Xây dựng quy trình định danh lactobacillus acidophilus và bacillus subtills có trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải trình tự RDNA 16s

II – NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: SỬ DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ rDNA 16 VÀ KĨ THUẬT ðỊNH LƯỢNG ðẾM KHUẨN LẠC ðỂ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG THỦY SẢN.. Trong

ðẠI HOC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2008

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành luận văn thạc sĩ này tôi xin :

Trân trọng tri ân TS.BS Phạm Hùng Vân- một cánh chim ựầu ựàn trong lĩnh vực công nghệ sinh hoc y học Thầy ựã luôn tận tình hướng dẫn và chỉ bảo em trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp từ bậc ựại học ựến bậc cao học

Trân trọng cảm ơn các thầy cô trường đại học Bách Khoa- ngành Công nghệ Sinh học ựã tiếp thêm cho tôi nhiều kiên thức chuyên ngành trong suốt hai năm học tại trường

Tôi xin gửi những lời cảm ơn chân thành ựến Ban Giám đốc, các anh chị nhân viên Công Ty TNHH-TM-DV Nam Khoa ựã tạo ựiều kiện cho tôi hoàn thành luân văn này đặc biệt xin cảm ơn các anh chị phòng RD, anh Thái Bình, chị Ngọc Thảo, chị Hiếu Ngọc ựã không ngại khó khăn giúp ựỡ tôi

Xin thật lòng cảm ơn Anh- Xuân Phán vì những giúp ựỡ vô cùng quan trọng, những lời ựộng viên, chia sẻ trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Gia ựình tôi Ờ Bố, mẹ và em luôn là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi, là nơi tôi cảm thấy bình yên nhất mỗi khi trở về Thành công ngày hôm nay là quà tặng tôi muốn gởi ựến Gia đình và Anh

Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn!

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

PHÒNG ðÀO TẠO SðH ðỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC

Tp HCM, ngày … tháng …năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: HOÀNG TƯỜNG VI Phái: Nữ

Ngày tháng năm sinh: 03/08/1983 Nơi sinh: Tp HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV:

I- TÊN ðỀ TÀI: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC CÓ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILUS SUBTILIS DÙNG TRONG THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ”

II – NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

SỬ DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ rDNA 16 VÀ KĨ THUẬT ðỊNH LƯỢNG ðẾM KHUẨN LẠC ðỂ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG THỦY SẢN

ÁP DỤNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG ðỂ KIỂM TRA MỘT SỐ SẢN PHẨM CHẾ PHẨM SINH HỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG

III – NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:

IV – NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:

TÓM TẮT

Một trong những khuynh hướng hiện nay trong ngành thủy sản là sử dụng chế phẩm sinh học ñể góp phần gia tăng sản lượng, chất lượng ñồng thời tạo sự phát triển bền vững với ñối với môi trường Trong các chế phẩm sinh học yêu cầu bắt buộc là phải ñịnh danh chính xác các lòai vi sinh vật và ñầy ñủ hàm lượng ñể mang lại kết quả tốt nhất ñối với người sử dụng Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xây dựng quá trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học trong thủy sản có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis bằng phương pháp sinh học phân tử và phương pháp vi sinh ðối với ñịnh danh, chúng tôi xây dựng quy trình ñịnh danh hai chủng vi khuẩn này bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S dựa trên

cơ sở vùng rDNA 16S là vùng có tính bảo tồn và ñặc hiệu cao ñối với từng loài ðối với ñịnh lượng, chúng tôi sử dụng vi sinh kỹ thuật ñịnh lượng gián tiếp khuẩn lạc trên môi trường BA (Bacillus subtilis), BAYK (Lactobacillus acidophilus) Áp dụng quy trình kiểm tra chất lượng này ñể kiểm tra 15 chế phẩm sinh học có

Bacillus subtilis và 12 chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus, chúng tôi thu ñược kết quả 9/15 chế phẩm có kết quả ñịnh danh chính xác Bacillus subtilis, 8/9 chế phẩm có ñịnh danh Bacillus subtilis không ñạt so với hàm lượng ñã ñăng

kí chất lượng; 1/12 chế phẩm sinh học có ñịnh danh là Lactobacillus acidophilus

và hàm lượng cũng thấp hơn hàm lượng ñã ñăng kí

ABSTRACT

Now one of the trends in aquaculture is using probiotic to increase quantity, quality and protect from the polluted environment in stable development Probiotic requires the exact identified organism and adequate organism’s quantity to have great influence on aquaculture In this research, we aimed to build a quality

control procedure of aquaculture probiotic having Lactobacillus acidophilus and Bacillus subtilis by bio-molecular method and microbiological method In terms of identification, we built the procedure based on rDNA 16S sequence analysis

because rDNA 16S is a highly conserved region In expression of enumberation,

we used plate counting technic with BA medium (Bacillus subtilis), BAYK

medium (Lactobacillus acidophilus) Using this quality control procedure to

examine 15 probiotic products having Bacillus subtilis on labels and 12 probiotic products having Lactobacillus acidophilus on labels We identified Bacillus

subtilis in 9/15 products and the number of this species in 8/9 products is not as many as printed on labels We identified Lactobacillus acidophilus in 1/12

products and the number of this species is less 100 times than printed on the

labels

Mục lục Trang

Danh mục bảng

Danh mục hình

Danh mục chữ viết tắt

ðẶT VẤN ðỀ 1

PHẦN MỘT 1.1 GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC 3

1.1.1 Lịch sử của Probiotic 3

1.1.2 Tác dụng của Probiotic .3

1.1.2.1 Tác dụng ñối với con người 4

1.1.2.2 Tác dụng ñối với ñộng vật 5

1.1.2.3 Tác dụng ñối với môi trường 5

1.1.3 Các yêu cầu ñối với vi sinh vật trong probiotic .6

1.1.4 Thực trạng việc sử dụng Probiotic trong hoạt ñộng nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam 6

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILLUS SUBTILIS 9

1.2.1 Lactobacillus acidophilus 9

1.2.1.1 Lịch sử phát hiện Lactobacillus acidophilus 9

1.2.1.2 Phân loại .9

1.2.1.3 ðặc ñiểm hình thái .10

1.2.1.4 ðặc ñiểm sinh hóa .10

1.2.1.5 ðiều kiện nuôi cấy 10

1.2.1.6 Vai trò của L acidophilus 11

1.2.2 Bacillus subtilis 12

1.2.2.1 Phân loại .12

1.2.2.2 ðặc ñiểm hình thái .13

1.2.2.3 ðặc ñiểm sinh hóa .13

1.2.2.4 ðiều kiện nuôi cấy 14

1.2.2.5 Vai trò của B subtilis 14

1.2.2.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 15

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP 17

1.3.1 Các phương pháp ñịnh danh vi sinh vật 17

1.3 1.1 ðịnh danh bằng thử nghiệm sinh hóa 17

1.3 1.2 ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự gen 18

a Giải trình tự bằng phương pháp hóa học 18

b Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy 19

c Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự ñộng 20

1.3.1.3 ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S 20

1.3.2 Các phương pháp ñịnh lượng vi sinh vật 22

1.3.2.1 Phương pháp ñếm trực tiếp 22

1.3.2.2 Phương pháp ñếm khuẩn lạc .22

1.3.2.3 Phương pháp màng lọc 23

1.3.2.4 Phương pháp MPN (Most Probable Number) 23

1.3.2.5 ðịnh lượng vi sinh vật bằng phương pháp ño mật ñộ quang .23

PHẦN HAI 2.1 VẬT LIỆU 25

2.1.1 Mẫu thí nghiệm 25

2.1.2 ðịnh lượng vi sinh vật 25

2.1.3 Tạo sản phẩm khuếch ñại 25

2.1.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn .25

2.1.3.2 Khuếch ñại DNA vi khuẩn và phát hiện sản phẩm 26

2.1.4 Giải trình tự sản phẩm khuếch ñại 27

2.1.4.1 Tinh sạch và kiểm tra sản phẩm 27

2.1.4.2 Chạy chu trình nhiệt giải trình tự 27

2.1.4.3 Tủa sản phẩm khuyếch ñại 28

2.1.4.4 ðiện di mao quản 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 29

