Khảo sát hiệu quả vi gói vi khuẩn lactic nhằm nâng cao hoạt tính probiotic và ứng dụng lên men sữa chua đậu nành

Nhưng trong thực tế sản xuất, hiện nay, để tối ưu nhiều yếu tố chất lượng quan trọng của sản phẩm như giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan và giá trị sinh học phải đạt được khá nhiều chỉ

NGUYỄN LƯU HIỀN TRANG

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ VI GÓI VI KHUẨN LACTIC NHẰM NÂNG CAO HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ ỨNG

DỤNG LÊN MEN SỮA CHUA ĐẬU NÀNH

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2009

Cán bộ hướng dẫn khoa học: GV – TS Nguyễn Thúy Hương

Chữ ký: Cán bộ chấm nhận xét 1:

Chữ ký: Cán bộ chấm nhận xét 2:

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Lưu Hiền Trang Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 20 – 04 – 1981 Nơi sinh: Long An

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

I TÊN ĐỀ TÀI:

KHẢO SÁT HIỆU QUẢ VI GÓI VI KHUẨN LACTIC NHẰM NÂNG CAO HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ ỨNG DỤNG LÊN MEN SỮA CHUA ĐẬU NÀNH

II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

1 Vi gói vi khuẩn lactic

2 Khảo sát hiệu quả vi gói nhằm nâng cao hoạt tính probiotic

3 Khảo sát hoạt lực lên men của chế phẩm vi gói

4 Ứng dụng vi gói lên men sữa chua đậu nành

III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày 01 tháng 06 năm 2008

IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 03 tháng 08 năm 2009

V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS Nguyễn Thúy Hương

trong và ngoài trường đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin ghi sâu và bày tỏ lòng biết ơn, sự ngưỡng mộ với cô Nguyễn Thúy Hương, người đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo và động viên tôi rất nhiều trong quá trình học tập và làm việc

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của tất cả các bạn, thành viên lớp cao

học Công nghệ sinh học khóa 2007

Nguyễn Thúy Hương, nhằm mục tiêu thử nghiệm vi gói vi khuẩn lactic Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus bằng gel Na-alginate với phương pháp nén ép

Sau đó khảo sát hoạt lực lên men, hiệu quả probiotic của chế phẩm này và ứng dụng lên men sữa chua đậu nành, nâng cao chất luợng sản phẩm ở chỉ tiêu vi sinh vật

Trong phạm vi đề tài, để đạt những mục tiêu trên chúng tôi thực hiện các nghiên cứu

cụ thể và đạt được kết quả như sau:

1 Khảo sát hiệu quả probiotic của vi gói vi khuẩn lactic trong môi trường dạ dày nhân tạo SGJ (pH = 2 và pH = 3) Ở 370C, vi gói 1mm giữ được hơn 30% tế bào sống sót bên trong nó với thời gian khảo sát là 60 phút

2 Quá trình thu dịch sữa đuợc đề nghị với các công đoạn chính là chần đậu nành trong dung dịch NaHCO3 0,2%, 800C và xay nóng, nhiệt độ nuớc xay ban đầu là 1000C

3 Hoạt lực lên men của vi gói vi khuẩn không khác biệt với tế bào tự do Vi gói có kích thuớc 1mm lên men tối ưu ở 420C trong 9 giờ với mật độ tế bào giống khởi động là 5.105 tế bào/ ml dịch lên men, tạo sản phẩm có chất luợng cảm quan khá tốt

4 Vi gói đã cải thiện thời gian bảo quản sản phẩm cuối đáng kể, tăng 2 lần khi so sánh

với sản phẩm lên men bằng tế bào tự do truyền thống

Một phần kết quả được đăng trên bài báo: “Nghiên cứu nâng cao chất lượng sữa chua đậu nành bằng phương pháp vi gói vi khuẩn lactic”, tạp chí Khoa học và công nghệ

Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn, số 1/ 2008, trang 43 – 48

This research studied by Nguyễn Lưu Hiền Trang, instructed and supervised by Nguyễn Thúy Hương PhD, in order to achieve the main targets, we encapsulated

Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus cells in alginate gel by extrusion

method And then, we studied fermentation ability of these capsules, its probiotic effect and fermented soy yoghurt by lactic acid bacterium inside the capsules in order to improve quality of soy yoghurt via the following microorganism criterion

With experiments, we suggested results as below:

1 Studied probiotic effect of lactic acid bacteria capsules in simulated gastric

juice medium (SGJ) (pH = 2 and pH = 3) At 370C, 1mm sized capsules kept over than 30% viable cells inside after 60 minutes in SGJ

2 The soymilk processing were suggested with main steps as follow: blanch soybean in NaHCO3 0,2% at 800C and use hot grind at initial water temperature around

1000C

3 Fermentation ability of these capsules did not differ meaningly as compare to free cells 1mm sized capsules fermented at 420C, 9 hours with 5.105 cells/ ml of cultured milk of start variety, produced good sense quality for yoghurt

4 Lactic acid bacterium encapsules improved 2 times of storage time of yoghurt as compare to free cell culture

Some of the results published in Science and Technology Journal of Agriculture and Rural Development, number 1/ 2008 with name: “Research on improving quality of soy yoghurt by microencapsulation of lactic acid bacteria” (43 – 48)

Bảng 2.2: Một số phương pháp sản xuất dịch sữa đậu 12

Bảng 2.3: Ưu và nhược điểm của hai phương pháp vi gói cơ bản 28

Bảng 4.1: Một số công đoạn chính của kỹ thuật vi gói được thực hiện 50

Bảng 4.2: Nhận xét một số tính chất chế phẩm vi gói vi khuẩn lactic 52

Bảng 4.3: Mật độ tế bào L.bulgaricus tồn tại trong điều kiện cực đoan 53

Bảng 4.4: Mật độ tế bào S.thermophilus tồn tại trong điều kiện cực

Bảng 4.6: Kết quả cảm quan ảnh hưởng của nhiệt độ chần 57

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaHCO3 59

Bảng 4.8: Kết quả cảm quan ảnh hưởng của nồng độ dung dịch

59

Bảng 4.10: Kết quả cảm quan ảnh hưởng của nhiệt độ xay 61

Bảng 4.11: So sánh khả năng lên men của 2 hình thức tiếp giống bởi tế

Bảng 4.15: Các chỉ tiêu cảm quan của sữa chua 75

Hình 2.2: Phân loại vi khuẩn lactic 13

Hình 2.7: Kỹ thuật vi gói tế bào vi sinh vật được sử dụng phổ biến 25

Hình 2.8: Cấu trúc của gel alginate với mô hình “ hộp trứng ” 29

Hình 2.9: Gel alginate hình hành khi có mặt ion Ca2+ 31

Hình 3.2: Hình thái Streptococcus thermophilus 35

Hình 3.4: Sơ đồ quy trình vi gói nén ép vi khuẩn lactic bằng màng bao

Hình 4.1: Chế phẩm vi gói quan sát bằng mắt thường 51

Hình 4.2: Chế phẩm vi gói quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét 51 Hình 4.3:Mật độ tế bào L bulgaricus trong môi trường dạ dày nhân tạo

Hình 4.4:Mật độ tế bào S thermophilus trong môi trường dạ dày nhân

Hình 4.5: Biểu đồ so sánh hàm lượng acid lactic sinh ra của tế bào tự

do và các kích thước vi gói khác nhau

65

Hình 4.6: Biểu đồ theo dõi kết quả pH, hàm lượng acid lactic sinh ra

theo thời gian của các mật độ giống khảo sát

69

Hình 4.7: Biểu đồ kết quả pH, hàm lượng acid lactic sinh ra theo thời

gian của nhiệt độ khảo sát

73

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2

2.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU ĐẬU NÀNH .2

2.1.1 Giá trị kinh tế của đậu nành .2

2.1.2 Thành phần hoá học của đậu nành và vấn đề hình thành mùi .3

2.1.2.1 Thành phần hoá học và một số đặc tính nổi bật 3

2.1.2.2 Lipoxygenase (LOX) và hoạt động gây mùi .6

2.1.3 Sự tạo gel của potein đậu nành .8

2.1.4 Sản phẩm từ đậu nành và các phương pháp thu dịch sữa 10

2.2 VI KHUẨN LACTIC VÀ QUÁ TRÌNH LÊN MEN .13

2.2.1 Hệ vi khuẩn lactic và giống vi sinh vật lên men sữa chua đậu nành .13

2.2.1.1 Hệ vi khuẩn lên men lactic 13

2.2.1.2 Giống vi sinh vật sử dụng trong sữa chua đậu nành 14

2.2.2 Cơ chế của quá trình lên men lactic .16

2.3 SẢN PHẨM SỮA CHUA ĐẬU NÀNH VÀ VẤN ĐỀ NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM 17

2.3.1 Sữa chua, một dạng sản phẩm probiotic .17

2.3.2 Sữa chua đậu nành và vấn đề nâng cao chất lượng sản phẩm 19

2.4 PHƯƠNG PHÁP VI GÓI 19

2.4.1 Tổng quan về vi gói 20

2.4.1.1 Cấu trúc hạt vi gói .21

2.4.1.2 Nguyên vật liệu cho vi gói 22

2.4.1.3 Ứng dụng của vi gói .23

2.4.2 Các phương pháp vi gói .25

2.4.2.1 Phương pháp nén ép .26

2.4.3 Alginate và sự tạo gel alginate 29

2.4.3.1 Cấu tạo của alginate 29

2.4.3.2 Tính chất của alginate 29

2.4.3.3 Một số kỹ thuật tạo gel alginate .30

2.4.4 Ảnh hưởng của vi gói đến hoạt động tế bào vi sinh vật và quá trình lên men 32

