Xây dựng hệ thống tái sinh và ứng dụng trong nghiên cứu chuyển nạp gen HB ag (tạo vỏ virus viêm gan b) vào cây cà chua bi

Van Sloten 1975 và Tạ Thu Cúc 1985 … phát hiện thấy giữa hai loại thấp cây và cao cây còn có loại trung gian, những giống thuộc loại này có chiều cây cao 65 cm < h ≤ 120 cm, thân lá sinh

LÊ HOÀN HẢO

XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP

GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B)

VÀO CÂY CÀ CHUA BI

Lycopersicon esculentum var Cerasiforme

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS Nguyễn Hữu Hổ

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2008

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Hổ

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: LÊ HOÀN HẢO. Phái: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 04 – 04 – 1981 Nơi sinh: Tp.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học MSHV: 03106670

I- TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG

NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY CÀ CHUA BI Lycopersicon esculentum var Cerasiforme

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

- Khảo sát khả năng khử trùng mẫu tối ưu

- Hệ thống tái sinh cho cà chua bi F1 TN84 cho tử diệp và trụ hạ diệp

- Thử kháng Kanamycin ở tử diệp và trụ hạ diệp

- Thử khả năng kháng Kanamycin ở cây cà chua bi con

- Chuyển gen vào cà chua bi

- Tách chiết DNA cà chua bi

- Kiểm tra sự hiện diện của gen nptII, gen gusA, gen mục tiêu HBsAg ở cây cà

chua bi mang gen giả định bằng phương pháp phân tích PCR

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 01/10/2007

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/08/2008

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS NGUYỄN HỮU HỔ

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN

TÓM TẮT

MỤC LỤC a

DANH MỤC HÌNH d DANH MỤC BẢNG f DANH MỤC BIỂU ĐỒ g

LỜI MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÀ CHUA 3

1.1.1 GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG 3

1.1.2 NGUỒN GỐC – PHÂN BỐ - Ý NGHĨA KINH TẾ 4

1.1.2.1 NGUỒN GỐC 4

1.1.2.2 PHÂN BỐ 4

1.1.2.3 Ý NGHĨA KINH TẾ 6

1.1.3 PHÂN LOẠI THỰC VẬT 7

1.1.4 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 7

1.1.4.1 HỆ RỄ 7

1.1.4.2 THÂN 8

1.1.4.3 LÁ 9

1.1.4.4 HOA 9

1.1.4.5 QUẢ 12

1.1.4.6 HẠT 14

1.1.5 GIỚI THIỆU MỘT SỐ GIỐNG CÀ CHUA BI 14

1.2 GIỚI THIỆU VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis viruses) 15

1.2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIRUS VIÊM GAN B (Hepatitis B virus – HBV) 15

1.2.1.1 CẤU TRÚC CỦA HBV 16

1.2.1.2 KHẢ NĂNG GÂY BỆNH 18

1.2.2 DỊCH TỄ HỌC VỀ VIÊM GAN B 20

1.2.3 SỰ KHÁC BIỆT CHÍNH GIỮA VIRUS VIÊM GAN A, B VÀ C 21

1.2.4 KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT VIRUS VIÊM GAN B (HBsAg – Hepatitis B surface antigen) 22

1.2.4.1 PROTEIN NHỎ (SHBs) 23

1.2.4.2 PROTEIN TRUNG BÌNH (MHBs) 23

1.2.4.3 PROTEIN LỚN (LHBs) 23

1.2.4.4 CÁC KIỂU SHBs PHỤ 24

1.3 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO 25

1.3.1 NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 26

1.3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG 27

1.4 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG 28

1.4.1 TẠO DÒNG GEN 28

1.4.2 ENZYME GIỚI HẠN (restriction enzyme) 29

1.4.3 ENZYME NUCLEASE 30

1.4.4 ENZYME NỐI DNA (ligase) 30

1.4.5 ENZYME POLYMERASE 31

1.4.6 VECTOR 31

1.5 GEN CHỌN LỌC VÀ GEN CHỈ THỊ 36

1.5.1 GEN CHỌN LỌC KHÁNG Kanamycin – nptII 36

1.5.2 GEN CHỈ THỊ - GusA 36

1.6 SỰ CHUYỂN GEN NHỜ A TUMEFACIENS 37

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 41

2.1.1 NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 41

2.1.2 CHỦNG VI KHUẨN 41

2.1.3 PLASMID 42

2.1.4 MỒI VÀ THANG DNA CHUẨN 43

2.1.4.1 MỒI CHO GEN HBsAg 43

2.1.4.2 THANG DNA CHUẨN 43

2.1.5 HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 44

2.1.5.1 HÓA CHẤT 44

2.1.5.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 44

2.1.6 THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ TRONG NGHIÊN CỨU 45

2.2 PHƯƠNG PHÁP 45

2.2.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CHO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var Cerasiforme) từ tử diệp và trụ hạ diệp 45

2.2.1.1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU TỐI ƯU 45

2.2.1.2 THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH TỐI ƯU CHO TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP 45

2.2.2 ỨNG DỤNG MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var Cerasiforme) nhờ vi khuẩn A tumefaciens 46

2.2.2.1 THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CHỌN LỌC TỐI ƯU CHUẨN BỊ CHO CÁC THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN 47

2.2.2.2 THÍ NGHIỆM 4: CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI NHỜ A TUMEFACIEN S 47

2.2.3 KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN MỤC TIÊU HBsAg BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PCR 49