2.2.1 Phương pháp xác ñịnh vi khuẩn yếm khí 29

2.2.2 Phương pháp cấy ñịnh lượng 29

2.2.2.1 Pha loãng mẫu theo dãy thập phân 29

2.2.2.2 Cấy ñịnh lượng 29

2.2.2.3 ðếm khuẩn lạc 30

2.2.3 Nhuộm gram .30

2.2.4 Thử nghiệm catalase .31

2.2.5 Tạo sản phẩm khuếch ñại 32

2.2.5.1 Ly trích DNA vi khuẩn .32

2.2.5.2 Khuếch ñại DNA vi khuẩn 33

2.2.5.3 ðiện di phát hiện sản phẩm 16S – DNA 35

2.2.6 Giải trình tự sản phẩm 36

2.2.6.1 Tinh sạch sản phẩm 37

2.2.6.2 Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự 38

2.2.6.3 Tủa sản phẩm của phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự 38

2.2.6.4 Chạy ñiện di mao quản giải trình tự 39

PHẦN BA 3.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA ðẶC ðIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HÓA HAI CHỦNG B1 VÀ L1: 40

3.1.1 B subtilis B1 40

3.1.2 L acidophilus L1 40

3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ HAI CHỦNG VI KHUẨN B SUBTILIS VÀ L ACIDOPHILUS 41

3.2.1 Ly trích và tạo sản phẩm khuếch ñại rDNA 16S: 41

3.2.2 Tinh sạch sản phẩm PCR 16S 42

3.2.3 Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự và tủa DNA 43

3.2.4 ðiện di mao quản và phân tích kết quả 44

3.3 XÂY DỰNG KỸ THUẬT ðỊNH LƯỢNG L.ACIDOPHILUS VÀ B SUBTILIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN 46

3.3.1 ðối với B subtilis 46

3.3.2 ðối với L acidophilus 47

3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ PHƯƠNG PHÁP VI SINH ðỐI VỚI CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN CÓ L ACIDOPHILUS VÀ B SUBTILIS 48

3.5 Kết quả ứng dụng quy trình kiểm tra chất lượng ñối với các mẫu chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản 50

3.5.1 ðối với B subtilis 50

3.5.1.1 Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh 50

3.5.1.2 Kết quả ñịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử 51

3.5.2 ðối với L acidophilus 53

3.5.2.1 Kết quả ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh 53

3.5.2.2 Kết quả ñịnh danh bằng phương pháp sinh học phân tử 54

3.6 BÀN LUẬN 56

3.6.1 Kết quả ñịnh danh: 57

a ðối với B subtilis: 57

b ðối với L acidophilus 59

3.6.2 Kết quả ñịnh lượng 60

a ðối với B subtilis 60

b ðối với L acidophilus 61

PHẦN BỐN 4.1 KẾT LUẬN 62

4.2 KIẾN NGHỊ 63

PHẦN NĂM TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 65

Hình 1: Kết quả ñịnh danh bẳng sinh hóa

Hình 2: Kết quả ñịnh lượng của mẫu V5 và V26

Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản có

B subtilis

Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản có

L acidophilus

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC : Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thống

(Association of Official Analytical Chemists)

EDTA : ethylendiamin tetra – acetic acid

FDA : Cơ quan quan lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration)

NCBI : National Center for Biotechnology Information

rpm : vòng trên phút (revolution per minute)

SLS : dung dịch tải mẫu (sample loading solution)

ðẶT VẤN ðỀ

Ngày nay các chế phẩm sinh học (hay còn gọi là Probiotic) ñược ứng dụng rộng rãi ở rất nhiều lĩnh vực của ñời sống xã hội từ chăm sóc sức khỏe con người ñến chăn nuôi, trồng trọt, xử lý môi trường… Trong ñó ngành nuôi trồng thủy sản

là một trong những ngành mà hằng năm tiêu thụ một khối lượng rất lớn các chế phẩm sinh học Việc sử dụng chế phẩm sinh học trong ngành thủy sản ngoài việc nâng cao chất lượng, gia tăng sản lượng còn tạo ñược sự phát triển bền vững với môi trường sinh thái

Hiện nay, tại nước ta có khoảng hơn 120 loại chế phẩm sinh học ñược cấp phép lưu hành bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước Các chế phẩm này chủ yếu do các công ty cung cấp, phân phối, ñại lý cho các công ty nước ngoài hoặc sử dụng công nghệ của nước ngoài ñề sản xuất và phân phối tại Việt Nam Với rất nhiều loài vi sinh vật hiện có trong các chế phẩm, thì hai chủng Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis có mặt ở hầu hết các sản phẩm.[4] ðối với những chủng vi khuẩn ñược sử dụng làm chế phẩm sinh học thì chúng

ta cẩn phải ñịnh danh chinh xác ñến loài

ðể ñịnh danh các vi khuẩn này một cách chính xác ta có thể sử dụng các thử nghiệm sinh hóa Tuy nhiên cần phải thực hiện hàng loạt các phản ứng sinh hóa cũng như việc biện luận kết quả vô cùng phức tạp, chính vì thế một số công ty dã cho ra ñời các bộ kit ñịnh danh Tuy nhiên ñối với B subtilis thì chưa có bộ kit ñịnh danh nào hoàn chỉnh Còn ñối với L acidophilus có thể sử dụng bộ kit API 20E nhưng ñây là bộ kit dùng ñể ñịnh danh vi khuẩn kỵ khí gây bệnh nên kết quả ñối với L acidophilus trong nhiều trường hợp không chính xác Vì vậy tôi thực hiện nghiên cứu: “Xây dựng quy trình ñịnh danh Lactobacillus acidophilus và

Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16s”

Bên cạnh ñó, chất lượng chế phẩm sinh học còn phụ thuộc vào hàm lượng vi khuẩn có trong chế phẩm Muốn xác ñịnh ñược chỉ tiêu này thì chỉ có thể thực hiện bằng phương pháp cấy ñịnh lượng Do thời gian thực hiện luận văn cho phép nên tôi xin ñược thực hiện thêm phần xây dựng quy trình ñịnh lượng Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng phương pháp vi sinh”

