức của cellulose có chứa nhóm –NH2 (3-amino-4-methoxyphenyl)- sulfonylethylicester của cellulose

Sợi polyamide và polyacryonitrile được xử lý bằng các chất khử (alumohydride, borhydide sodium).Sau đó sẽ sử dụng nhóm –NH2 được tạo thành trên bề mặt sợi để gắn tế bào

- Tiến hành

Dịch huyền phù chứa tế bào vi sinh vật có thể được đưa trực tiếp vào các khe của sợi rỗng Sau đó sợi được giữ vài giờ ở nhiệt độ phòng, trong thời gian đó các tế bào sẽ khuyếch tán vào các lỗ của sợi

Theo cách khác, ép dịch huyền phù tế bào vào khoảng không gian giữa các sợi, dịch lọc sẽ đi ra ngoài qua khe của sợi, còn tế bào sẽ được giữ lại trong các lỗ sợi

Mật độ tế bào cao làm tăng năng suất, rút ngắn thời gian sản xuất

Đòi hỏi kích thước thiết bị nhỏ, gọn tiết kiệm chi phí thiết kế thiết bị

Khả năng tái sử dụng nhiều lần mà vẫn đảm bảo chất lượng sản phẩm

Ứng dụng cho nhiều loại cơ chất, do có thể cố định nhiều loại tế bào khác nhau lên chất mang

Quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật ít bị rữa trôi, nên luôn duy trì một lượng đủ lớn số lượng tế bào cần thiết cho quá trình lên men

Chất lượng sản phẩm đồng đều do số lượng, mật độ tế bào luôn ổn định trong quá trình lên men

• Nhược điểm

Trong một số trường hợp hoạt lực của tế bào cố định thấp hơn tế bào tự do

pH hoạt động tối ưu bị chuyển sang kiềm hay acid so với tế bào bình thường

Cơ chất muốn vào trong tế bào để thực hiện trao đổi chất tạo sản phẩm phải trải qua chất mang, thành tế bào, màng tế bào…Do đó làm hạn chế tốc độ chuyển hoá

cơ chất [6, 11, 16, 19]

1.4 Những nghiên cứu về nấm men cố định trong lên men rượu

Maritrenko V.A và các cộng sự (1988) có công trình nghiên cứu sử dụng các tế

bào nấm men có thể nâng cao hiệu suất quá trình tổng hợp rượu có kết luận sau: Trong phương pháp lên men tuần hoàn nếu sử dụng các tế nấm men cố định, lượng rượu tạo thành trong quá trình lên men sẽ cao hơn từ 1,5 đến 2% thể tích so với trường hợp sử dụng các tế bào nấm men tự do Tương tự phương pháp lên men liên tục thì lượng rượu tạo thành sẽ cao hơn từ 4 đến 5% [17]

P Mallios, Y Kourkoutas, và cộng sự (2004) với nghiên cứu về sản xuất rượu bằng nấm men cố định trên miếng lê và có kết luận sau: Cố định giống

Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 trên những miếng lê Sau đó tiến hành lên men

rượu nho theo hai cách theo mẻ, liên tục Các tế bào nấm men cố định ổn định và hoạt động ngay cả ở nhiệt độ thấp (<100C) Quá trình lên men rượu theo mẻ ở nhiệt

độ 80C kết thúc sau 15 ngày, trong khi ở 30C cần 36 ngày Quá trình lên men rượu theo phương pháp liên tục kết thúc sau 33 ngày tại nhiệt độ 100C Nồng độ alcol cao phân tử sinh ra thấp (1-propanol, isobutyl alcol, amyl alcol), ethyl acetate tạo ra nhiều hơn 118mg/ l, góp phần tạo hương trái cây trong quá trình sản xuất rượu [20] Minoru Nagashima, Masaki Azuma, Sadao Noguchi, Keiichi Inuzuka, Hirotoshi

Samejima (2004) với công trình nghiên cứu lên men rượu liên tục bằng tế bào nấm men cố định có kết luận sau: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định

nguyên liệu đường khác Nhiều cải tiến được ứng dụng để tránh nhiễm vi sinh hại

và ổn định họat tính tế bào nấm men trong quá trình lên men trong thời gian lâu dài

Sử dụng sterol và acid béo không no làm chất hấp thu vào gel nấm men cố định làm tăng cường khả năng tạo ethanol nhiều hơn 50 g/ l.h và kéo dài thời gian ổn định của chế phẩm nấm men cố định hơn 6 tháng Nồng độ tế bào cố định trên chất mang khoảng 250 g sinh khối khô/l gel Bể lên men được thiết có thể tích chứa 4000 l tạo được ethanol có hàm lượng 8-10% (v/v) từ dịch mật rỉ pha loãng không khử trùng trong lên men liên tục duy trì hơn 6 tháng Năng suất tạo ethanol trong 1 ngày là

600 l/ 1000l thể tích bể lên men [18]

Trong nước có một số nghiên cứu về nấm men cố định ở Đại học Bách Khoa Hà Nội với chất mang là alginate ứng dụng lên men rượu vang và bia ở quy mô phòng thí nghiệm Ứng dụng nấm men cố định ở quy mô công nghiệp chưa được đề cập đến

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về kĩ thuật cố định tế bào nấm men ứng dụng lên men rượu thường có chất mang là alginate và trái cây, tuy nhiên chất mang

từ các dạng này có nhược điểm là kém bền, ứng dụng quy mô nhỏ Chất mang BC chúng tôi chưa thấy được đề cập đến [4,11]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống vi sinh vật: Giống nấm men Sacharomyces cerevisiae 28 dùng để lên men

rượu Giống nấm men này được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, có nguồn gốc từ trung tâm Bảo Tàng Giống Vi Sinh Vật Chuẩn, Đại học Quốc Gia Hà Nội

Vật liệu cố định: Bacterial cellulose (BC) từ vi khuẩn Acetobacter xylinum dùng

để cố định nấm men được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, trong đề tài chúng tôi không khảo sát quá trình nuôi cấy thu nhận BC

• Nguyên liệu lên men: Quả chanh dây làm nguyên liệu cho lên men rượu

• Môi trường: Môi trường giữ giống và nhân giống S cerevisae 28

Môi trường Hansen:

trưởng của

nấm men

Cố định nấm men tạo chế phẩm men giống

Khảo sát thời gian

tế bào tự do và bằng chế phẩm

Khảo sát mật

độ tế bào cố định trên BC

Khảo sát khả năng tái sử dụng chế phẩm

Hình 2.1 Nội dung thí nghiệm