Khảo sát khả năng kháng khuẩn của enzyme lysozyme, thử nghiệm sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo

Nguyễn Đức Lượng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng kháng khuẩn của enzyme lysozyme và thử nghiệm sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo”

Lời Cám Ơn

Xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc PGS.TS Nguyễn Đức Lượng, người thầy đã hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em thực hiện luận văn

Xin cảm Ba mẹ và gia đình đã nuôi dưỡng và tạo điều kiện cho con được học tập và thực hiện được luận văn này

Xin bày tỏ lòng biết ơn cô Nguyễn Thị Thùy Dương đã tận tình truyền đạt kiến thức kinh, kinh nghiệm trong quá trình làm luận văn

Xin chân thành biết ơn các Cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã giúp đỡ

và tạo điều kiện tốt cho tôi trong thời gian làm luận văn này

Xin cảm ơn những người bạn đã cùng tôi học tập, trao đổi, động viên và có những giúp đỡ quý báu trong thời gian làm luận văn này

Cuối cùng tôi xin cám ơn chồng tôi, người đã động viên và luôn ở bên và giúp tôi vượt qua giai đoạn khăn trong thời gian tôi thực hiện luận văn này

Chu Thị Hà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện, không sao chép

của người khác

Chu Thị Hà

MỤC LỤC

LỚI CÁM ƠN I LỜI CAM ĐOAN……… II DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC ĐỒ THỊ VI DANH MỤC HÌNH .VII DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VIII TÓM TẮT NỘI DUNG IX

ABSTRACT X

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 2 TỔNG QUAN 2

2.1 Kiểm soát khả năng kháng khuẩn 2

2.1.1 Tác nhân vật lý và hóa học ảnh hưởng đến việc kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn 2

2.1.2 Các ảnh hưởng đối với vi khuẩn 3

2.2 Enzyme lysozyme 9

2.2.1 Cấu trúc của enzyme lysozyme 10

2.2.2 Tính chất hóa học của enzyme lysozyme 12

2.2.3 Lysozyme ức chế vi khuẩn 12

2.2.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, Gram âm của lysozyme 14

2.2.5 Tăng khả năng kháng khuẩn của lysozyme bằng cách kết hợp với một số chất kháng khuẩn 15

2.2.6 Ứng Dụng của lysozyme trong các lãnh vực khác nhau trên thế giới 21

2.2.7 Những nghiên cứu và ứng dụng lysozyme tại Việt Nam 25

2.3 Bảo quản thịt heo 26

2.3.1 Các biến đổi của thịt sau khi giết mổ 26

2.3.2 Các dạng hư hỏng thịt 27

2.3.3 Một số loại vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng của thịt 28

2.3.3 Các phương pháp bảo quản thịt hiện nay 30

Chương 3 MỤC TIÊU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

3.1 Nội dung của đề tài 31

3.2 Phương pháp nghiên cứu 31

3.2.1.Nguyên liệu, giống vi sinh vật, hoá chất, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 31

3.2.2 Phương pháp phân tích 35

3.2.3 Xử lý số liệu 36

3.2.4 Các phương pháp nghiên cứu cụ thể 37

Chương 4 KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 44

4.1 Tương quan giữa nồng độ lysozyme và khả năng kháng E coli, Listeria monocytogens 44

4.2 Tương quan giữa nồng độ nisin và khả năng kháng E coli, Listeria monocytogens 45

4.3 Tương quan giữa nồng độ EDTA và khả năng kháng E coli, Listeria monocytogens 46

4.4 Khả năng khả năng kháng E Coli, Listeria monocytogenes của hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE) 46

4.5 Ảnh hưởng của các loại màng khác nhau đến lượng vi sinh vật trên mặt thịt trong quá trình bảo quản 49

4.6 Tác dụng kháng vi sinh vật các tác nhân kháng khuẩn gắn lên màng gelatin trong 5 tuần 51

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

Bảng 3.3 Phương pháp pha dung dịch EDTA có nồng độ cần khảo sát……… 39

Bảng 3.4 Phương pháp pha hỗn hợp dung dịch kháng Listeria monocytogenes có

đối với E.coli ……… 47

Bảng 4.4 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes trên bề mặt thịt của màng

gelatin có gắn các tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần ……… 48 Bảng 4.5 Kết quả thống kê ảnh hưởng của nồng độ các chất trong hỗn hợp LNE

đối với Listeria monocytogenes ……… 51

Bảng 4.6 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes trên bề mặt thịt của màng

gelatin có gắn các tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần ……… 51

Bảng 4.7 Tác dụng kháng E.coli trên bề mặt thịt của màng gelatin có gắn các tác

nhân kháng khuẩn trong 5 tuần ……… 53

Đồ thị 4.4 Khả năng khả năng kháng E Coli, Listeria monocytogenes của hỗn

hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE)……… 52

Đồ thị 4.5 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes trên bề mặt thịt của màng

gelatin có gắn các tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần……… 52

Đồ thị 4.6 Tác dụng kháng E.coli trên bề mặt thịt của màng gelatin có gắn các

tác nhân kháng khuẩn trong 5 tuần……… 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu tạo lớp peptidoglican……… 5

Hình 2.2 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn G+, G_……… 8

Hình 2.3 Các cách tác động của chất kháng khuẩn lên vi khuẩn……… 9

Hình 2.4 Cấu trúc bậc một của lysozyme……… 10

Hình 2.5 Cấu trúc bậc 3 của lysozyme……… 11

Hình 2.6 Cơ chế phân cắt cơ chất của lysozyme ……… 14

Hình 2.7 Cấu tạo của Nisin……… 15

Hình 2.8 Phân tử EDTA……… 16

Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin - EDTA LNE

Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme –

EDTA GLE Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin GLN

Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin

Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn nisin - EDTA GNE

TÓM TẮT NỘI DUNG

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của enzyme lysozyme và thử nghiệm

sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo

Lysozyme là enzyme được tìm thầy nhiều trong lòng trắng trứng, nước mắt, sữa, nước bọt và một số loại rau, củ, quả Enzyme này có hoạt tính làm tan thành tế bào vi khuẩn bằng cách thủy phân liên kết 1,4 giữa acit N-acetyl muramic, N-acetyl glucosamine của mucopolysacharit trong peptidoglucan của thành tế bào vi khuẩn Lysozyme được Fleming phát hiện năm 1922 từ đó đến nay đã có nhiều nghiên cứu nhiều về tính chất, cũng như ứng dụng Nghiên cứu này khảo sát khả năng kháng khuẩn (G+, G-) của lysozyme, tăng cường khả năng này bằng cách kết hợp với các tác nhân kháng khuẩn khác, và bước đầu tiến hành thử nghiệm bảo quản thịt heo bằng cách tạo màng kháng khuẩn

Sử dụng hai loại vi sinh vật chỉ thị E Coli, listeria monocytogenes để

khảo sát khả năng kháng khuẩn của lysozyme, và hỗn hợp chứa lysozyme chúng tôi thu được kết quả như sau:

Lysozyme có hiệu quả khi chống lại Listeria monocytogenes nhưng bị hạn chế đối với E coli

Với nồng độ 500 µg/ml diệt được 99,99 % Listeria monocytogenes, 48.917% đối với E.coli

Khi kết hợp với EDTA, nisin thì khả năng kháng khuẩn của lysozyme được tăng cường

o Để ức chế 99,99 Listeria monocytogenes, lysozyme kết hợp với nisin

theo tỷ lệ: 150:125

o Để ức chế 99,012 , lysozyme kết hợp với nisin và EDTA theo tỷ lệ

lysozyme:nisin:EDTA: 500:500:125

Màng gelatin (7%) có gắn hỗn hợp lysozyme : nisin: 150:125 để phủ lên

miếng thịt nạc 1g nhiễm Listeria monocytogenes thì lượng Listeria

monocytogenes sau 24h ở nhiệt độ 40C giảm nhiều hơn so với từng tác nhân gắn lên màng

