Cố định acetobacter aceti bằng chất mang cellulose vi khuẩn để ứng dụng lên men acid acetic

I- TÊN ĐỀ TÀI CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Xác định một số điều kiện dinh dưỡng thích

LÊ NGUYỄN HỒNG ÂN

CỐ ĐỊNH ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT

MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG

LÊN MEN ACID ACETIC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ NGÀNH : 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2009

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ và tên học viên: Lê Nguyễn Hồng Ân Giới tính: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 21-04-1983 Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 03106662

Khoá (năm trúng tuyển): 2006

I- TÊN ĐỀ TÀI

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG

CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Xác định một số điều kiện dinh dưỡng thích hợp của Acetobacter aceti trong

lên men acid acetic

- So sánh hiệu quả tạo acid acetic trong quá trình lên men theo mẻ ở chế độ lắc

và chế độ tĩnh

- Tạo chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn ở

điều kiện cố định tối ưu

- Xác định chế độ tối ưu để bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên

chất mang cellulose vi khuẩn

khuẩn trong hệ thống lên men acid acetic liên tục

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng chuyên ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

LỜI CÁM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cô luôn đồng hành cùng em trong thời gian thực hiện đề tài, những lúc em gặp khó khăn nhất Em vô cùng quý trọng sự nhiệt tình và hi sinh của Cô đã dành cho em để

em có thể hoàn thành luận văn

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG đã tạo điều kiện cho em thực hiện luận văn này

Em xin chân thành cám ơn các Cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giúp đỡ, quan tâm chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian em thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cám ơn đến tất cả các bạn học viên Cao học khóa 2006, khóa

2007, các bạn sinh viên trường Đại học Dân lập Kỹ thuật Công nghệ đã chia sẻ buồn vui cùng tôi trong khóa học và thời gian làm luận văn Đặc biệt cám ơn hai em Minh và Mi đã chia sẽ cho anh những lời khuyên và kinh nghiệm quý báu

Tôi xin cám ơn các bạn thân đồng nghiệp đã luôn bên cạnh tôi những lúc tôi gặp khó khăn để động viên tinh thần cho tôi sớm hoàn thành luận văn

Con xin cảm ơn Bố Mẹ và em Bi luôn là chỗ dựa vững chắc nhất để con có thể an tâm làm việc và hoàn thành luận văn Gia đình mình luôn là động lực lớn nhất giúp con phấn đấu hơn trong cuộc sống

Tp.HCM, ngày 01 tháng 8 năm 2009

LÊ NGUYỄN HỒNG ÂN

công nghiệp thực phẩm, tổng hợp chất dẻo tơ sợi, chế biến mủ cao su, sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ…Để nâng cao nồng độ acid acetic, luận văn có sử dụng

phương pháp cố định Acetobacter aceti lên chất mang cellulose vi khuẩn và hệ

thống lên men liên tục Các kết quả nghiên cứu đạt được như sau:

− Điều kiện dinh dưỡng thích hợp trong lên men acid acetic của Acetobacter

aceti: nồng độ sulfate amon 0.2%, nồng độ ethanol 0.3% và nồng độ acid acetic bổ

sung ban đầu 0.5%

− Trong thí nghiệm khảo sát sự lên men theo mẻ, chế độ lắc tạo ra nồng độ acid acetic cao hơn nồng độ acid acetic được tạo ra ở chế độ tĩnh Thời gian lên men

để nồng độ acid acetic đạt giá trị cao (7.03%) là 6 ngày

− Tạo ra được chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên cellulose vi khuẩn

trong điều kiện tối ưu lắc 250 vòng/phút ở 35oC Chế phẩm Acetobacter aceti cố

lượng, mật độ tế bào còn sống đạt 94.6% so với ban đầu

−Khi tiến hành ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên cellulose vi

khuẩn trong hệ thống lên men liên tục, đã xác định được tốc độ pha loãng tối ưu cho

hệ thống lên men liên tục là 0.008 (1/h); hệ thống lên men liên tục hoạt động ổn

định trong thời gian theo dõi, đạt nồng độ acid acetic là 7.5%; không phát hiện thấy

tế bào rửa trôi của chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên cellulose vi khuẩn trong

quá trình lên men liên tục

foodstuff industry, the synthesis of fibrous plastic and the manufacture of rubber latex, colourant, organic solven… In this thesis, with the aim of increasing the

acetic acid concentration, the immobilization of Acetobacter aceti cells in the

bacterial cellulose and the continuous fermentation system are applied The results are given as following:

− The nutritional conditions suitable for Acetobacter aceti in the acetic acid

fermentation include: the sulfate amon concentration of 0.2 percent, the ethanol concentration of 0.3 percent and the supplied acetic acid concentration of 0.5 percent

− Each day of batch fermentation, the fermentation with shaking condition makes the acetic acid concentration higher than the acetic acid concentration made form the stable fermentation The fermentation time to get high acetic acid concentration (7.03%) is determined as 6 days

−The product of Acetobacter aceti cells immobilizated in bacterial cellulose

carrier is optimally created in the shaking condition of 250 rpm and at 35oC Its preservation at the cool temprature (5 – 10oC) still remains the quality, the density

of live cells is 94.6% in comparision with the initial product

−The product of Acetobacter aceti cells immobilizated in bacterial cellulose

carrier is applied in the continuous fermentation system The optimal speed of dilution is determined as 0.008(1/h) The continuous fermentation system works stably in observation time and gets the acetic acid concentration of 7.5 percent

Acetobacter aceti cells in bacterial cellulose carrier may not be wash-out in the

continuous fermentation process

MỤC LỤC

Trang

LỜI MỞ ĐẦU - 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU - 3

1.1 Đặc điểm của acid acetic - 4

1.2 Tác nhân vi sinh vật - 4

1.3 Bản chất sinh hóa của quá trình lên men acetic -10

1.4 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men acetic -11

1.5 Các phương pháp sản xuất acid acetic -13

1.6 Cố định tế bào vi sinh vật -17

1.7 Hệ thống lên men -28

1.8 Các nghiên cứu về tế bào vi sinh vật cố định trong sản xuất acid acetic -33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -39

2.1 Vật liệu và hóa chất -40

2.2 Phương pháp nghiên cứu -42

2.2.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống -42

2.2.2 Khảo sát một số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự lên men acid acetic của Acetobacter aceti -44

2.2.3 Khảo sát khả năng tạo acid acetic trong điều kiện lên men theo mẻ -44

2.2.4 Khảo sát các điều kiện tối ưu để tạo chế phẩm Acetobacter aceti cố định lên chất mang BC -44

2.2.5 Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên BC -45

2.2.6 Ứng dụng chế phẩm A aceti cố định trong hệ thống lên men liên tục -45

2.2.7 Các phương pháp phân tích -46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN -50

3.1 Khảo sát một số đặc điểm sinh học của Acetobacter aceti -51

3.2 Khảo sát một số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự lên men acid acetic của Acetobacter aceti -56

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon -56

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol -58

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu -60

3.3 Khảo sát khả năng tạo acid acetic trong điều kiện lên men theo mẻ -63

3.4 Khảo sát các điều kiện tối ưu để cố định chủng A aceti lên chất mang BC 65

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ lắc đến mật độ tế bào hấp phụ lên chất mang BC theo thời gian -65