2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả vi gói và các phương pháp đánh giá hiệu quả 33

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 34

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 34

3.2 NGUYÊN VẬT LIỆU – THIẾT BỊ SỬ DỤNG .34

3.3 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36

3.3.1 Mục tiêu đề tài 36

3.3.2 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 37

3.3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 38

3.3.3.1 Nghiên cứu tạo vi gói vi khuẩn lactic, khảo sát khả năng tồn tại của vi khuẩn vi gói trong môi trường dạ dày nhân tạo 38

3.3.3.2 Khảo sát các thông số chính ảnh hưởng đến chất lượng dịch sữa 40

3.3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của 2 hình thức tiếp giống bởi tế bào tự do và chế phẩm vi gói .44

3.3.3.4 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men .45

3.3.3.5 Đánh giá chất lượng 47

3.3.4.3 Các phương pháp hóa sinh .48

3.3.4.4 Các phương pháp khác .49

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 50

4.1 TẠO HẠT VI GÓI VI KHUẨN LACTIC .50

4.2 KHẢO SÁT HIỆU QUẢ PROBIOTIC VÀ ỨNG DỤNG LÊN MEN SỮA CHUA ĐẬU NÀNH 52

4.2.1Khảo sát hiệu quả vi gói vi khuẩn probiotic trong môi trường dạ dày nhân tạo 52

4.2.2 Khảo sát các thông số chính ảnh hưởng đến chất lượng của dịch sữa 56

4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của 2 hình thức tiếp giống bởi tế bào tự do và chế phẩm vi gói 63

4.2.4 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men 69

4.3 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM 75

4.3.1 Đánh giá chất lượng sản phẩm sữa chua đậu nành .75

4.3.2 Khảo sát thời gian bảo quản sản phẩm lên men bởi vi gói vi khuẩn lactic 77

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

5.1 KẾT LUẬN .79

5.2 KIẾN NGHỊ 80

5.3 DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ .80

TÀI LIỆU THAM KHẢO .81 - 85

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Sữa chua đậu nành là một dạng sản phẩm lên men tận dụng ưu điểm của nguồn dinh dưỡng đậu nành và cả đặc tính quý giá của sữa chua vốn được xem là loại thực phẩm chức năng được ưa chuộng Sản phẩm này được sản xuất từ nguồn dưỡng chất thực vật đầy đủ, cân đối và có giá trị sinh học cao, mang lại nhiều hy vọng cho những vấn đề sức khỏe của con người Mặt khác, sữa chua đậu nành còn cung cấp nguồn chế phẩm vi khuẩn lactic sống cho hệ tiêu hóa một cách đơn giản và dễ dàng, nhất là với trẻ nhỏ Đó là một sản phẩm Probitic dạng thực phẩm

Nhưng trong thực tế sản xuất, hiện nay, để tối ưu nhiều yếu tố chất lượng quan trọng của sản phẩm như giá trị dinh dưỡng, giá trị cảm quan và giá trị sinh học phải đạt được khá nhiều chỉ tiêu, khó khăn nhất là việc giảm thiểu mùi khó chịu của đậu nành

và bảo vệ hệ vi khuẩn lactic sống trong sản phẩm

Từ lâu người ta đã biết rằng do đặc tính nguyên liệu, enzyme lipoxygenase trong đậu nành sẽ oxy hóa các acid béo không no hình thành mùi khó chịu cho sản phẩm, ngay khi cấu trúc hạt vừa bị bẽ gãy [16]

Với chỉ tiêu vi sinh vật, dù hệ vi khuẩn lactic rất có lợi cho sức khỏe con người, là một sảm phẩm Probiotic, nhưng qua quá trình hạn chế khả năng, bảo quản và sử dụng, nguồn vi khuẩn này bị yếu đi và sống sót trong môi trường acid cao của dạ dày để phát huy hiệu quả của nó trong cơ thể [17]

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hiệu

quả vi gói vi khuẩn lactic nhằm nâng cao hoạt tính probiotic và ứng dụng lên men sữa chua đậu nành”

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU ĐẬU NÀNH

Cây đậu nành hoặc đậu tương tên khoa học là Glycine max (L) Merrill, thuộc họ đậu (Leguminosae), họ phụ cánh bướm (Papilionodae) có nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis), du nhập vào Việt Nam từ rất lâu và có nhiều chủng

loại khác nhau [1]

Hiện nay ở các chợ lớn của thành phố Hồ Chí Minh người mua chỉ tìm thấy chủ yếu là ba loại đậu nành: đậu Miên, đậu Phương Lâm và Trung Quốc vì có số lượng cung cấp lớn, giá thành ổn định, hạt to, phẩm chất tốt Vì thế, chúng tôi chọn nguyên liệu trên cơ sở chọn lọc từ ba loại giống trên

Với giá trị kinh tế cao, đậu nành đã trở thành nguồn nguyên liệu quí trong công nghiệp thực phẩm, đây là lý do chúng tôi chọn mảng đề tài này

2.1.1 Giá trị kinh tế của đậu nành

Hạt đậu nành có giá trị kinh tế cao, là một trong những nguồn thực phẩm tự nhiên giàu dinh dưỡng nhất Hàm lượng protein từ 38 - 40% là cao hơn cả ở cá, thịt, gấp hai lần các loại đậu đỗ khác Trong đậu nành có mặt rất nhiều các loại acid amin quý với hàm lượng cao như methionine, cistein, cistyl…

Đậu nành còn là cây cung cấp dầu thực vật, giúp phòng tránh những bệnh liên quan đến chất béo Lipid của đậu nành chứa nhiều các acid béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm ngon

Ngoài ra, trong hạt đậu nành nhiều loại vitamin cần thiết đã được tìm thấy như: B1, B2, PP, A, E, K, D, C… và các loại muối khoáng khác

Với lĩnh vực thực phẩm, người ta có thể chế biến ra trên 600 sản phẩm khác nhau dưới dạng tươi, khô, lên men như làm giá, bột, tương, …các sản phẩm cao cấp gián tiếp như cà phê, sôcôla, bánh kẹo, patê, thịt nhân tạo…và là nguồn cung cấp protein có giá trị cho người ăn chay

Đậu nành còn là vị thuốc chữa bệnh, đặc biệt là đậu nành hạt đen có tác dụng tốt cho tim, gan, thận, dạ dày, ruột, làm thức ăn tốt cho người bị bệnh tiểu đường, thấp khớp, mới ốm dậy hoặc do lao động quá sức Các chất lecithin và cazein có trong hạt đậu nành còn có thể dùng riêng hoặc phối hợp để làm thuốc bổ dưỡng có tác dụng làm

cơ thể trẻ lâu, làm tăng trí nhớ, tái sinh các mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể

Protein và lipid đậu nành dễ tiêu hóa hơn thịt, không có các thành phần tạo thành cholesterol, hoặc dạng acid uric…

Đậu nành sau khi đã ép lấy dầu, bã vẫn còn hàm lượng protein cao chính vì thế người ta sử dụng nó như nguồn thức ăn giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm

Ở nhiều nước phát triển người ta còn sử dụng đậu nành vào các ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không

Ngoài ra đậu nành còn có tác dụng tích cực trong việc cải tạo đất nhờ khả năng cố

định đạm của bộ rễ [10]

Tuy có gía trị cao nhưng quy trình chế biến sản phẩm từ đậu nành phải tuân thủ nhiều giải pháp công nghệ khá nghiêm ngặt vì đặc thù thành phần hóa học của hạt

2.1.2 Thành phần hoá học của đậu nành và vấn đề hình thành mùi

Hạt đậu nành gồm có ba bộ phận chính: vỏ, phôi và lá mầm Thành phần hóa học quan trọng gồm protein, lipide, glucide và khoáng chất, trong đó protein chiếm tỉ lệ cao nhất

2.1.2.1 Thành phần hoá học và một số đặc tính nổi bật

Trên phương diện hóa học, mỗi thành phần của hạt đậu nành cùng với đặc tính của chúng đều có ảnh hưởng đến công nghệ sản xuất