Màng gelatin (7%) có gắn hỗn hợp lysozyme : nisin: EDTA để phủ lên

miếng thịt nạc 1g nhiễm E.coli thì lượng sau 24h ở nhiệt độ 40C giảm nhiều hơn so với từng tác nhân gắn lên màng E.coli

Đối với thịt cho nhiễm vi sinh vật nhân tạo để trong môi trường lạnh thì

màng GLN chỉ có tác dụng ức chế được Listeria monocytogenes trong 7 ngày, sau đó hoạt tính giảm dần theo thời gian

Đối với thit cho nhiễm vi sinh vật nhân tạo để trong môi trường lạnh thì

màng GLNE chỉ có tác dụng ức chế được E.coli trong 35 ngày

Using two kinds of micro-organism as indicators: E.coli and listeria

monocytogenes to screen antiviral ability of lysozyme, and the compound that

contain lysozyme, we obtain result as follow:

Lysozyme has effectiveness when it resists Listeria monocytogenes, but restricts to E coli With the concentration of 500 µg/ml, Lysozyme can kill 99,99 % Listeria monocytogenes, 48.917% E.coli

Antiviral ability of lysozyme will be strengthened when combine with EDTA, nisin

Combination of 150 µg/ml lysozyme and 125 µg/ml nisin treatments

inhibit 99,99% Listeria monocytogenes

Combination of 500 µg/ml lysozyme and 500 µg/ml nisin, 125 EDTA

treatments inhibit 99,012% E.coli

Stick agents of antiviral ability on to the gelatin film (7%) that contain lysozyme, nisin, mixture of lysozyme – nisin respectively , then use it to cover a

piece of 1gram pork which is inoculated Listeria monocytogenes in

environment of 4 degree Celcius, 24 hours The result is that the quatity of

Listeria monocytogenes most decreased when we use the film containing

we use the membrane containing lysozyme – nisin – EDTA

For the pork contaiminated artificial micro-organism in environment of 4

degree Celcius, Lysozyme only inhibit Listeria monocytogenes in 7 days, after

that, its active ability decrease gradually

For the pork contaiminated artificial micro-organism in environment of 4

degree Celcius, Lysozyme only inhibit E.coli in 35 days

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Cục an toàn thực phẩm – Bộ y tế, trong 5 năm (2001-2005) cả nước xảy ra gần 1.000 vụ với hơn 23.000 người bị ngộ độc thực phẩm, trong đó có hơn

260 người chết Qua phân tích, ngộ độc do thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật chiếm

tỷ lệ cao nhất (33-49%), do hóa chất (11-27%), do chất độc tự nhiên (6-25%), còn lại không xác định được nguyên nhân Tỷ lệ tử vong 2005 được xác nhận là tăng 90% so với năm 2004.So cùng kỳ năm 2006, số vụ ngộ độc thực phẩm và số người mắc trong năm 2007 đều tăng từ hơn 6% đến 22,4%, riêng số người chết

giảm hơn 40% Những vi sinh vật chủ yếu gây ngộ độc là Salmonella anatum,

Listeria monocytogens, Escherichia coli, và Campylobacte [7]

Như vậy, thực phẩm không chỉ là nguồn cung cấp năng lượng và chất dinh dưỡng cho con người phát triển, duy trì sự sống và lao động, mà thực phẩm còn

là nguyên nhân gây ngộ độc cho con người, nếu như các biện pháp an toàn thực phẩm không được chúng ta tuân thủ

Một trong những phương pháp ức chế vi sinh vật, đó là sử dụng những tác nhân gây ức chế quá trình sinh sản và phát triển của vi sinh vật Các tác nhân này

có thể là những hợp chất hóa học được tổng hợp nhân tạo và cũng có thể là những hợp chất có nguồn gốc tự nhiên Xu hướng ngày nay, hạn chế sử dụng hóa chất , tăng cường sử dụng các tác nhân sinh học để bảo quản thực phẩm Do

đó, có nhiều nghiên cứu đã và đang tiến hành để tìm kiếm và sử dụng các tác nhân sinh học trong công nghiệp thực phẩm nói chung và trong bảo quản thực phẩm nói riêng

Một trong những tác nhân kháng khuẩn tự nhiên là lysozyme, một loại enzyme có trong trứng gà, nước mắt, một số loại thực vật… Lysozyme có tác dụng ức chế vi sinh vật với cơ chế phá hủy thành tế bào vi khuẩn Do cấu tạo thành tế bào của hai loại vi khuẩn Gram dương, Gram âm khác nhau nên khả năng kháng khuẩn của lysozyme chỉ hiệu quả cao đối với vi khuẩn Gram dương, đối với vi khuẩn Gram âm thì thấp hơn Vì vậy cần phải nghiên cứu hiệu quả tương tác của lysozyme với các chất khác để tăng cường khả năng sử dụng lysozyme ức chế nhiều loại vi sinh vật đồng thời ứng dụng bảo quản các loại thực phẩm khác nhau bằng lysozyme Được sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn

Đức Lượng, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng kháng

khuẩn của enzyme lysozyme và thử nghiệm sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo”

Đề tài này mang ý nghĩa khoa học: Góp phần giải quyết được một phần vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Tạo tiền đề cho việc nghiên cứu và ứng dụng lysozyme trong thực phẩm và các ngành khác

Yêu cầu của đề tài: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của lysozyme đối với các vi sinh vật chỉ thị Tạo được màng bao kháng khuẩn có chứa lysozyme Khảo sát tác dụng bảo quản của màng bao lên thực phẩm được bảo quản

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 Kiểm soát khả năng kháng khuẩn

Việc kiểm soát sự phát triển của các vi sinh vật có trong môi trường không khí trong nhà, môi trường công nghiệp, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm và công nghệ sản xuất dược phẩm là rất cần thiết Kiểm soát quá trình sống của vi sinh vật có thể giúp ngăn chặn và điều trị các căn bệnh lây nhiễm, kìm hãm sự phân hủy thực phẩm và các sản phẩm công nghiệp khác Hiện nay, phương pháp phổ biến để kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn là sử dụng các tác nhân hóa học

và tác nhân vật lý Đây là những tác nhân ảnh hưởng lên cấu trúc và chức năng của tế bào, từ đó sản xuất các chất diệt khuẩn hay các chất kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn Khái niệm hiệu quả diệt khuẩn được hiểu là khả năng tiêu diệt vi khuẩn ngay lập tức hoặc kìm hãm sự tái tạo số lượng tế bào và duy trì số vi khuẩn ở một lượng nhất định Việc quan tâm đến dạng hoạt động của các tác nhân hóa học và tác nhân vật lý là rất cần thiết nhằm lựa chọn và ứng dụng hình thức kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn một cách thích hợp

2.1.1 Tác nhân vật lý và hóa học ảnh hưởng đến việc kiểm soát sự phát

triển của vi khuẩn

Tác nhân hóa học

Có thể sử dụng các hóa chất có tác dụng tiệt trùng, khử trùng hoặc tẩy uế

để điều khiển sự phát triển của vi khuẩn

Tiệt trùng là dùng kỹ thuật vật lý hoặc hoá học để diệt tất cả những dạng sống của vi khuẩn Tẩy uế nói chung là một quá trình gây chết ít, trong đó, nội bào tử vi

khuẩn thường không vô hoạt nếu không để cho tiếp xúc thời gian lâu với những chất tẩy

uế có nồng độ cao Khử trùng là dùng chất sát trùng tác động lên mô sống nhằm ức chế

hoặc phá huỷ vi sinh vật Một số chất sát trùng có thể được sử dụng với cả hai vai trò: tẩy uế và sát trùng