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật độ tế bào hấp phụ lên chất mang BC theo thời gian -67

3.5 Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định -69

3.6 Ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên chất mang BC trong hệ thống lên men liên tục -71

3.6.1 Xác định tốc độ pha loãng tối ưu cho quá trình lên men -73

3.6.2 Kiểm tra tính ổn định của hệ thống lên men liên tục -76

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ -79 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Vi khuẩn Acetobacter aceti dưới kính hiển vi điện tử .9

Hình 1.2 Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic .10

Hình 1.3 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét của màng BC .20

Hình 1.4 Các liên kết hydro trong cellulose .20

Hình 1.5 Lớp màng BC được hình thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh 21

Hình 1.6 Các hạt BC được hình thành trong điều kiện nuôi cấy lắc .22

Hình 1.7 Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang .25

Hình 1.8 Phương pháp cố định vi sinh vật trong lòng chất mang 26

Hình 1.9 Fermenter làm việc liên tục .29

Hình 3.1 Khuẩn lạc A aceti sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa 51

Hình 3.2 A aceti sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường thạch đứng 51

Hình 3.3 Hình dạng và cách sắp xếp của tế bào A aceti dưới kính hiển vi .52

Hình 3.4 Phản ứng dương tính khi thử với FeCl3 52

Hình 3.5 Bình nhân giống khảo sát đường cong sinh trưởng .54

Hình 3.6 Đường cong sinh trưởng của chủng Acetobacter aceti .55

Hình 3.7 Bình lên men tĩnh .63

Hình 3.8 Bình nuôi cấy cho các thí nghiệm cố định tế bào .65

Hình 3.9 Hệ thống lên men acid acetic liên tục .71

Hình 3.10 Cấu tạo của 1 bình lên men 72

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân loại vi khuẩn acetic theo Frateur .6

Bảng 1.2 Các chủng vi sinh vật tổng hợp BC .23

Bảng 3.1 Tương quan giữa mật độ tế bào (CFU/ml)và OD540 53

Bảng 3.2 Mật độ tế bào sau 5 ngày nhân giống .54

Bảng 3.3 Kết quả khảo ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon 56

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol .59

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu .61

Bảng 3.6 Kết quả lên men theo mẻ ở 2 chế độ tĩnh và lắc 63

Bảng 3.7 Biến thiên mật độ tế bào ở 3 chế độ lắc theo thời gian 66

Bảng 3.8 Biến thiên mật độ tế bào ở 3 chế độ nhiệt độ theo thời gian 67

Bảng 3.9 Chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản .69

Bảng 3.10 Tỉ lệ % tế bào còn sống so với chế phẩm ban đầu theo thời gian bảo quản .69

Bảng 3.11 Các thông số lên men ban đầu .73

Bảng 3.12 Lượng chế phẩm cho vào mỗi bình lên men .75

Bảng 3.13 Biến động pH trong quá trình lên men 75

Bảng 3.14 Biến động nồng độ acid acetic trong quá trình lên men .76

Bảng 3.15 Nồng độ acid acetic và pH với tốc độ pha loãng 0.008(1/h) 77

Bảng 3.16 Biến động của lượng acid acetic qua 5 bình của hệ thống ở tốc độ pha loãng 0.008(1/h) .77

Bảng 3.17 Bảng so sánh hiệu quả lên men của thí nghiệm lên men theo mẻ và lên men liên tục 78

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Trang

Đồ thị 3.1 Đồ thị chuẩn mối tương quan giữa mật độ tế bào và OD .53

Đồ thị 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon bổ sung ban đầu đến nồng độ acid tổng tạo thành .57

Đồ thị 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon ban đầu đến mật độ tế bào .58

Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol bổ sung ban đầu đến nồng độ acid tổng tạo thành .59

Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ban đầu đến mật độ tế bào .60

Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic bổ sung ban đầu đến nồng độ acid tổng tạo thành .61

Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu đến mật độ tế bào 62

Đồ thị 3.8 Giá trị pH ở 2 chế độ tĩnh và lắc theo từng ngày .64

Đồ thị 3.9 Nồng độ acid acetic ở 2 chế độ tĩnh và lắc theo từng ngày 64

Đồ thị 3.10 So sánh mật độ tế bào hấp phụ trên BC ở 3 chế độ lắc 66

Đồ thị 3.11 So sánh mật độ tế bào hấp phụ trên BC ở 3 chế độ nhiệt độ 68

Đồ thị 3.12 Tỉ lệ tế bào còn sống ở 2 chế độ nhiệt độ bảo quản khác nhau 70

DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Đường hướng tạo cellulose của vi khuẩn 24

Sơ dồ 1.2 Phân loại các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật .25

Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu .42

LỜI MỞ ĐẦU

Acid acetic (hay còn gọi là ethanol acid) là một loại hóa chất có giá trị kinh

tế cao, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: sản xuất chất dẻo, tơ sợi, chất màu, sợi tổng hợp, dung môi hữu cơ, phim ảnh, thực phẩm, hóa dược

Ở Việt Nam nhu cầu sử dụng acid acetic trong đời sống và trong hoạt động

công nghiệp rất lớn Acid acetic được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến

mủ cao su, công nghiệp thực phẩm, sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ, tổng hợp các chất dẻo tơ sợi [8]

Nhu cầu sử dụng acid acetic ngày càng nhiều, trong khi đó việc sản xuất acid acetic trong nước không đủ đáp ứng những nhu cầu trên Gần như toàn bộ nhu cầu acid acetic ở nước ta đều phải đáp ứng bằng con đường nhập khẩu

Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nên nguồn nguyên liệu để sản xuất acid acetic trong nước khá dồi dào như: mật rỉ, hoa quả chín, tinh bột, cồn Với điều kiện như vậy rất thích hợp cho việc nghiên cứu sản xuất acid acetic bằng cách ứng dụng công nghệ sinh học, nhằm đáp ứng nhu cầu về acid acetic ngày càng tăng của nước ta hiện nay và trong tương lai

Sự cố định tế bào vi sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào vi sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch, nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên Người

ta cho rằng các tế bào vi sinh vật cố định sẽ giúp giải quyết nhiều quá trình công nghệ mới chưa có tiền lệ và rất có ý nghĩa về mặt kinh tế ở mức độ sản xuất công nghiệp [40]

Được sự chấp thuận của trường Đại Học Bách Khoa và cán bộ hướng dẫn

khoa học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “CỐ ĐỊNH TẾ BÀO

ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ

ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC” nhằm mục đích tạo chế phẩm vi khuẩn

cố định và ứng dụng lên men acid acetic trong hệ thống lên men liên tục

Nội dung của đề tài bao gồm:

− Khảo sát một số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự lên men acid acetic

của Acetobacter aceti

− Khảo sát khả năng tạo acid acetic trong điều kiện lên men theo mẻ

− Khảo sát các điều kiện tối ưu để cố định Acetobacter aceti lên chất mang BC

− Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định

acetic liên tục

CHƯƠNG I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm của acid acetic

Acid acetic là hợp chất hóa học chủ yếu tạo nên mùi thơm và vị chua đặc trưng của giấm, được xem như là thành phần chính của giấm Giấm chứa khoảng 4 – 8 % acid acetic Acid acetic được sản xuất và sử dụng từ rất lâu đời Tên gọi acid acetic

xuất phát từ tên Latinh của giấm – acetum [36]

Công thức hóa học của acid acetic là CH3COOH

Khối lượng phân tử của acid acetic là 60,05

Acid acetic hoàn toàn tan trong nước, cồn, ester, benzen, acetone và chloroform; không tan trong CS2

Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic, permanganate Chúng có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose; có khả năng phân hủy da, ăn mòn nhiều kim loại [7]

1.2 Tác nhân vi sinh vật

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng lên men để tạo ra acid acetic Tất cả các vi khuẩn có khả năng lên men tạo ra acid acetic được gọi chung là vi khuẩn acetic Các

vi khuẩn acetic được xếp vào hai giống chính : Acetobacter, Gluconobacter Trong

đó, Acetobacter là tác nhân chính của quá trình lên men acetic, tạo acid acetic từ

ethanol Đây là những vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, có trên bề mặt lá, quả, hoa, nước ép trái cây chua, giấm, thức uống có cồn [7, 8]

1.2.1 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn acetic là vi khuẩn Gram (-) Các tế bào trẻ thuộc Gram (-), các tế bào già ở một số giống có đặc tính nhuộm Gram thay đổi

Về hình dạng tế bào, vi khuẩn acetic là trực khuẩn hình que tới elip, kích thước

tế bào 0.6 - 0.8 µm / 1 - 3 µm Các tế bào đứng tách riêng rẽ, một số xếp thành cặp, một số khác xếp thành chuỗi dài Một số loài đặc biệt có tế bào hình cầu, hình kéo dài, hình căng phồng, hình dùi cui, hình cong, hình phân nhánh, hình sợi Tùy điều

kiện pH môi trường, nhiệt độ nuôi cấy mà một số loài có thể có hình dạng bán nguyệt Nhiều loài vi khuẩn acetic khi phát triển trên môi trường thiếu dinh dưỡng hay môi trường đã nuôi cấy lâu (môi trường già) dễ sinh ra hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài ra) có thể phân nhánh

Vi khuẩn acetic có khả năng tạo màng nhày, không có khả năng tạo nội bào tử, một số có khả năng di động nhờ tiên mao ở cực hoặc xung quang cơ thể

Nhìn chung, vi khuẩn acetic không có khả năng tạo sắc tố, nhưng các khối tế bào có thể nhuộm màu hồng bởi porphirin Một số giống vi khuẩn acetic tạo sắc tố màu nâu tan trong nước

Trên môi trường đặc, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc tròn,

đều đặn, đường kính trung bình 1 – 3 mm Trên môi trường lỏng, chúng chỉ phát triển

trên bề mặt môi trường tạo thành những lớp màng dày mỏng khác nhau Một số loài vi khuẩn acetic tạo thành màng dày như sứa (0,5 mm), nhẵn trơn, khi lắc chúng chìm xuống đáy bình và thay vào đó một lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển [7, 35]

1.2.2 Đặc điểm sinh trưởng

Vi khuẩn acetic có khả năng sinh trưởng trên môi trường đơn giản đến phức tạp (hầu hết không cần các vitamin); có khả năng phát triển tốt trên môi trường nước bia, các môi trường có chứa cao nấm men, glucose, ethanol hay manitol

Vi khuẩn acetic là loài vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Trong điều kiện môi trường đầy đủ và lượng oxy được cung cấp liên tục, chúng có thể tăng sinh khối sau

12 giờ gấp 17 triệu lần so với sinh khối ban đầu

Vi khuẩn acetic có thể sinh trưởng ở pH 4.0 - 4.5; đôi khi ở pH 7 - 8; phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25 - 30oC, pH 5.4 - 5.8

Tính chất đặc trưng của vi khuẩn acetic là khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic ở pH trung tính và pH acid (pH 4.5)

Ngoài ra, vi khuẩn acetic còn thực hiện quá trình oxy hóa acetate, oxy hóa lactate thành CO2 và H2O, chuyển hóa glucose thành gluconate, oxy hóa không

hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo thành các hợp chất ketone hay các acid hữu cơ tương ứng

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn C, N và chất sinh trưởng cũng rất đa dạng Vi khuẩn acetic sử dụng đường, ethanol và các acid hữu cơ làm nguồn C Hexose và glycerol được sử dụng như nguồn C bởi hầu hết các giống; manitol và glutamate ít được sử dụng hoặc không sử dụng Vi khuẩn acetic không thủy phân lactose, dextrin, tinh bột và sử dụng muối amon làm nguồn N

Trong quá trình phát triển, vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với một số acid amin như valin, alanin, prolin

Một số chất kích thích sinh trưởng như acid nicotine, acid amin, acid folic và biotin… có vai trò quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn acetic

Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp polysaccharide như cellulose, tinh bột, dextran…Người ta ứng dụng khả năng này trong sản xuất công nghiệp

Một số loài tổng hợp được những sợi cellulose giống như bông là: A xylinum, A

acetigenum, A viizingianum [7, 8, 35]

1.2.3 Phân loại

Năm 1950, Frateur chia vi khuẩn acetic làm 4 nhóm

Bảng 1.1 Phân loại vi khuẩn acetic theo Frateur

Subosydans Acetobacter subosydaz

Acetobacter melanogennum

Không có khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O Mezoxydans Acetobacter aceti, Acetobacter

xylinum, Acetobacter mezoxydans Có đầy đủ các đặc điểm trên

Oxydans

Acetobacter ascendans Acetobacter ransens Actobacter lovaniens

Không có khả năng tạo các hợp chất ketose

Peroxydans Acetobacter peroxydans

Acetobacter paradoxum

Không chứa catalase, không oxy hóa glucose

[9]

Trong số 20 loài vi khuẩn Acetobacter hiện đã được nghiên cứu kỹ, khả năng

áp dụng vào thực tế sản xuất của các giống vi khuẩn sau đây được xem như có nhiều ưu điểm hơn cả:

Acetobacter pasteurianum:

Acetobacter pasteurianum là trực khuẩn ngắn, có hình thái gần giống Acetobacter aceti Nhưng khi ta nhuộm chúng với iod, tế bào sẽ có màu xanh thẫm Acetobacter pasteurianum tạo hình nhăn nheo khi phát triển trên môi trường đặc