Bảng 2.1: Thành phần của các hợp phần trong hạt đậu nành (% so với khối lượng

chất khô của hạt)[12]

Với tỉ lệ cao nhất, protein đậu nành có khá nhiều đặc tính ảnh hưởng đến chất

lượng sản phẩm

™ Protein đậu nành và các đặc tính chung

Trong lá mầm, protein tồn tại dưới dạng thể hình cầu đường kính 2 – 10 µm Globulin 7S (β-conglycynine) và 11S (glycinine) là hai loại protein chính trong đậu nành, có nhiệt độ biến tính lần lượt là 63 – 680C và 80 – 880C [58] Hai hợp phần này

có thể được tách riêng bằng cách sử dụng ion H+ hay Ca2+ Một số đặc điểm của chúng

sẽ được trình bày trong phụ lục 1

Với cấu tạo là hai hợp phần trên, protein đậu nành có các đặc tính chức năng chính như: tính tan - sự hydrat hóa, sự tạo gel, tạo bọt, tạo nhũ… Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi sử dụng chủ yếu khả năng tạo gel của protein từ dịch sữa để tạo sản phẩm lên men đặc trưng giàu dinh dưỡng

Protein được tập hợp bởi nhiều acid amin nên trong phân tử protein chứa đồng thời các nhóm acid (-COOH) và nhóm bazơ (-NH2) Trong môi trường acid sự phân ly của các nhóm acid bị kìm hãm nên phân tử protein tích điện dương Ngược lại trong

môi trường bazơ sự phân ly của các nhóm bazơ bị kìm hãm nên protein tích điện âm Như vậy sẽ có một giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hoà về điện và người ta gọi giá trị pH đó là pH đẳng điện (pHI) Ở pH = pHI các phân tử protein trung hoà về điện nên chúng có thể kết hợp thành tập hợp lớn và kết tủa Điểm đẳng điện của protein đậu nành là 4,5 và đây là cơ sở cho những ứng dụng protein đậu nành

Protein trong đậu nành một số mang tính kỵ nước dù gần 90% tổng lượng protein

có khả năng hoà tan trong nước nên tính hoà tan khá phức tạp Tính tan của protein đậu nành phụ thuộc nhiều vào pH môi trường, giá trị pH càng xa pHI protein càng dễ hòa tan Ở pH = 7, 85% protein trong đậu nành hoà tan (globulin); pH = 3,7 – 5,2, protein ít hoà tan

Protein đậu nành chứa đầy đủ và cân đối các acid amin không thay thế vì thế rất

có giá trị cho cuộc sống con người (phụ lục 2)

Protein trong đậu nành còn có các enzyme và các chất kìm hãm enzyme Hệ enzyme hiện diện trong đậu nành thường bao gồm: allantoinase, amylase, ascorbicase, chalcone-flavanone isomerase, coenzyme Q… trong đó đáng chú ý nhất là lipoxygenase, đây là enzyme oxi hoá tác động lên acid béo đơn giản đặc biệt là acid linoleic, tạo mùi khó chịu cho sản phẩm [35]

Ngoài ra trong hạt đậu nành còn chứa một lượng nhỏ các hợp chất như: fitat, saponin, các chất phản vitamin… Về phương diện dinh dưỡng thì các hợp chất này cũng như các chất kìm hãm enzyme và một số oligosaccharide khác không có lợi và đôi khi còn là chất độc Do vậy thường người ta phải làm biến tính chúng bằng gia nhiệt hoặc loại trừ bằng phương pháp chiết [12]

™ Hydratcacbon

Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành chia làm hai loại tan và không tan trong nước Loại tan trong nước chỉ chiếm 10% nhưng lại ảnh hưởng rất lớn đến công nghệ lên men (phụ lục 4)

Ngoài ra, hàm lượng khoáng chất và vitamin trong đậu nành cũng rất phong phú

(phụ lục 5)

Do hạt có cấu tạo đặc thù, việc phá vỡ cấu trúc hạt thu dịch sữa phải tuân thủ quy trình công nghệ nghiêm ngặt để giảm thiểu ảnh hưởng không mong muốn của những

thành phần hoạt tính cao

2.1.2.2 Lipoxygenase (LOX) và hoạt động gây mùi

Hiện nay, người ta biết rằng mùi khó chịu của đậu nành là do hoạt động của enzyme lipoxygenase có sẵn trong loại nguyên liệu này

Lipoxygenase (E.C.1.13.11.12) là protein thuộc nhóm 7S của protein đậu nành, có nhiệt độ biến tính vào khoảng 63 – 680C [58], là một dioxyzenase mang Fe thúc đẩy oxi hoá nhóm methylen của các acid béo không bão hoà và các ester của chúng như acid linoleic, linolenic LOX có nhiệt độ hoạt động khoảng 35 – 400C, pH tối ưu là 8,5 LOX có thể tác dụng đến màu sắc, mùi vị và tính chất của các protein LOX hoạt động khi mô bào bị tổn thương, phóng thích acid béo ra ngoài

LOX sẽ chuyển cơ chất của nó thành các dẫn xuất hydroperoxide qua ba bước: 1: hoạt hóa; 2: lấy một proton từ nhóm methylene của cơ chất; 3: gắn oxi tự do vào cơ chất Sản phẩm tạo thành tiếp tục bị phân huỷ bởi hydroperoxide lyase, hydroperoxide isomerase, tạo thành hàng loạt hợp chất phân tử lượng thấp khác như: aldehyde, ketone, alcohol, đặc biệt là hỗn hợp của hexanal sẽ hình thành mùi khó chịu của đậu nành

Hình 2.1: Cơ chế oxi hóa acid linoleic của LOX sản sinh

13-hydro-peroxy-cis-9, trans-11-octadecadienoic (13-HPOD) [41]

LOX là một enzyme có hoạt động tương tự như hiện tượng tự oxy hoá của các acid béo không bão hoà Tuy nhiên LOX có khả năng chọn lựa và tấn công cơ chất đã chọn Trong đậu nành có ít nhất 3 loại isoenzyme nhưng chỉ có LOX-1 và cơ chất của

nó, acid linoleic được quan tâm nhiều nhất Chuỗi cis, cis 1 – 4 pentadeine của linoleic

có chứa một nhóm methylen tại vị trí 8 tính từ đầu methyl của chuỗi và đây là điều kiện rất tốt cho hoạt động LOX, sản phẩm oxy hoá thường là các đồng phân hydroperoxyde 9 và 13 Còn lại, hầu hết acid béo đều bị oxy hoá tại vị trí C6 ngoại trừ acid linolenic có thể bị tấn công tại C6 lẫn C10

Trong quá trình oxy hoá lipid còn có sự hiện diện của sắt, có vai trò chuyển tải electron khi kết hợp oxy vào acid béo không bão hoà có chứa nhóm cis, cis 1 – 4 pentadeine

Trước khi hoạt động, LOX phải biến đổi thành dạng đã oxy hoá (mang Fe3+) Sau

đó, LOX thúc đẩy quá trình di chuyển H+ của nhóm methylen của acid linoleic hoặc acid linolenic Gốc tự do được tạo thành và LOX được khử thành dạng bình thường Sau đó dưới điều kiện vi hiếu khí hoặc kỵ khí các phản ứng dây chuyền khác sẽ tiếp tục

và các hydroperoxyde tạo thành các sản phẩm gây mùi

Hiện tượng LOX là nguyên nhân gây ra mùi khó chịu đã khiến việc ức chế chúng trở thành một vấn đề lớn đối với các sản phẩm có chứa chất béo LOX có thể bị ức chế bởi nhiều cách khác nhau như: sử dụng chất chống oxy hoá, thay đổi pH hoặc tác dụng nhiệt Tuy nhiên, đối với các sản phẩm chứa protein như đậu nành thì việc tác dụng nhiệt có tác dụng bất lợi đến khả năng ly trích và tính chất của protein Ví dụ 99% LOX có thể bị ức chế khi đưa nhiệt độ đến 910C hoặc cao hơn nhưng chỉ còn thu được

70% hàm lượng protein [33]

2.1.3 Sự tạo gel của potein đậu nành

Một cách tổng quát sự hình thành mạng lưới gel protein phụ thuộc vào sự cân bằng giữa liên kết protein – nước và liên kết protein – protein

Để tạo gel, nhất thiết phải xử lý nhiệt để protein bị biến tính Với các liên kết trong protein: liên kết hydrogen, tương tác tĩnh điện, liên kết disulfur…, chúng bền ở nhiệt độ thấp nhưng không bền ở nhiệt độ cao Ngược lại, tương tác kỵ nước lại không bền ở nhiệt độ thấp mà bền ở nhiệt độ cao Do vậy khi đun nóng dung dịch sữa, các liên kết hydrogen bị cắt đứt, có sự giãn mạch một phần để lộ các nhóm kỵ nước lên bề mặt tạo điều kiện cho tương tác kỵ nước giữa các protein Từ đó sẽ tạo thành khối kết

tụ và khi dung dịch được làm nguội sẽ tạo thành gel Loại gel này cần có nồng độ dung dịch cao để tạo thành