Tác nhân vật lý

Các phương pháp vật lý để kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn bao gồm:

− Ảnh hưởng của nhiệt độ

− Ảnh hưởng của các tia bức xạ

− Ảnh hưởng của áp suất thấm lọc

− Ảnh hưởng của quá trình sấy

− Ảnh hưởng của dao động sóng âm

− Ảnh hưởng của quá trình lọc

2.1.2 Các ảnh hưởng đối với vi khuẩn

Các tác nhân vật lý và hóa học có hoạt tính khác nhau đối với quá trình phát triển của vi khuẩn Các tác nhân này tạo ra sự tổn hại, ảnh hưởng đến cấu trúc của một hoặc nhiều tế bào chính làm cho tế bào hoặc kìm hãm sự phát triển của tế bào Cơ chế của quá trình này là làm cho các bộ phận của tế bào như thành

tế bào, tế bào chất, enzyme và các axít nucleic không còn đảm nhận tốt chức năng của nó Các tác nhân có gây ra ảnh hưởng sau đối với tế bào:

Tổn thương thành tế bào

Việc làm tổn thương thành tế bào có thể đạt được bằng hai cách Một là, các tác nhân sẽ có tác dụng phá hủy một phần hoặc toàn bộ thành tế bào và làm cho chất nguyên sinh bị tổn thương Hai là, một số tác nhân khác sẽ kìm hãm sự tổng hợp thành tế bào, đây là một quá trình cần thiết trong suốt quá trình tái tạo tế bào của vi khuẩn Lúc này, do thành tế bào đã bị tổn thương, tế bào vi khuẩn trở nên dễ bị tiêu diệt vì chất nguyên sinh của nó không được bảo vệ Có sự khác biệt về cấu tạo giữa vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm Chính sự khác biệt này đã tạo ra cơ chế ức chế của lysozyme đối với vi khuẩn gram âm và dương khác nhau Lysozyme phân cắt liên kết β(1-4) glycosidic giữa C1 của N-acetylmuramic acid và C4 của N-acetylglucosamine, một liên kết tạo nên thành

tế bào vi khuẩn Thành tế bào có chức năng: duy trì hình thái của tế bào, hỗ trợ

sự chuyển động của tiên mao , giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào , cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên , tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể Nồng độ đường và muối bên trong tế bào thường cao hơn bên ngoài tế bào vì vậy mà tế bào hấp thu khá nhiều nước từ môi trường từ bên ngoài vào, điều này dẫn đến tế bào sẽ bị phá vỡ nếu không có thành vững chắc Trong những trường hợp sau không quan sát thấy có sự tồn tại của thành tế bào:

Thể nguyên sinh Sau khi dung lysozyme để phá vỡ thành tế bào hoặc dung penixilin để ức chế việc tổng hợp thành tế bào có thể tạo ra những tế bào chỉ được bao bọc bởi màng tế bào chất Thường gặp ở vi khuẩn G+

Thể trần Thể nguyên sinh chỉ còn sót lại một phần của thành tế bào, thường chỉ gặp ở vi khuẩn G -

Vi khuẩn dạng L Chủng vi khuẩn thiếu thành tế bào được sinh ra do đột biến trong phòng thí nghiệm Tế bào của chúng phình to lên và rất mẫn cảm với

áp suất thẩm thấu, trên môi trường đặc, khuẩn lạc nhỏ bé và có dạng ốp lết

Microplasma Một dạng vi khuẩn không có thành tế bào sinh ra trong quá trình tiến hóa lâu dài của tự nhiên

Thể nguyên sinh và thể cầu có đặc điểm chung là không có thành tế bào,

tế bào trở lên có hình cầu, rất mẫn cảm với áp suất thẩm thấu, có thể có tiêm mao nhưng không di động được, không mẫn cảm với thể thực khuẩn, tế bào không phân cắt được…Nếu đang hình thành bào tử trước khi sinh ra thể nguyên sinh thì bào tử này vẫn hình thành một cách bình thường

Hoạt tính kháng khuẩn của lysozyme chỉ hiệu quả đối với vi khuẩn gram dương (G+), còn đối với vi khuẩn gram âm hoạt tính kháng khuẩn của lysozyme lại bị hạn chế Do vị trí và tỷ lệ của peptidoglican trong thành tế bào vi khuẩn gram dương và gram âm là khác nhau nên khả năng kháng khuẩn có sự khác nhau Một sai khác chủ yếu như sau về tỉ lệ các thành phần của thành tế bào:

Bảng 2.1 Thành phần cấu tạo của thành tế bào của vi khuẩn

Tỉ lệ % theo khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn Thành phần

5-20

0

20 cao

(Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, Vi Sinh Vật Học)

Cấu tạo thành tế bào vi khuẩnG +

Peptidoglican là loại polime xốp, không tan, khá cứng và bền vững, bao

quanh tế bào như một mạng lưới Cấu trúc cơ bản của peptidoglican gồm có 3 thành phần: N-axetylglucozamin (NAG), axit N-axetylmuramic (NAM) và tetrapeptit chứa cả L và D axit amin Để tạo thành mạng lưới cứng, tetrapeptit trên mỗi chuỗi peptidoglican (PG) liên kết chéo với các tetrapeptit trên chuỗi khác Cấu tạo của lơp peptidoglican được thể hiện ở hình 2.1

Hình 2.1 cấu tạo lớp peptidoglican

(Nguồn: http://employees.csbsju.edu)

Axit teicoic là một thành phần đặc trưng của tế bào vi khuẩn G+ Axit teicoic là polime của ribitol và glixerol phosphate liên kết với PG hoặc màng tế bào chất Loại liên kết với màng tế bào chất được gọi là axit lipoteicoic Do tích điện âm, axit teicoic giúp cho việc vận chuyển các ion dương vào, ra tế bào và giúp tế bào dự trữ phosphate Ngoài ra axit teicoic còn liên quan đến kháng nguyên bề mặt và tính gây bệnh của một số vi khuẩn G+ Chúng còn gọi là thụ thể hấp phụ đặc biệt đối với một số thể thực khuẩn Như vậy, nếu sử dụng lysozyme để phá vỡ thành thì tế bào sẽ hình thành thể nguyên sinh, mất kháng nguyên dễ bị tổn thương Năm 1957, Salton đã phát hiện ra cơ chế hoạt động của lysozyme, khi mà ông sử dụng 3 loại vi khuẩn gram dương để chứng minh lysozyme làm mất đi hoàn toàn thành tế bào của những vi khuẩn này và phóng thích acetyl amino đường và acetyl muranic acid [25]

Thành tế bào G -

Vi khuẩn G- có thành tế bào với cấu trúc khá phức tạp Lớp ngoài cùng của thành phần tế bào là hai lớp lipopolisaccarit có đan xen với các phân tử protein Các protein này đã được chứng minh là có khả năng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác Thành tế bào cho phép các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản sự xâm nhập của một số chất có hại đối với tế bào (thuốc nhuộm, một số chất kháng sinh, muối mật, muối kim loại năng, một số enzyme phân giải)

Thành tế bào vi khuẩn gram âm có cấu tạo như sau:

Lớp trong cùng là một lớp PG mỏng PG của vi khuẩn G- chỉ khoảng 10%, tiếp theo lớp PG là một lớp không gian chu chất và cuối cùng là lớp màng ngoài

5 Màng ngoài là lipopolisaccarit (LPS) LPS dày khoảng 85 10 nm và cấu

tạo bởi 3 thành phần như sau:

+ Lipit A: bao gồm 2 phân tử N-axetylglucozamin và 5 chuỗi dài axit béo

Phần lipit A là nội độc tố của vi khuẩn, gây ra sốt, tiêu chảy, phá hủy hồng cầu và dẫn đến sốc, gây nguy hiểm

+ Kháng nguyên O: phần polisaccarit vươn khỏi màng vào môi trường,

gồm các phân tử hexozơ (bao gồm galactozơ, ramnozơ, mannozơ, abequozơ) Kháng nguyên O quyết định nhiều đặc tính huyết thanh của các vi khuẩn có chứa LPS và là vị trí gắn (thụ thể) của thể thực khuẩn

Màng ngoài của vi khuẩn G- còn có thể chứa một số loại protein, đó là:

Protein cơ chất (matrix protein): chẳng hạn porin ở vi khuẩn E.coli Porin

còn gọi là protein lỗ Các protein này nằm xuyên suốt qua màng ngoài và cho phép đi qua chúng một số loại phân tử như đường (nhất là disaccarit), axit amin, dipeptit, tripeptit, penixilin và các ion vô cơ

Protein màng ngoài (outer membrane protein, OMP): OMP là loại protein

có năng lực vận chuyển chuyên biệt một số phân tử khá lớn và đưa chúng đi qua màng ngoài, như vitamin B12, nucleotit, fericrom, enterokelin

Lipoprotein: bao gồm rất nhiều chủng loại, chủ yếu là các lipoprotein có khối lượng phân tử 7200, chúng có vai trò liên kết giữa lớp PG bên trong với lớp màng ngoài

Sự hiện diện của màng ngoài vi khuẩn đã hỗ trợ hàng rào thấm lọc chính chống lại các phân tử nguy hiểm như lysozyme và chất kháng sinh

- Lớp không gian chu chất: lớp không gian chu chất không chỉ ở giữa lớp

màng ngoài và lớp PG mỏng ở thành tế bào vi khuẩn G- mà còn có ở giữa lớp thành tế bào và lớp màng tế bào chất của cả vi khuẩn G+ lẫn vi khuẩn G- Bên trong lớp này có chứa rất nhiều thành phần như proteinaza, nucleaza, protein vận chuyển qua màng, protein thụ thể (làm chỗ bám của thể thực khuẩn)… Ngoài ra,

nó cũng chứa enzyme phân giải làm vỡ các chất nền không vận chuyển được và tạo thành các chất dinh dưỡng vận chuyển được

- Lớp trong chứa một lớp đơn peptidoglican mỏng (5-20nm) không chứa acid teichoic [2]

Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn G- và G+ được mô tả ở hình 2.2 dưới đây

Hình 2.2 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn G + , G -

( nguồn www.employees.csbsju.edu)

Phá hủy màng tế bào

Việc điều khiển sự phát triển của vi khuẩn có thể đạt được bằng cách phá huỷ màng tế bào, đây cũng là nguyên nhân gián tiếp gây chết tế bào Hơn nữa, bản chất lựa chọn của màng có thể bị ảnh hưởng mà không gây phá hủy hoàn toàn Hậu quả dẫn đến là làm giảm đi các phân tử tế bào chính hoặc cản trở sự hấp thu chất dinh dưỡng của màng tế bào vi khuẩn Trong cả hai trường hợp, quá trình trao đổi chất sẽ bị ảnh hưởng

Sự biến đổi trạng thái của tế bào chất

Khi xảy ra sự biến đổi trạng thái của tế bào chất, tế bào sẽ bị phá huỷ bởi

vì các tác nhân điều khiển sẽ tạo nên sự biến chất protein của tế bào chất Các protein bị đông lại, trong trạng thái dạng khối, cục và do đó không thể hoạt động

về mặt sinh học

Khử hoạt tính của enzyme

Tuỳ thuộc vào hoạt tính của tác nhân hóa học hoặc tác nhân vật lý được đưa vào để điều khiển quá trình phát triển của vi khuẩn mà enzyme do vi khuẩn tạo ra sẽ bị khử hoạt tính Khi này, tế bào không thể thực hiện các chức năng sống thiết yếu của nó Việc khử hoạt tính của enzyme được thực hiện thông qua

cơ chế kìm hãm cạnh tranh hoặc cơ chế kìm hãm không cạnh tranh

Thay đổi cấu trúc và chức năng của phân tử ADN

Phân tử ADN là trung tâm điều khiển tế bào Vì vậy, tác động vào ADN

sẽ làm tế bào kìm hãm sự phát triển hoặc thậm chí có thể tiêu diệt tế bào vi khuẩn Các tác nhân tác động lên ADN gây nên nhiều chổ nứt hoặc bóp méo cấu trúc phân tử ADN, từ đó gây cản trở sự tái tạo và vai trò trong tổng hợp protein của ADN

Các ảnh hưởng nói trên của các tác nhân đến vi khuẩn được thể hiện ở hình 2.3

Hình 2.3 Các cách tác động của chất kháng khuẩn lên vi khuẩn

2.2 Enzyme lysozyme

Lysozyme được Fleming khám phá lần đầu tiên ở trong nước mũi vào năm 1922 Chẳng bao lâu sau, Fleming khám phá hoạt tính phân hủy vi khuẩn của lysozyme tìm thấy trong lòng trắng trứng, nước mắt, sữa, nước miếng và một

số loại rau củ Tên lysozyme bắt nguồn từ chữ enzyme và hoạt tính làm tan thành

tế bào vi khuẩn Ông đã chứng minh được lysozyme là một chất kháng vi khuẩn Gram dương

2.2.1 Cấu trúc của enzyme lysozyme

Lysozyme từ lòng trắng trứng gà là loại đầu tiên nhờ kỹ thuật 3-D, xác định cấu trúc và tính chất [9]

EC 3-2-1-17, lysozyme (muramidase, mucopeptit N-acetylhydrolase) từ lòng trắng trứng gà là một polypeptit gồm 129 gốc acid amino có phân tử lượng

14400 Lysozyme là một protein tích điện dương với điểm đẳng điện 10.7-11 Trong lòng trắng trứng, lysozyme chiếm khoảng 3.5% trong tổng lượng protein Lyszoyme là một enzyme có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gram-dương bằng cách thủy phân liên kết -1,4 giữa acid N-acetylmuramic (NAM) và N-acetylglucosamine (NAG) của mucopolysaccharid trong peptidoglican của thành

tế bào vi khuẩn

Hình 2 4 Cấu trúc bậc một của lysozyme (Nguồn: Astrid Rau,Structure of the muramidase)

Lysozyme là protein có trật tự và cấu trúc 3-D được phân tích toàn diện Lysozyme từ lòng trắng trứng gà là một protein monomeric, chứa 4 cầu nối disulfit: Cys 6-127, 30-115, 64-80, và 76-94 và không có nhóm sulfhydryl tự do

nào Lysozyme có cấu trúc bền bỉ trong dung dịch hòa tan nước Khi các nối disulfit bị mất đi, lysozyme chuyển từ cấu trúc nguyên thủy sang cấu trúc lỏng

Phân tử lysozyme có dạng hình trứng, chứa hai vùng hay hai thùy, liên kết bởi một -helix dài, ở giữa là vị trí hoạt động của enzyme Thuỳ dưới được tạo bởi các gốc 40-88, chứa vài cấu trúc xoắn ốc và phần lớn các cấu trúc -sheet không song song Thuỳ thứ trên được tạo bởi gốc 1-39 và 89-129, chủ yếu là các cấu trúc xoăn ốc lớn Hai thùy của phân tử được liên kết với nhau thông qua tương tác giữa gốc Lys 97 và gốc Phe 38 Phân tử cấu tạo theo quy luật “kị nước ở trong”, “hút nước ở ngoài” của protein, tất cả các nhóm phân cực nằm trên bề

mặt và đa số các nhóm không phân cực (kị nước) nằm bên trong [23]