Khả năng chịu ethanol của Acetobacter pasteurianum kém hơn của

Acetobacter aceti Trong điều kiện môi trường phát triển thuận lợi, chúng có khả

năng tạo được 5 – 6 % acid acetic

trên bề mặt Lớp váng vi khuẩn này thường rất chắc Khi nhuộm với iod, tế bào

Acetobacter orleaneuse sẽ chuyển sang màu vàng Vi khuẩn này chịu đựng được

lượng ethanol đến 12 % thể tích và trong điều kiện lên men thích hợp, chúng có thể tạo ra được 9,5 % acid acetic

Acetobacter xylinum:

Acetobacter xylinum là trực khuẩn dạng hình que, kích thước 2 µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi, không di động Các tế bào được bao bọc bởi chất nhầy, tạo váng nhẵn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iod và H2SO4 (phản

ứng của hemicellulose) vì váng có chứa hemicellulose

Vi khuẩn này khi phát triển trong môi trường thuận lợi, Acetobacter xylinum có thể

dày trên bề mặt môi trường Ngoài ra, Acetobacter xylinum còn có khả năng oxy hóa tiếp

acid acetic thành CO2 và H2O

Ở nhiều nước như Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật Bản, người ta thường sử dụng vi

khuẩn này cùng với nấm men để sản xuất ra loại nước uống rất đặc biệt gọi là “cvas”

Acetobacter schiitzenbachii:

Acetobacter schiitzenbachii thuộc vi khuẩn hình que, nhưng kích thước của

chúng dài hơn các giống đã trình bày ở trên A schiitzenbachii không tạo bào tử,

không có khả năng di động và thuộc vi khuẩn Gram (-)

Khi phát triển ở môi trường lỏng, A schiitzenbachii tạo ra lớp màng dày nhưng không chắc Ở các nước trên thế giới, người ta thường sử dụng A

schiitzenbachii để sản xuất giấm theo phương pháp chìm Trong điều kiện môi

trường thuận lợi, A schiitzenbachii có khả năng tạo được 11 – 12 % acid acetic

Acetobacter curvum:

Về cơ bản vi khuẩn này giống Acetobacter schiitzenbachii Trong môi

trường lên men thuận lợi, vi khuẩn này có thể tạo ra được 10 – 11 % acid acetic

Acetobacter curvum tạo váng rất chắc trên bề mặt môi trường Nhiệt độ lên men tối

C

Acetobacter suboxydans:

Acetobacter suboxydans phát triển trên bề mặt cơ chất tạo thành màng nhẹ,

mỏng Khi phát triển, chúng cần vitamin như acid paraaminonezoic, acid pantonic, acid nicotinic

A suboxydans được sử dụng nhiều trong công nghệ sản xuất vitamin C

Chúng có khả năng chịu đựng được nồng độ ethanol rất cao Nếu ta cho thêm một lượng nhỏ các chất dinh dưỡng cần thiết trong môi trường (ví dụ như glucose), vi khuẩn này có thể chuyển hóa hoàn toàn ethanol thành acid acetic Lượng acid acetic tạo được từ quá trình lên men có thể lên đến 13 %

Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này tiến hành lên men là 28 – 30oC Thời gian lên men xảy ra rất nhanh, chỉ cần 48 giờ lượng acid acetic có thể đạt được đến 13 %

Trong quá trình lên men cần thông khí liên tục, vì vi khuẩn này cần lượng oxy rất nhiều cho quá trình chuyển hóa ethanol thành acid acetic và cho quá trình phát triển

Acetobacter aceti - Tác nhân vi sinh vật sử dụng trong đề tài :

Acetobacter aceti là trực khuẩn ngắn có dạng hình que, kích thước rất ngắn

0,4 – 0,8 và 1 – 1,2 µm; thuộc tế bào Gram (-); không có khả năng di động; không tạo bào tử Các tế bào thường tạo hình chuỗi có kích thước rất dài Khi nhuộm với iod, tế bào chuyển thành màu vàng

Hình 1.1 Vi khuẩn Acetobacter aceti dưới kính hiển vi điện tử [42, 43]

A aceti tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên gelatin với dịch lên men chứa 10 %

đường saccharose, tạo thành màng dày nhẵn

A aceti sinh trưởng được trên môi trường thạch chứa dịch chiết nấm men và 2 %

canxi acetate hoặc canxi lactate Trên môi trường thạch chứa dịch chiết nấm men, 10 % glucose và 3 % CaCO3, A aceti có khả sinh trưởng tốt, tạo ra nhiều acid gluconic, các

tinh thể canxi 5-ketogluconate Nếu bổ sung 10 % fructose, đôi khi chúng còn tạo thành canxi oxalate

A aceti có khả năng phát triển trên môi trường có nồng độ ethanol khá cao

(11 %), có khả năng tích lũy 6 % acid acetic Nhiệt độ thích hợp nhất để A aceti

phát triển là 30oC Nếu nhiệt độ cao quá 43oC sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tế

bào có hình dạng quả lê A aceti thường phát triển trong môi trường bia [9]

1.3 Bản chất sinh hóa của quá trình lên men acid acetic

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic nhờ vi khuẩn acetic trong điều kiện hiếu khí

Phương trình tổng quát của quá trình lên men là:

Phản ứng này xảy ra trong tế bào của vi khuẩn Muốn phản ứng được xảy ra,

C2H5OH và O2 phải được thẩm thấu vào trong tế bào Khi đó các enzyme oxy hóa có trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic Acid acetic

được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan trong dung dịch môi trường

Hình 1.2 Quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic [8]

Trong quá trình lên men, ethanol được oxy hóa thành acid acetic Ở đây, sự chuyển hydro được thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP (Nicotiamide adenine dinucleotide phosphate) dạng oxy hóa Hydro được NADP nhận trở thành NADPH2

được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu nhận năng lượng xuất hiện được chuyển qua chuỗi

hô hấp để thu nhận năng lượng, song cơ chất không bị phân giải hoàn toàn, do vậy quá trình chuyển hóa trên còn được gọi là sự oxy hóa không hoàn toàn

C 2 H 5 OH

C 2 H 5 OH + O 2 Vi khuẩn Acetic CH 3 COOH + H 2 O +117 KCal

Cơ chế chuyển hóa ethanol thành acid acetic theo các phản ứng sau:

CH3COOH + 2O2  → CO2 + H2O

trong dung dịch lên men phải có dư một lượng ethanol khoảng 0.3 – 0.5% để đảm bảo không bao giờ hết ethanol [1, 7]

1.4 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men acetic

1.4.1 Ảnh hưởng của oxy

Sự chuyển hóa ethanol thành acid acetic do phản ứng oxy hóa trong đó oxy của khí quyển là chất tiếp nhận hydro Do vậy trong sản xuất, sự oxy hóa ethanol thành acid acetic chỉ xảy ra trong trường hợp vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với oxy của không khí Trong điều kiện yếm khí thì vi khuẩn actic sẽ sử dụng cơ chất dinh dưỡng mà không tạo thành acid acetic Như vậy chế độ cung cấp oxy là nhân tố