2.2.3.1 TÁCH CHIẾT DNA NHIỄM SẮC THỂ CÂY CÀ CHUA BI ĐÃ ĐƯỢC CHUYỂN GEN 49

2.2.3.2 PHƯƠNG PHÁP PCR KIỂM TRA SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN nptII, GEN gusA, GEN HBsAg Ở CÂY CÀ CHUA BI MANG GEN GIẢ ĐỊNH 50

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1 XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH CHO CÂY CÀ CHUA BI

(Lycopersicon esculentum var Cerasiforme) từ tử diệp và trụ hạ diệp 52

3.1.1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG MẪU

TỐI ƯU 52

3.1.1.1 QUY TRÌNH THỰC HIỆN 52

3.1.1.2 NHẬN XÉT – THẢO LUẬN 53

3.1.2 THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH TỐI ƯU

CHO TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP 54

3.1.2.1 QUY TRÌNH THỰC HIỆN 54

3.1.2.2 NHẬN XÉT – THẢO LUẬN 56

3.2 ỨNG DỤNG MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU TRONG CHUYỂN GEN

VÀO CÂY CÀ CHUA BI (Lycopersicon esculentum var Cerasiforme)

nhờ vi khuẩn A tumefaciens 65

3.2.1 THÍ NGHIỆM 3: XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CHỌN LỌC TỐI ƯU

CHUẨN BỊ CHO CÁC THÍ NGHIỆM CHUYỂN GEN 65

3.2.1.1 THÍ NGHIỆM 3a: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ

Kanamycin LÊN SỰ TÁI SINH CỦA TỬ DIỆP VÀ TRỤ HẠ DIỆP 65

3.2.1.2 THÍ NGHIỆM 3b: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ

Kanamycin LÊN SỰ TÁI SINH CỦA CÀ CHUA BI CON 69

3.2.2 THÍ NGHIỆM 4: CHUYỂN GEN VÀO CÂY CÀ CHUA BI NHỜ

3.3.2.1 SỰ HIỆN DIỆN CỦA GEN nptII TRONG CÀ CHUA BI

F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 80

3.3.2.2 SỰ HIỆN DIỆNCỦA GEN gusA (uidA) TRONG CÀ CHUA BI

F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 81

3.3.2.3 SỰ HIỆN DIỆNCỦA GEN HBsAg TRONG CÀ CHUA BI

F1 TN84 MANG GEN GIẢ ĐỊNH ĐƯỢC KIỂM TRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR 83

DANH MỤC HÌNH

- oOo -

1.1 Quả cà chua bi F1 TN84 thương phẩm của công ty Trang Nông 3

1.2 Trồng cà chua bi trong máy AeroGarden in black 5

1.5 Virus HBV dưới kính hiển vi điện tử 16

1.8 Sự phản ứng của tế bào trước sự xâm nhiễm của virus HBV 19

1.9 Sự phân bố địa lý của bệnh biêm gan siêu vi B 20

1.10 Ba vùng của gen S (S, tiền S1, tiền S2) và các protein được gen này mã hóa 23

1.11 Các protein bề mặt 24

1.14 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bám trên rễ cây dưới kính hiển vi điện tử 37

1.15 Nốt sần ở rễ cây được tạo bởi Agrobacterium tumefaciens 38

1.16 Sơ đồ xâm nhiễm của Agrobacterium tumefaciens vào tế bào thực vật 39

1.17 Sự chuyển gen vào tế bào thực vật nhờ

2.1 Túi hạt giống cà chua bi F1 TN84 của công ty Trang Nông được dùng trong thí nghiệm 41

2.3 Phương pháp PCR _ Polymerase Chain Reaction 51

3.2 Cây cà chua bi F1 TN84 sau 14 ngày gieo hạt 53

3.3 Cách xử lý lấy mẫu ở cà chua bi F1 TN84 55

3.4 Sự tái sinh của tử diệp và trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 ở nghiệm thức từ I

3.5 Ảnh hưởng của kanamycin từ 0 mg/l đến 50 mg/l lên sự tái sinh mô tử diệp và trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 68

3.6 Ảnh hưởng của kanamycin lên sự phát triển của cà chua bi

3.7 Các mô chuyển gen tái nhiễm và mô chuyển gen không mang gen mục tiêu 74

3.8 Mô chuyển gen tái nhiễm và mô chuyển gen giả định chưa nhiễm 74

3.9 Chồi cây cà chua bi F1 TN84 bị tái nhiễm 77

3.10 Chồi cà chua bi F1 TN84 giả định đã mọc rễ tạo cây hoàn chỉnh và các chồi cà chua bi F1 TN84 giả định bị héo úa mà chết sau

5 tháng chọn lọc trong môi trường MS có kháng sinh 79

3.11 Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen nptII ở cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định 81

3.12 Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen gusA ở cà

3.13 Kết quả phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen HBsAg ở cà chua bi F1 TN84 mang gen giả định 84

DANH MỤC BẢNG

- oOo -

1.1 Số lượng hoa và tỷ lệ rụng hoa của 3 loại hình sinh trưởng 11

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của kanamycin lên sự tái sinh của tử diệp và

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của kanamycin lên sự sống của cà chua bi