Sự chuyển đổi trạng thái để thích nghi của lysozyme liên quan đến sự chuyển động của hai thùy tương tác với nhau, do đó cho phép các chuyển động quan trọng của các vùng cấu trúc bên trong phân tử Sự chuyển động của hai thùy gây ảnh hưởng lẫn nhau giữa các vùng trong phân tử lysozyme, gây ra một sự thay đổi toàn diện về hình dạng, từ đó có thể cho phép lysozyme xâm nhập vào chất nền và tạo ra môi trường thích hợp cho các xúc tác Sự chuyển đổi hình thái

để thích nghi của lysozyme có vai trò quan trọng trong hoạt tính enzyme [23]

α helix

Cystine S–S Liên kết disulfit

β sheet

β bend

Hình 2.5 Cấu trúc bậc 3 của lysozyme

(nguồn: http://www.biochem.arizona.edu)

Mô hình của lysozyme được vẽ bằng máy tính Các gốc Cα làm thành xương sống của lysozyme, có màu xanh và lớp vỏ protein màu tím Nhìn tổng quát, lớp vỏ protein có dạng hình elip Các axit amin quan trọng cho xúc tác là gluctamtae-35 (Glu-35) và aspartate (Asp-52) Rãnh trong của lysozyme là nơi chất nền được kết nối vào

2.2.2 Tính chất hóa học của enzyme lysozyme [17]

Kể từ khi được Alexander Fleming phát hiện ra lysozyme, đã có nhiều nghiên cứu về đặc tính kháng khuẩn của enzyme này đối với nhiều loại vi sinh vật khác nhau và các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của nó như nhiệt độ, pH, ion… cụ thể các tác nhân ảnh hưởng như sau:

pH: một số nhà nghiên cứu đã thực hiện thí nghiệm trong môi trường trung tính và môi trường acid, đã nhận thấy rằng đối với lysozyme có nguồn gốc

từ trứng gà có vùng pH hoạt động là 6.0-7.0, còn pH tối thích khoảng 6.2 Đối với lysozyme sò, pH tối thích trong điều kiện có ion là khoảng 5.5 đến 6.0

Nhiệt độ: Khả năng phân cắt thành tế bào của lysozyme trong lòng trắng trứng tăng dần khi nhiệt độ tăng (khoảng 60o C) Lysozyme sò có họat tính tăng khi nhiệt độ tăng dần từ 00 – 450C và giảm dần khi nhiệt độ lớn hơn 550C [30]

Sự có mặt của các chất hoạt hóa: lysozyme có họat tính phân cắt lớn nhất khi có mặt của muối kali, magiê, canxi với nồng độ khoảng 0,1

2.2.3 Lysozyme ức chế vi khuẩn

Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được rằng lysozyme có khả năng ức chế sự phát triển của cả Gram dương bằng hoạt tính enzyme và Gram âm không bằng hoạt tính enzyme [18]

Có 6 vòng đường kết gắn với trung tâm hoạt động của lysozyme Khi tiếp xúc với trung tâm hoạt động của lysozyme NAM và NAG của peptidoglican liên kết với nhau tạo thành một hexasaccharid theo thứ tự sau đây: NAM NAG NAM NAG NAM NAG được ký hiệu A, B,C, D, E, F Lysozyme phân cắt liên kết β(1-4) glycosidic giữa vị trí D và E

Quá trình phân cắt của enzyme này đối với peptidoglican trải qua các giai đoạn sau:

ƒ Giai đoạn I: trung tâm hoạt động của lysozyme là một rãnh, chạy dọc phân tử enzyme Ba vòng đường ở vị trí D, E, F đi vào trung tâm hoạt động của enzyme Do có sự xoắn từ hình dạng ghế (chair) sang nửa ghế (half chair) với trạng thái tự nhiên của vòng đường thứ D (vị trí hexasaccharid bị cắt bởi lysozyme chính tại liên kết glycosidic của vòng cacbon D và E) mà hexasaccharid mới có thể gắn vào được trung tâm hoạt động của lysozyme

ƒ Giai đoạn II: Sau khi vị trí thứ 4 bị xoắn làm cho liên kết glycosidic giữa vị trí thứ D và E bị giãn ra Làm cho năng lượng của liên kết này chuyển từ trạng thái nghỉ sang trạng thái hoạt động Amino acid Glu 35 gần 2 vị trí D và E (cách cầu nối –O– bị bẻ gãy khoảng 3 Ao)cung cấp tính chất hóa học thích hợp để hoàn thành việc liên kết

ƒ Giai đoạn III: Nhóm carboxyl tự do của acid glutamic thứ 35 là chất nhường hydrogen và có khả năng chuyển H+ sang nguyên tử Oxy Khi bị mất điện tử Cacbon của Glu34 mang điện tích dương Bình thường ion cacbon không ổn định , nhưng nhờ lực hút điện tích âm nhóm carboxyl của Asp-52 sẽ tạo nên lực hút làm cho ion –OH có thể gắn với cacbon Tại pH=7, H20 sẽ phân ly thành H+ và OH- Sau đó H+ sẽ di chuyển về phía trái để thay thế vị trí đã mất của Glu-35 Kết quả l hexasaccharide sẽ

bị phân cắt và enzyme sẽ trở lại trạng thái ban đầu của chúng

Hình 2.6 Cơ chế phân cắt cơ chất của lysozyme

(www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a) Lysozyme ức chế vi khuẩn gram âm không nhờ trung tâm hoạt động mà phụ thuộc vào cấu trúc xoắn ốc ở hai bên thùy Đoạn cuối C (C-terminal) của cấu trúc xoắn

ốc sẽ tấn công vào kênh vận chuyển của lớp màng ngoài và phá hủy màng trong thông qua prolein lỗ

2.2.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, Gram âm của lysozyme

Năm 1957, Salton đã sử dụng lysozyme là tác nhân kháng 3 vi khuẩn

Micococcus lysodeikticus, Sarcina lutea, và Bacillus megaterium thì thấy có sự

phóng thích các nhóm đường acetyl amino Hoạt tính của lysozyme được xác định bằng cách đo độ đục của huyền phù và xác định lượng cơ chất tự do bị phóng thích [25]

Nếu như lysozyme phá vỡ thành tế bào của vi khuẩn gram dương bằng việc phân cắt peptidoglican, thì việc ức chế của lysozyme với gram âm theo cơ chế nào? Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy, khi thành tế bào đã cô lập của một loại vi khuẩn gram âm nào đó được ủ với lysozyme, thì độ đục của huyền phù bị giảm đi không đáng kể Điều này có thể giải thích là do những hợp chất không bị phân tách phóng thích bởi lysozyme bao gồm: alanine, axit glutamic, axit diaminopimelic, một phần nhỏ axit muramic, và axit amin [25] Trong một nghiên cứu của Ibarahim chỉ ra rằng hoạt tính kháng khuẩn của

lysozyme phụ thuộc vào hoạt tính muramidase của nó Theo During thì hoạt tính kháng khuẩn của lysozyme có sự tham gia gián tiếp của trạng thái giãn hình xoắn

ốc kị nước của điểm cuối C của lysozyme Lớp màng ngòai dày LPS của vi khuẩn gram âm cản trở sự tiếp xúc của enzyme lysozyme và cơ chất peptidoglican Để lysozyme có thể tác động đến peptidoglican cần một số tác nhân có tác dụng phá vỡ màng ngòai vi khuẩn gram âm trước.Trong đề tài này chúng tôi sử dụng nisin, EDTA là tác nhân phá hủy lớp LPS phía ngoài cùng, tạo điều kiện thuận lợi cho lysozyme tiếp xúc với lớp peptidoglican