Tuy nhiên việc tạo gel trong dung dịch còn phụ thuộc vào khả năng lại gần nhau của protein Với sữa đậu nành, do có nồng độ thấp nên khi đun sôi protein giãn mạch

và ở trạng thái tan Các protein vẫn tích điện khá cao tạo lực đẩy tĩnh điện mạnh không cho chúng lại gần nhau Có thể giảm lực đẩy bằng các dung dịch muối để trung hoà các điện tích, dùng ion như cầu nối giữa các phân tử hoặc bằng cách giảm pH [58]

Khi nồng độ protein trong dung dịch tương đối cao (≥ 5% P/ V), sự tạo gel xảy ra khi đun nóng ở pH gần trung tính Trước hết độ nhớt của dung dịch này sẽ tăng cao (trạng thái “tiền gel”) Khi lực ion còn thấp trạng thái này xuất hiện ở nhiệt độ 7000C

trở đi và tương ứng với sự giãn mạch của β-conglycinine Khi lực ion có giá trị cao phải ở nhiệt độ cao hơn mới xuất hiện sự tăng độ nhớt

Vấn đề độ chặt của gel, khi nồng độ muối xử lý tăng, độ chặt gel sẽ giảm do ảnh hưởng của lực ion lên cấu trúc bậc 2 và bậc 4 Độ chặt này cũng giảm đi khi bị xử lý nhiệt mạnh Vì thế tùy dung dịch, nồng độ protein tương đối cao, ta sẽ thu được gel có

độ chặt cao khi gia nhiệt ở 800C Tuy nhiên độ chặt này lại giảm đi ở 1200C do một số liên kết phân tử bị phá vỡ Cần lưu ý là thời gian xử lý nhiệt cũng có ảnh hưởng đến kết cấu gel

Gel của glycinin chặt hơn và đàn hồi hơn so với β-conglycinin Có thể do độ bền của phân tử glycinine cao hơn và độ bền gel còn được củng cố bằng các liên kết S-S liên phân tử Đối với glycinin độ chặt của gel cực đại đạt được ở 800C và nhiệt độ cao không phá huỷ được gel của loại protein này Tuy nhiên, gel glycinin chỉ được hình thành ở nồng độ và nhiệt độ cao hơn so với β-conglycinin

Bằng cách acid hoá (ở pH 5,5) hay bằng cách thêm ion canxi vào dung dịch protein đậu nành, người ta có thể thu các khối protein đông tụ Các khối đông này kém chặt hơn các gel thu được bằng phương pháp nhiệt Các khối đông bằng canxi đàn hồi hơn do liên kết ion giữa canxi với các nhóm carboxyl Khi gia nhiệt các khối đông đã thu được bằng phương pháp canxi hay bằng pH đẳng điện, các mạch polypeptid sẽ bị giãn ra và hình thành mạng lưới protein 3 chiều Nồng độ canxi tối ưu tăng theo nồng

độ protein

Quá trình tạo gel cũng có thể được thực hiện bằng những phương pháp khác: kìm hoá rồi trung hòa, thuỷ phân nhẹ protein, thêm vào dung dịch các dung môi tan trong nước như alcohol hay glycol

Cả glycinine và β-conglycinin đều biến tính khi hoà vào hỗn hợp nước – alcohol với nồng độ alcohol lớn hơn 20% Khi tính kỵ nước của alcohol tăng, sự dãn mạch xảy

ra nhanh hơn và độ chặt của gel cũng tăng theo Điều này có thể do các liên kết kỵ nước giữa dây R của alcohol và các acid amin không phân cực Điều này chỉ xảy ra khi

nồng độ protein lớn hơn 8% Tuy vậy khi nồng độ rượu cao hơn 40% thì xảy ra hiện tượng đông tụ nhưng không tạo gel, do hoạt độ nước giảm đi nên các liên kết protein - nước bị thay thế bằng liên kết protein – protein

Người ta cũng nghiên cứu tạo gel từ các tiểu đơn vị của glycinin đậu nành và của các thành phần 11S của các loại cây họ đậu khác, kết hợp các tiểu đơn vị này theo những tỉ lệ khác nhau để thu được nhiều loại gel khác nhau [12]

2.1.4 Sản phẩm từ đậu nành và các phương pháp thu dịch sữa

Sữa đậu nành là nguồn nguyên liệu chủ yếu của ngành công nghiệp thực phẩm, việc ly trích dịch sữa thực hiện nhờ một số phương pháp:

™ Các phương pháp thu dịch sữa:

Từ lâu người ta biết rằng, dịch sữa đậu nành ly trích theo phương pháp truyền thống mang nặng mùi là nguyên nhân chính hạn chế việc sử dụng nguồn nguyên liệu quí giá này

Chính vì thế, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, từ đầu những năm 20 của thế kỷ trước đã có nhiều nghiên cứu để giảm bớt mùi đậu trong sản phẩm Tuy đã

có rất nhiều phương pháp được đề nghị nhưng chỉ có một vài phương pháp được nhiều người sử dụng rộng rãi (bảng 2.2)

™ Một số sản phẩm từ đậu nành

Từ đậu nành, người ta chế biến thành nhiều sản phẩm khác nhau

- Sữa đậu nành: một trong những sản phẩm xuất hiện đầu tiên được làm từ đậu nành bằng cách xay đậu đã qua ngâm và gia nhiệt dịch lọc

- Đậu hũ: sản phẩm ép loại nước dịch sữa đông tụ bởi tác nhân gây đông

- Chao: dạng bánh, nước, vi sinh vật có thể là mốc (Mucor hiemalis, M.silvaticus) hoặc vi khuẩn (Bacillus subtilis)

- Nước chấm: đậu nành qua hai giai đoạn thủy phân và chín tới tạo hương Hệ vi

sinh vật sử dụng: Asp.orizae, Pediococcus halophilus, Sac.rouxii

- Tương: sản phẩm còn nguyên hạt sau khi lên men

- Dầu đậu nành: thu bằng phương pháp ép hoặc trích ly

- Bột sữa đậu nành có thể thu được bằng cách sấy phun dịch sữa cô đặc

- Bột dinh dưỡng: là bột sữa đậu nành phối hợp với một số chất dinh dưỡng khác

- Sữa chua đậu nành: là sản phẩm dùng dịch sữa đậu nành cho lên men, sản phẩm ngoài giá trị dinh dưỡng cao, cung cấp hệ vi sinh vật đường ruột giúp tiêu hoá tốt còn

có giá trị sinh học đặc trưng của đậu nành rất tốt cho sức khoẻ con người

Một số sản phẩm khác ứng dụng tính chất của protein đậu nành như phụ gia thực

phẩm Ngoài ra đậu nành cũng có thể sử dụng trong các ngành công nghiệp khác

Bảng 2.2: Một số phương pháp sản xuất dịch sữa đậu [3,40]

Phương pháp Truyền thống Illinois 1976 Instoy 1997 Nảy mầm 3 ngày

Thực hiện

ngái) Cảm giác

Tách vỏ để ráo nước

Ươm mầm

T = 250C, t = 72h

Lọc

Thanh trùng (1210C/15’)

Chần với kiềm 2 lần

Lọc Xay nóng

Ngâm

2.2 VI KHUẨN LACTIC VÀ QUÁ TRÌNH LÊN MEN

Vi khuẩn lactic có vai trò rất quan trọng trong lên men tạo sản phẩm

2.2.1 Hệ vi khuẩn lactic và giống vi sinh vật lên men sữa chua đậu nành

Giống như sữa chua, sữa chua đậu nành cũng sử dụng khuẩn lactic làm tác nhân đông tụ sữa trong quá trình lên men

2.2.1.1 Hệ vi khuẩn lên men lactic

a Vị trí phân loại

Vi khuẩn lactic được xếp vào các nhóm giống và giống phụ sau:

Hình 2.2: Phân loại vi khuẩn lactic [2]

b Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Nhìn chung, vi khuẩn lactic được xếp vào hệ vi sinh vật có lợi, thường dùng để sản xuất chế phẩm probiotic quý giá cho sức khỏe con người, gồm hai nhóm chính: cầu khuẩn và trực khuẩn, dạng hình cầu, nối nhau thành chuỗi hay hình que ngắn xếp đôi

Đa số tế bào lactic không có khả năng di động, không tạo bào tử, thuộc nhóm Gram dương, kị khí tuỳ ý

Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic sống hoại sinh nhờ nguồn protein, hydratcacbon, acid amin từ xác động thực vật Biên độ nhiệt phát triển thích hợp từ 10 – 400C Trong công nghiệp, do nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, vi khuẩn lactic không thể phát triển trên môi trường thuần khiết chứa khoáng, glucose, amon, mà phải cần hàng loạt vitamin nhóm B, H, acid folic, acid nicotinic và các acid amin khác