Với quy trình ñịnh danh và ñịnh lượng ñược thiết lập tôi xin ñề xuất một quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis bằng phương pháp vi sinh và sinh học phân tử

Với những lý do như ñã trình bày chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài nghiên cứu với mục tiêu tổng quát là: “Xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis dùng trong thủy sản bằng phương pháp vi sinh và sinh học phân tử”

MỤC TIÊU CHUYÊN BIỆT CỦA ðỀ TÀI

- Xây dựng quy trình ñịnh danh bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S ñối với hai chủng Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis

- Xây dựng quy trình ñịnh lượng bằng phương pháp vi sinh

- Kết hợp quy trình ñịnh danh bằng kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S với phương pháp ñịnh lượng vi sinh vật ñể kiểm tra một số chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản ñang lưu hành trên thị trường

THỜI GIAN – ðỊA ðIỂM THỰC HIỆN

- Thời gian tiến hành: từ tháng 1/2008 ñến tháng 7/2008

- ðịa ñiểm: Công ty TNHH-TM-DV Nam Khoa

Phần một

TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC

1.1.1 Lịch sử của Probiotic [12, 13]

Probiotic bắt nguồn từ ngôn ngữ Hy Lạp có nghĩa là vì sự sống (fọr life) Năm 1974, Parker là người ñầu tiên sử dụng thuật ngữ probiotic và ông ñã ñịnh nghĩa:”Probiotic là những vi sinh vật và những chất góp phần vào sự cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột

ðến năm 1980, Yasuda và Taga ñã ñề xuất việc sử dụng probiotic như là một tác nhân kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thủy sản

Sau ñó, vào năm 1989, Fuller ñã nghiên cứu và ñịnh nghiã lại dựa trên ñịnh nghĩa trước ñây của Parker về probiotic: probiotic là phần bổ sung vào thực phẩm những vi sinh vật sống tạo ảnh hưởng có lợi lên trên ñộng vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột của vật chủ Mãi ñến năm 1992, Havenaar và Huis In’t Veld ñã nghiên cứu và ñưa ra một ñịnh nghĩa ñầy ñủ hơn:”probiotic là một hỗn hợp vi khuẩn có thể tồn tại ñược khi ñưa vào cơ thể ñộng vật hoặc con người và tạo nên những tác ñộng có ích trên vật củ bằng cách cải thiện ñặc tính hệ vsv vật chủ.”

Vào năm 1998, một ñịnh nghĩa khác cũng ñược Guarner và Schafsma ñưa ra: probiotic là những vi sinh vật sống khi ñược tiêu thụ một lượng thích hợp sẽ tạo nên hiệu quả tốt cho sức khỏe của cơ thể chủ

Tất cả các ñịnh nghĩa trên ñều nhấn mạnh tác dụng của probiotic ñối với việc bảo vệ sức khỏe con người, ñộng vật cũng như môi trường và trong trồng trọt, chăn nuôi

1.1.2 Tác dụng của Probiotic

Ngày nay chế phẩm sinh học ñược ứng dụng rộng rãi ở rất nhiều lĩnh vực của ñời sống xã hội từ chăm sóc sức khỏe con người ñến chăn nuôi, trồng trọt, xử lý môi trường… Các tác dụng của probiotic có thể kể ñến như sau:

1.1.2.1 Tác dụng ñối với con người

• Cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột

Probiotic có khả năng ức chế, cạnh tranh với các vi khuẩn có hại trong ruột, làm thay ñổi hệ vi sinh vật nội tại theo hướng có lợi Khả năng này ñược giải thích nhờ:

- Tranh giành vị trí bám trên niêm mạc

- Tranh giành thức ăn với những sinh vật khác

- Tạo ra môi trường acid, các chất kháng khuẩn, ức chế các vi sinh vật khác

Vì vậy, probiotic ñược sử dụng ñể ñiều trị tiêu chảy do loạn khuẩn ñường ruột

• Tăng cường khả năng tiêu hóa sữa

Một số sản phẩm sữa hiện nay bổ sung thêm probiotic do các vi sinh vật probiotic có khả năng sinh ra lactase, số ñơn vị lactase này tùy thuộc từng loại vi khuẩn Việc bổ sung probiotic sẽ cải thiện dung nạp lactose, tăng cường khả năng tiêu hóa và dung nạp sữa cho người dùng

• Tăng cường khả năng miễn dịch

Probiotic kích thích miễn dịch tại chỗ, ñặc biệt kích thích làm tăng số tế bào sản xuất IgA, làm ức chế khả năng ñính, cư trú cũng như khả năng hoạt ñộng và gắn ñộc tố vi khuẩn

• Chống ung thư

Có thể do chúng cạnh tranh với các vi khuẩn tạo amin trong ruột, hạn chế

sự tạo những sản phẩm ñồng hóa có hại là các chất gây ung thư

• Một số tác dụng khác

Làm giảm cholesterol; tăng và cân bằng oestrogen, phòng chống loãng xương; trị viêm khớp, viêm niệu, bệnh nấm Candida…

1.1.2.2 Tác dụng ñối với ñộng vật

Khi probiotic ñược ñưa vào ñường ruột, các vi sinh vật hữu ích trong các chế phẩm có khả năng cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột, ức chế các vi sinh vật có hại hoặc gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại gây

ra Từ ñó giúp cho các chức năng của ñường rụôt hoạt ñộng tốt hơn Ngoài ra, probiotic còn làm tăng cường hệ số tiêu hóa của thức ăn tức là tăng hệ số hấp thu

và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn Probiotic còn giúp ñộng vật tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể

Các probiotic có nhóm vi khuẩn lactic và Bacillus có tác dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh như Salmonella, Shigella, Vibrio Ngaòi ra axit lactic ñược tạo ngoài tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột còn là cơ chất dinh dưỡng cho ñộng vật tiêu hóa Các chất kháng sinh do các vi khuẩn này tạo ra còn có tác dụng ức chế các vi khuẩn gây hại khác

Hiện nay, probiotic sử dụng cho ñộng vật thường ñược dùng theo nhiều cách khác nhau nhưng thtường thấy nhất là trộn vào thức ăn của vật nuôi hoặc phun rắc vào môi trường với dạng bột hoặc dạng dịch

1.1.2.3 Tác dụng ñối với môi trường [4]

Các nhóm vi khuẩn trong probiotic, ñặc biệt là nhóm Bacillus có khả năng sinh các laọi enzyme thủy phân ngoại bào có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của các

vi khuẩn gây bệnh và phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn dư thừa và phân bài tiết

từ ñộng vật nuôi ñể làm giảm thiểu ô nhiễm môi trường

Ngoài ra, trong các chế phẩm sinh học có sự hiện diện của các nhóm vi khuẩn có khả năng sử dụng các loại cơ chất như H2S, NH3, CO2… làm cơ chất dẫn ñến việc làm giảm thiểu các chất này trong môi trường nuôi

1.1.3 Các yêu cầu ñối với vi sinh vật trong probiotic

Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic muốn ñạt ñược hiệu quả mong muốn cần phải ñáp ứng ñúng một số yêu cầu :