2.2.5 Tăng khả năng kháng khuẩn của lysozyme bằng cách kết hợp với một số chất kháng khuẩn

2.2.5.1 Nisin

Nisin là độc tố mà vi khuẩn lactococus lactic sinh ra để chống lại tác dụng

của vi khuẩn G+ Nisin là một loại protein, bao gồm 34 amino acid

Hình 2.7 Cấu tạo của Nisin

Nisin chỉ có tác dụng đối với vi sinh vật, an toàn với người,vì nisin bị thủy phân bởi α - chromotrypsin Nisin được cho phép là một trong những chất bảo quản thực phẩm Khi sử dụng nisin sẽ làm giảm đi hàm lượng hóa chất dùng bảo quản, và nisin cũng không phá hủy chất dinh dưỡng cũng như màu, mùi, vị, trạng thái của thực phẩm Nisin được sử dụng như một tác nhân bảo quản thực phẩm từ những năm 1960 Dong-Sung Jung (1991) đã sử dụng nisin như là một tác nhân

kháng Listeria monocytogenes trong sản phẩm sữa lỏng Zottola đã sản xuất bơ

có chứa nisin, nhằm chống lại C.sporogenes, L monocytogenes và St aureus

[29] Năm 1951, nisin được bán rộng rãi với tên thương mại là Nisaplin®, chứa

khỏang 2,5% nisin Nisin được kết hợp với lipit II (có trong thành tế bào) tấn công vào thành tế bào chất gây ra thành lỗ hổng trên thành tế bào tạo điều kiện cho nguyên sinh chất tràn ra ngoài gây ức chế hoặc làm chết vi khuẩn Vi khuẩn gram âm có tính kháng với nisin vì thành tế bào của nó ít thấm hơn màng của vi khuẩn gram dương Tuy nhiên có một số phương pháp xử lý màng bán thấm của

vi khuẩn gram âm, làm chúng dễ bị tổn thương khi có mặt nisin

2.2.5.2 EDTA

EDTA (Ethylenediaminetetraacetic axit) là phân tử có thể tạo phức với ion kim loại EDTA là một polyprotic axit chứa 4 nhóm axit carboxylic và 2 nhóm amin với một cặp điện tử riêng lẻ Công thức cấu trúc thể hiện EDTA được tổng hợp theo một tỷ lệ nhất định từ ethylenediamine, formaldehyde và xyanua (HCN hay NaCN)

Ngoài 4 nhóm carboxylic hydrogen, EDTA có thể thêm 2 hydro nữa vào các nhóm amin Phân tử EDTA có ở 3 dạng cấu trúc: cấu trúc dạng đầy đủ của phân tử EDTA có thêm một proton (H6Y+2), dạng điển hình là (H4Y) và dạng đầy

đủ không có proton thêm vào (Y-4)

(Nguồn: Prince George’s Community College)

Hình 2.8 Phân tử EDTA

EDTA có hàm lượng và nồng độ cao nhất trong nước, đặc biệt là ở Châu

Âu (nguồn gốc chủ yếu là do con người sử dụng và thải vào nước) Các nghiên cứu cho thấy sự phân hủy EDTA bởi vi khuẩn trong môi trường là rất thấp Như vậy, EDTA hoạt động như một chất bền, khó bị phân hủy trong môi trường Mặt khác, EDTA có thể tạo phức với hầu hết các cation, do đó làm tăng tích lũy kim loại nặng trong môi trường

Nghiên cứu của Dufkova về tương tác của EDTA với vi sinh vật cho thấy EDTA là một chất độc kìm hãm sự phân chia tế bào, sự tổng hợp chlorophyl Ảnh hưởng của EDTA là đa dạng tùy theo từng loại sinh vật nghiên cứu, nồng độ

sử dụng và cấu trúc kim loại Vì vậy, cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về tính độc hại của EDTA [20]

Thuộc tính đặc biệt của EDTA là khả năng tạo phức với các ion kim loại theo tỷ lệ 1:1 EDTA có thể tạo phức với hầu hết các kim loại như: Ca+2, Mg+2,

Fe+2, Cr+3… Các phản ứng này thường phụ thuộc vào độ pH

Dạng đầy đủ không có proton thêm vào (Y-4) của EDTA nối vào ion kim loại có phương trình tổng quan như sau: M+ + Y-4 € MYn-4

Trong đó: M+ là ion kim loại và Y-4 là phân tử EDTA

EDTA có hoạt tính kháng khuẩn vì khả năng tạo phức với hầu hết các ion kim loại Ảnh hưởng của EDTA đối với vi khuẩn gram âm đã được báo cáo EDTA gây ra sự phá hủy màng ngoài bằng cách chuyển các cation hóa trị hai (Ca+2, Mg+2) với hậu quả làm mất đi lượng đáng kể các ion cần thiết cho quá trình tổng hợp lipopolysaccharides Ảnh hưởng này làm tế bào bị tổn thương, dễ

bị tấn công bởi những chất khác như chất tẩy, proteaza, lipaza và lysozyme Vì vậy, EDTA được dùng trong công nghiệp thực phẩm với vai trò của một tác nhân kìm hãm

Mặc dù lysozyme có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn gram -, tuy nhiên hiệu quả kháng khuẩn không cao so với tác động của nó

so với vi khuẩn gram+ Để khắc phục vấn đề này đã có nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tăng khả năng kháng khuẩn của lysozyme bằng cách kết hợp

lysozyme với các hợp chất kháng khuẩn khác Các chất được kết hợp đa phần có tác dụng bẻ gãy màng tế bào tạo điều kiện tiếp xúc lysozyme với cơ chất peptidoglican, một thành phần cấu tạo nên thành tế bào Shively và Hartsell đã chứng minh khả năng phân cách tế bào của lysozyme tăng đáng kể khi có sự trợ giúp của EDTA, sodium deoxycholate, isoamyl alcohol, ethanol, và thymol Theo Boland thì lysozyme kết hợp với EDTA ở pH thích hợp từ 6-8 Chất tạo phức thông dụng làm tăng khả năng phá hủy thành tế bào của lysozyme bằng cách hạn chế hiệu lực của ion kim loại, chất tạo cầu giữa các đại phân tử như lipopolysaccharides [26]

Raza đã nghiên cứu, tác dụng của hợp chất giữa lysozyme và các chất kháng khuẩn khác nhau đối với 7 loại vi khẩn gram+ và 8 loại Gram- khi sử phương pháp xác định MIC Kết quả là khi ức chế vi sinh vật bởi hợp chất lysozyme và EDTA để thì giá trị MIC nhỏ hơn so một mình lysozyme [24] Trong một nghiên cứu của Pay ne đã sử dụng EDTA (≤ 250 mg/l) kết hợp với lysozyme (≤ 200mg/l) để ức chế vi sinh vật trong sữa thanh trùng, kết quả là hợp

chất kháng khuẩn không có tác dụng đến pseudomonas flourescens và

S.typhimirim, sự phát triển của E.coli bị một mình EDTA ức chế nhưng không

nhiều bằng khi có sự kết hợp giữa EDTA và lysozyme[21]

E1- kest và Marth đã chứng minh, tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát

triển của listeria monocytogenes, một vi sinh vật có thể sống trong điều kiện

lạnh, của lysozyme được tăng cường khi có mặt của enzyme lipaza [13]