Trong công nghệ lên men, vi khuẩn lactic có thể lên men dễ dàng các loại đường đơn (glucoza, galactoza, manoza…) Đường kép (sacaroza, mantoza, lactoza…) được đồng hoá chọn lọc hơn Còn polysaccharide (dextrin, tinh bột, …) chỉ được lên men lactic bởi một số loại vi khuẩn

Mặt khác, vi khuẩn lactic thường đòi hỏi nguồn dinh dưỡng đạm hữu cơ Chỉ có một số ít loài có khả năng sinh trưởng trên môi trường đạm vô vơ là nguồn đạm duy nhất Chúng cũng thường đòi hỏi một số chất sinh trưởng Một số loại vi khuẩn lactic

(L.leichmannii, L casei, L rabinous…) có tính mẫn cảm rất cao đối với những chất

sinh trưởng nào đó và vì thế loại này được dùng để định lượng các chất sinh trưởng này

Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn sống cộng sinh rất chặt chẽ Mặc dù cạnh tranh nhưng lại hỗ trợ nhau rất tốt trong quá trình sinh trưởng Khi sử dụng hệ công sinh các

vi khuẩn lactic sẽ cho năng suất, sản phẩm tốt hơn khi chúng sống riêng rẽ

2.2.1.2 Giống vi sinh vật sử dụng trong sữa chua đậu nành

Trong công nghiệp sản xuất sữa chua, sữa chua đậu nành người ta thường dùng

Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus, chúng có một số đặc điểm

sau:

™ Lactobacillus bulgaricus (L bulgaricus)

L bulgaricus là vi khuẩn Gram dương, có khả năng tạo lớp vỏ nhầy, lên men các

loại đường như glucose, lactose, galactose, không có khả năng lên men xylose, arabinose, sorbose,… nhiệt độ phát triển tối ưu là 45 – 500C, sinh ra acetaldehyde tạo mùi hương cho sản phẩm

Hình 2.3: L Bulgaricus [ 49]

™ Streptococcus thermophilus (S thermophilus)

S thermophilus cũng là vi khuẩn Gram dương, hình cầu, đường kính nhỏ hơn

1µm, có khả năng tạo lớp vỏ nhầy, tồn tại dạng chuỗi hay cặp đôi, có vách tế bào là

N-acetylglucoamin, N- acetylmuranic acid nên có khả năng chịu nhiệt Streptococcus thermophilus lên men tùy ý (hiếu khí hay kị khí), không di chuyển và không tạo bào tử,

nhiệt độ tối ưu là 450C, chịu đựng được đến 600C trong 30 phút, sinh L (+) lactate, acetaldehyde, diacetyl từ đường lactose, quá trình lên men cần vitamin B và một số acid amin xúc tác

Hình 2.4: S thermophilus [49]

™ Quan hệ giữa S thermophilus và L.bulgaricus

Sản phẩm sữa chua đậu nành sẽ sử dụng tổ hợp cộng sinh L bulgaricus và S thermophilus (tỉ lệ 1:1) Đầu tiên S thermophilus phát triển rất nhanh nhờ vào loại

đường đơn giản và lượng acid amin, peptide hòa tan có sẵn trong nguyên liệu Sau đó,

L bulgaricus nhờ có protease chuyển hóa một phần protein sữa thành peptide và sau

đó là acid amin như: valine, lysine, histidine, acid aspartic…, S thermophilus từ đó có thể tiếp tục phát triển, sinh ra một số hợp chất kích thích sự phát triển của L bulgaricus

nhất là acid formic, CO2 và acid pyruvic [27]

Cả hai loại vi khuẩn trên đều có khả năng tạo vỏ nhầy tạo độ láng mịn cho sản phẩm, giúp duy trì toàn vẹn khối đông và cấu trúc bề mặt trong quá trình xử lý sau khi lên men Điều này cũng đóng góp và là một trong các yếu tố đặc trưng về cấu trúc cảm quan của sản phẩm sữa chua

Mặt khác, L.bulgaricus, vi khuẩn lactic đồng hình, sinh ra lượng acid lactic khá

cao, lên men cho mùi vị đặc trưng, là vi khuẩn định hướng quá trình lên men rất tốt Nhưng đồng thời chính lượng acid sinh ra quá cao ức chế chính nó và hệ vi sinh vật có lợi trong dịch sữa Vì thế để dung hòa lượng acid lactic, trong sản xuất sữa chua sử

dụng hệ cộng sinh L bulgaricus và S thermophilus Sự cân bằng giữa hai giống được

duy trì trong khi lên men và cho sản phẩm mùi vị tốt hơn [ 27]

Hơn nữa, hai loại trên đặc biệt có khả năng kháng khuẩn, điều này rất có ý nghĩa trong điều kiện sản xuất công nghiệp Đồng thời hiện nay chúng còn được công nhận là

vi khuẩn đường ruột có lợi cho cơ thể con người, vi khuẩn probiotic [17]

2.2.2 Cơ chế của quá trình lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường tạo acid lactic của nhóm vi khuẩn lactic Tùy vào loại enzyme có trong vi khuẩn lactic, con đường phân giải và tính chất các sản phẩm tạo ra của quá trình lên men, người ta chia thành hai loại sau:

a Lên men lactic đồng hình

Quá trình lên men tạo ra sản phẩm chính là acid lactic chiếm 90 - 98% tổng sản phẩm lên men Sản phẩm phụ là etanol, acid lactic, CO2, acetoin

Hình 2.5: Sơ đồ chuyển hóa sinh acid lactic [6]

Thực chất của quá trình là đường được chuyển hóa theo sơ đồ Embden – Mayerhoff tạo acid pyruvic Trong tế bào vi khuẩn lên men đồng hình không có đủ enzyme cacboxylase nên acid pyruvic không bị phân giải sâu hơn nữa mà nhận hydro tạo acid lactic Một phần nhỏ acid pyruvic bị decarboxy thành các sản phẩm phụ kể trên

b Lên men lactic dị hình

Quá trình lên men khá phức tạp tạo ra các sản phẩm đa dạng Ngoài acid lactic chiếm 40% tổng sản phẩm lên men còn có các sản phẩm khác với tỉ lệ khá cao như: acid succinic và etanol 20% , acid acetic 10% và các chất khí 20%

Phương trình phản ứng tổng quát:

C6H12O6 CH3CHOH-COOH + COOH-(CH2)2-COOH + CH3COOH + C2H5OH +…

Vi khuẩn lên men có enzym decacboxylase để phân hủy acid pyruvic tạo CO2 và

CH3CHO Tuy nhiên enzym trên không phân hủy hết acid pyruvic nên một phần acid này chuyển thành acid lactic và acid succinic

Trong tế bào nhóm vi khuẩn này có nhiều hệ thống enzym nên quá trình phân hủy phức tạp hơn lên men acid lactic đồng hình

Do có nhiều giả thuyết khác nhau, cơ chế chuyển hóa trong lên men lactic dị hình chưa được giải thích đầy đủ Trong công nghệ lên men công nghiệp ít được sử dụng vì sinh ra nhiều sản phẩm, gây khó khăn cho quá trình chiết tách và cô đặc [2, 6]

c Các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men lactic

Cũng như các quá trình lên men khác, quá trình lên men lactic cũng chịu ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng, pH của môi trường, nhiệt độ, lượng oxi cung cấp,

nồng độ acid sinh ra và hệ vi sinh vật tạp nhiễm

2.3 SẢN PHẨM SỮA CHUA ĐẬU NÀNH VÀ VẤN ĐỀ NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM

2.3.1 Sữa chua, một dạng sản phẩm probiotic

Theo E Waagne Nielsen, 1989, sữa chua là một dạng sản phẩm lên men từ sữa, trong đó sữa là nguồn dinh dưỡng của hệ vi khuẩn lactic, cung cấp năng lượng cho quá trình chuyển hóa của chúng Quá trình này đã sản sinh acid lactic, làm giảm pH môi trường, gây biến đổi cấu trúc sữa thành dạng đông tụ Chính bản thân hệ vi khuẩn này

là một trong những giống loài vi sinh vật hữu ích cho hoạt động tiêu hóa của con người – hệ vi sinh vật probiotic

Probiotic là những giống loài vi sinh vật định cư trong hệ tiêu hóa của vật chủ (người, động vật), chủ yếu ở đường ruột Chúng hỗ trợ, duy trì và cải thiện sự cân bằng sinh học trong hệ tiêu hóa vật chủ Sự cân bằng này có lợi cho vật chủ và cho chính vi sinh vật vì hoạt động chuyển hóa để sinh trưởng, phát triển của hệ vi sinh vật này cũng

là một phần hoạt động tiêu hóa thức ăn của cơ thể vật chủ

Vai trò của vi sinh vật probiotic đã được minh chứng như: kháng tác nhân đột biến, tác nhân ung thư, viêm nhiễm, kích thích hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giúp

dung nạp lactose và tăng cường dinh dưỡng cho vật chủ [17]