3.6 Kết quả chuyển gen vào mô tử diệp cà chua bi F1 TN84 75

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

- oOo -

3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nghiệm thức lên sự tái

sinh của tử diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày 59

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các nghiệm thức lên sự tái sinh của trụ hạ diệp cà chua bi F1 TN84 sau 60 ngày 62

iêm gan B là một bệnh nguy hiểm gây ra bởi virus tấn công vào gan Virus ấy có tên gọi là virus viêm gan B có thể gây ra sự lây nhiễm suốt đời, xơ gan, ung thư gan và chết Sự chủng ngừa bằng vaccine viêm gan B là một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn sự truyền nhiễm và những

hệ quả của nó Những vaccine này có giá trị sử dụng từ những năm 1980 và hơn một tỷ liều đã được dùng Khoảng 100 quốc gia, phù hợp với chính sách của WHO, thêm vào sự chủng ngừa viêm gan B tới chương trình chủng ngừa trẻ em thường lệ

và hơn nữa, hầu hết các quốc gia đã nhận một chính sách để chủng ngừa những trẻ trưởng thành ở mức rủi ro cao Vaccine viêm gan B có khả năng ngăn ngừa khoảng 95% tình trạng mang HBV mạn tính và sự giảm trực tiếp của ung thư gan đã được chứng minh ở sự miễn dịch trẻ em

V

Trong những năm gần đây, tuy việc sản xuất vaccine đã gặt hái được nhiều thành công nhưng ở nhiều nước vaccine vẫn là quá đắt khi cần dùng trên diện rộng, khó khăn nhất vẫn là điều kiện bảo quản lạnh, đường xá, Thật vậy, tại Việt Nam

đã xảy ra sự cố khi tiêm phòng chống viêm gan B bằng các lô vaccine viêm gan B Euvax B, UVX-06007 do LG (Hàn Quốc) và r-Hbvax B, B-BR-010406 do Công ty vaccine và sinh phẩm số 1 (Việt Nam) sản xuất trên diện rộng trong thời gian từ tháng tư đến tháng sáu năm 2007 do bảo quản không đúng cách đã làm bảy trẻ tử vong và một trẻ tai biến nặng sau khi tiêm [Tuổi Trẻ, 20-10-2007; 01-02-2008] Việc sản xuất, đóng gói khiến các vaccine thương mại thường đắt và phải cần nhân viên được đào tạo để tiêm Vì vậy, việc sản xuất vaccine dưới dạng ăn được trên diện rộng sẽ ít tốn kém hơn, tức là một thành phần của hoa quả và rau Khi vaccine được đưa bằng đường miệng, nó có thể kích thích trực tiếp hệ miễn dịch Một vaccine ăn được, khác với các loại vaccine truyền thống, không cần các cơ sở sản xuất phức tạp, sự tinh sạch, sự thanh trùng, sự đóng gói hoặc các hệ thống chuyển giao chuyên biệt Hơn nữa, không như nhiều hệ thống biểu hiện protein tái

tổ hợp hiện nay, thực vật glycosol hóa protein, một yếu tố có thể góp phần làm tăng

độ miễn dịch và làm bền protein đích Nhiều công trình về vaccine ăn được đã được công bố cho đến nay sử dụng khoai tây làm phương tiện chuyển giao Khoai tây sở

dĩ bước đầu được chọn cho công trình này vì có thể thao tác với chúng dễ dàng Khoai tây chưa bao giờ được xem là cây chuyển giao vaccine; chúng đòi hỏi phải nấu chín mới ăn được và quá trình nấu sẽ phá hủy (bất hoạt) hầu hết kháng nguyên protein Cây được xem là nguồn chuyển giao vaccine ăn được gồm chuối, cà chua,

xà lách, cà rốt, lạc và ngô

Vì vậy, theo sự phân công của bộ môn chuyên ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Hữu

Hổ, Phòng Công Nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới, tôi thực hiện đề tài:

“XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN

CỨU CHUYỂN NẠP GEN HBsAg (TẠO VỎ VIRUS VIÊM GAN B) VÀO CÂY

CÀ CHUA BI Lycopersicon esculentum var Cerasiforme”

Mục tiêu của đề tài là xác định được môi trường tối ưu cho sự tái sinh của cây

cà chua bi, từ đó thực hiện bước chuyển gen HBsAg vào cây cà chua bi nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Giới hạn đề tài là chỉ tập trung xây dựng hệ

thống tái sinh in vitro, chỉ thực hiện các bước chuyển gen vào cây cà chua bi, và nuôi các cây cà chua bi có mang gen giả định trong môi trường có chất chọn lọc Sau đó, thực hiện phân tích bằng phương pháp PCR nhằm xác định gen mục tiêu trên cây cà chua bi đó

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CÀ CHUA:

Hình 1.1: Quả cà chua bi F1 TN84 thương phẩm của công ty Trang Nông

Theo A Gray, 1878: [46]

Bộ: Solanales Họ: Solanaceae Phụ họ: Solanoideae Giống: Lycopersicon esculentum var Cerasiforme

Cà chua có nhiều tên gọi khác nhau như: L.Kort, L.Lycopersicum, S.Lycopersicon, L.esculentum Từ “tomato” là của Nam Mỹ, có nguồn gốc từ những từ hoặc nhóm từ Xitomate hoặc là Zitotomate và Mexican Tomati Trước đây, người ta đặt tên cho cà chua là quả táo vàng (Golden apple) [10,34]

1.1.1 Giá trị dinh dưỡng: [10,34,47]

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, được sử dụng rộng rãi trên thế giới hơn 150 năm nay Trong quả cà chua chín có chất dinh dưỡng như: đường,

vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan trọng như: canxi, sắt, photpho, kali, magie, …

Theo EDWaDC Tigchelear (1989), thành phần hóa học trong quả cà chua chín như sau: Nước 94% − 95%; vật chất còn lại: 5% − 6% bao gồm các chất sau:

- 55% đường (fructo, gluco, sucro)

- 21% chất không hòa tan trong rượu (protein, xenlulo, pectin, pictin, polysaccarit)

- 12% axit hữu cơ (citric, malic, galacturonic, pyrrolidonk cacboxylic)