Hauben et al đã kết hợp lysozyme, nisin, và EDTA làm tác nhân kháng

khuẩn E.coli trong điều kiện áp suất cao Khi tăng áp suất từ 220 lên 320 MPa thì lượng E.coli bị ức chế nhiều hơn Khi E.coli cho vào môi trường đệm với áp suất

320 MPa thì lượng E.coli bị giết là 4.06 log, trong khi nếu thêm vào các tác nhân kháng khuẩn thì lượng E.coli bị giết sẽ tăng lên cụ thể là: 5.46 log (lysozyme),

5.71 log (nisin), 6.05 (EDTA), 6.90 log (lysozyme+nisin), 7.92(lysozyme+EDTA), 8.22 log (nisin+EDTA), > 8.22 log (lysozyme+nisin+EDTA) [16]

2.2.5.3 Gắn lysozyme lên màng bán thấm

Quá trình hư hỏng của thịt gắn liền với quá trình phân hủy thối rữa Đây là quá trình biến đổi phức tạp đặc trưng xảy ra trong thịt dưới tác dụng của các tác nhân không liên quan đến thịt Quá trình biến đổi protein đóng vai trò chính trong

sự phân hủy thối rữa Việc phân giải hợp chất này xảy ra do hoạt động sống của

vi sinh vật, phân giải protein, chúng tiết enzyme phân giải protein hoặc các sản phẩm thủy phân không hoàn toàn của nó Thịt ở trạng thái thủy phân thối rữa có chứa các độc tố gây hại cho sức khỏe của người sử dụng Sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt cuả thịt phụ thuộc vào hàm lượng nước trong và trên bề mặt thịt và nhiệt độ, độ ẩm, của môi trường xung quanh Để hạn chế sự hư hỏng này

có thể sử dụng màng bao, có thể gắn các hợp chất kháng khuẩn Màng này có tác dụng ngăn ngừa sự tiếp xúc của thịt đối với độ ẩm và vi sinh vật trong môi trường, làm giảm quá trình thoát hơi nước và tích tụ hơi nước trên bề mặt thực phẩm Hạn chế quá trình oxi hóa và giữ lại được màu, mùi, vị của thịt gần giống trạng thái ban đầu [2]

Ngày nay các vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm đặc biệt là việc sử dụng những hóa chất không được phép và không rõ nguồn gốc để kéo dài thời gian thương mại đã và đang làm tăng lên những bất an trong xã hội Vì vậy việc nghiên cứu và sử dụng những vật liệu có nguồn gốc thực phẩm để sử dụng trong công nghệ thực phẩm là hết sức cần thiết và cần được quan tâm Màng bán thấm

có thể được làm từ nhiều loại vật liệu có bản chất thực phẩm như chất béo, protein, và các đường đa phân tử (poli-sác-ca-rit)

Màng bán thấm có thể được làm từ nhiều loại polysaccharides và được sử dụng để làm giảm sự mất nước trong quá trình bảo quản ngắn hạn Tuy nhiên bản thân các chất polysaccharide cũng là những chất ưa nước vì thế chúng không thể

có chức năng ngăn cản sự mất nước Thực chất sự giảm quá trình mất nước với màng bán thấm làm từ polysaccharide được thực hiện qua cách khác gọi là sự mất nước thay thế, tức là sự mất nước vẫn xảy ra trên màng polysaccharide nhưng không làm mất nước của bản thân rau, quả Ngoài việc ngăn ngừa mất nước một số màng bán thấm polysaccharide còn có tác dụng hạn chế sự khuếch tán của không khí và oxy nhờ đó có tác dụng hỗ trợ trong bảo quản Các polysaccharide sử dụng làm màng bán thấm là cellulose, tinh bột, dẫn xuất của tinh bột, pectin và gum

Màng bán thấm được làm từ chất béo Màng bán thấm làm từ chất béo đã được sử dụng từ hơn 800 năm Màng bán thấm lipid được sử dụng bởi chúng có tính kị nước cao vì thế có tác dụng ngăn chặn sự mất nước Ngoài khả năng hạn chế mất nước màng lipid còn có làm giảm hô hấp nhờ đó kéo dài thời gian bảo quản cũng như cải thiện chất lượng cảm quan bên ngoài cho rau quả bằng cách tạo một lớp vỏ sáng bóng Màng lipid có thể được làm từ nhiều loại lipid khác nhau bao gồm acetyl monoglycerides, wax và chất bề mặt

Màng bán thấm có nguồn gốc từ protein Màng bán thấm ăn được có thể được làm từ nhiều nguồn protein khác nhau Protein cũng ưa nước và nhạy cảm với sự hấp thụ nước vì thế độ ẩm tương đối và nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến tính chất của chúng Các nguồn protein được dùng làm màng bán thấm ăn được gồm

có đạm của ngô, gluten của lúa mì, protein đậu tương, protein sữa và các protein

có nguồn gốc động vật như collagen, keratin và gelatin Bao bọc rau quả với màng thuần túy protein hiện không được sử dụng do hạn chế của chúng chống lại việc thoát hơi nước tuy nhiên màng hỗn hợp hoặc màng kép giữa protein và một vài vật liệu kị nước khác có khả năng tương hỗ với nhau làm tăng tính hữu ích của chúng

Gelatin, một loại protein được thu nhận từ sự thủy phân giới hạn sợi collagen Collagen được biến tính ở nhiệt độ cao làm tháo cấu trúc xoắn ba tạo các chuỗi tách rời, được làm lạnh và hấp thu nước mạnh sẽ tạo thành gelatin Gelatin có chứa 18 loại axit amin (không có tryptophan va cystine), có hàm lượng glycine, proline và hydroxyproline cao Gelatin không tan trong nước lạnh nhưng dễ tan trong nước ấm Khi thêm nước lạnh những hạt gelatin sẽ trương phồng tăng đến 5-10 lần trọng lượng Khi tăng nhiệt độ trên 400C những hạt gelatin này hòa tan để tạo thành dung dịch Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hòa tan của gelatin là nhiệt độ, nồng độ và kích thước hạt

2.2.6 Ứng dụng của lysozyme trong các lãnh vực khác nhau trên thế giới

Hiện nay, lysozyme đang được xem là một trong những chất kháng khuẩn rất có tiềm năng và có thể ứng dụng vào nhiều lĩnh vực nhất là lĩnh vực bảo quản thực phẩm do có các ưu điểm sau:

ƒ Lysozyme có khả năng kháng khuẩn cao và ngoài ra còn có khả năng kết

hợp với nhiều chất khác để tăng khả năng kháng khuẩn của mình đem lại hiệu suất khử khuẩn cao, mang lại hiệu quả kinh tế

ƒ Lysozyne vẫn giữ được hoạt tính sau khi phá hủy liên kết β-1,4 glycosidic Khi đun nóng 100 0 C, trong thời gian từ 1 – 2 phút, lysozyme không bị mất hoạt tính kháng khuẩn Ngoài ra, lysozyme còn bền trong dung dịch axit

ƒ Lysozyme được tìm thấy trong nhiều nguồn tự nhiên và không độc hại

ƒ Phương pháp thu nhận enzyme rất đa dạng, đơn giản và có thể thu nhận

số lượng lớn lysozyme với giá thành rẻ (từ lòng trắng trứng gà)

Ngoài các ưu điểm nêu trên, lysozyme còn có thể sử dụng ở mọi dạng: chất lỏng, chất xịt hay dạng rắn khô, chính vì vậy lysozyme đang được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực bảo quản thực phẩm Để tạo ra lysozyme dạng xịt khô, người ta nghiền lysozyme rắn thành bột mịn để thích nghi với dạng bình phun trong suốt quá trình chế biến thực phẩm Lysozyme đã chứng minh được lợi thế

về mặt kinh tế khi sử dụng, nên hiện đang được áp dụng đa dạng với nhiều ứng dụng trong lưu trữ, bảo quản thực phẩm, đáng kể nhất là trong quy trình công nghệ chế tạo pho mát

