Định lượng nhanh vibrio parahaemolyticus bằng mẫu dò biotin labeled ap conjugate khảo sát mật độ nhiễm v parahaemolyticus trong nhuyễn thể tại vùng nuôi cần giờ tp HCM

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Nghiên cứu xây dựng dự thảo phương pháp định lượng nhanh V.parahaemolyticus trong thủy sản và thức ăn chế biến dựa trên quá trình lai phân tử, sử dụng mẫu dò biotin-t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ VĂN HIỂU

ĐỊNH LƯỢNG NHANH VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS BẰNG MẪU DÒ BIOTIN-

LABELED AP CONJUGATE KHẢO SÁT MẬT ĐỘ

NHIỄM V.PARAHAEMOLYTICUS TRONG NHUYỄN

THỂ TẠI VÙNG NUÔI CẦN GIỜ - TP HCM

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 08 NĂM 2009

Phần 1

MỞ ĐẦU

Phần 2

TỔNG QUAN

Phần 3

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

Phần 4

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

Phần 5 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

oOo -

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Ngày tháng 08 năm 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

- -oOo -

TP HCM, ngày tháng 08 năm 2009

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SỸ

Họ và tên học viên: LÊ VĂN HIỂU Giới tính: Nam

Ngày tháng năm sinh: 10/10/1983 Nơi sinh: Hà Tĩnh

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Khóa: 2007

1 TÊN ĐỀ TÀI: ĐỊNH LƯỢNG NHANH VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

BẰNG MẪU DÒ BIOTIN-LABELED AP CONJUGATE KHẢO SÁT MẬT

ĐỘ NHIỄM V.PARAHAEMOLYTICUS TRONG NHUYỄN THỂ TẠI VÙNG

NUÔI CẦN GIỜ - TP HCM

2 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

Nghiên cứu xây dựng dự thảo phương pháp định lượng nhanh

V.parahaemolyticus trong thủy sản và thức ăn chế biến dựa trên quá trình lai phân

tử, sử dụng mẫu dò biotin-tlh-labele alkaline phosphatase conjugate, đặc hiệu với đoạn gene thermolabile hemolysin chỉ có ở các dòng V.parahaemolyticus mà không

có ở các vi sinh vật khác

Xác nhận hiệu lực phương pháp mới xây dựng

Xác định một số thông số của phương pháp mới

So sánh hiệu quả phân tích của phương pháp mới xây dựng với phương pháp định lượng truyền thống

Ứng dụng phương pháp mới vào phân tích mẫu nhuyễn thể tại vùng nuôi Cần Giờ - Tp Hồ Chí Minh, từ kết quả đưa ra khuyến cáo cần thiết

4 NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 03/08/2009

5 HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN

QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

Em xin chân thành cảm ơn Thầy, PGS.TS Nguyễn Đức Lượng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho Tôi cả về vật chất và thời gian để hoàn thành luận văn này

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến các Thầy Cô Bộ Môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy đã truyền đạt cho em những kiến thức nền tảng trong quá trình học tập

Em xin chân thành cảm ơn Anh, ThS Nguyễn Tiến Dũng đã nhiệt tình giúp

đỡ và động viên em hoàn thành tốt luận văn Cảm ơn tất cả các Anh, Chị, bạn đồng nghiệp bộ phận Vi sinh đã luôn sát cánh và chia sẻ cùng Tôi những khó khăn trong công việc và tận tình giúp đỡ Tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Lời tri ân cuối cùng, con xin gửi đến Ba Má, anh hai và em út, những người luôn ủng hộ, động viên và tạo cho con động lực, niềm tin để học tập, lao động và vươn lên trong cuộc sống

Trân trọng

LÊ VĂN HIỂU

TÓM TẮT

Vibrio parahaemolyticus có khả năng gây bệnh cho người và các đối tượng

thủy sản Một số dòng mang gene Thermostable Direct Hemolysin (TDH) và Thermostable Related Hemolysin (TRH) gây nên bệnh tiêu chảy và viêm dạ dày rất

nguy hiểm ở người Một nghiên cứu của Taniguchi và các cộng sự vào năm 1986 đã

chỉ ra Thermolabile Hemolysin (TLH) là đoạn gene đặc hiệu cho

V.parahaemolyticus mà không có ở bất cứ loài nào khác Các phương pháp định

lượng V.parahaemolyticus trong thực phẩm hiện nay chủ yếu dựa trên phương pháp

nuôi cấy vi sinh truyền thống và các phép thử sinh hóa, đòi hỏi nhiều thời gian và công thực hiện, nhưng đôi khi kết quả lại không ổn định và thời gian phân tích dài 5 – 6 ngày Mục tiêu của luận văn này là xây dựng phương pháp định lượng nhanh

V.parahaemolyticus dựa trên phương pháp lai phân tử, sử dụng mẫu dò

biotin-tlh-labeled AP conjugate, để phát hiện đoạn gene TLH của V.parahaemolyticus

Phương pháp lai DNA với mẫu dò có gắn biotin (biotin-labele) để phát hiện gene đặc hiệu của vi khuẩn là một kỹ thuật mới của Công nghệ sinh học cho phép xác định chính xác đối tượng quan tâm mà không cần phải tốn nhiều thời gian và công sức

Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng lai: thời gian, độ đặc hiệu, hiệu suất chuyển khuẩn lạc lên màng lai…, từ đó làm cơ sở cho

việc đề xuất dự thảo phương pháp định lượng nhanh V.parahaemolyticus bằng

phương pháp lai phân tử Đồng thời, chúng tôi thực hiện xác định hiệu lực và đánh giá hiệu quả phân tích của phương pháp mới so với phương pháp truyền thống

Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp chúng tôi xây dựng có độ nhạy đạt trên 95%, độ đặc hiệu 100%, tỷ lệ dương tính giả 0%, và tỷ lệ âm tính giả dưới 5% Hiệu quả phân tích tương đương với phương pháp truyền thống (trên đối tượng chủng gây nhiễm vào mẫu) ở độ tin cậy 95%

Cần Giờ - Tp Hồ Chí Minh, kết quả trong 11 mẫu phân tích có 03 mẫu nghêu

nhiễm V.parahaemolyticus vượt giới hạn cho phép, chiếm tỷ lệ 27,3%

ABSTRACT

Vibrio parahaemolyticus is the pathogenic organism of human and aquatic

animals Some strains of V parahaemolyticus carry Thermostable Direct Hemolysin

(TDH) and Thermostable Related Hemolysin (TRH) genes causing human serious

diarrhea and gastritis Taniguchi et al (1986) indicates that Thermolabile Hemolysin (TLH) is a specified gene of V parahaemolyticus, which does not exist

in any other species Current methods of quantifying V parahaemolyticus in

foodstuff are mostly based on traditional cultivation and biochemical tests, which are time and labor consuming It takes from five to six days for the whole analyzing procedure However, the testing results are sometimes variable This thesis aims to

construct a rapid quantitative method of V parahaemolyticus based on principle of molecular hybridization Biotin-tlh-labeled probe AP conjugate is used to detect V

parahaemolyticus TLH gene The hybridization between DNA and a biotin-labele

probe, allowing detecting bacterial specified gene, is an advanced technique of applied biotechnology This method takes less time and labor to accurately capture the targets

Several factors, affecting the hybridization reaction, are investigated such as time, specificity, efficiency of transferring colonies on hybridization membrane The result of investigation provides a sound basis to propose the rapid method of

quantifying V parahaemolyticus based on in-situ hybridization Simultaneously, the

new method is validated and compared with a tradition testing method

Results show that of the new method, the sensitivity, specificity, false positive rate and false negative rate are above 95%, 100%, 0% and below 5%, respectively Compared with the traditional method, the new method has no statistically significant difference in analyzing effectiveness at the confidence of

95%

Minh aquaculture ponds Of eleven samples tested, three are excessively

contaminated with V parahaemolytis, well over accepted limit, proportion 27,3%

MỤC LỤC

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

Phần 2: TỔNG QUAN 6

2.1 Tổng quan về Vibrio parahaemolyticus 6

2.1.1 Định nghĩa và phân loại V.parahaemolyticus 6

2.1.2 Đặc điểm sinh học V.parahaemolyticus 7

2.1.3 Các bệnh do V.parahaemolyticus gây ra 7

2.1.4 Cách điều trị 9

2.1.5 Đặc điểm cấu trúc phân tử và miễn dịch học của V.parahaemolyticus 10

2.1.6 Trình tự đoạn gene thermolabile hemolysin và mẫu dò 11

biotin-tlh-labele của V.parahaemolyticus 2.2 Phương pháp lai phân tử 12

2.2.1 Các hệ thống đánh dấu mẫu dò 13

2.2.1.1 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ 13

2.2.1.2 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ 13

2.2.2 Giới thiệu về hệ thống biotin – streptavidin 14

2.2.3 Giới thiệu về biotin 17

2.2.4 Giới thiệu về NBT 18

2.2.5 Giới thiệu về BCIP-T 18

2.2.6 Giới thiệu về alkaline phosphatase 19

2.3 Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực phương pháp 19

2.3.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 19

2.3.3 Độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả 20

2.4 Các phương pháp định lượng V.parahaemolyticus trong thực phẩm 21

2.4.1 Phương pháp MPN 21

2.4.2 Phương pháp đếm đĩa 22

2.4.3 Phương pháp màng lọc 22

2.4.4 Phương pháp lai phân tử 23

2.5 Giới thiệu về chương trình nhuyễn thể 24

Phần 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Nguyên vật liệu 26

3.1.1 Chủng chuẩn V.parahaemolyticus và mẫu thủy sản 26

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ chính 26

3.1.3 Môi trường và hóa chất 26

3.2 Phương pháp nghiên cứu 28

3.2.1 Phương pháp nhuộm gram 28

3.2.2 Phương pháp xác định V.cholerae và V.parahaemolyticus 29

trong thực phẩm 3.2.3 Phương pháp định lượng V.parahaemolyticus 32

bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 3.2.4 Phương pháp gây nhiễm chủng vào mẫu thực phẩm 37

3.2.5 Phương pháp xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 39

3.2.6 Xác định các thuộc tính của phương pháp 41

3.2.7 So sánh hiệu quả phân tích V.parahaemolyticus giữa 43

3.2.8 Ứng dụng phân tích mẫu nhuyễn thể 44

Phần 4: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 45

4.1 Kết quả phân lập và kiểm tra chủng V.parahaemolyticus 45

4.2 Xây dựng dự thảo phương pháp định lượng nhanh V.parahaemolyticus 46

bằng mẫu dò biotin-labele 4.2.1 Cơ sở xây dựng phương pháp 46

4.2.2 Đề xuất dự thảo phương pháp 48

4.3 Thăm dò phương pháp 53

4.4 Xác định tính đặc hiệu của phương pháp 54

4.5 Khảo sát hiệu suất chuyển khuẩn lạc lên màng lai 57

và mật độ phát hiện tối ưu trên màng 4.6 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 59

của phương pháp mới xây dựng 4.7 Khảo sát các thuộc tính của phương pháp định lượng nhanh 62