Vì thế sữa chua ngoài tác dụng cung cấp hệ vi sinh vật probiotic còn có một số đặc tính ưu việt:

- Giảm béo: sữa chua giàu canxi đã giúp giảm được 11% trọng lượng cơ thể trong

vòng 24 tuần sau một thời gian kiên trì ăn 3 bữa sữa chua và các sản phẩm sữa ít béo hằng ngày vì canxi từ nguồn sữa có ảnh hưởng lên hoạt động của các tế bào mỡ, giúp chuyển hóa thành năng lượng và đốt cháy hoàn toàn thay vì đọng lại trong cơ thể

- Tăng cường hệ miễn dịch: sữa chua sống giúp ngăn ngừa bệnh viêm mũi dị ứng, viêm đường hô hấp do virus như cảm lạnh hoặc cúm

- Bệnh đường ruột: các bệnh dạ dày - ruột, như bệnh viêm ruột, đau dạ dày do

nhiễm khuẩn Helicobacter pylori , có thể giảm bớt triệu chứng nhờ hệ vi khuẩn lactic

trong sữa chua đã khuyến khích sự gia tăng số khuẩn "tích cực" trong đường ruột và giúp khử hoạt tính của một số hóa chất gây hại Nguồn canxi trong sữa chua cũng giúp cải thiện hệ tiêu hóa, giúp hạn chế những tác động của acid chua (hiện tượng ợ chua) trong hệ tiêu hóa

Ngoài ra, sữa chua còn có khả năng chữa bệnh nấm Candida của hệ sinh dục,

giảm cholesterol, cải thiện sự cân bằng giữa cholesterol có lợi và cholesterol có hại, phân hủy acid mật chứa cholesterol, giảm thiểu nguy cơ tử vong ở những nam giới bị ung thư ruột kết và ung thư trực tràng, trị tiêu chảy, táo bón, giúp giảm nguy cơ và thời gian bị tiêu chảy liên quan đến thuốc kháng sinh, chứng đầy hơi, táo bón và tình trạng

viêm trong hội chứng khó chịu dạ dày, tăng cường sức miễn dịch của đường ruột, tăng khả năng tiêu hoá, giúp tăng cường, hấp thu sinh tố B giúp duy trì cảm giác ngon miệng cũng như sự phát triển của cơ thể, kích thích thèm ăn ở những người ăn uống kém hay tăng tuổi thọ, làm chắc xương, hạn chế sự phát triển mầm mống ung thư Sữa chua cũng có tác dụng giải khát, làm mát cơ thể khi hoạt động quá mức [25]

2.3.2 Sữa chua đậu nành và vấn đề nâng cao chất lượng sản phẩm

Hiện nay, ở một số nước phát triển, sản phẩm sữa chua đậu nành đã là một sản phẩm quen thuộc, là một trong những thực phẩm thông dụng mỗi ngày được ưa chuộng Nó được đánh giá là loại thực phẩm chức năng tận dụng ưu điểm của nguyên liệu đậu nành quí giá và được lên men bằng hệ vi khuẩn lactic Chính hệ vi khuẩn probiotic này đã góp phần nâng cao giá trị, tính hữu ích cho sữa chua đậu nành

Tuy thế, yêu cầu về chất lượng sản phẩm khá gắt gao, do đặc tính nguyên liệu, hoạt động oxy hóa các acid béo không no của enzyme lipoxygenase hình thành mùi khó chịu cho sản phẩm rất dễ xảy ra, ngay khi cấu trúc hạt mới bị bẽ gãy

Với chỉ tiêu vi sinh vật, dù hệ vi khuẩn lactic có lợi cho sức khỏe con người nhưng qua quá trình bảo quản, nguồn vi khuẩn này bị yếu đi và hạn chế khả năng sống sót trong môi trường acid cao của dạ dày

Vì thế nâng cao chất lượng sữa chua đậu nành, trên nền tảng nâng cao giá trị dinh dưỡng (protein), giá trị cảm quan, giảm thiểu mùi khó chịu đặc trưng của nguyên liệu, chúng tôi đã thử nghiệm kỹ thuật vi gói vi khuẩn lactic, bảo vệ chúng đến khi chúng có thể phát huy hiệu quả trong hệ tiêu hóa người, nâng cao giá trị công nghệ của sản phẩm, một dạng thực phẩm chức năng sản xuất từ đậu nành, bổ sung chế phẩm

probiotic

2.4 PHƯƠNG PHÁP VI GÓI

Hơn 60 năm trước, khi kỹ thuật bao gói, đặc biệt là kỹ thuật vi bao (vi gói) được

phát hiện, khả năng ứng dụng to lớn của nó đã mở ra rất nhiều thành tựu

2.4.1 Tổng quan về vi gói

a Vi gói

Theo King A.H, 1995, bao gói được hiểu là quá trình tạo thành một lớp màng mỏng, như một lớp vỏ bọc gói gọn hoàn toàn khối vật chất trong lòng nó, phần lõi Phần lõi này có thể ở dạng rắn, giọt lỏng hoặc bọt khí, điền đầy vùng không gian bên trong lớp vỏ Cả hai hợp phần này tạo thành những hạt có kích thước khác nhau Dựa vào kích thước hạt, kỹ thuật bao gói được phân thành 3 loại như sau:

- Bao gói lớn: kích thước hạt lớn hơn 5,000 µm

- Vi gói: kích thước hạt từ 0,2 – 5,000 µm

- Siêu vi gói: kích thước hạt nhỏ hơn 0,2 µm

Với kích thước trung bình, vi gói là phương pháp bảo vệ phần vật liệu lõi bên trong bằng một lớp vỏ bọc Thành phần điển hình của lớp vỏ này chính là những cơ chất tạo gel thông dụng Ngoài ra, đây còn là phương pháp cô lập, điều khiển giai đoạn, thời điểm giải phóng phần lõi hoạt động để giảm thiểu hay tăng hiệu quả của nó, từ đó

đạt được mục tiêu của việc bao, vi gói

Trong y học, vi gói mở ra con đường vận chuyển những hợp phần dược chất, hệ

vi sinh vật đường ruột có lợi (vi khuẩn lactic), bảo vệ và giải phóng chúng đúng thời điểm nhằm tăng hiệu quả điều trị

Trong công nghiệp thực phẩm vi gói cung cấp những thành phần, cơ chất hoạt động, những vật liệu rắn, lỏng cần thiết cho quy trình chế biến như hợp chất dễ bay

hơi, hương liệu, vitamin, vi khoáng, enzyme, vi sinh vật… nhưng vẫn đảm bảo loại trừ

những tương tác bất lợi cho chúng Hiệu quả nổi bật của vi gói như sau:

- Điều khiển quá trình giải phóng thành phần được vi gói

- Tăng cường sự ổn định trong xử lý nhiệt, ẩm, tác nhân oxi hóa và ánh sáng

- Bao bọc các thành phần tạo mùi vị không mong muốn

- Giảm sự tương tác không thuận lợi với những thành phần khác

- Tăng tính chống chịu, sự ổn định của các thành phần vật liệu chính của quá trình chế biến như trộn, nén ép, đồng hóa…

Ngoài ra, kỹ thuật vi gói còn được ứng dụng trong nông nghiệp, phòng trừ dịch

hại; công nghệ enzyme hay hương liệu cũng với những cơ chế trên [17]

b Vi gói tế bào vi sinh vật

Được định nghĩa là quá trình bẫy hoặc nhốt tế bào vi sinh vật bởi một lớp gel nước, có vai trò như lớp vỏ bọc để phân cách, bảo vệ tế bào với ảnh hưởng của môi trường xung quanh và giải phóng chúng đúng thời điểm mong muốn của mỗi ứng dụng

cụ thể [42, 45, 55]

Tác nhân giúp giải phóng hệ vi sinh vật được vi gói thường là: sự thay đổi pH, ứng suất cơ học, tác dụng nhiệt xử lý (nhiệt nóng hoặc nhiệt lạnh), hoạt động enzyme,

áp suất thẩm thấu, sự khuyếch tán ẩm chậm xuyên qua lớp màng, một số hợp chất hóa

học, thời gian lưu trữ [36]

Trong phạm vi luận văn chúng tôi nghiên cứu vi gói tế bào vi khuẩn lactic và hiệu quả vi gói này trong quá trình lên men, trong môi trường dạ dày nhân tạo để nâng cao chất lượng sản phẩm sữa chua đậu nành ở chỉ tiêu vi sinh vật, cung cấp hệ vi khuẩn probiotic cho cơ thể Vì thế, thuật ngữ vi gói trình bày trong luận văn được hiểu là vi gói tế bào vi khuẩn lactic