Lysozyme có những ứng dụng rất quan trọng trong các ngành công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm, trong ngành dược và trong lĩnh vực y khoa

Trong công nghiệp (chủ yếu là công nghiệp thực phẩm), lysozyme được

sử dụng như một chất lưu trữ, bảo quản thực phẩm Trong lãnh vực này, nước Nhật đã phát triển nhiều ứng dụng của lysozyme Ví dụ, họ sử dụng lysozyme như một chất bảo quản cho trái cây tươi, rau cải và sữa đậu nành, hải sản và thịt Đặc biệt, lysozyme còn có thể dùng như một chất thêm vào thực phẩm cho em bé

để giả làm sữa mẹ

™ Một số ứng dụng của lysozyme trong lĩnh vực y dược

Trong lãnh vực dược và y học, lysozyme được sử dụng để chữa bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus và vi khuẩn Một số ứng dụng của lysozyme có thể

kể đến:

Dung dịch EDTA-tris-lysozyme thì rất hiệu quả đối với bệnh viêm bọng

đái pseudomonas gây ra bởi truyền nhiễm E coli

Lượng lysozyme trong huyết thanh của người và động vật là một chất chỉ thị của sự nhiễm trùng, thể hiện bệnh nhiễm trùng (nghĩa là nó có thể dùng để báo hiệu khả năng nhiễm bệnh)

Zajackowska-Bialowas và Murai nghiên cứu mối quan hệ giữa hoạt tính lysozyme trong nước bọt và các bệnh trong khoang miệng Kết quả cho thấy

lysozyme có hiệu quả giảm nhẹ rõ ràng trong các triệu chứng của bệnh nha chu mãn tính Ngoài ra, 2 tác giả trên tìm ra hiệu quả của lysozyme khi kết hợp với

các chất kháng sinh khác như amoxicillin, hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn S aureus

được tăng cao và phụ thuộc vào lượng lysozyme sử dụng

Năm 1955, Caselli và Shumacher báo cáo rằng lysozyme kìm hãm 70% sự

biến đổi hình dạng giác mạc của gà khi bị lây nhiễm bởi virus Rous sarcoma

Nhiều nghiên cứu khác chỉ ra rằng lysozyme hỗ trợ trong việc kiềm chế sự phát triển của khối u (bướu) ở người Lysozyme tương tác với phân tử phospho

và glucolipit của các tế bào u, bướu

™ Một số ứng dụng của lysozyme trong công nghệ thực phẩm

Lysozyme có nguồn gốc từ lòng trắng trứng gà, được sử dụng ngày càng nhiều để bảo quản thực phẩm ở châu A đặc biệt ở Nhật, Châu Âu, các nước Mỹ

La Tinh Ở Mỹ, Lysozyme được FDA (Food & Drug Administration) cho phép

sử dụng như một tác nhân kháng khuẩn trong thực phẩm với liều lượng 5,5 mg lysozyme trong 1 kg thực phẩm, đối với thực phẩm “ready to eat’ là 2 mg Lysozyme cũng được WHO cho phép sử dụng để bảo quản thực phẩm với liều lượng cho phép sử dụng giống như FDA Bảng 2.2 thống kê ứng dụng của lysozyme để bảo quản thực phẩm được các nhà khoa học nghiên cứu (Shreya Datta, 2005)

Quá trình chế biến phô mai

Các ví dụ điển hình về lưu trữ sản phẩm cho thấy tính hiệu quả của việc lựa chọn lysozyme như là một chất kháng khuẩn cho thực phẩm

Vi khuẩn butyric axit thường được tìm thấy trong sữa và nếu không bị tiêu

diệt, chúng sẽ chuyển hóa axit lactic thành axit butyric, axit acetic, carbon dioxit

và hydrogen Sự tích luỹ của butyric axit làm phô mai có mùi khó chịu, không

ngon Sự tích luỹ carbon dioxide và hydrogen có thể làm phô mai thiu và không được tiêu thụ

Trong quá trình chế biến phô mai, lysozyme được thêm vào ở dạng lỏng, dạng phun khô hay dạng bột nhỏ Trên 90% hoạt tính của lysozyme xuất hiện trên sữa đông Sau khi được tạo hình từ sữa đông, các bánh phô mai được trữ trong dung dịch muối, trong thời gian 2 năm Suốt quá trình lưu trữ, ở điều kiện

kị khí, các mầm gây nhiễm của Clostridium tyrobutyricum và các dạng tế bào

thực vật bắt đầu xuất hiện Lysozyme hiện diện trong phô mai trong suốt quá trình trữ để kìm hãm sự phát triển các mầm bệnh Ở dạng tế bào thực vật thì dễ bị tấn công bởi hoạt tính phân hủy của lysozyme Lysozyme ở mật độ 21 mg/L tiêu diệt 99% trong tổng số 5.105 các tế bào thực vật C tyrobutyricum trong vòng 24

h ủ ở nhiệt độ 25oC và kìm hãm sự phát triển các tế bào thực vật

Bảng 2 2 Tác dụng của lysozyme lên các vi sinh vật khác nhau từ các nguồn

Listeria monocytogenes

m+ Wang và Shelef, 1991

m+ mức độ ôn hòa, + ức chế, - đề kháng

Quá trình tồn trữ hải sản

Lysozyme ở mật độ 0.005-0.03% kết hợp với 0.25 đến 0.35% NaCl được

sử dụng để lưu trữ sản phẩm cá hồi Kết hợp của lysozyme và glycine có hiệu quả trong lưu trữ pa-tê cá

Lysozyme làm chậm sự phát triển của L monocytogenes trong xúc xích

tươi nhưng không hoàn toàn tiêu diệt vi khuẩn này Lysozyme kết hợp với EDTA

thì có hiệu quả hơn trong việc điều khiển L monocytogenes trong xúch xích lợn,

thịt lợn, thịt bò Sự kết hợp hiệu quả của các chất lưu trữ hóa học như EDTA, polyphosphates, phytic acid, parabens, benzoic acid, sorbic acid, hydrogen peroxide và p-hydroxybenxoate là rất cần thiết để làm chậm sự phát triển và tiêu

diệt lượng đáng kể các tế bào L monocytogenes trong quá trình chế biến sản

phẩm thịt

Khi nisin kết hợp với lysozyme, thì hiệu quả hơn so với chỉ có lysozyme trong bảo quản sản phẩm thịt Lysozyme riêng lẻ hay kết hợp với các chất bảo quản sinh học khác giúp cho tăng mức độ an toàn và chắc chắn cho chất lượng của sản phẩm thịt

Kết quả từ một thí nghiệm thì xúc xích Vienna được bảo quản tốt khi ngâm xúc xích trong 0.05% lysozyme trong chất đệm phosphate pH 6.5

Sản xuất rượu

Ứng dụng tiềm năng của lysozyme như là một phần thay thế của SO2 để điều khiển sự lên men malolactic trong rượu Ứng dụng này được thử nghiệm khi

lysozyme được biết là có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn lactic axit

2 enzyme khác được cho là có hiệu quả làm giảm SO2 sử dụng trong rượu là glucose oxidase và catalase Glucose oxidase và catalase thì an toàn và hiệu quả trong các hệ thống anti-oxidizing Glucose oxidase được sử dụng thành công để giữ vị ngon và màu sắc trong các chai rượu trắng và rượu hoa hồng Sự thêm vào lysozyme riêng lẻ hay kết hợp với glucose oxidase có thể có tác dụng đáng kể