V.parahaemolyticus bằng mẫu dò Biotin-labele AP conjugate 4.8 So sánh hiệu quả định lượng V.parahaemolyticus 64

giữa phương pháp mới xây dựng và phương pháp sinh hóa truyền thống 4.9 Ứng dụng quy trình phân tích mẫu nhuyễn thể tại vùng nuôi CầnGiờ 67

Tp Hồ Chí Minh Phần 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 69

5.1 Kết luận 69

5.2 Đề nghị 69

PHỤ LỤC

Hình 2.1: Hình dạng V.parahaemolyticus chụp dưới kính hiển vi điện tử 6

Hình 2.2: Biotin gắn vào mẫu dò tại vị trí của Adenine ở đầu 5’ 12

Hình 2.3: Cơ chế hoạt động và phát hiện mẫu dò 16

Hình 2.4: Đồng phân lập thể dạng D(+) của biotin 17

Hình 2.5: Cấu trúc phân tử của NBT 18

Hình 2.6: Cấu trúc phân tử của BCIP-T 18

Hình 2.7: Cấu trúc enzyme alkaline phosphatase 19

Hình 4.1: Khuẩn lạc V.parahaemolyticus trên thạch TCBS và kết quả lai 46

Hình 4.2: Màng lai bị đen khi ủ với thuốc nhuộm qua đêm 54

Hình 4.3: Kết quả lai giữa 2 chủng V.parahaemolyticus và E.coli 56

Hình 4.4: Kết quả lai giữa 7 chủng V.parahaemolyticus và 5 chủng vsv 57

không phải là vsv mục tiêu Hình 4.5: Khả năng phát hiện khuẩn lạc khi trên màng có mật độ vsv lớn 59

Hình 4.6: Dãy thử nghiệm sinh hóa của V.parahaemolyticus 66

Bảng 3.1: Các nghiệm sinh hóa sơ bộ xác định V.cholerae 30

và V.parahaemolyticus Bảng 3.2: Các nghiệm sinh hóa xác định V.cholerae 31

và V.parahaemolyticus Bảng 3.3: Các nghiệm sinh hóa sơ bộ xác định V.parahaemolyticus 33

Bảng 3.4: Các nghiệm sinh hóa xác định V.parahaemolyticus 34

Bảng 4.1: Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng lai 53

Bảng 4.2: Kết quả phản ứng lai với 2 chủng V.parahaemolyticus và E.coli 55

Bảng 4.3: Kết quả lai 7 chủng V.parahaemolyticus và 5 chủng không phải 55

là V.parahaemolyticus Bảng 4.4: Hiệu suất chuyển khuẩn lạc từ đĩa thạch lên màng lai 58

Bảng 4.5: Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp cho 10g mẫu tôm tươi 60

Bảng 4.6: Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp cho 10g mẫu khô 60

Bảng 4.7: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 61

Bảng 4.8: Kết quả khảo sát các thuộc tính của phương pháp trên nền mẫu 63

tôm tươi và cá khô Bảng 4.9: Các thuộc tính của phương pháp trên hai nền mẫu tôm tươi 64

và cá khô Bảng 4.10: Kết quả phân tích 5 mẫu đại diện theo hai phương pháp 65

Bảng 4.11: Kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể 67

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AP : Alkaline Phosphatase

APW : Alkaline Peptone Water

ADH : Arginine dihydrolase

BYT : Bộ y tế

BNN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn

bp : base pair – cặp base

CFU : Colony-forming unit – số đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA : Deoxyribonucleotide Acid – bộ mã di truyền

FDA : Food and Drung Administration – Cơ quan quản lý thực

ODC : Ornithine decarboxylase

PCR : Polymerase Chain Reaction – phản ứng khuếch đại

Probe : Mẫu dò

RFLP : Restriction Fragments Length Polymorphism – Tính đa hình

chiều dài các đoạn cắt giới hạn

TDH : Thermostable Direct Hemolysin

TRH : Thermostable Related Hemolysin

TLH : Thermolabile Hemolysin

Tm : Melting Temperature – Nhiệt độ nóng chảy

UV : Untra Violet – tia cực tím

V parahaemolyticus : Vibrio parahaemolyticus.

vsv : Vi sinh vật

µl : micro lit

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Hệ thống phát hiện mẫu dò được đánh dấu bằng Biotin 16

Sơ đồ 3.1: Quy trình định lượng V.parahaemolyticus 36

bằng phương pháp đếm đĩa

Sơ đồ 3.2: Quy trình gây nhiễm chủng vào mẫu 38

Sơ đồ 3.3: Quy trình xác định giới hạn định lượng của phương pháp 40

Sơ đồ 4.1: Quy trình định lượng V.parahaemolyticus bằng mẫu dò 49

biotin-labele AP conjugate

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG MỞ ĐẦU

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Sử dụng thực phẩm không an toàn có thể gây ngộ độc thực phẩm và các bệnh truyền qua thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người sử dụng, tác động xấu đến kinh tế - xã hội và quan hệ quốc tế