2.4.1.1 Cấu trúc hạt vi gói

Mỗi hạt vi gói bao gồm lớp gel ưa nước bao bọc tế bào vi sinh vật, còn gọi là vỏ bọc Vì vỏ có cấu trúc gel nên còn gọi hạt là hạt gel Hình dạng hạt thường là hình cầu hoặc elip nên cũng được gọi là hạt vi cầu Hạt có bề mặt phẳng hoặc gồ ghề (hình 2.6 - 1.1) Mỗi hạt chứa một hoặc nhiều tế bào

Khi vi gói tế bào, chất lỏng qua khe hở lấp đầy không gian bên trong hạt Vết nứt trên bề mặt hoặc sâu bên trong có thể xuất hiện ở hạt (hình 2.6-1.1) Sự gia tăng vết nứt dẫn đến hình thành lỗ, và như vậy sẽ làm giảm hiệu quả vi gói

Ngoài ra, hạt vi gói còn có thể được bọc bằng 2 lớp hợp chất hóa học để tăng hiệu quả vi gói Lớp thứ hai được gọi là vỏ ngoài, hoặc lớp bọc bổ sung (hình 1.3) [22, 26,

42, 45, 64]

Hình 2.6: Cấu trúc hạt vi gói [17]

1.1 Hạt tế bào đơn: tế bào vi khuẩn (a), bề mặt không phẳng (b), bề mặt phẳng (c), bề mặt gãy (d); 1.2 Hạt đa tế bào: tế bào vi khuẩn (a), chất lỏng bên trong hạt (b), vỏ bọc (c);

1.3 Hạt tế bào vi gói: tế bào vi khuẩn (a), vỏ bọc (b), vỏ bọc ngoài (c)

2.4.1.2 Nguyên vật liệu cho vi gói

Có rất nhiều vật liệu tạo gel nhưng để sử dụng vi gói tế bào vi sinh vật cần đạt một số yêu cầu chính như [18, 29, 30, 59]

- Dễ dàng tạo lớp gel bao quanh tế bào vi sinh vật

- Không độc với cơ thể vật chủ, vi sinh vật (an toàn hoặc tương thích sinh học)

- Giá thành thấp

- Điều kiện tiến hành, việc chuẩn bị, thao tác đơn giản

- Giải phóng tế bào vi gói dễ dàng

- Không mẫn cảm với sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men

- Không hoặc ít tương tác với môi trường ngoài đến khi giải phóng phần lõi

- Hạn chế những vết nứt, rạn, kích cỡ lỗ phải phù hợp với mục đích vi gói

Một số loại vật liệu thường dùng như: alginate và phức hợp, tinh bột, hỗn hợp xanthan-gelan, carrageenan và hỗn hợp, gelatin, cellulose acetate phethalate,… (phụ lục) Trong đó, alginate là cơ chất thông dụng nhất, người ta nghiên cứu ứng dụng nó cho từng trường hợp cụ thể, ví dụ:

- Bổ sung vào alginate những thành phần phụ trợ khác như tinh bột, bột bắp biến tính, glycerol… để tăng cường tính chất vỏ bọc, cung cấp nguồn vi chất dinh dưỡng, hỗ

trợ quá trình chuyển hóa, thẩm thấu qua vỏ [39]

- Bọc bên ngoài alginate lớp vỏ phụ trợ, giúp tăng cường đặc tính cơ lý hóa của hạt vi gói, ví dụ như lớp vỏ phụ chitosan polymer bảo vệ alginate trước tác nhân chelate, tác nhân hấp thụ ion Ca2+ làm mất tính ổn định của vỏ vi gói, hay lớp vỏ phụ CaCl2 ổn định lớp gel alginate bên trong hạt [22]

2.4.1.3 Ứng dụng của vi gói

Vi gói tế bào vi sinh vật thường ứng dụng trong y dược và thực phẩm, có thể liệt

kê một số hướng chính như sau:

™ Sản xuất giống khởi động cho quá trình lên men

Vi gói có thể sử dụng hiệu quả cho việc tạo giống khởi động có khả năng sống cao dù trải qua quá trình lên men, bảo quản lạnh đông sâu hay điều kiện khắc nghiệt

của quá trình chế biến (gia nhiệt, phối trộn, xử lý acid, kềm ) [51, 55, 63]

™ Sản xuất sinh khối, lên men fermentor

Ứng dụng của vi gói trong lĩnh vực này là gia tăng sức chống chịu của tế bào trong quá trình sản xuất sinh khối, lên men fermentor, chống chịu với các yếu tố bất lợi của môi trường như: sự nhiễm phage, bacteriophage, độc tố hóa học, đột biến gen [17]

Vi gói tế bào còn có thể cho hiệu suất chuyển hóa cao đặc biệt ở tốc độ khuấy lớn Thí nghiệm của Champagne và đồng sự, 1992 cũng cho rằng vi gói tế bào có thể tạo lượng lớn tế bào (123.1x108 ml -1), cao hơn 6 lần so với huyền phù của tế bào tự do (18.6x108

ml-1)

™ Tăng khả năng sống của tế bào vi sinh vật probiotic trong hệ tiêu hóa Với khả năng chống chịu trong điều kiện acid - enzyme - mật có trong dạ dày và ruột, vi gói probiotic đã được ứng dụng rất nhiều trong sản xuất dược phẩm và trong công nghiệp thực phẩm, mở ra phương hướng sản xuất nhiều loại thực phẩm chức năng chứa chế phẩm vi gói probiotic, giúp con người dễ dàng tiếp cận và chấp nhận sản

phẩm probiotic, giúp chúng trở thành những thực phẩm cần thiết hàng ngày quí giá cho sức khỏe [17]

™ Sản xuất thực phẩm

Hiệu quả vi gói tế bào vi sinh vật, nhất là vi sinh vật probiotic trong sản xuất thực phẩm được nhìn nhận dưới các góc độ:

¾ Tăng khả năng sống của tế bào vi sinh vật

Vi gói có thể cải thiện đáng kể khả năng sống của tế bào vi sinh vật chống lại các nhân tố môi trường bất lợi trong quá trình chế biến thực phẩm như: nồng độ acid cao,

pH thấp, ảnh hưởng của oxy (trong trường hợp vi khuẩn kị khí bắt buộc), nhiệt xử lý, quá trình bảo quản lạnh đông sâu,…vì thế tăng thời gian bảo quản sản phẩm, đặc biệt với sản phẩm probiotic [25, 52, 53, 54, 60]

¾ Phương pháp mới ưu việt cho quá trình sản xuất thực phẩm

Tuy bị kìm hãm trong vi gói nhưng tế bào vi sinh vật vẫn có thể hoạt động chuyển hóa và vì thế nó được ứng dụng trong quá trình lên men thực phẩm Xét ví dụ sản xuất

sữa chua nhờ vi gói vi khuẩn Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus,

kết quả đã nêu bật nhiều ưu điểm so với phương pháp sản xuất truyền thống như: cải thiện giá trị cảm quan, kiểm soát hương vị sản phẩm cuối dễ dàng, gia tăng sức sống của tế bào [17, 65]

¾ Cố định tế bào

Cố định tế bào vi sinh vật được vi gói để hỗ trợ quá trình đồng nhất, tạo sự phân tán đều tế bào trong sản phẩm Chức năng cố định tế bào sẽ đặc biệt quan trọng với sản phẩm nhiều pha cần đồng hóa và độ nhớt cao như mayonnaise [43]

¾ Cải thiện giá trị cảm quan của sản phẩm lên men

Vi gói tế bào vi sinh vật giúp cải thiện giá trị cảm quan của sản phẩm Với sản phẩm lên men bởi tế bào tự do, sự lên men quá mức là nguyên nhân chính làm giảm sức sống tế bào và khó ổn định mùi vị sản phẩm cuối trong giai đoạn bảo quản Vi gói

sẽ khắc phục nhược điểm trên, tế bào hầu như không hoạt động chuyển hóa và gây ảnh

hưởng mùi vị sản phẩm, điều này phụ thuộc vào kiểu và đường kính vi gói [54]

Ở sữa chua, chế phẩm vi gói lên men có mùi acid nhẹ hơn vì chủ yếu tạo thành

acid lactic L+, giảm thiểu lượng acid acetic, làm giảm giá trị cảm quan sản phẩm

2.4.2 Các phương pháp vi gói

Từ cuối thập kỉ 80, phương pháp vi gói tế bào vi sinh vật đã được quan tâm

nghiên cứu Có hai hướng chính là phương pháp nén ép (extrusion) và phương pháp tạo nhũ (emulsion) được ứng dụng rộng rãi [65] Quy trình thực hiện như sau:

Tế bào vi sinh vật

Dung dịch muối alginate

Kỹ thuật nén ép Kỹ thuật tạo nhũ

Tạo giot treo huyền phù tế bào - alginate

Tạo nhũ trong dầu thực vật

Cho vào dung dịch CaCl 2 Cho giọt CaCl2 vào hệ nhũ để tạo gel

Vi gói

Dịch lỏng Alginate

2.4.2.1 Phương pháp nén ép

Phương pháp nén ép là phương pháp xuất hiện sớm nhất và được sử dụng phổ biến nhất với chất gói là loại gel tan trong nước [14] Nhìn chung, đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, nhẹ nhàng nên ít làm tổn thương tế bào Khả năng tương hợp sinh học và tính linh hoạt là những tính chất đặc biệt của phương pháp này