điều chỉnh quá trình lên men Lượng oxy cần thiết lớn gấp 2 lần lượng oxy lý

thuyết, càng thoáng khí thì năng suất càng lên men cao

1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ

Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sinh lý của vi sinh vật, do đó sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men

Vi khuẩn acetic thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho chúng là từ 25 –

32oC Ở nhiệt độ thấp, quá trình lên men sẽ xảy ra chậm Nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn và nhiệt độ tăng đến mức độ nào đó sẽ làm cho tế bào

ngừng sinh sản; hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acid acetic

và ethanol Thường nhiệt độ lên men trong sản xuất được khống chế từ 30 – 34oC

1.4.3 Ảnh hưởng của các nguồn C, N, P và các nguyên tố vi lượng

1.4.3.1 Sự acid hóa của dịch lên men

Trong lên men acid acetic, người ta thường cho vào cơ chất ban đầu một lượng acid acetic nhất định để acid hóa môi trường nhằm: ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật tạp, tạo pH thích hợp cho vi khuẩn acetic phát triển Môi trường acid (pH 3) là điều kiện thuận lợi đối với vi khuẩn acetic

Độ acid ban đầu 0.2 – 0.5 %, nếu cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của vi

khuẩn và giảm khả năng lên men Nồng độ acid acetic 8 % sẽ ức chế hoạt động của

vi khuẩn rất lớn và bị ngừng hoạt động hoàn toàn khi lượng acid đạt 12 – 14 %

1.4.3.2 Hàm lượng ethanol trong dịch lên men

Ethanol là chất sát khuẩn đối với vi khuẩn acetic và được sử dụng như cơ chất Nồng độ ethanol thường sử dụng là 6 – 14 % thể tích Khi thiếu ethanol trong môi trường lên men thì vi khuẩn sẽ bắt đầu sử dụng acid acetic và acid acetic sẽ bị mất đi theo phản ứng:

CH3COOH + 2O2→ 2CO2 + H2O

Do vậy, phải luôn luôn để thừa lại một lượng ethanol khoảng 0,3 – 0,5 % Lượng ethanol sót có tác dụng ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic

1.4.3.3 Hàm lượng các chất dinh dưỡng

Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh trong dịch lên men, ta cần bổ sung một số

muối khoáng (NH4)2SO4, KH2PO4, CaHPO4, FeCl3…tùy theo nhu cầu cụ thể từng loài

Ngoài ra, môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung vitamin, chất kích thích sinh trưởng như pepton, cao nấm men…

Thông thường tổng hàm lượng chất khoáng trong vi sinh vật chiếm 5 – 8% trọng lượng chất khô [8]

1.5 Các phương pháp sản xuất acid acetic

1.5.1 Phương pháp hóa gỗ

Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men, người ta thu được một hỗn hợp nhiều chất khác nhau, trong đó có acid acetic với hàm lượng rất lớn Hiện nay phương pháp này không còn sử dụng [8]

1.5.2 Phương pháp hóa học

Phương pháp này dựa trên quá trình oxy hóa acetaldehyde thành acid acetic,

có xúc tác của mangan rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50 – 80oC

Phản ứng oxy hóa xảy ra như sau:

Hiện nay, người ta tổng hợp acid acetic từ methanol và CO bằng phản ứng carbonyl hóa

CH3OH + CO → CH3COOH [8]

1.5.3 Phương pháp hỗn hợp

Trước tiên, người ta tiến hành quá trình oxy hóa hydrate carbon có mạch carbon ngắn như propan hay butan để tạo thành acid acetaldehyde, formaldehyde methanol và acetone Sau đó acetaldehyde được oxy hóa để tạo thành acid acetic Phương pháp hỗn hợp được sử dụng nhiều hơn cả là phương pháp thủy phân bột gỗ bằng acid (phương pháp hóa học) Sau đó, người ta trung hòa khối thủy phân này và tiến hành lên men để thu nhận được dung dịch chứa acid acetic [8]

1.5.4 Phương pháp sinh học

Hiện nay, người ta sản xuất acid acetic chủ yếu bằng phương pháp lên men

So với những phương pháp khác, phương pháp lên men có nhiều ưu điểm

Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm Có thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước trái dừa, nước ép mía…),

+ O 2

CH≡CH + H2O

CH2=CH2 + O2 → CH3CHO CH3COOH

Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua ba giai đoạn chuyển hóa:

− Giai đoạn chuyển tinh bột thành đường

− Giai đoạn chuyển đường thành cồn

− Giai đoạn chuyển cồn thành acid acetic

Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì qua hai giai đoạn:

− Giai đoạn chuyển đường thành cồn

− Giai đoạn chuyển cồn thành acid acetic

Nếu sản xuất từ nguyên liệu đã chứa cồn thì ta cần tạo điều kiện thuận lợi để

vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acid acetic

Quá trình chuyển hóa (hay quá trình lên men) được thực hiện ở điều kiện rất

ôn hòa; không cần nhiệt độ cao, áp suất hay máy móc, thiết bị phức tạp

Bản chất của quá trình lên men là lên men hiếu khí, vì thế phải tạo điều kiện tối đa để vi khuẩn tiếp xúc được với oxy và ethanol

Để giải quyết tốt vấn đề này có 4 phương pháp khác nhau:

1.5.4.1 Phương pháp lên men chậm

Phương pháp này được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là phương pháp truyền thống của người Pháp Phương pháp này được thực hiện như sau:

Người ta đóng các thùng lên men bằng gỗ có dung tích khoảng 250 – 300 lít bằng gỗ sồi hình tang trống (giống các thùng sản xuất bia và rượu vang)

Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho

Giống vi khuẩn acetic được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter

orleaneuse

Người ta thường cho vào thùng gỗ 1/5 thể tích lượng giấm và sau đó cho vào thùng dung dịch nước ép nho sao cho toàn bộ khối lượng đạt 1/2 thể tích thùng lên men (hoặc 2/3 thể tích thùng lên men) Sở dĩ người ta cho acid acetic trước là để tạo

điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát

triển, không bị nhiễm

Tiến hành quá trình lên men ở nhiệt độ thường Trong thời gian lên men, trên bề mặt dịch có một lớp váng trắng Lớp váng này là vi khuẩn acetic Quá trình lên men kết thúc sau vài tuần, khi hàm lượng ethanol trong dung dịch lên men còn khoảng 0,2 – 0,3

% thể tích Hàm lượng acid acetic sản xuất theo phương pháp này sau khi lên men là 5 – 6 % Hàm lượng acetic quá thấp rất có khả năng bị oxy hóa tiếp, làm giảm độ acid

Do đó, acid acetic sản xuất xong phải được thanh trùng và bảo quản

Phương pháp lên men chậm chỉ sản xuất acid acetic dùng trong công nghệ thực phẩm Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, sản phẩm của quá trình lên men là giấm có hàm lượng acid acetic thấp, có mùi thơm đặc trưng rất thích hợp cho công nghệ thực phẩm

Tuy nhiên, phương pháp này bộc lộ một loạt nhược điểm: thời gian lên men thường rất dài; hàm lượng acid acetic trong dung dịch thấp; năng suất thấp, thiết bị nhiều [8]