Ngộ độc thực phẩm và các bệnh có liên quan từ thực phẩm do nhiều nguyên

nhân khác nhau, một trong số các nguyên nhân đó là do vi khuẩn Vibrio

parahaemolyticus (V.parahaemolyticus) gây ra

Ngộ độc do nhiễm V.parahaemolyticus thường xảy ra suốt cả năm, đặc biệt

vào các tháng mùa hè, và có thể lây lan thành dịch lớn nếu không được kiểm soát chữa trị kịp thời Vi khuẩn này được tìm thấy trong hải sản và các sản phẩm chế biến từ hải sản, trong nước vùng nuôi, trong các loài hải sản sống như cá, giáp xác đặc biệt trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ: hàu, nghêu, sò… Các triệu chứng thường

gặp khi bệnh nhân bị nhiễm V.parahaemolyticus: nôn mửa, sốt cao, tiêu chảy, và co thắt bụng V.parahaemolyticus gây ra các bệnh viêm dạ dày, viêm ruột cấp, nhiễm

trùng máu và bệnh gan [13,14]

Năm 2002, một nghiên cứu được thực hiện tại tỉnh Khánh Hòa, các nhà nghiên cứu ghi nhận trong thời gian từ tháng 01/1995 đến tháng 09/2001, có 528 bệnh nhân bị tiêu chảy, trong số này có 471 người lớn và 57 trẻ em Phân tích vi sinh học cho thấy trong số 528 bệnh nhân bị tiêu chảy, có 53% dương tính với

V.parahaemolyticus.[6]

Ngoài ra, V.parahaemolyticus còn gây bệnh cho các loài thủy hải sản, đặc

biệt gây bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm có thể gây chết từ 80 – 100% ấu trùng

Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam năm 2007 đạt 917,3 nghìn tấn; kim ngạch đạt 3,758 tỷ USD, tăng 15,3% về lượng và 10,5% về kim ngạch so với năm 2006

Dự kiến năm 2008 sản lượng và kim ngạch xuất khẩu sẽ cao hơn năm 2007 Bên cạnh việc phát triển số lượng xuất khẩu, mở rộng thị trường, thường kèm theo những yêu cầu trong công tác đảm bảo chất lượng các mặt hàng xuất khẩu mà các

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG MỞ ĐẦU

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

thị trường nhập khẩu đặt ra Trong số các chỉ tiêu vi sinh cần kiểm soát có chỉ tiêu

định lượng V.parahaemolyticus [2]

Hiện nay, đang có một dự án “kiểm soát chất lượng vùng nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ”, nhằm tạo ra một vùng nuôi và nguồn nguyên liệu sạch không có các

độc tố hóa học, sinh học và nhiễm vi sinh vật

Việc định lượng V.parahaemolyticus bằng phương pháp nuôi cấy vi sinh

truyền thống đòi hỏi nhiều thời gian thực hiện các thử nghiệm sinh hóa sơ bộ và khẳng định, ảnh hưởng đến việc tìm ra nguyên nhân gây bệnh, cũng như chậm trễ trong công tác kiểm dịch cấp chứng thư đảm bảo chất lượng các mặt hàng thủy sản xuất nhập khẩu, cũng như tăng thêm chi phí cho doanh nghiệp do tăng thời gian lưu kho chờ thông quan

Một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phát hiện các gene gây bệnh: TRH, TDH, phương pháp này cho kết quả khá nhanh và chính xác Tuy nhiên, việc đầu tư cho thiết bị và hóa chất đòi hỏi chi phí cao, thao tác thực hiện phức tạp và qua nhiều công đoạn [5,18]

Hiện nay, quy trình định lượng V.parahaemolyticus trực tiếp dựa trên

phương pháp sử dụng mẫu dò DNA đã được áp dụng tại nhiều phòng thí nghiệm

trên thế giới và các bộ kit đã được thương mại hóa [18]

Định lượng mật độ V.parahaemolyticus sử dụng mẫu dò Biotin-tlh-labeled

Alkaline phosphatase (AP) conjugate là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi nhiều về thiết bị và công thực hiện, lại cho kết quả nhanh, chỉ sau 48 giờ phân tích [5,18]

Trên cơ sở này, cùng với mục tiêu xây dựng phương pháp định lượng

V.parahaemolyticus cho kết quả nhanh, chính xác, phù hợp với thực trạng các

phòng Thí nghiệm tại Việt Nam, nhằm phục vụ công tác kiểm dịch xuất nhập khẩu

và chương trình kiểm soát chất lượng vùng nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại địa bàn huyện Cần Giờ, được sự đồng ý của Bộ môn Công nghệ sinh học - Trường Đại học

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG MỞ ĐẦU

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh và cán bộ hướng dẫn khoa học, chúng tôi tiến

hành đề tài nghiên cứu “Định lượng nhanh Vibrio parahaemolyticus bằng mẫu dò

Biotin-labeled AP conjugate Khảo sát mật độ nhiễm V.parahaemolyticus trong nhuyễn thể tại vùng nuôi Cần Giờ - Tp HCM”, với mong muốn áp dụng thực tế

vào việc kiểm tra mẫu, phục vụ cho công tác quản lý chất lượng thủy sản xuất nhập khẩu của đơn vị đồng thời kiểm soát chất lượng vùng nuôi nhuyễn thể 2 mảnh vỏ phục vụ chương trình vùng nuôi sạch