Đầu tiên, huyền phù tế bào – alginate sẽ được đẩy xuyên qua kim tiêm để tạo các giọt nhỏ, rơi trực tiếp vào trong dung dịch chứa các cation canxi dưới dạng CaCl2 Ngay lập tức polymer alginate bao chung quanh tế bào và hình thành khung 3 chiều bởi liên kết với ion Ca2+ [45] Ở nồng độ alginate thấp (khoảng 0,6%), việc tạo gel chỉ xảy

ra nếu có mặt ion Ca2+ 0,3M [39] Nồng độ phổ biến được sử dụng nằm trong khoảng 1

– 2% cho alginate và 0,05 – 1,5M cho CaCl2 Hầu hết các giọt được tạo ra có đường kính 2 – 3mm [45]

Đường kính giọt bị ảnh hưởng lớn bởi các nhân tố như loại alginate, nồng độ, độ nhớt của dung dịch alginate và đường kính kim tiêm [62] Đường kính hạt giảm theo sự tăng nồng độ và độ nhớt của dung dịch vi gói Người ta còn nghiên cứu sử dụng alginate có tỉ lệ acid guluronic thấp để tạo giọt với đường kính bé hơn [50]

Với vỏ bọc ngoài là chitosan, dung dịch alginate được nhỏ vào dịch chứa CaCl2 và

chitosan 0,1%, pH 6,5 khoảng 20 phút để tạo hạt có các đặc tính tốt hơn [46]

2.4.2.2 Phương pháp vi gói với hệ nhũ tương (nhũ tương hóa)

Phương pháp này đã được áp dụng thành công để vi gói vi khuẩn lactic, so với phương pháp nén ép, phương pháp vi gói với hệ nhũ tương có nhiều ưu điểm vượt trội nhưng yêu cầu kỹ thuật cao hơn [18, 47]

Trong kỹ thuật này, pha phân tán là huyền phù tế bào, alginate được thêm vào một lượng lớn dầu thực vật đóng vai trò pha liên tục như dầu đậu nành, dầu hướng dương, dầu bắp [37] Dung dịch tạo thành sẽ đồng nhất hơn khi khuấy, lắc với tốc độ thích hợp cho đến khi hệ nhũ tương hình thành

Chất chuyển thể có thể được sử dụng với mục đích tạo hệ nhũ tương tốt hơn Tween 80 với nồng độ 0,2% cho hiệu quả tốt nhất [61] Khi đã có hệ nhũ tương, thêm dung dịch CaCl2 vào ở dạng vi giọt để tạo mầm hạt gel trong pha dầu Các hạt nhỏ hơn của pha nước trong hệ nhũ tương dầu sẽ tạo các hạt có đường kính nhỏ hơn Tốc độ lắc hỗn hợp và loại chất chuyển thể cũng là các nhân tố quyết định đường kính hạt [45] Việc sử dụng chất chuyển thể để tạo hạt có đường kính nhỏ hơn là do các phân tử này làm giảm sức căng giữa hai bề mặt pha nước và pha dầu [15] Bằng cách sử dụng chất chuyển thể kết hợp giữa Tween 80 và lauryl sulphate, đường kính hạt nằm trong khoảng 25 – 35μm [61] Các hạt micro được tạo thành theo phương pháp nhũ tương

hóa có thể được thu nhận bằng màng lọc [45]

Đường kính hạt quyết định khả năng sống của tế bào, khả năng trao đổi chất của chúng, giá trị cảm quan sản phẩm cuối cùng và khả năng phân tán các hạt trong sản phẩm [55]

Kỹ thuật này có một số hạn chế khi sử dụng trong sản xuất thực phẩm vì lượng dầu dư trong vật liệu vi gói làm ảnh hưởng cấu trúc và giá trị cảm quan của sản phẩm, không thích hợp cho các thực phẩm mỗi ngày yêu cầu hàm lượng béo thấp Mặt khác, lượng dầu dư, chất chuyển thể và hoạt dịch trong vật liệu vi gói có thể là độc tố đối với

sự sống của tế bào và ảnh hưởng đến thành phần thực phẩm

2.4.2.3 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật hai phương pháp vi gói

Cũng theo Wunwisa Krasaekoopt và đồng sự, 2002, cả hai phương pháp trên đều

có thể được ứng dụng bao gói tế bào vi sinh vật, vi khuẩn probiotic tùy vào điều kiện công nghệ, mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng qua việc phân tích một số chỉ tiêu sau:

Bảng 2.3: Ưu và nhược điểm của hai phương pháp vi gói cơ bản [65]

Tính khả thi trong công nghiệp

Chi phí

Sự đơn giản

Tỉ lệ sống sót của tế bào vi gói

Kích thước hạt của vi gói

Khó khăn Thấp Cao

80 – 95%

2 – 5mm

Dễ dàng Cao Thấp

80 – 95%

25µm – 2mm

Phương pháp nén ép có ưu điểm về chi phí thấp, kỹ thuật đơn giản nhưng kích thước vi gói phụ thuộc lớn vào đường kính kim tiêm, quá trình tạo hạt và ổn định chất lượng hạt mất nhiều thời gian hơn kỹ thuật nhũ tương hóa nên thích hợp với quy mô sản xuất nhỏ

Với kỹ thuật tạo nhũ tương, trong công nghiệp thực phẩm sẽ dễ dàng cơ giới hóa,

mở rộng quy mô và hiệu suất vì quá trình tạo hạt và ổn định chất lượng hạt nhanh, kích thước hạt nhỏ khó nhận biết trong thực phẩm, tạo cảm giác cảm quan tốt (do giọt hệ nước CaCl2 có sức căng bề mặt nhỏ, kích thước nhỏ lại là tác nhân chính tạo gel trong

hệ nhũ tương dầu) Tuy nhiên, quá trình thực hiện phải qua công đoạn tạo nhũ hỗn hợp huyền phù tế bào – chất tạo gel, chính chất tạo nhũ làm tăng chi phí sản xuất của kỹ thuật này

Mặt khác, phương pháp này cần có thiết bị hỗ trợ tạo nhũ phân tán đều vi khuẩn trong dung dịch, nếu không sẽ khó khăn trong việc khống chế số lượng tế bào vi khuẩn trong vi gói nên làm cho công nghệ của phương pháp này phức tạp hơn

2.4.2.4 Một số nghiên cứu về vi gói đã công bố

Phạm vi ứng dụng, cơ chất, nồng độ cơ chất, chất hỗ trợ kỹ thuật, đường kính vi gói của hai phương pháp này đã được Wunwisa Krasaekoopt và đồng sự, 2002, đúc kết dựa trên nghiên cứu của nhiều tác giả, chúng tôi xin được trình bày trong phụ lục 6,7

2.4.3 Alginate và sự tạo gel alginate

Alginate khá thông dụng trong công nghiệp thực phẩm, cấu tạo khá đơn giản

2.4.3.1 Cấu tạo của alginate

Alginate là polysaccharide dị hợp mạch thẳng được chiết tách từ các loại tảo khác nhau, với 2 đơn vị cấu trúc là β-D-mannuronic và α-L-guluronic acid Alginate hình thành từ sự liên kết giữa các monomer này ở các vị trí C-1 và C-4 bằng liên kết glucozide, tỉ lệ của hai hợp phần này (mannuronic: guluronic acid) thường là là 1,5 Dạng thương phẩm của alginate thường gặp là Na-alginate

Trọng lượng phân tử của alginate dao động từ 32 – 200 kdal, hấp thụ nước ở dạng muối của kim loại kềm, magnesium, amonia hoặc muối amin Alginate là tác nhân làm dày, ổn định và tạo gel rất thông dụng trong công nghiệp thực phẩm [19]

Hình 2.8: Cấu trúc của gel alginate với mô hình “ hộp trứng ” [19]

2.4.3.2 Tính chất của alginate

Đặc tính quan trọng của alginate là độ nhớt dễ biến đổi và khả năng tạo gel

™ Độ nhớt dung dịch alginate: phụ thuộc bởi nhiều yếu tố, theo Belitz, Grosch

(1999), Nguyễn xích Liên (2000) là:

- Trọng lượng phân tử alginate: trọng lượng phân tử càng cao, độ nhớt càng cao

- Tỉ lệ ion của muối: độ nhớt tỉ lệ thuận với nồng độ cation đa hóa trị Vì thế, khi dung dịch alginate có tác nhân chelate (tác nhân xúc tác tạo thành hợp chất hữu cơ có nhiều hơn một liên kết với các kim loại trong dung dịch), độ nhớt sẽ giảm