1.5.4.2 Phương pháp lên men nhanh

Phương pháp do người Đức thực hiện theo quy mô công nghiệp đã khắc phục

được những nhược điểm của phương pháp lên men chậm của người Pháp thực hiện

Theo phương pháp này, quá trình được thực hiện như sau:

Người ta thiết kế những thùng lên men rất lớn, hình trụ, thường có kích thước như sau: Chiều cao thùng 2,5 – 6 m Đường kính đáy của thùng 1,2 – 3 m Tỷ

lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng 1/2 là thích hợp nhất Trong thùng được chất đầy phoi bào hay lõi ngô (bắp) Phoi bào hay lõi ngô được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men, nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng Ngoài ra, ở đáy thiết bị, người ta cho lắp một hệ thống phân phối không khí đưa từ dưới lên Môi trường được đưa vào từ trên xuống

Quá trình vận hành thiết bị được thực hiện như sau: đầu tiên, người ta dùng acid acetic có nồng độ 3 – 5 % chảy qua lớp phoi bào hay lõi bắp để vừa có mục

đích thanh trùng vừa có tác dụng acid hóa vật liệu chất mang để vi sinh vật giống dễ

thích nghi trong quá trình lên men Sau đó, dùng nước vô trùng rửa qua và nạp

giống vi khuẩn acetic vào Vi khuẩn acetic sẽ bám vào phoi bào hay lõi bắp Tiếp

đó, người ta cho dòng môi trường từ trên xuống qua hệ thống phân phối như một

vòi hoa sen trong buồng tắm Môi trường sẽ được phân phối đều khắp vật liệu phoi bào hay lõi bắp Cùng lúc, người ta thổi khí từ dưới lên

Môi trường được đưa từ trên xuống, chảy qua lớp chất mang có chứa các tế bào

vi khuẩn Ethanol sẽ thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn, không khí được đưa từ dưới đáy thiết bị lên trên, thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn Vi khuẩn tiến hành quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic sẽ thấm thấu qua màng tế bào ra ngoài và theo dung dịch xuống đáy thiết bị lên men, sản phẩm được thu nhận từ đáy thiết bị lên men

Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24 – 37oC Thời gian lên men kéo dài 8 – 10 ngày Trong trường hợp dịch lên men cuối cùng chứa lượng acid acetic thấp, người ta tiến hành tái lên men bằng cách bơm chúng ngược lại từ trên xuống

Phương pháp này có một số ưu điểm sau: thời gian lên men nhanh; thiết bị

đơn giản và không cần nhiều thiết bị cho quá trình lên men; hàm lượng acid acetic

cao (thường đạt từ 10 – 11 %)

Tuy nhiên, vì thổi khí từ dưới lên nên xảy ra quá trình làm mất ethanol hoặc acid acetic [8]

1.5.4.3 Phương pháp lên men chìm

Người ta thiết kế hệ thống lên men acid acetic được gọi là acetator Cho dung dịch lên men vào thiết bị và tiến hành thổi khí rất mạnh Khi đó sẽ hình thành hai thể là huyền phù và dung dịch lên men Hai thể này luôn luôn được trộn lẫn nhau và quá trình oxy hóa xảy ra rất mãnh liệt Phương pháp này có ưu điểm là hiệu suất chuyển hóa có thể đạt 98 – 99 % [8]

1.5.4.4 Phương pháp kết hợp

Người ta thiết kế hệ thống lên men bao gồm hai phần: phần trên là lớp đệm hay lớp chất mang chứa vi sinh vật (giống phương pháp nhanh), lớp giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống Dưới cùng là hệ

thống thổi khí mạnh; khí sẽ được thổi qua phần dung dịch này rồi chuyển ngược lên phần trên (giống thiết bị lên men chìm)

Phương pháp kết hợp có rất nhiều ưu điểm, trong đó ưu điểm lớn nhất là hiệu suất lên men rất cao, nồng độ acid acetic thu nhận được thường nằm trong khoảng

ưa nước Tế bào sau khi cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm

đổi chất còn diễn ra quá trình tái tạo cofactor

1.6.3 Các yêu cầu đối với tế bào vi sinh vật cố định

Sự mất hoạt tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp; các tế bào phải có khả năng chiếm thể tích riêng của thiết bị phản ứng nhiều nhất nhằm làm tăng năng suất thể tích

Cơ chất và sản phẩm tạo ra phải có khả năng khắc phục được hàng rào cản khuếch tán; chất xúc tác (tế bào gắn vào chất mang) phải dễ dàng khuấy trộn được

và bền về mặt cơ học

Chất xúc tác phải ổn định trong khoảng nhiệt độ hoạt động của quy trình công nghệ cũng như phải bền đối với hóa chất và pH sử dụng trong quy trình công nghệ; phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào hoạt động của quá trình trao đổi chất đặc thù đối với từng cơ thể vi sinh vật [12]

1.6.4 Giới thiệu về chất mang Cellulose vi khuẩn (Bacterial Cellulose – BC)

Cellulose là một loại polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất, không những được xem như thành phần chính của sinh khối thực vật, mà còn là đại diện polymer ngoại bào của vi sinh vật BC phụ thuộc vào những sản phẩm đặc trưng của quá trình trao đổi chất nguyên thủy và chủ yếu là màng bảo vệ, trong khi cellulose thực vật đóng vai trò cấu trúc tế bào

Cellulose được tổng hợp bởi vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, Rhizobium,

Agrobacterium, và Sarcina (Jonas và Farah, 1998) Các sinh vật tổng hợp cellulose

hiệu quả nhất là vi khuẩn sinh acid acetic, Gram (-) Acetobacter xylinum (phân loại như Gluconacetobacter xylinus, Yamada và cộng sự, 1997; Yamada, 2000), loại vi

khuẩn được sử dụng làm vi sinh vật mẫu dùng trong những nghiên cứu ứng dụng và nghiên cứu cơ bản trên cellulose

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của BC là độ tinh sạch hóa học

Đây là đặc điểm phân biệt cellulose vi khuẩn với cellulose thực vật, loại cellulose

thường liên kết với hemicellulose và lignin

Do những đặc tính duy nhất được tạo ra từ cấu trúc hạt cực mịn, BC có nhiều

ứng dụng trong ngành giấy, dệt sợi và công nghệ thực phẩm; được xem như vật liệu

sinh học trong ngành mỹ phẩm và y khoa (Ring và cộng sự, 1986) Ứng dụng rộng hơn của loại polysaccharide này phụ thuộc vào quy mô sản xuất và chi phí của nó

Vì vậy, các nghiên cứu cơ bản được tiến hành cùng những nghiên cứu chuyên sâu

về lĩnh vực cải tiến giống và phát triển quá trình sản xuất [25]