- 7% chất vô cơ, 5% các chất khác (carotenoit, axit ascorlic, amino axit, …)

Trên 100 mẫu giống trồng tại vùng Gia Lâm, Hà Nội có thành phần hóa học chủ yếu như sau:

1.1.2.2 Phân bố:

Quá trình thuần hóa và du nhập của cà chua đến các châu lục có thể tóm lược như sau:

- Cà chua được người Aztec và người Toltec mang đến châu Âu Đầu tiên, người Tây Ban Nha đem cà chua từ châu Âu về, sau đó đem đến vùng Địa Trung Hải [10,34]

- Năm 1554, nhà nghiên cứ thực vật Pier Andrea Mattioli giới thiệu những giống cà chua từ Mêhicô có màu vàng và đỏ nhạt, đây cũng chính là thời điểm chứng minh sự tồn tại của cà chua trên thế giới Ở Bắc Âu, lúc đầu người ta trồng cà chua là để trang trí và thỏa tính tò mò, đó là những năm thuộc thế kỷ 17 Năm 1710, Thomas Jefferson đã trồng cà chua trong vườn nhưng không thu được kết quả đáng kể trong việc cải tiến giống Đến năm 1750, cà chua được trồng ở Anh

để làm thực phẩm Cà chua được gọi với nhiều tên khác nhau; ở Ý, cà chua được gọi là Pomid’oro hay Golden apple (quả táo vàng); ở Pháp, người ta gọi chua là Pomme d’amour (táo tình yêu) Mặc dù cà chua có nhiều tên khác nhau nhưng vào thời đó người ta vẫn chưa được chấp nhận là cây thực phẩm Vì đâu đó người ta vẫn còn quan điểm cho rằng cà chua có chất độc vì cây cà chua có họ hàng với cây cà độc dược, quan niệm này vẫn tồn tại ở một vài nơi cho đến thế kỷ 20 Đầu thế kỷ

18, giống cà chua trở nên phong phú, đa dạng, nhiều vùng đã dùng nó làm thực phẩm Vào cuối thế kỷ này, cà chua mới được dùng làm thực phẩm ở Nga Đến thế

kỷ 19, cà chua đã trở thành thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của nhiều nước Năm 1860, những giống cà chua mới đã được giới thiệu ở Mỹ và cũng

là thời điểm cà chua trở thành cây trồng chính ở Pháp [10,34]

Hình 1.2: Trồng cà chua bi trong máy AeroGarden in black

- Những tiến bộ ban đầu về dòng, giống cà chua hoàn toàn xuất phát từ châu Âu Năm 1863, 23 giống cà chua được giới thiệu, trong đó giống Trophy được coi là giống có chất lượng tốt với giá 5 USD 1 gói nhỏ gồm 20 hạt giống [10,34]

- Chương trình thử nghiệm của Liberty, Hyde Bailey tại trường nông nghiệp Michigan (Mỹ) bắt đầu từ năm 1886, tác giả đã tiến hành chọn lọc, phân loại giống cà chua trồng trọt Từ năm 1870 đến năm 1893, A.W.Livingston đã giới thiệu

13 giống cà chua trồng trọt được chọn lọc theo phương pháp chọn lọc cá thể Cuối thế kỷ 19 có trên 200 dòng, giống cà chua đã được giới thiệu rộng rãi Quá trình chọn tạo giống cà chua vẫn được tiến hành thường xuyên cho đến ngày nay [10,34]

1.1.2.3 Ý nghĩa kinh tế:

Cà chua là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao được trồng rộng rãi trên thế giới Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 thì diện tích và sản lượng cà chua năm 2003 trên thế giới như sau: 4.310.669 ha và 113.308.298 tấn [10,34]

Châu Á là khu vực đứng đầu về sản xuất cà chua, thứ đến là châu Âu Mỹ là nước đứng đầu về cả 2 lĩnh vực năng suất và giá trị trên 1 ha gieo trồng Trên thế giới, sản xuất cà chua đứng thứ hai sau khoai tây.[10,34]

Trung Quốc có diện tích trồng cà chua lớn nhất thế giới (trên 753 ngàn ha), tiếp theo là Ấn Độ (365 ngàn ha), Anh (300 ngàn ha), Ai Cập (180 ngàn ha), Mỹ (170 ngàn ha) và Anh (140 ngàn ha) [10,34]

Về năng suất (tấn/ha) đạt cao nhất phải kể đến Mỹ (66,5), tiếp theo là Hà Lan (42,85), Anh (37,76), Ai Cập (35,5), Bỉ (33,33), Trung Quốc (25,62), … [10,34]

Nhìn chung châu Á có diện tích trồng lớn nhưng năng suất còn thấp (23,8 tạ/ha), năng suất cà chua toàn thế giới khoảng 27,51 tấn/ha [10,34]

Ở Việt Nam, cà chua được trồng trên 100 năm nay, diện tích trồng trọt hàng năm diễn biến từ 15 – 17 ngàn ha, sản lượng 280 ngàn tấn, bình quân đầu người 3 kg/năm, tiêu thụ cà chua của người Việt Nam hiện nay chỉ bằng 1/5 của người Trung Quốc (16kg/người/năm) [10,34]

Nơi tiêu thụ cà chua lớn nhất là châu Âu rồi đến châu Á, Bắc Mỹ và Nam Mỹ [10,34]

Cà chua có thể dùng làm quả tươi, xào, nấu, nước giải khát Cà chua còn là nguyên liệu chế biến thành nhiều sản phẩm như: cà chua cô đặc, nước quả, nước sốt, tương cà chua, tương ớt, cà chua đóng hộp, … [10,34]