- Chủng loại vi sinh vật phải ñược ñịnh danh chính xác

- Chủng loại vi sinh vật cần thiết là vi sinh vật cư trú bình thường ở người, không ñộc, không gây bệnh

- ðủ số lượng ñể trị liệu: thường liều ñiều trị trong một ngày khoảng 108– 109 tế bào

- Có khả năng tồn tại khi ñi qua dạ dày, nơi có pH thay ñổi từ 1 – 4

- Có khả năng chịu ñựng ñược khi ñi qua ruột non, nơi mà dịch mật toàn phần tiết ra có thể có nồng ñộ cao nhất khoảng 2%

- Có khả năng ñề kháng với một số loại kháng sinh

- Di truyền ổn ñịnh

- Không có khả năng chuyển gen ñề kháng kháng sinh sang những vi sinh vật khác

- Không ñược mang vào cơ thể những vi sinh vật gây bệnh

- Có khả năng cạnh tranh và lấn át với những vi sinh vật gây bệnh và bám vào niêm mạc ñường tiêu hóa

1.1.4 Thực trạng việc sử dụng Probiotic trong hoạt ñộng nuôi trồng thủy sản

tại Việt Nam [4]

Nuôi trồng thủy sản là một trong những ngành nghề sử dụng nguồn tài nguyên thiên nhiên nhiên là dất và nước – hai nhân tố gắn liền với môi trường sinh thái Vì vậy bên cạnh việc phải nâng cao năng suất, sản lượng tiêu thụ còn phải phát triển một cách bền vững Những ao hồ nuôi thâm canh có môi trường nước rất phú dưỡng do sử dụng nhiều thức ăn tổng hợp có thành phần ñạm cao 30 – 45% Do

ñó ô nhiễm trong các ao hồ chủ yếu có nguồn gốc từ thức ăn dư thừa, kế ñến là do hoạt ñộng bài tiết của vật nuôi Khi môi trường nước bị ô nhiễm thì dịch bệnh có

cơ hội phát triển Như vậy, ñể hạn chế dịch bệnh, người nuôi phải dùng thường xuyên chất diệt khuẩn như Clorin, Iodin,…Biện pháp hóa học này ñều có hậu quả nguy hiểm ñối với sức khỏe của vật nuôi và sức khỏe người sử dụng Khi vật nuôi

có dấu hiệu nhiễm bệnh thì người nuôi sử dụng các chất kháng sinh ñể trị bệnh

Việc lạm dụng chất kháng sinh dẫn ñến sự nhờn thuốc của các vi sinh vật gây bệnh và có thể không kiểm soát ñược dịch bệnh, Ngoài ra việc dùng hóa chất và kháng sinh là một trở ngại ñối với các loại thủy sản xuất khẩu Chính vì vậy, việc

sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản ñể xử lý môi trường là biện pháp tối ưu ñang ñược sử dụng khá phổ biến tại Việt Nam

Chế phẩm sinh học ñược sử dụng có tác dụng ñiều chỉnh hệ vi sinh vật theo hướng hạn chế các vi sinh vật gây bệnh, tăng cường sự phân hủy các chất hữu cơ

do thức ăn thừa, do ñộng vật nuôi bài tiết, do xác ñộng thực vật thối rữa … ñể cải thiện môi trường, ñồng thời làm tăng khả năng miễn dịch của vật nuôi với vi sinh vật gây bệnh Bên cạnh ñó, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế sử dụng hóa chất và kháng sinh tạo ñiều kiện thuận lợi cho ngành thủy sản của nước ta tiến vào thị trường các nước mà không gặp phải rào cản gì Hiện nay, tại nước ta có khoảng hơn 120 loại chế phẩm sinh học ñược cấp phép lưu hành bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước Các chế phẩm này chủ yếu do các công ty cung cấp, phân phối, ñại lý cho các công ty nước ngoài hoặc sử dụng công nghệ của nước ngoài ñề sản xuất và phân phối tại Việt Nam Mặc dù nhiều công ty tham gia chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ thuật ñến người nuôi nhưng do vì mục ñích thương mại ñể có thể thu ñược nhiều lợi nhuận nên các sản phẩm này ña phần không ñáp ứng ñúng với chất lượng ñã công

bố Chưa kể ñến các chế phẩm ngoại nhập hay chủng vi sinh vật từ nước ngoài ñưa vào Việt Nam có phù hợp với ñiều kiện của Việt Nam hay không, tác dụng như thế nào nhưng xét về khía cạnh an toàn sinh học thì việc ñưa các chủng vi sinh vật vào nước ta cũng là một mối nguy hiểm tiềm tàng

Vì vậy yêu cầu cần có một quy trình hoàn thiện ñể kiểm tra chất lượng vi sinh vật có trong các chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản là ñiều cần thiết phải thực hiện trong giai ñoạn hiện nay Quy trình này cần phải có sự chính xác và mức ñộ tin cậy cao

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ

BACILLUS SUBTILIS

1.2.1 LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

1.2.1.1 Lịch sử phát hiện LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS

Vào những năm ñầu thế kỷ 20 (1900), Moro ñã lần ñầu tiên phân lập ñược vi khuẩn L acidophilus từ phân của trẻ sơ sinh qua phẫu thuật Ông ñã mô tả ñược các ñặc ñiểm của quá ttrình trao ñổi chất cũng như chức năg của vi khuẩn này.[22,30]

ðến năm 1906, Metchnikoff cho xuất bản quyển sách “ Prolongation of life optimistic studies” Trong sách này ông ñã chứng tỏ ñược rằng L acidophilus có khả năng lên men ñồng hình và có thể sống trong ñường rụôt, miệng và âm ñạo Vào năm 1995, Hammes và Vogel ñã phân nhóm Lactobacillus các nhóm có liên quan dựa trên kiểu lên men và cách phát sinh chủng loài Từ ñó giúp con người hiểu rõ hơn về hình thức phân loại của L acidophilus

1.2.1.3 ðặc ñiểm hình thái

L acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, dài, mảnh có kích thước từ 0,5 – 1 × 2 – 10 µm, thường xếp theo cặp hoặc tạo thành chuỗi ngắn Khuẩn lạc trên môi trường thạch có kích thước 2-5 mm, lồi, ñục, ñều và không sinh chất tạo màu ðặc ñiểm chung của họ vi khuẩn lactic là không sinh bào tử ðây là vi khuẩn ưa nhiệt, có thể phát triển ở 45oC [17,18]

1.2.1.4 ðặc ñiểm sinh hóa

L acidophilus là loài ít có khả năng di ñộng, không phân giải protein, phản ứng catalase và chuyển hóa nitrat thành nitrit âm tính L acidophilus lên men ñường lactose nhưng chậm, có khả năng lên men các loại ñường glucose, sacarose, maltose, mannose, salicin, không lên men mannit, arabinose, xilose, ramnose, sorbit, glycerin

L acidophilus có khả năng tạo bacteriocin gồm lactacin F, lactacin B, acidocin

A có khả năng ức chế các loài Lactobacillus khác và Enterococcus.[17,10] 1.2.1.5 ðiều kiện nuôi cấy