Cấu trúc của BC

Cellulose là polymer không phân nhánh của gốc β-1,4-glucopyranose Các chuỗi BC tập hợp thành các sợi phụ có bề rộng xấp xỉ 1.5 nm tùy thuộc vào các sợi xuất hiện tự nhiên dày nhất, chỉ so sánh với các sợi cellulose dưới mức cơ bản được tìm thấy trong lớp thượng tầng của một số thực vật và cây quinee nhầy (Kudlicka, 1989) Các sợi phụ BC được kết tinh thành các vi sợi (Jonas và Farah, 1998), các vi sợi này tạo thành các bó và các bó tạo thành các dải (Yamanaka và cộng sự, 2000) Kích thước của các dải là 3 – 4 nm (bề dày) x 70 – 80 nm (bề rộng), theo Zarr (1977), 3.2 x 133 nm, theo Brown và cộng sự (1976), hoặc 4.1 x 117 nm, theo Yamanaka và cộng sự (2000), trong khi bề rộng của các sợi cellulose được tạo ra bằng cách nghiền nhão gỗ bulô hay gỗ thông lớn gấp hai lần độ lớn (theo thứ tự, 1.4 – 4.0 x 10-2 và 3.0 – 7.5 x 10-2 mm) Các dải cellulose vi khuẩn cực mảnh, với chiều dài dao động từ 1 – 9 µm tạo thành một cấu trúc hình mắt lưới dày đặc được cố định bởi liên kết hydro kéo dài BC cũng được phân biệt với cellulose thực vật bởi chỉ số kết tinh cao (trên 60%) và mức độ polymer hóa khác nhau (DP) thường giữa 2000

và 6000 (Jonas và Farah, 1998) Trong một số trường hợp nghiên cứu là 16,000 và 20,000 (Watanabe và cộng sự, 1998b), trái lại DP trung bình của polymer thực vật biến đổi từ 13,000 đến 14,000 (Teeri, 1997) [25]

Hình 1.3 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét của màng BC từ quá trình nuôi

cấy tĩnh Acetobacter xylinum (a) và tế bào vi khuẩn với các dải cellulose liên kết với nhau (b) [25]

Hình 1.4 Các liên kết hydro trong cellulose [25]

Hình thái của BC

Hình thái đại thể của BC phụ thuộc nghiêm ngặt vào những điều kiện nuôi cấy (Watanabe và cộng sự, 1998a; Yamanaka và cộng sự, 2000) Trong các điều kiện tĩnh, vi khuẩn tích lũy các mảng (S-BC) cellulose trên bề mặt môi trường nước luộc thịt chứa dinh dưỡng ở mặt phân giới (phân cắt phase) khí-lỏng giàu oxy Các sợi phụ cellulose nhô ra từ các lỗ sắp theo thứ tự đường thẳng ở bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết tinh thành các vi sợi và ép sâu hơn vào môi trường tăng trưởng Vì thế,

màng mỏng giống như da, nâng đỡ quần thể tế bào A xylinum bao gồm các dải

cellulose chồng lên nhau và xoắn vào nhau tạo thành các mặt phẳng song song và

vô tổ chức (Jonas và Farah, 1998) Các sợi S-BC liền kề nhau thường ít phân nhánh

và nối liền nhau hơn các sợi của BC được tạo trong nuôi cấy lắc (A-BC), ở dạng những thể hạt không đều nhau, những dải hình sao và hình sợi, phân tán đều trong nuôi cấy lỏng (Vandamme và cộng sự, 1998) [25]

Hình 1.5 Lớp màng BC được hình thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [25]

Hình 1.6 Các hạt BC được hình thành trong điều kiện nuôi cấy lắc [25]

Tính chất

- BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao hơn so với các dạng cellulose khác, không chứa lignin và hemicellulose BC có thể bị phân hủy hoàn toàn

- Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao

- Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt Trong điều kiện ngập nước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt

- Tính bền cơ học tốt, khả năng chịu nhiệt tốt

- Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sản phẩm mong muốn không cần qua bước trung gian Chẳng hạn như sản xuất giấy không cần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ Đặc biệt là vi khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ Trong cấu trúc BC thu được trong điều kiện nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màng tạo nên chặt chẽ hơn

Vi sinh vật tổng hợp BC

BC được tổng hợp bởi một vài giống vi khuẩn, trong đó chủng Acetobacter

phổ biến nhất Các giống vi sinh vật tổng hợp BC được giới thiệu trong bảng sau:

Bảng 1.2 Các chủng vi sinh vật tổng hợp BC

Chủng vi sinh vật Cấu trúc cellulose

A xylinum (tương tự A aceti spp xylinum, A xylinus) là chủng tổng hợp BC

hiệu quả nhất Hiện nay, chủng này được tái phân loại và được xếp thuộc giống

Gluconacetobater như G xylinus (Yamada và cộng sự, 1998, 2000) cùng với các

loài khác (G hansensii, G europaeus, G oboediens và G intermedius)

Chức năng sinh lý học

Trong môi trường sống tự nhiên, phần lớn vi khuẩn tổng hợp polysaccharide ngoại bào Các tế bào vi khuẩn tổng hợp cellulose được bẫy trong mạng lưới polymer, mà mạng này thường xuyên nâng đỡ khuẩn lạc ở mặt phân giới lỏng-khí

Vì thế, các chủng tạo thành BC có thể sống trong nước thải Chất nền polymer tham gia trong sự dính chặt của tế bào lên trên bất kỳ bề mặt nào có thể được sử dụng và tạo điều kiện cho sự cung cấp dinh dưỡng Nồng độ của chúng trong lưới polymer

được tăng cường đáng kể do các tính chất hấp phụ so với môi trường nước xung

quanh Một số tác giả cho rằng cellulose tổng hợp bởi A xylinum cũng đóng vai trò

dự trữ và có thể được sử dụng bởi các vi sinh vật đói Sự phân hủy của nó sau đó sẽ

được xúc tác bởi exo và endoglucanase Sự có mặt đồng thời của hai chất này được

tìm thấy trong nuôi cấy lỏng một số chủng A xylinum sản sinh cellulose

Do độ nhớt và các đặc tính hút nước của lớp cellulose, khả năng kháng lại các thay đổi bất lợi của các tế bào sản sinh BC (sự giảm hàm lượng nước, biến đổi

pH, sự xuất hiện các chất độc, các sinh vật gây bệnh…) trong môi trường sống tăng lên và các tế bào này có thể sinh trưởng sâu hơn và phát triển bên trong màng Người ta cũng khám phá ra rằng cellulose bảo vệ các tế bào vi khuẩn khỏi sự bức xạ tia tử ngoại 23% tế bào vi khuẩn sản sinh acid acetic được bao bởi BC sống sót 1 giờ khi xử lý với sự nhiễu xạ tia tử ngoại Việc loại bỏ polysaccharide bảo vệ làm giảm mạnh khả năng sống của các tế bào vi khuẩn