1.1.3 Phân loại thực vật:

Cà chua là thành viên trong họ cà, chi Lycopersicon, thông thường phân loại

thành 2 chi phụ dựa vào màu sắc quả [10,34]

Chi phụ Eulycopersicon (red fruited): quả của chi phụ này có màu đỏ hoặc

vàng, hoa to, cho quả quanh năm [10,34]

Chi phụ Eriopersicon (green fruited): quả của chi phụ này có màu xanh, trên

quả có sọc tía, có lông, hạt nhỏ [10,34]

Cà chua là cây thân thảo hàng năm hoặc thân thảo lưu niên [10,34]

Sự phân loại của chi Lycopersicon: [10,34]

ƒ Chi phụ Eulycopersicon (quả đỏ) gồm 2 loài:

- Lycopersicon Esculentum: cà chua thông thường

- Lycopersicon Pimpinellifolium: cà chua nho

ƒ Chi phụ Eriopersicon (quả xanh) gồm 5 loài:

- L.Cheesmanii: hoang dại

- L.Chilense: hoang dại

- L.Glandulosum: hoang dại

- L.Hirstum: hoang dại

- L.Peruvianum: hoang dại

1.1.4 Đặc điểm thực vật:

1.1.4.1 Hệ rễ:

Hệ rễ cà chua thuộc loại rễ chùm, ăn sâu trung bình, rễ phụ cấp 2 phân bố dày đặc trong đất khi cây sinh trưởng mạnh Khi gieo thẳng, rễ cà chua có thể ăn sâu tới 1,5 m; nhìn chung ở độ sâu dưới 1 m, rễ ít; khả năng hút nước và dinh dưỡng ở độ sâu 0,5 m yếu Hệ rễ phân bố chủ yếu ở tầng đất 0 – 30 cm Khả năng tái sinh của

hệ rễ cà chua mạnh, khi rễ chính bị đứt, rễ phụ phát triển mạnh Khi nhổ hoặc vận chuyển cây giống, một số rễ sẽ bị rơi rụng rồi khô héo, nhưng rễ mới sẽ nhanh

chóng phát triển, rễ cà chua hóa bần chậm nên nhanh chóng hút nước và chất dinh dưỡng sau khi trồng Cây cà chua còn có khả năng sinh ra rễ bất định, loại rễ này tập trung chủ yếu ở đoạn thân dưới 2 lá mầm Sự phát triển của hệ rễ phụ thuộc vào

bộ phận trên mặt đất và các yếu tố khác (điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt) Rễ phụ phát triển tốt ở nhiệt độ 18 – 200C; còn ở nhiệt độ 14 – 160C, sự phát triển của hệ rễ chậm lại 15 – 20 ngày, nhiệt độ đất trên 390C thì hệ rễ cà chua sinh trưởng kém Hệ rễ cà chua chịu hạn tương đối tốt, nhưng rễ sinh trưởng tốt ở độ ẩm đất 70 % – 80 % [10,34]

- Loại cao: cây cao trên 120 cm trở lên, thân lá phát triển mạnh, có những giống cao 150 – 200 cm như LV200, P375, … Trong kỹ thuật trồng trọt, ta cần làm giàn, tỉa cành tạo hình, tỉa hoa, quả

- Loại cao trung bình: một số tác giả D.H Van Sloten (1975) và Tạ Thu Cúc (1985) … phát hiện thấy giữa hai loại thấp cây và cao cây còn có loại trung gian, những giống thuộc loại này có chiều cây cao 65 cm < h ≤ 120 cm, thân lá sinh trưởng mạnh, là loại hình thích hợp cho nhiều mùa vụ và nhiều vùng sinh thái Trong sản xuất cần phải làm giàn, tỉa cành, tạo hình

Thân cây cà chua thay đổi trong quá trình sinh trưởng, ở thời kỳ vườn ươm, thân cây tròn, thường có màu tím nhạt, giòn, dễ gãy Khi trưởng thành, thân cây có màu xanh nhạt, trên thân cây có lông tơ tập trung ở phần non Cây trưởng thành, thân thường có tiết diện đa giác, cứng, phần gốc hóa gỗ

Đặc điểm của thân cà chua là phát triển theo kiểu lưỡng phân, các chùm hoa được sinh ra từ thân chính Vì vậy, thân chính có vị trí quan trọng đối với sản lượng quả trên cây

Nhìn chung, chiều cao cây thay đổi theo giống nhưng cũng thay đổi theo điều kiện ngoại cảnh và kỹ thuật trồng trọt Các chồi ở nách lá phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ không khí thích hợp Chồi nách khi trưởng thành đều có khả năng ra hoa, đậu quả, nhưng sản lượng của cành, nhánh thay đổi theo vị trí trên cây Những cành ở sát ngay dưới chùm hoa thứ nhất của thân chính cho năng suất quả tương đương thân chính Vì vậy, khi tạo hình, tỉa cành nên để thân chính và một thân phụ dưới chùm hoa thứ nhất Những nhánh khác cần tỉa bỏ kịp thời để tập trung dinh dưỡng vào quả

1.1.4.3 Lá:

Lá cà chua thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá hoàn chỉnh có 3 – 4 đôi lá chét, ngọn lá có một phiến lá riêng rẽ gọi là lá đỉnh Trên lá còn có những lá giữa nằm giữa những đôi lá chét, lá bên nằm ngay trên gốc những lá chét [10,34]