Điểm mới của đề tài

Hiện nay, các phương pháp định lượng V.parahaemolyticus ở Việt Nam dựa

trên các phương pháp nuôi cấy truyền thống nên thời gian phân tích dài từ 5 - 6 ngày và phải trải qua nhiều thử nghiệm sinh hóa, trong khi với phương pháp sử

dụng mẫu dò Biotin-tlh-labeled cho kết quả trong thời gian ngắn với độ đặc hiệu

cao Nhưng phương pháp này lại chưa được quan tâm và ứng dụng ở nước ta

Với mong muốn xây dựng một qui trình hoàn chỉnh, phù hợp với các phòng thí nghiệm ở Việt Nam đồng thời ứng dụng vào thực tế kiểm tra cấp giấy chứng nhận đảm bảo chất lượng hàng thủy sản xuất nhập khẩu của cơ quan một cách nhanh chóng và chính xác

Ngoài ra, chúng tôi sẽ tiến hành đánh giá, xác định hiệu lực sơ cấp của phương pháp mới theo ISO 16140:2003 khi áp dụng thực tế vào Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình định lượng Vibrio parahaemolyticus dựa trên việc phát hiện gene thermolabile hemolysin (tlh) thông qua mẫu dò Biotin-tlh-labeled

Alkaline phosphatase conjugate

Xác định hiệu lực một số thông số của phương pháp

So sánh kết quả phân tích của phương pháp mới xây dựng với phương pháp truyền thống

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG MỞ ĐẦU

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Ứng dụng phương pháp mới vào phân tích mẫu nhuyễn thể tại vùng nuôi Cần Giờ - Tp Hồ Chí Minh

Nội dung nghiên cứu

Thu mẫu tại phòng Kiểm nghiệm Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 và vùng nuôi nhuyễn thể tại địa bàn huyện Cần Giờ

Định lượng V.parahaemolyticus trong mẫu thu nhận theo 2 phương pháp:

¾ Phương pháp đếm khuẩn lạc, tham chiếu theo phương pháp định lượng

V.parahaemolyticus áp dụng tại Trung tâm chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4

¾ Phương pháp định lượng V.parahaemolyticus dựa trên phương pháp sử dụng mẫu dò Biotin-tlh-labeled AP conjugate

So sánh mức tương đồng kết quả giữa hai phương pháp trên toàn bộ mẫu phân tích

Đề nghị phương pháp định lượng V.parahaemolyticus sử dụng mẫu dò Biotin-tlh-labeled AP conjugate hoàn chỉnh

Đánh giá các thông số của phương pháp mới xây dựng:

¾ Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

¾ Xác định độ chọn lọc của phương pháp

¾ Xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp mới xây dựng trên cơ sở so sánh với phương pháp nuôi cấy truyền thống như: độ chính xác, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả

Thu mẫu nhuyễn thể, tiến hành phân tích mẫu bằng phương pháp mới Từ kết quả phân tích, đưa ra các khuyến cáo (nếu có)

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG MỞ ĐẦU

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Ý nghĩa của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Xây dựng được quy trình định lượng

V.parahaemolyticus hoàn chỉnh, xác nhận hiệu lực của quy trình khi áp dụng vào

Việt Nam, đồng thời ứng dụng vào thực tế kiểm nghiệm nhằm đảm bảo chất lượng,

an toàn vệ sinh các lô hàng thủy hải sản xuất nhập khẩu nhanh chóng, chính xác

Từ quy trình này có thể mở rộng ra nghiên cứu xây dựng quy trình chỉ phát

hiện các dòng V.parahaemolyticus gây độc thông qua việc phát hiện các gene gây

độc như TDH hoặc TRH

Ý nghĩa thực tiễn: Phương pháp này đơn giản, không đòi hỏi nhiều nhân lực, cho kết quả nhanh hơn so với các phương pháp truyền thống và có độ đặc hiệu cao

Trong lĩnh vực xuất khẩu, đặc biệt là xuất khẩu thủy sản, việc rút ngắn thời gian kiểm tra mẫu là yêu cầu cấp bách và cần thiết của các công ty, xí nghiệp xuất khẩu nhằm giảm chi phí và thời gian lưu kho sản phẩm trong quá trình chờ cấp giấy chứng nhận chất lượng để xuất khẩu, đồng thời góp phần đảm bảo chất lượng sản phẩm

Từ kết quả phân tích mẫu nhuyễn thể, đưa ra các hướng dẫn cần thiết đối với các nhà máy chế biến, người tiêu dùng cũng như các cơ quan quản lý, nhằm tạo ra các sản phẩm sạch an toàn cho người sử dụng

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

2.1 TỔNG QUAN VỀ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS

2.1.1 Định nghĩa và phân loại Vibrio parahaemolyticus [9]

Định nghĩa:

Vibrio parahaemolyticus là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều

nhau tạo thành hình dấu phẩy, di động, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase dương (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S, có khả năng khử nitrate thành nitrite nhưng không lên men sucrose Không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường có 10%muối

Hình 2.1: Hình dạng V.parahaemolyticus chụp dưới kính hiển vi điện tử

Phân loại:

Giới : Bacteria

Ngành : Proteobacteria

Lớp : Gamma Proteobacteria

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Bộ : Vibrionales

Họ : Vibrionaceae

Giống : Vibrio

Loài : Vibrio parahaemolyticus

2.1.2 Đặc điểm sinh học V.parahaemolyticus [9]

V.parahaemolyticus hiện diện trong nước biển, nước cửa sông, đặc biệt ở

vùng khí hậu ấm, có thể nhiễm vào cá hay các loại hải sản khác như là tôm, nghêu,

sò và đặc biệt là hàu

Chúng còn hiện diện trong cát, bùn và phân của bệnh nhân bị tiêu chảy

Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu 35 – 37oC Có thể phát triển được ở 42oC