L acidophilus là loài vi khuẩn kỵ khí tùy nghi nhưng chúng phát triển mạnh trong môi trường lỏng và agar ở ñiều kiện kị khí chuẩn (5% CO2, 10% H2,

và 85% N2) Nhiệt ñộ tối ưu là 370C pH tối ưu cho sự tăng trưởng dao ñộng trong khoảng 3,8 – 6,5 Nhu cầu dinh dưỡng của L acidophilus phản ánh bản chất rất khó nuôi cấy của vi khuẩn này Môi trường nuôi cấy chuẩn thường phải rất giàu axit amin và vitamin như peptone, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleate (tween 80), sodium acetat và muối magiê kích thích sự tăng trưởng Môi trường nuôi cấy hay dược sử dụng là MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) lỏng hay agar

Ngoài ra hiện nay người ta còn sử dụng một số loại môi trường ñể chọn lọc

L acidophilus từ mẫu thực phẩm và sinh thiết với ba tác nhân chính là:Sodium acetate (15-25 g/l), dịch cà chua và mật (dao ñộng từ 0.15-1% oxgall) [5]

1.2.1.6 Vai trò của L acidophilus

Như chúng ta biết, trong ñường ruột thường có sự cân bằng giữa hệ vi sinh vật phân giải ñường và hệ vi sinh vật phân giải protein ðiều này tạo nên trạng thái cân bằng của hệ vi sinh vật ñường ruột Khi có yếu tố tấn công vào hệ vi sinh vật phân giải ñường như cồn, chất kháng sinh, hóa trị liệu, nhiễm trùng, stress thì sự cân bằng này sẽ bị phá vỡ Khi ñó có sự tăng sinh của hệ vi sinh vật phân giải protein và sẽ gây ra một số bệnh như tiêu chẩy cấp hoặc mãn tính, rối lọan tiêu hóa, táo bó, trướng bụng,.v.v… L acidophilus sống là một phần của hệ vi sinh vật phân giải ñường sẽ giúp phòng ngừa hay ñiều trị các bệnh này khi ñưa trực tiế[ một lượng lớn vào ruột, tái lập lại sự cân bằng của hệ vi sinh ñường ruột

Ngừơi ta cũng nghiên cứu thấy rằng L acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật tinh khiết và 8 ngày trong dịch ruột Chúng có khả năng tạo ra các bacterocin như lactocidin, acidophilin Ngoài ra, chúng còn có vai trò trong hoạt ñộng sinh lí bình thường của cơ thể do chúng có khả năng tổng hợp vitamin

ðối với gà, người ta thấy rằng L acidophilus có thể ức chế vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium cũng như E.coli

2.2.2 BACILLUS SUBTILIS

B subtilis ñược phát hiện lần ñầu tiên vào năm 1835, ñược nhà khoa học Christan Gottfried Ehrenberg ñặt tên là Vibrio subtilis ðến năm 1872, Ferdinard Cohn mới ñổi tên lại thành B subtilis như ngày nay

Cùng với sự phát hiện và phân lập ñược nhiều loài Bacillus khác, Gordan và các cộng sự ñã lần ñầu tiên nghiên cứu phân loại và ñịnh tên Bacillus Hệ thống phân loại dựa trên các ñặc ñiểm hình thái và vị trí của bào tử Tuy nhên ñặc ñiểm hình thái dễ bị biến ñộng và có giá trị phân loại thấp Phương pháp phân loại và ñịnh danh bằng các ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa có nhiều hạn chế về khí cạnh thời

gian, hiệu quả kinh tế, ñôi khi không thể phân biệt sự khác nhau giữa nhóm, dẫn ñến nhầm lẫn khi phân loại ñến loài Ứng dụng của khóa phân loại số cũng ñã làm sáng tỏ mối quan hệ Bacillus ở mức ñộ loài Việc phân biệt các chi trong loài chỉ ñược thực hiện dựa vào trình tự RNA của các ñơn vị 16S Toàn bộ bộ gen của Bacillus ñã ñược khám phá, với số lượng khoảng 4.100 gen

Giống (Genus): Bacillus

Loài (Species): Bacillus subtilis[17]

1.2.2.2 ðặc ñiểm hình thái

B subtilis là loài vi khuẩn hiếu khí Gram dương, sống trong ñất, có nhiều trong bụi và cỏ khô Trên môi trường thạch, khuẩn lạc B subtilis không màu hay màu vàng nhạt ñến xám, hơi nhăn, tạo màng mịn lan trên bề mặt thạch Xét về mặt

vi thể, B subtilis có hình dạng trực, kích thước 3-5 ×0,5µm, thường xếp thành chuỗi và có khả năng di ñộng bằng tiêm mao Nhiệt ñộ phát triển khá rộng từ 35

oC ñến 45oC Cũng như các loài khác thuộc giống Bacillus, B subtilis có khả năng tạo bào tử theo chu kỳ phát triển tự nhiên hay khi gặp ñiều kiện bất lợi về enzyme nội bào, ngoại bào hay cạn kiệt nguồn dinh dưỡng Bào tử hình bầu dục có kích thước 0,9 ×0,6µm, là nội bào tử nằm lệch tâm hay gần tâm, không làm biến dạng tế bào mẹ [17, 18]

1.2.2.3 ðặc ñiểm sinh hóa

Lên men không sinh hơi các loại ñường sau ñây: Glucose, maltose, manitol, saccharose, arabinose, salicin

Di ñộng (+)

Urease (–) Oxidase (–) Gelatine (+)

B subtilis có khả năng chịu ñược nồng ñộ muối lên ñến 7,5%, tạo ñược enzyme phân giải tinh bột

B subtilis có khả năng sinh tổng hợp bacitracin.[10,11,12]

1.2.2.4 ðiều kiện nuôi cấy

B subtilis là loài vi khuẩn hiếu khí bắt buộc

B subtilis mọc tốt trên môi trường có nguồn Cacbon duy nhất là ñường, axit hữu cơ, rượu, … Nguồn Nitơ duy nhất là muối amon từ peptone, cao thịt Ngoài ra còn có yêu cầu về các loại chất khoáng từ muối K+, Mg2+

Nhiệt ñộ tối ưu cho sự phát triển là 37 oC

pH thích hợp trong khoảng 5,8 – 8,5

Môi trường tổng hợp ñể nuôi cấy B subtilis thừơng dùng là TSB hay TSA Ngoài ra người ta còn thấy B subtilis dễ mọc trên các môi trường dịch chiết như khoai tây, giá ñậu

1.2.2.5 Vai trò của B subtilis

B subtllis là một trong những chế phẩm ñược sử dụng sớm nhất B subtilis ñược sử dụng qua ñường uống ñể chữa ñề phòng các bệnh rối lọan tiêu hóa sau khi dùng kháng sinh kéo dài họặc bị bệnh Bào tử của B subtilis có thể qua ñược rào chắn của ñường tiêu hóa, một phần nảy mầm trong ruột non và sinh sôi, cải thiện cân bằng vi sinh vật trong ñường ruột một số tác dụng lâm sàng của B subtilis ñược biết như một tác nhân kích thích miễn dịch trong ñiều trị một số bệnh, gây kích thích tiết IgA in vitro và in vivo và làm tác nhân xúc tiến phân bào in vitro Khả năng sinh tổng hợp Bacitracin – một loại kháng sinh có bản chất polypeptide - của B subtilis có tác dụng ức chế các vi khuẩn Gram dương như Atinomyces, Clostridium, Staphylococcus, Neisseria, Corynebacterium …, kích thích phân giải tế bào, tạo tế bào trần, ngăn ngừa sự ñồng hóa các axit amin tổng hợp mucopeptide của thành tế bào