Lá là đặc trưng hình thái để phân biệt giống Màu sắc lá thay đổi từ xanh vàng đến xanh thẫm Số lá trên cây là đặc tính di truyền của giống, nhưng cũng chịu chi phối bởi nhiệt độ Để hình thành 10 lá đầu sau khi trồng cần nhiệt độ trung bình trên

130C, khi hình thành 20 lá cần nhiệt độ trung bình ngày đêm là 240C, nhiệt độ cao trên mức để xuất hiện một lá mới được xem là ngưỡng của nhiệt độ [10,34]

1.1.4.4 Hoa:

Hoa cà chua là loại hoa hoàn chỉnh (gồm lá đài, cánh hoa, nhị, nhụy) Cà chua

là cây tự thụ phấn chủ yếu, do đặc điểm cấu tạo của hoa; các bao phấn quanh nhụy thường cao hơn nhụy, núm nhụy thông thường chín sớm hơn phấn hoa, hoa cà chua nhỏ, màu sắc hoa và mùi vị không hấp dẫn côn trùng Tuy vậy, hiện tượng thụ phấn chéo cũng xảy ra là do cấu tạo của hoa (nhụy cao hơn nhị), giống và thời vụ gieo trồng … [10,34]

Ở vùng ôn đới, thụ phấn chéo chiếm tỷ lệ 0,5 – 4%; ở vùng nhiệt đới từ

10 – 15% Ở ngoài trời, phấn hoa di chuyển nhờ gió, gió làm cho hạt phấn rơi ra dễ dàng và thực hiện quá trình tự thụ phấn [10,34]

Trồng cà chua trong nhà kính, nhà lưới cần tác động bằng cách rung cây, rung cành để giúp cho hạt phấn ra khỏi bao phấn [10,34]

Màu sắc của hoa thay đổi theo quá trình phát triển từ màu vàng xanh đến vàng tươi rồi vàng úa Trong kỹ thuật lai, người tạo giống thường khử đực trên cây mẹ khi hoa có màu vàng xanh, tràng hoa chưa tách rời Lấy phấn hoa trên cây bố khi hoa nở cực đại, có màu vàng tươi là tốt nhất [10,34]

Hoa cà chua mọc thành chùm, hoa đính vào chùm bởi cuống ngắn Một lớp tế bào riêng rẽ hình thành ở cuống hoa, vì một nguyên nhân nào đó (nhiệt

độ, ánh sáng, độ ẩm,…) tầng rời sẽ được hình thành, lớp tế bào ở đó bị chết

và hoa rụng [10,34]

Chùm hoa cà chua có 3 loại: đơn giản, trung gian, phức tạp Loại chùm đơn giản chỉ có một trục chính, hoa mọc so le trên trên trục [10,34]

Loại chùm trung gian thường có 2 nhánh, loại chùm phức tạp có nhiều nhánh

Số chùm hoa trên cây trong một chu kỳ sống khoảng 20 chùm, cũng có thể nhiều hơn, điều đó phụ thuộc vào giống và điều kiện ngoại cảnh [10,34]

Số hoa trên chùm của loài trồng trọt từ 3 – 20 hoa, thông thường từ 5 – 7 hoa [10,34] Điều kiện cần thiết cho quá trình phân hóa mầm hoa và hình thành hoa: nhiệt

độ ban ngày 20 – 250C, nhiệt độ ban đêm 13 – 150C, độ ẩm đất 60 – 70 %, độ ẩm không khí 55 – 65 %, cường độ ánh sáng tối thiểu là 400 lux [10,34]

Khi nhiệt độ là 200C thì hoa to, tỷ lệ đậu hoa cao Chất dinh dưỡng cũng rất quan trọng trong quá trình ra hoa, khi cây có đầy đủ nước, đạm và đường được dự trữ trong quá trình sinh trưởng thì cây sẽ hình thành nhiều mầm hoa Trong quá trình phát triển, hạt phấn chịu ảnh hưởng của nhiệt độ rất lớn, nhiệt độ thấp dưới

150C và cao trên 350C hạt phấn bị ức chế, phát triển không bình thường gây ra hiện tượng thụ phấn không đầy đủ Bầu quả phát triển không bình thường tạo thành những vết lõm sâu, làm cho quả bị nhăn, quả dị hình làm giảm giá trị hàng hóa [10] Nhiệt độ thích hợp cho hạt phấn cà chua phát triển từ 21 – 240C, hạt phấn không nảy mầm khi nhiệt độ đất dưới 100C và trên 350C Nghiên cứu sự phát triển của hạt phấn trong điều kiện nhiệt độ cao được xem là phương pháp hữu hiệu để chọn tạo ra giống cà chua nhiệt [10,34]

Căn cứ vào đặc điểm ra hoa của cà chua có thể phân chia thành 3 loại:

- Loại hình sinh trưởng hữu hạn: chiều cao cây dưới 65 cm, cây mập

lùn, trên cây có nhiều nhánh, dạng bụi Vị trí chùm hoa thứ nhất thấp, khoảng cách

giữa các lóng ngắn, khi trên thân chính có từ 7 – 8 lá thì xuất hiện chùm hoa thứ

nhất, sau đó cứ cách 1 – 2 lá thì có chùm hoa tiếp theo cho đến khi trên thân chính

có 3 – 4 chùm hoa, tại đỉnh sinh trưởng xuất hiện chùm hoa cuối cùng, cây ngừng

sinh trưởng chiều cao Loại hình này phù hợp với kỹ thuật gieo trồng, thu hoạch

bằng máy Trong sản xuất không cần làm giàn, tăng số cành trên mỗi cây (3 – 4 cành), trồng dày hợp lý để tăng năng suất trên đơn vị diện tích [10,34]