Sinh tổng hợp BC

Tổng hợp BC là một quá trình gồm nhiều bước được điều hòa bởi vô số enzyme và phức hợp các protein xúc tác và điều hòa Quá trình bao gồm sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDPGlc), mà chất này là tiền thân cellulose, nối tiếp theo sau bởi sự polymer hóa thành chuỗi β-1,4-glucan và sự kết hợp chuỗi mới thành cấu trúc giống dải ruy băng đặc trưng, được tạo thành bởi hàng trăm hay cả hàng ngàn chuỗi cellulose riêng biệt [25]

Sơ đồ 1.1 Đường hướng tạo cellulose của vi khuẩn [25]

1.6.5 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật

Sơ dồ 1.2 Phân loại các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật [12]

1.6.5.1 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang

Hình 1.7 Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang [21]

a Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Đây là phương pháp liên kết tế bào với các polymer đã được hoạt hóa Bản

chất liên kết cộng hóa trị là nối tế bào vi sinh vật với chất mang thông qua “cầu nối” nào đó Cầu nối này phải có kích thước không lớn lắm và có hai đầu, một đầu nối polymer còn đầu kia nối với tế bào

Các chất mang thường dùng: polypeptide, polysaccharide, dẫn xuất cellulose, dextrin, các polymer tổng hợp như polyacrylamide…

b Phương pháp hấp phụ

Đây được coi là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về cố định tế bào vi sinh vật

Trong quá trình cố định vi sinh vật bằng cách hấp phụ có các liên kết sau được hình thành:

Liên kết tĩnh điện Van Der Walls: giữ tế bào và bề mặt chất mang tạo nên một sự chênh lệch điện thế giữa bề mặt chất mang và bề mặt tế bào Giúp tế bào và chất mang gắn liền nhau

Lực mao quản: chất mang có các mao quản, khi được ngâm trong các huyền phù vi sinh vật sẽ hình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào trong lòng chất mang

Liên kết ion: bề mặt chất mang và vi sinh vật có mang các ion trái dấu, nhờ vậy tế bào vi sinh vật liên kết với chất mang [12, 21]

1.6.5.2 Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang

Hình 1.8 Phương pháp cố định vi sinh vật trong lòng chất mang [21]

Đối với tế bào vi sinh vật, trong một số trường hợp không nhất thiết phải gắn

chặt tế bào vào chất mang polymer và có thể giữ nó bên trong polymer, lúc này polymer tạo thành bao xung quanh tế bào Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui qua khỏi mạng, nhưng đồng thời đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo

được trộn vào trong một polymer, sau đó tiến hành quá trình trùng hợp với sự có

mặt của tác nhân khâu mạch, khi đó tế bào sẽ được bao bọc trong khuôn gel mới

b Nhốt trong các sợi nhỏ của sợi tổng hợp

Cho dòng chảy tuần hoàn bên trong sợi, do đó hạn chế được sự phân cực bề mặt và sự bịt lắp thường gặp với các màng Các sợi được dùng thường là các sợi nhân tạo Các sợi này thường có độ bền acid, kiềm, các loại ion và các dung môi hữu cơ hòa tan Tính chất trên phụ thuộc vào bản chất hóa học của các polymer tạo

ra loại sợi này Phương pháp này thường đơn giản trong thao tác hoạt động và không đòi hỏi cải biến hóa học đối với chất mang polymer sợi Polymer tạo sợi sử dụng trong cố định tế bào thường có giá rẻ và phổ biến ở số lượng đáng kể [12, 21]

1.6.5.3 Cố định vi khuẩn Acetic bằng BC

Với những tính chất và cấu tạo của BC, ta thấy BC là chất mang thích hợp để

cố định vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ, kích cỡ của sợi cellulose phù hợp với

việc cố định tế bào vi khuẩn Acetobacter aceti lên BC

Acetobacter là một trong những vi khuẩn sản xuất ra cellulose Vi khuẩn này

được bẫy bên trong mạng lưới polymer Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần

thể vi sinh vật luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng với không khí Hệ thống polymer làm cho các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và giúp tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới cellulose

Nhờ tính dẻo dai và tính hút nước, các lớp cellulose giúp các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, sự xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật cạnh tranh

Sau khi được vắt kiệt nước, BC có khả năng hấp phụ và trương nở tốt khi

đưa dịch giống vào Mặt khác, với phương pháp hấp phụ này ta không cần sử dụng

thêm những hóa chất dặc biệt, do đó ít gây ảnh hưởng hoạt tính của vi sinh vật, không gây ô nhiễm môi trường và rẻ tiền

Từ những nguyên nhân trên, ta thấy cellulose là một loại giá thể phù hợp để

cố định vi sinh vật [12]

1.7 Hệ thống lên men

1.7.1 Các khái niệm chung

Một quy trình sản xuất các sản phẩm công nghệ sinh học có nhiều thiết bị tham gia Ta có thể chia ra làm bốn nhóm thiết bị như sau:

- Thiết bị trước lên men bao gồm các thiết bị chuẩn bị môi trường, tiệt trùng môi trường, nhân giống

- Thiết bị lên men (fermenter)

- Thiết bị sau lên men gồm các thiết bị thu hồi sản phẩm, chế biến sản phẩm lên men thành các dạng thương phẩm Có thể kể tên các thiết bị như: trích ly, ly tâm, sấy, lọc, kết tinh, hấp phụ, bao gói

- Thiết bị bổ trợ cho nhóm thiết bị trên: các băng tải, thùng chứa

Thiết bị lên men (fermenter) là các thiết bị đóng vai trò chính trong một quy trình sản xuất Tại đây, các phản ứng sinh hóa diễn ra, chuyển hóa các nguồn cơ chất thành các sản phẩm mong muốn thông qua các vi sinh vật và các enzyme của chúng Các loại sản phẩm của quá trình lên men thường là: sinh khối của vi sinh

vật, sản phẩm trao đổi chất hoặc các loại enzyme sử dụng cho các chuyển hóa sinh hóa khác

1.7.2 Phân loại fermenter

Tùy vào loại sản phẩm, loại vi sinh vật, loại cơ chất, động học của quá trình lên men mà cấu tạo, phương thức hoạt động của các fermenter sẽ khác nhau

Phân loại fermenter theo cách thức nhập liệu và tháo liệu ta có:

- Fermenter làm việc liên tục: cơ chất được đưa vào và sản phẩm được tháo ra

liên tục

Hình 1.9 Fermenter lên men liên tục [11]

- Fermenter làm việc gián đoạn: đây là dạng fermenter có cơ chất được đưa

vào một lần từ đầu quá trình lên men Quá trình lên men diễn ra trong một hệ kín, không có nhập liệu cũng như tháo liệu Sản phẩm chỉ được lấy ra khi kết thúc thời gian lên men

- Fermenter làm việc bán liên tục: đây là dạng fermenter có cơ chất được

nhập liệu theo chu kì, ngoài lượng cơ chất được nhập liệu ban đầu thì sẽ có một lượng cơ chất bổ sung trong khi đang tiến hành lên men Sản phẩm được tháo ra vào

Van điều chỉnh lưu lượng

Môi trường vào liên tục

Sản phẩm ra liên tục Đường ống

thổi khí