ðối với môi trừơng, B subtilis có vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các hơp chất hữu cơ nhờ có enzyme Protease, amylase, cellulase [12]

1.2.2.6 Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis:

a Cấu tạo bào tử:

Bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis có hình bầu dục và nhỏ hơn tế bào vi khuẩn, mỗi tế bào thường có 1 bào tử Bào tử có vách dày hình thành bên trong tế bào vi khuẩn, có khả năng chịu ñựng khỏi sự tiêu diệt bởi nhiệt ñộ, các hoá chất và những tác nhân vật lý khác Nội bào tử ñược xác nhận bằng cách chứng minh khả năng sống sót khi nuôi cấy sau khi xử lý ở 70 – 80oC trong 10 phút Vi khuẩn thường tạo bào tử sau 48 giờ nuôi cấy, kích thước bào tử thường 0,6 – 0,9 µm Nội bào tử nằm lệch tâm hay gần tâm nhưng không làm biến dạng tế bào mẹ

Trong cùng của bào tử là thể nhân, tế bào chất chứa bộ máy tổng hợp protein, các enzyme, hệ thống tạo năng lượng của tế bào… Tiếp ñến là màng tế bào chất, thành tế bào của tế bào dinh dưỡng Bào tử có ba lớp màng: màng ngoài bào tử, màng trong bào tử và vỏ bào tử Khi hình thành bào tử, trong tế bào chất xuất hiện acid dipicolinic (ở tế bào dinh dưỡng không có loại acid này) Acid dipicolinic sẽ kết hợp với ion canxi tạo hợp chất dipicolinatcanxi bền với nhiệt Các lớp màng bào tử giúp cho bào tử vi khuẩn chịu ñược sự khô hạn và chịu ñược nhiệt Với các bào tử phải dùng nhiệt ñộ trên 100oC trong 2 giờ mới diệt ñược chúng Vỏ bào tử có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao ñổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái bào tử trong nhiều năm Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý.[11]

b Khả năng tạo bào tử:

Một trong những ñặc ñiểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những ñiều kiện nhất ñịnh Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp ñiều kiện sống bất lợi

Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai ñoạn, tổng cộng gần 8 giờ ñể hoàn tất Lúc ñầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào ñược sử dụng Tế bào chất và nhân tập trung lại một vị trí nhất ñịnh trong tế bào Tế bào chất tiếp tục ñược cô ñặc lại và tạo thành tiền bào tử Tiền bào tử bắt ñầu ñược bao bọc bởi dần các lớp màng Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử ñược giải phóng khỏi tế bào mẹ Khi gặp ñiều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra Sau ñó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới.[11,12]

1.1 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP

1.3.2 Các phương pháp ñịnh danh vi sinh vật

1.3 1.3 ðịnh danh bằng thử nghiệm sinh hóa

Việc phân loại vi khuẩn ñược thực hiện ñầu tiên vào năm 1987 khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào, bao gồm: hình que ngắn, hình que dài, hình cầu và dạng xoắn Mặc dù phương pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và ñặc ñiểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong ñịnh danh vi sinh vật

Phương pháp truyền thống ñể ñịnh danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh lý, ñặc ñiểm biến dưỡng và ñặc ñiểm sinh thái

Các ñặc ñiểm hình thái của một chủng vi sinh vật bao gồm: hình dạng và kích thước tế bào, hình dạng và màu sắc khuẩn lạc, khả năng di ñộng và sự hiện diện của các cơ quan như: tiêm mao, chiên mao, bào tử, màng nhầy và các thể vùi…

ðặc ñiểm sinh lý và ñặc ñiểm biến dưỡng năng lượng bao gồm: khả năng sử dụng nguồn carbon và nitrogen, phương thức biến dưỡng năng lượng, các sản phẩm tạo ra trong quá trình trao ñổi chất, mối quan hệ với oxy, khả năng chịu áp xuất thẩm thấu, khoảng nhiệt ñộ và pH thích hợp…Trong ñó các thử nghiệm sinh hóa về ñặc ñiểm sinh lý và ñặc ñiểm biến dưỡng năng lượng là các chỉ tiêu cơ bản nhất trong phân loại vi sinh vật.[5]

Thông thường, ñể ñịnh danh ñược loài vi sinh vật mục tiêu theo phương pháp truyền thống ta phải dựa vào các khoá phân loại (hay bảng sinh hóa) Khoá phân loại prokarytote ñầy ñủ nhất, ñược sử dụng rộng rãi là khoá phân loại Bergey’s (Bergey’s manual of systematic bacteriology)

Tuy nhiên, trong một số trường hợp cần phải dựa vào ñặc ñiểm của vật liệu

di truyền ñể có thể ñịnh danh một cách chính xác chủng vi sinh vật mục tiêu 1.3 1.4 ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự gen

d Giải trình tự bằng phương pháp hóa học

Năm 1977, Alan Maxam và Walter Gilbert lần ñầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học Phương pháp của Maxam và Gilbert dựa trên cơ sở biến tính phân tử DNA thành các mạch ñơn không tự xoắn lại với nhau, ñánh dấu ñồng vị phóng xạ P32 ñầu 5’ của mạch ñơn tạo các ñoạn ñánh dấu có thể phát hiện bằng phóng xạ Xử lý hóa học ñặc hiệu phân hủy ñặc trưng một ñoạn nucleotide của mạch DNA ñã ñánh dấu phóng xạ, tạo các ñoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide ñược phát hiện bằng ñiện di Kết quả các phản ứng hóa học xử lý mạch DNA ñược phát hiện bằng ñiện di trên gel polyacrylamid có thể xác ñịnh trình tự các mạch ñơn

Các mạch ñơn ñã ñánh dấu phóng xạ có thể xử lý theo bốn nhóm phản ứng:

- Nhóm phản ứng thứ nhất xử lý mạch ñơn DNA bằng dimethyl sulfat làm ñứt mạch ñơn tại G

- Nhóm phản ứng thứ hai xử lý mạch ñơn DNA bằng acid pH = 2 làm ñứt mạch ñơn tại A hoặc G

- Nhóm phản ứng thứ ba xử lý mạch ñơn DNA bằng hydrazin gây ñứt mạch ñơn tại C và T

- Nhóm phản ứng thứ tư xử lý mạch ñơn DNA bằng hydrazin với nồng ñộ muối cao làm ñứt mạch ñơn tại C

Kết quả các phản ứng tạo thành các ñoạn DNA cắt ngẫu nhiên, có kích thước khác nhau ðiện di kết quả trên gel polyacrylamid, ñọc kết quả ñiện di bằng phóng xạ tự ghi, thu ñược trình tự các nucleotide của mạch ñơn DNA Tổng hợp kết quả thu ñược trình tự các nucleotide trên mạch ñơn DNA biết ñược trình tự sắp xếp các nucleotide trên gen.[3]

e Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy

Frederick Sanger và cộng sự ñã phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme hay còn gọi là phương pháp dideoxy vào năm 1977 Các tác giả lần ñầu tiên giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen của phage φX174 xâm nhiễm tế bào E.coli

Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này dựa vào hoạt ñộng của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA Enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide vào mạch ñơn DNA ñang tổng hợp ở vị trí 3’OH gặp nucleotide không có nhóm 3’ OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại

ðặc trưng của phương pháp dideoxy là sử dụng dideoxynucleotide ñể làm ngừng mạch ñơn DNA ñang ñược tổng hợp một cách ngẫu nhiên Trong phản ứng

sử dụng ñoạn DNA mồi là ñoạn mạch ñơn khoảng 20 nucleotide, bốn loại deoxynucleotide (dNTP) bình thường và bổ sung khoảng 1% một loại dideoxynucleotide (ddNTP) ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP cho mỗi loại phản ứng Các dideoxynucleotide mất hai nguyên tử oxy ở C3 và C2 Khi mạch ñơn DNA ñang tổng hợp ñược gắn một ddNTP phản ứng tổng hợp ngừng lại, không

có nhóm 3’ OH ở nucleotide cuối cùng do ñó mạch ñang ñược tổng hợp không ñược tiếp tục kéo dài Mỗi loại phản ứng ñược thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, ñầy ñủ các loại dNTP, enzyme Taq polymerase, dung dịch ñệm và các ñiều kiện thích hợp ñể tổng hợp DNA ðồng thời có cả các loại ddNTP ñể làm ngừng phản ứng tổng hợp Kết quả phản ứng tổng hợp nên các ñoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide và ñược nhận biết nhờ phương pháp ñiện di trên gel polyacrylamid

Phương pháp giải trình tự gen do F Sanger và cộng sự phát minh có ñộ chính xác tương ñối cao, là cơ sở của các máy giải trình tự gen tự ñộng.[3]

f Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự ñộng

Hiện nay phương pháp dideoxynuclotide là cơ sở cho việc giải trình tự tự ñộng Phân tích có thể ñược thực hiện bởi bốn loại thuốc nhuộm hùynh quang

khác nhau, mỗi loại cho một phản ứng dideoxunucleotide Mỗi loại thuốc nhuộm huỳnh quang sẽ phát ra một phổ ánh sang hẹp với 1 ñỉnh khác biệt khi nó bị tia laser ion argon chiếu vào Các số liệu phát ra ñược ghi lại và lưu trong một máy tính Khi quá trình chạy ñiện di kết thúc, chuỗi tín hiệu huỳnh quang ñược chuyển ngược thành thông tin trình tự nucleotide Nói chung các hệ thống giải trình tự DNA tự ñộng có thể ñọc với ñộ chính xác cao khoảng 500 nu mỗi lần chạy Giá nền ñiện di có thể phân tách các sản phẩm kết thúc dideoxynucleotide có thể là một thanh gel hay 1 polyme lỏng trong một ống mao dẫn Các máy giải trình tự DNA mao dẫn tự ñộng ñiều khiển một số lượng lớn các mẫu với sự phân tách nhanh hơn từng máy phân tích thanh gel

Ưu ñiểm của giải trình tự DNA tự ñộng sẽ giảm thiểu các thao tác thủ công

và tăng tốc ñộ thu thập các dẫn liệu về trình tự, máy có thể ñọc trình tự trên cả hai mạch ñơn, do ñó có thể phát hiện và giảm ñược sự nhầm lẫn do kỹ thuật Các loại máy giải trình tự hiện nay như Beckman Coulter CEQ 8000, Sequencer Truegene, ALFress II …, có kèm theo phần mềm xử lý số liệu, kit hóa chất tiêu chuẩn bán sẵn.[3]

1.3.1.3 ðịnh danh bằng phương pháp giải trình tự rDNA 16S

Ribosome 70S của prokaryote ñóng vai trò chính trong quá trình sinh tổng hợp protein, ñược cấu thành từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S và 23S) Bởi vì rRNA ñóng vai trò quan trọng, ñảm nhận một chứa năng duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự ñặc trưng cho từng nhóm sinh vật Do vậy, rRNA ñược xem là một thước ño tiến hoá ở sinh vật và cũng chính là công cụ hữu ích cho phân loại và ñịnh danh vi sinh vật Kỹ thuật này không chỉ dựa vào trình tự rRNA mà thường dựa vào rDNA (trình tự mã hoá cho rRNA), vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA Trong các loại rRNA thì phân tử rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại

vì kích thước vừa phải của nó (khoảng 1500 ribonucleotide) Trong khi ñó phân tử

5S (khoảng 120 ribonucleotide) chứa quá ít thông tin và 23S (khoảng 3000 ribonucleotide) lại quá dài gây khó khăn trong việc giải trình tự Một vài vùng trên rRNA 16S của tất cả prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi ñó tại một số vùng khác lại có một số khác biệt[25], [31]

Khi một trình tự rDNA 16S ñược giải mã hoàn toàn ta có thể ñịnh danh ñược loài vi sinh vật mục tiêu nhờ so sánh trình tự rDNA 16S của loài vi sinh vật ñang quan tâm với tất cả các trình tự rDNA 16S của tất cả các loài vi sinh vật lưu trữ trong ngân hàng gen nhờ vào phần mềm Blast, hay kết hợp sử dụng các phần mềm

ñể so sánh mức ñộ tương ñồng của các trình tự Từ những cơ sở dữ liệu này ta có thể vẽ ñược cây phát sinh loài, thể hiện mối quan hệ tiến hoá của các loài và vị trí của loài vi sinh vật cần ñịnh danh

Ngày nay, rDNA 16S ngày càng ñược sử dụng rộng rãi ñể nghiên cứu về quá trình tiến hoá ở vi sinh vật hay ñể ñịnh danh vi sinh vật Tuy nhiên, khi sử dụng rDNA 16S ñể ñịnh ñanh một loài vi sinh vật cần phải bảo ñảm một số vấn ñề sau:

Trình tự rDNA 16S phải có kích thước ñủ lớn (>1300 nucleotide)

Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của chủng vi sinh vật không lớn hơn 0,5 %

Ngoài ra, một số tác giả ñã thực hiện công tác ñịnh danh vi sinh vật bằng cách giải trình tự một phần của ñoạn gen rDNA 16S Trong ñó ghi nhận ñoạn gen

có chứa nhiều trình tự bảo tồn cao và ñặc hiệu cho giống và loài vi khuẩn có kích thước tương ñương 550pb Nhờ vậy, việc giải trình tự ñoạn ñặc hiệu này sẽ giúp ñịnh danh chính xác ñến loài vi khuẩn.[29, 32]

2.3.2 Các phương pháp ñịnh lượng vi sinh vật

1.3.2.5 Phương pháp ñếm trực tiếp

Áp dụng trên những vi sinh vật ñơn bào có kích thước lớn như nấm men, tảo… Phương pháp này ñếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật, cho phép xác