- Loại hình sinh trưởng vô hạn: chiều cao cây trên 120 cm, thân lá sinh

trưởng xum xuê, chồi nách phát triển mạnh, vị trí chùm hoa thứ nhất cao, khoảng

cách giữa các lóng dài Khi trên thân chính có 9 – 10 lá thật (có khi 10 – 12 lá), thì

xuất hiện chùm hoa thứ nhất, sau đó cứ cách 2 – 3 lá có chùm hoa tiếp theo cho tới

khi cây già và chết Trong kỹ thuật trồng trọt cần phải làm giàn, tỉa cành tạo hình

Loại hình này thường có thời gian sinh trưởng dài hơn 2 loại hình kể trên, năng suất

và chất lượng tốt [10,34]

- Loại hình sinh trưởng bán hữu hạn: là loại hình trung gian giữa 2 loại

trên, cây cao vào loại trung bình trên 65 cm và dưới 120 cm, thân lá sinh trưởng tốt

Vị trí chùm hoa thứ nhất thấp, khoảng cách giữa các lóng ngắn Khi trên thân chính

có 7 – 8 lá (có khi 9 – 10 lá) thì có chùm hoa thứ nhất, sau đó cách 1 – 2 lá có chùm

hoa tiếp theo cho tới khi trên thân chính có 7 – 8 chùm hoa cây ngừng sinh trưởng

chiều cao; loại hình này phù hợp cho nhiều mùa vụ và nhiều vùng sinh thái, năng

suất cao, chất lượng tốt [10,34]

Bảng 1.1:Số lượng hoa và tỷ lệ rụng hoa của 3 loại hình sinh trưởng

Tỷ lệ rụng hoa (%) Loại hình sinh trưởng Tổng số hoa trên

cây Thân chính Thân phụ

Sinh trưởng hữu hạn 61 – 127 41 – 86 36 – 85

Sinh trưởng bán hữu hạn 69 – 157 28 – 83 34 – 87

Sinh trưởng vô hạn 71 - 210 51 – 77 61 – 87

Cây cà chua có khả năng cho rất nhiều hoa, nhưng tỷ lệ rụng hoa rất lớn Nguyên nhân dẫn đến rụng nụ rụng hoa rất phức tạp, nhưng nguyên nhân cơ bản là

do sự hình thành tầng rời ở cuống hoa, làm cho hoa bị rụng Những yếu tố dẫn đến hình thành tầng rời do điều kiện ngoại cảnh bất lợi, sâu bệnh, kỹ thuật trồng trọt Ví dụ: nhiệt độ quá cao hoặc thấp, bón quá nhiều phân đạm, thừa, hoặc thiếu ẩm, …

Để hạn chế hiện tượng rụng nụ, rụng hoa có thể áp dụng biện pháp kỹ thuật tổng hợp, đặc biệt là phải chọn tạo được những giống cà chua có khả năng đậu quả cao trong điều kiện bất lợi (giống chịu nhiệt và chịu rét)… [10,34]

Hình 1.3: Hoa và quả cà chua bi

phân bón, … Các giống lai tạo trong nước, gieo trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, có số quả trung bình từ 11 – 28 quả trong vụ đông và 7 – 19 quả trong vụ xuân hè

Khối lượng quả có sự chênh lệch đáng kể giữa loài và trong loài cà chua trồng trọt từ 1 – 2 g đến 200 – 300 g Có thể phân chia quả thành 3 loại: quả nhỏ có khối lượng dưới 50 g, quả trung bình có khối lượng trên 50 đến 100 g, quả to có khối lượng trên 100 g

Trong cùng một giống, số lượng quả và trọng lượng quả thường có mối tương quan nghịch, thường thì giống có số lượng quả trên cây nhiều, khối lượng quả nhỏ

và ngược lại Số lượng quả trên cây có tương quan chặt chẽ với năng suất, thứ đến

là khối lượng quả; các nhà chọn tạo giống rất quan tâm đến 2 tính trạng này Trong loài cà chua trồng trọt có nhiều giống kết hợp được 2 yếu tố khối lượng quả và số lượng quả một cách hài hòa Ví dụ: nếu số quả trên cây đạt trên 25 quả và khối lượng quả trên 65 g thì sẽ cho năng suất cao

Hình dạng quả thay đổi giữa loài và ngay cả trong loài, chẳng hạn hình vuông, hình quả lê và anh đào

Hình dạng quả được xác định bằng công thức:

D

H

I =Trong công thức trên:

I: chỉ số hình dạng H: chiều cao quả (cm) D: đường kính quả (cm) Nếu I = 0,6 – 0,8, quả tròn dẹt; I > 0,80 – 1,25, quả tròn; I > 1,25, quả có dạng ôvan

Màu sắc quả là đặc trưng quan trọng của giống loài cà chua trồng trọt thường

có màu đỏ, đỏ thẫm, vàng và vàng da cam Lycopen là sắc tố chủ yếu trong màu đỏ của cà chua, nhưng không thể hiện được hàm lượng provitamin A; nhưng những

giống có màu vàng da cam có hàm lượng provitamin A gấp 8 – 10 lần quả màu đỏ, màu vàng da cam thể hiện hàm lượng B – caroten trong quả cà chua

Chất lượng quả cà chua được đánh giá qua các chỉ tiêu: cấu trúc quả, độ rắn chắc, tỷ lệ thịt quả, tỷ lệ đường/axit, sắc tố quả và thành phần hóa học chủ yếu trong quả Sự cân bằng về đường và axit thể hiện hương vị thích hợp