Bị tiêu diệt ở 65oC sau 10 phút, và không phát triển được ở nhiệt độ dưới

15oC

Phát triển tốt trong môi trường kiềm, pH tối ưu 8.6

Có phản ứng oxidase (+), có phản ứng ADH (-), LDC (+), ODC (+), có khả năng khử nitrate thành nitrite nhưng không lên men sucrose

Sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi

Không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường 10% muối

Khuẩn lạc đặc trưng của V.parahaemolyticus trên môi trường thạch TCBS là

khuẩn lạc lớn, đường kính 3 - 4 mm, có màu từ xanh đến xanh dương

2.1.3 Các bệnh do V.parahaemolyticus gây ra [5,6,13,14,17,18]

Vi khuẩn này được phân lập lần đầu tiên ở Nhật vào năm 1950 từ phân bệnh nhân bị tiêu chảy do ăn cá biển

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

V.parahaemolyticus đã được xác nhận là nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc

thức ăn do cá biển và hải sản Các vụ ngộ độc do vsv này đã được báo cáo ở nước ta

và nhiều nước trên thế giới

Bệnh hầu hết xảy ra vào mùa hè, là lúc thời tiết thuận lợi cho vi khuẩn này phát triển từ các lớp bùn cát ven biển vào ký sinh trong hải sản

Ở người, V.parahaemolyticus gây ra các bệnh viêm dạ dày, viêm ruột cấp, nhiễm trùng máu và bệnh gan V.parahaemolyticus gây ra hai hội chứng lâm sàng

khác biệt nhau là tiêu chảy kiểu tả nhẹ và tiêu chảy phân có nhiều máu, kèm theo đau bụng và sốt theo kiểu lỵ trực khuẩn Chúng sản sinh ra độc hemolysine bền nhiệt, chất này chịu trách nhiệm cho phản ứng kháng nguyên Kanagawa Tuy nhiên,

trong những năm gần đây các dòng V.parahaemolyticus có phản ứng Kanagawa âm

tính cũng gây bệnh Triệu chứng biểu hiện của bệnh có thể xuất hiện trong khoảng 2 – 96 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm, thời gian này phụ thuộc vào liều lượng xâm nhiễm, trạng thái sức khỏe của từng bệnh nhân, loại thực phẩm tiêu thụ

và hàm lượng acid trong dạ dày Thông thường bệnh nhẹ và ít nguy hiểm, song nếu phát hiện chậm và không điều trị kịp thời cũng có thể gây tử vong

Trong hội chứng kiểu tả nhẹ, thời kỳ ủ bệnh là 15 giờ, còn trong kiểu lỵ trực khuẩn, thời gian ủ bệnh ngắn, khoảng 3 giờ

Khi bị nhiễm V.parahaemolyticus hoặc độc tố, triệu chứng thường gặp là nôn

mửa, tiêu chảy, sốt cao, ớn lạnh và co thắt bụng, bệnh có thể lây lan thành dịch lớn nếu không được kiểm soát kịp thời và tình trạng vệ sinh môi trường, nước, thực phẩm và thói quen vệ sinh cá nhân chưa tốt

Tại Việt Nam, V.parahaemolyticus đã từng gây ra ngộ độc tập thể do ăn tôm

nhiễm tại Hải Phòng vào năm 1983 Ngoài ra, còn một số vụ nhiễm vi sinh vật này

đã được ghi nhận mà gần đây nhất là dịch tiêu chảy tại Mang Thít – Vĩnh Long bắt đầu từ ngày 03/10/2005, điểm xuất phát của dịch là ở xã Mỹ Phước, giáp ranh với

xã Mỹ An và lây lan nhanh qua các xã khác theo đường nước và thực phẩm Các

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

nhà khoa học đã phát hiện V.parahaemolyticus hiện diện trong mẫu con ba khía và

phân của bệnh nhân bị nhiễm bệnh tại vùng

Ngoài ra, V.parahaemolyticus có khả năng gây bệnh cho nhiều đối tượng

thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) Đặc biệt chúng gây bệnh phát sáng ở các loại tôm biển và tôm càng xanh trong giai đoạn ấu trùng Zoea ương trong bể, nguồn nước nhiễm khuẩn gây bệnh cho ấu trùng Tôm nhiễm bệnh bị yếu, có màu trắng đục, tôm sắp chết thường nổi lên mặt nước hay ven mé Tôm nhiễm bệnh nặng sẽ phát sáng trong tối, lắng xuống đáy bể thành một thảm sáng xanh ở đáy, chết hàng loạt và rất nhanh đến 80 – 100%

Mất nước nặng: biểu hiện ở mắt trũng, môi khô, da nhăn nheo Khi lượng nước mất hơn 5% trọng lượng cơ thể hoặc khi uống không có kết quả thì phải bù nước bằng truyền tĩnh mạch

Chỉ sử dụng kháng sinh khi bệnh nhân có dấu hiệu tiêu chảy xâm nhiễm (có bạch cầu trong phân)

Ngoài ra, cần chú ý đến chế độ dinh dưỡng của bệnh nhân Do bệnh nhân trong giai đoạn nhiễm bệnh thì khả năng tiêu hóa và hấp thụ thức ăn kém, vì vậy thức ăn cần phải chế biến kỹ, nấu nhuyễn dễ tiêu hóa, và đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

2.1.5 Đặc điểm cấu trúc phân tử và miễn dịch học của Vibrio parahaemolyticus

[14,16,17, 18]

V.parahaemolyticus có 3 loại kháng nguyên:

¾ Kháng nguyên thân O: là kháng nguyên chịu nhiệt và được chia thành 12 type

¾ Kháng nguyên lông H

¾ Kháng nguyên vỏ K: là kháng nguyên không chịu nhiệt và được chia thành

59 type

Hầu hết các dòng tạo ra thermostable direct hemolysin (TDH) có hiện tượng

ngưng kết Kanagawa Đoạn gene mã hóa cho tdh đã được tạo dòng và giải trình tự

Thermostable related hemolysin (TRH) có sự tương đồng khoảng 60% với TDH, cũng được tìm thấy ở các dòng gây bệnh viêm dạ dày Tuy nhiên, hiện nay chưa có các phương thức để phát hiện đoạn gen này ngoài tế bào Nhiều dòng

V.parahaemolyticus sản sinh ra cả TDH và TRH

Một nghiên cứu của Taniguchi và các cộng sự vào năm 1986 đã chỉ ra rằng

thermolabile hemolysin (TLH) được tìm thấy ở tất cả các dòng V.parahaemolyticus

mà không có bất cứ ở loài nào khác Do đó các mẫu dò phát hiện đoạn gene tlh mã

hóa cho thermolabile hemolysin đã được phát triển để phát hiện sự hiện diện của

V.parahaemolyticus

Thermolabile hemolysin là một trong những độc tố đường ruột được sản sinh

bởi V.parahaemolyticus, và đoạn gene mã hóa được ký hiệu là TLH (tlh) Nó là đoạn gene đặc hiệu cho các dòng V.parahaemolyticus, do đó khi phát hiện ra đoạn gene tlh ta xác định sự hiện diện của V.parahaemolyticus

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

2.1.6 Trình tự đoạn gene thermolabile hemolysin và mẫu dò Biotin -tlh-labeled

của V.parahaemolyticus [19]

Trình tự đoạn gene tlh của V.parahaemolyticus đã được công bố trên NCBI,

mã số EF 640375 Đoạn gene có kích thước gần 450 bp, có trình tự như sau:

1 tgaacagcaa gagacagcag gggtcagcag aagactgcat tgttggatgg

Trình tự oligonucleotide được gắn trên Biotin-labeled sử dụng trong phản

ứng lai phát hiện đoạn gene tlh:

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Hình 2.2: Biotin gắn vào mẫu dò tại vị trí của Adenine ở đầu 5’

2.2 PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (HYBRIDIZATION) [3,9]

Phương pháp sử dụng mẫu dò (probe) để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm được dựa trên sự phát hiện một đoạn gene đặc trưng của vi sinh vật Cơ sở của việc sử dụng mẫu dò là quá trình lai phân tử

Quá trình này bao gồm sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép DNA khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử DNA và sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có trình tự nucleotide bổ sung khi nhiệt độ trở lại bình thường Một trong hai mạch DNA bổ sung được cố định trên một giá thể rắn hoặc nằm ngay trên tế bào hay mô

Sự lai phân tử xảy ra khi đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với một vùng trình tự trên DNA mục tiêu gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA

và RNA

Quá trình lai phân tử chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường

2.2.1 Các hệ thống đánh dấu mẫu dò (probe) [3]

Có 2 hệ thống đánh dấu và phát hiện mẫu dò trong lai phân tử: hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ và hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ

2.2.1.1 Hệ thống đánh dấu không dùng phóng xạ

Hệ thống đánh dấu các nucleic acid không dùng phóng xạ đã được áp dụng với những mẫu dò cho kỹ thuật lai DNA Hệ thống này có nhiều ưu điểm so với hệ thống sử dụng đồng vị phóng xạ đánh dấu nucleic acid

Phương pháp này làm giảm chất thải khó xử lý, an toàn, thể “probe” ổn định hơn so với mẫu dò được đánh dấu bằng P32, thời gian để phát hiện mẫu dò ngắn hơn

Hệ thống phát hiện và đánh dấu không dùng phóng xạ bao gồm các hệ thống

có thuật ngữ chuyên môn là “horseradish peroxidase”, “digoxigenin – antidigoxigenin”, và “biotin – streptavidin” Cả 3 hệ thống này, mẫu dò có thể được phát hiện với cơ chất chromogenic (có tính chất colorimetric = so màu) Cơ chất này sẽ tạo ra ánh sáng đối với enzyme có trong hệ thống

2.2.1.2 Hệ thống đánh dấu dùng phóng xạ

Phương pháp này rất phổ biến trong phân tích genome với RFLP trong những năm 1980 và những năm đầu thập niên 1990

Người ta sử dụng một loại phim để phát hiện mẫu dò được đánh dấu bằng P32

có đặc tính là một nhũ tương, rất nhạy cảm với bức xạ, làm bằng tinh thể “halides”

có bạc (Ag) như bromide, chloride, hoặc iodile, chúng được treo trong gelatin

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Gelatine này có nhiệm vụ tạo ra một matrix ổn định mà thông qua đó quá trình hòa tan thành dung dịch có thể thực hiện Nhũ tương trong gelatin được phủ trên giá phim một cách linh hoạt Thông thường phim được phủ lớp nhũ kép trên cả 2 mặt

Năng lượng tỏa ra từ đồng vị phóng xạ sẽ được những hạt halides này hấp thụ, tạo nên hiệu ứng electron, các điện tử Ag+ sẽ bị khử thành nguyên tử Ag và được phát hiện khi rửa phim

Có 3 phương pháp đánh dấu: phương pháp “nick translation”, phương pháp đánh dấu nhóm phân tử, và phương pháp photobiotin