ñịnh nhanh chóng mật ñộ vi sinh vật trong mẫu nhưng phương pháp này có một số nhược ñiểm là không phân biệt ñược giữa tế bào sống và tế bào chết, dễ nhầm lẫn

tế bào vi sinh vật với các hạt vật thể khác trong mẫu, khó ñạt ñược ñộ chính xác cao, không thích hợp cho huyền phù vi sinh vật có mật ñộ thấp Gồm những phương pháp sau:

- ðếm trực tiếp bằng buồng ñếm hồng cầu

- ðếm trực tiếp bằng buồng ñếm Breed

- ðếm trực tiếp bằng kính hiển vi huỳnh quang.[5]

1.3.2.6 Phương pháp ñếm khuẩn lạc

Phương pháp ñếm khuẩn lạc cho phép xác ñịnh số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Do vậy phương pháp này có tên gọi là phương pháp ñếm khuẩn lạc hay ñếm ñĩa Phương pháp này cho phép ñịnh lượng chọn lọc vi sinh vật tuỳ môi trường, ñiều kiện nuôi cấy và có thể ñược thực hiện bằng kỹ thuật hộp trải hay hộp ñổ Trong phương pháp này, cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều ñộ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho có ñộ pha loãng với mật ñộ tế bào thích hợp ñể xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch với

số lượng ñủ lớn ñể hạn chế sai số khi ñếm và tính toán Số lượng khuẩn lạc tối ưu ñược ñề nghị bởi các cơ quan có uy tín như FDA, AOAC là 25 – 250 khuẩn lạc/ñĩa Kết quả ñếm và mật ñộ tế bào thường ñược trình bày bằng số ñơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml (hay CFU/g) (colony – forming unit) thay vì số tế bào/ml (hay số tế bào/g)

1.3.2.7 Phương pháp màng lọc

Phương pháp này thường ñược dùng ñể ñịnh lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật ñộ vi sinh vật tương ñối thấp Phương pháp này gồm bước lọc ñể tập trung vi sinh vật trong một

mẫu nước trên màng lọc và xác ñịnh số tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc ñếm ñược sau khi ñặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh vật cần kiểm Như vậy, phương pháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc vô trùng và phương pháp ñếm khuẩn lạc trên ñĩa petri

1.3.2.8 Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phương pháp MPN (phương pháp số có xác suất cao nhất, số tối khả) còn ñược gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn ñộ ðây là phương pháp dùng ñể ñịnh lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một ñơn vị thể tích, dựa trên kết quả ñịnh tính của một loạt thí nghiệm ñược lặp lại ở một số ñộ pha loãng khác nhau (thường ñược thực hiện lặp lại ba lần ở ba ñộ pha loãng bậc 10 liên tiếp) Ghi nhận số ống nghiệm dương tính

ở từng ñộ pha loãng và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật ñộ vi sinh vật cần kiểm

1.3.2.5 ðịnh lượng vi sinh vật bằng phương pháp ño mật ñộ quang

Số lượng tế bào vi sinh vật trong môi trường có thể xác ñịnh một cách gián tiếp nhờ phương pháp ño mật ñộ quang Theo phương pháp này, số lượng photon ánh sang bị phân tán tỉ lệ thuận với lượng sinh khối tế bào có trong mẫu ñem ño (trừ những mẫu có nồng ñộ tế bào ñậm ñặc), hay trong những ñiều kiện sinh trưởng nhất ñịnh thì tỉ lệ với nồng ñộ tế bào Tuy nhiên, lượng ánh sang lọt vào bộ tách sóng quang ở mỗi máy ño mật ñộ quang bị quy ñịnh bởi hình dạng hình học của máy ñó Vì vậy, ñường cong chuẩn xác ñịnh mối liên quan giữa hấp thu và nồng ñộ tế bào phải ñược thiết lập riêng cho từng máy ño mật ñộ quang ðiều này ñược thực hiện bằng cách ño hấp thu của dịch huyền phù tế bào những nồng ñộ khác nhau và xác ñịnh nồng ñộ tế bào của mỗi dịch huyền phù bằng cách ñếm số lượng tế bào trực tiếp dưới kính hiển vi hay cấy lên thạch ñĩa rồi ñếm số khuẩn lạc tạo thành

ðộ hấp thu là số ño lượng sinh khối, không phải ño số lượng tế bào Kích thước tê bào thay ñổi tùy theo từng giai ñoạn sinh trưởng, vì thế xây dựng ñường cong chuẩn cho máy ño mật ñộ quang với các tế bào ở giai ñoạn tăng trưởng tốt nhất Kích thước tế bào cũng thay ñổi tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy khác nhau Kích thước tế bào càng nhỏ lại nếu môi trường càng nghèo chất dinh dưỡng;

vì vậy, ñường cong chuẩn phải xây dựng theo từng môi trường nuôi cấy và từng chủng vi sinh vật riêng biệt [5]

Phần hai

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

Các chế phẩm ñược sử dụng trong ñề tài này là: DT-Lacto, Bio-DW, PRObiotex –one, Vime-Subtyl, Biozyme for fish, Novazyme F, Subtyl – LA, NPV- Prozyme, ProKura, Men Gấu Vàng, Zymmix, Biobac, Biolac Green,Pond Clear, Bio Pond, Men Bac, Lactovet, Microzyme, Zeofarm

Trong ñó có 15 mẫu có chứa Bacillus, và 12 mẫu có chứa Lactobacillus

2.1.4 ðịnh lượng vi sinh vật

• Dụng cụ:

- Que cấy ñịnh lượng

- Bịch ủ yếm khí Mikrobiology Anaerocult ®A mini

- Môi trường thạch máu BA (sản phẩm của Công ty Nam Khoa)

- Môi trường thạch máu yếm khí BAYK có bổ sung Vitamin K và Hemin (sản phẩm của Công ty Nam Khoa)

2.1.5 Tạo sản phẩm khuếch ñại

- ðầu micropipette 20 µl và 200 µl vô trùng

- Tube eppendorf nắp khoá 1,5 ml, loại vô trùng

- Bộ ñiện di ngang i – Mupid J

- Máy chụp hình Gel (BioRad)

- Dung dịch ñệm tải blue juice ( Nam Khoa)

- Thang chuẩn DNA 100bp (Nam Khoa)

2.1.4 Giải trình tự sản phẩm khuếch ñại

2.1.4.1 Tinh sạch và kiểm tra sản phẩm

•••• Thiết bị - Dụng cụ

- Máy ly tâm 13.000 rpm với rotor cho tube 1.5 hay 2 ml

- Bộ ñiện di ngang i – Mupid J

- Máy chụp hình Gel (BioRad)

- Tube eppendorf 1,5 hay 2 ml tinh sạch

- Dung dịch ñệm tải blue juice ( Nam Khoa)

- Thang chuẩn DNA 100bp (Nam Khoa)

2.1.4.2 Chạy chu trình nhiệt giải trình tự

• Mồi ñặc hiệu của ñoạn gen 16S

• Lượng sản phẩm khuyếch ñại

• Nước cất

2.1.4.3 Tủa sản phẩm khuếch ñại

•••• Thiết bị - Dụng cụ

- Dung dịch tải mẫu

- Ethanol 95% và 70% pha với nước khử ion, giữ trong tủ -20oC

2.1.4.4 ðiện di mao quản