Phương pháp này tạo ra các chất thải khó xử lý (đồng vị phóng xạ, các nguyên tử Ag…), mẫu dò thường không ổn định và cần thời gian phát hiện dài

2.2.2 Giới thiệu về hệ thống biotin – streptavidin

Sự tương tác giữa biotin và avidin được sử dụng rất phổ biến trong lĩnh vực miễn dịch học Avidin là một glycoprotein cơ bản có độ lớn 68.000 Da, được phân lập trong lòng trắng trứng gà Avidin kết dính với biotin rất chặt, không đồng hóa trị Biotin là một vitamin, mỗi phân tử avidin gắn với bốn phân tử biotin

Phản ứng kết gắn avidin – biotin tạo ra một vật chất có khối lượng lớn, bởi vì điểm đẳng điện của avidin mạnh hơn tương tác có tính chất tĩnh điện, và carbohydrate của avidin có xu hướng gắn với lectin như những protein Tuy nhiên, vấn đề đặt ra cho vật chất có khối lượng lớn này là, khi sử dụng hệ thống biotin – avidin, nó có thể bị mất

Streptavidin là một protein bên ngoài tế bào của Streptomyces avidinii, rất

giống với avidin Streptavidin có trọng lượng phân tử là 60.000 Da, với bốn tiểu đơn vị đồng nhất, mỗi tiểu đơn vị đều có thể gắn với một phân tử biotin Streptavidin, giống như avidin, có tính chất kết gắn với biotin rất mạnh mẽ, nhưng không phát sinh ra vấn đề do vật chất có khối lượng lớn như avidin

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Mẫu dò có gắn biotin-labele sẽ bắt cặp đặc hiệu đoạn gene mục tiêu và được nhận biết qua sự kết hợp với enzyme alkaline phosphatse thông qua cầu nối streptavidin Sự hình thành phức hợp trong quy trình rất nhanh và sự hình thành này không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố bên ngoài

Sau khi lai, DNA có biotin đánh dấu sẽ được phát hiện nhờ hiện tượng kết gắn chuyên tính của streptavidin, nhờ đó nó được nối với alkaline phosphatase (AP) Streptavidin kết hợp với alkaline phosphatase (AP), dễ dàng được phát hiện thông qua hệ thống cơ chất

Hệ thống cơ chất có tính chất chromogenic được dùng phổ biến nhất là bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) đi kèm với nitroblue tetrazolium chloride (NBT) Sau khi phản ứng với gốc phosphate của dung dịch, BCIP không có màu sẽ bị loại ra nhờ phản ứng enzyme của alkaline phosphatase, sản phẩm indolyl được hình thành sẽ bị oxid hóa để cho ra một phẩm nhuộm có màu chàm, như một dimer không thể hòa tan Màu chàm sẽ được khuếch đại nhờ có NBT trong hệ thống NBT hoạt động như một chất oxid hóa đối với indolyl, và nó tự khử hóa để tạo ra phẩm nhuộm màu xanh lơ NBT-formazan NBT là một dung dịch muối, một khi bị khử thành NBT formazan, nó sẽ trở nên không thể hòa tan

5-GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Sơ đồ 2.1: Hệ thống phát hiện mẫu dò được đánh dấu bằng Biotin

Hình 2.3: Cơ chế hoạt động và phát hiện mẫu dò

DNA của vsv mục tiêu được chuyển và cố định trên màng và lai với một mẫu dò DNA sợi đơn được đánh dấu bằng biotin Phân tử DNA được đánh dấu bằng biotin này sẽ được phát hiện do sự thêm vào streptavidin-alkaline phosphatase Streptavidin gắn chặt với biotin Cơ chất có tính chất chromogenic đối với alkaline phosphatase được thêm vào để tạo ra màu xanh lơ

DNA vsv

Chuyển lên màng

Lai với probe đánh dấu biotin

Thêm streptavidin alkaline phosphatase Thêm

AP chromogenic substrate BCIP-NBT Đọc kết quả

hiện màu

GVHD: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG TỔNG QUAN

HVTH: LÊ VĂN HIỂU LUẬN VĂN THẠC SỸ

Khi alkaline phosphatase loại ra gốc phosphate của BCIP, phản ứng dimer hóa trong phân tử trong điều kiện oxid hóa sẽ tạo ra 5,5’-dibromo-4,4’-dichloro-indigo, tạo ra kết tủa có màu xanh, ngoài ra sự có mặt của NBT sẽ khử màu để tạo

ra màu chàm

2.2.3 Giới thiệu về Biotin

Biotin hay còn được gọi là vitamin H, có công thức phân tử C10H16O3N2S

Có tám dạng đồng phân lập thể, quan trọng nhất là D(+) – biotin

Tinh thể có hình kim, nhiệt độ nóng chảy từ 230 – 232oC

Ít tan trong nước lạnh, dễ tan trong nước nóng, hầu như không tan trong ethanol và clorofom

Biotin gặp nhiều cùng với các vitamin nhóm B trong phức hệ vitamin B Nó

có nhiều trong thức ăn tự nhiên như lòng đỏ trứng, gan, thận, nấm men và đậu

Biotin có vai trò như một coenzyme cho các phản ứng cacboxyl hóa các chất hữu cơ trong tế bào Ở động vật và người, biotin được tổng hợp nhờ hệ vsv đường ruột Nó cần thiết cho cơ thể như một enzyme trong quá trình chuyển hóa các chất dinh dưỡng, điều hòa phát triển phôi tế bào

Hình 2.4: Đồng phân lập thể dạng D (+) của biotin