1.1.4.6 Hạt:

Hạt cà chua nhỏ, dẹt, nhọn, ở cuống hạt màu vàng sáng, vàng tối hoặc vàng nhạt, hạt của một số loài phủ lông tơ rất rõ Hạt khô có màu vàng, hạt nằm trong buồng hạt chứa đầy dịch tế bào, thông thường những giống quả to chứa số lượng hạt tương đối ít hơn so với giống quả nhỏ Hạt chín sớm hơn thịt quả, khi quả chưa chín hoàn toàn thì hạt đã có thể nảy mầm Sức nảy mầm của hạt có thể giữ được 4 – 5 năm trong điều kiện bảo quản đơn giản [10,34]

1.1.5 Giới thiệu một số giống cà chua bi: [1,47,53]

Cà chua bi nhỏ quả nhưng dễ trồng, trồng được nhiều vụ trong năm, sai quả và giá bán thường cao gấp 2 – 3 lần cà chua thông thường nên hiệu quả đưa lại rất cao Hiện nay trên thị trường có một số giống cà chua bi tốt sau đây:

- Giống cà chua bi VR2: quả hình trái nhót, khi chín có màu đỏ hoặc vàng Quả nhỏ, đường kính quả ở thời điểm thu hoạch khoảng 1,4 – 1,8 cm; dài 2,2 – 2,5 cm; trọng lượng quả trung bình 13 g (90 quả/kg) Cây sai quả, năng suất trung bình đạt 20 – 30 tấn/ha tùy theo mùa vụ gieo trồng

- Giống cà chua bi TN061: có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn, quả hình oval, khi chín đỏ tươi, cứng quả thích hợp cho vận chuyển và bảo quản Trọng lượng trái trung bình là 10 – 13 g/quả (90 – 100 quả/kg) Giống có thể thích nghi cho cả 3 vụ trong năm Cây dễ đậu trái, năng suất cao (1,2 – 1,5 tấn/sào)

- Giống lai F1 Thúy Hồng 1657: dạng trái elip dài, thon, màu đỏ tươi, nặng khoảng 13 g Thịt quả dai, ăn ngon, độ Brix khoảng 8,5; trái cứng, dễ vận chuyển, bảo quản

- Giống lai F1 Kim Ngọc 1917: do công ty Nông Hữu lai tạo và trồng ở miền Bắc Giống này cho năng suất cao, trung bình đạt 1,5-2 tấn/sào Bắc bộ; chất

lượng tốt; đặc biệt là độ đường rất cao (8,5 – 10 %), giàu vitamin Cây cho quả hình elip dài, thon, màu vàng tươi, nặng khoảng 13 g, thịt quả dai, ăn ngon, rất thích hợp cho ăn tươi dưới dạng tráng miệng hoặc đóng lọ, đóng hộp như các loại trái cây khác Trái cứng và dễ vận chuyển, bảo quản được lâu trước khi chế biến Thời gian cho thu hoạch kéo dài trong 2- 3 tháng

- Giống cà chua bi F1 TN84: do công ty Trang Nông nhập từ Đài Loan giới thiệu Nó thuộc dạng cây vô hạn; chiều cao cây trung bình 120 – 130 cm; từ ngày trồng đến khi thu hoạch là 70 – 75 ngày; một cây cho trung bình 4 – 5 kg; trọng lượng quả 15 g Quả có dạng tròn cứng, thịt trái dày cứng Theo công ty thì giống này thích hợp cho việc trồng tại Lâm Đồng

1.2 GIỚI THIỆU VIRUS VIÊM GAN (Hepatitis viruses):

Virus gây viêm gan là những virus có ái tính với tế bào gan Sau khi virus viêm gan xâm nhập vào cơ thể thì các tế bào khác tổn thương là thứ yếu, tế bào đích

mà virus hướng tới và xâm nhập, nhân lên, gây tổn thương chủ yếu là tế bào gan Các virus viêm gan đều có tế bào đích chung là tế bào gan, nhưng chúng có cấu trúc, đường xâm nhập, cơ chế lan truyền, … khác nhau Do vậy, cho đến nay, các virus viêm gan chính được chia ra 5 loại là A, B, C, D, E [6,8,9,18,54]

1.2.1 Đại cương về virus viêm gan B (Hepatitis B virus – HBV):

Hình 1.4: Cấu trúc không gian của virus HBV

Baruch, Blumberg và cộng sự đã phát hiện kháng nguyên Australia vào năm

1970 Sau đó, kháng nguyên Australia được xác định là kháng nguyên bề mặt của

hạt virus và năm 1976 được gọi là HBsAg (Hepatitis B surface antigen) [6,8,9,18]

Năm 1970, Dane đã phát hiện dưới kính hiển vi điện tử các hạt nhỏ, đường kính khoảng 42 nm, chúng được gọi tên là các hạt Dane Về sau, các tác giả nghiên cứu về HBV đã xác định hạt Dane là những virus hoàn chỉnh [6,8,9,18,54]

Hình 1.5: Virus HBV dưới kính hiển vi điện tử

Họ: Hepadnaviridae Giống: Orthohepadnavirus Loài: Hepatitis B virus

1.2.1.1 Cấu trúc của HBV: [6,8,9,18,50,52,54]

* HBV được xếp trong họ Hepadnaviridae HBV là virus mang DNA hai sợi không khép kín, có trọng lượng phân tử 2 x 106 Dalton, được cấu tạo bởi 3200 nucleotid, vỏ capsid có đối xứng hình khối, kích thước khoảng 27 nm, vỏ ngoài bao dày khoảng 7 nm được cấu tạo bởi 3 protein cấu trúc: protein lớn, protein trung bình

và protein nhỏ; vỏ bao tạo cho virus có hình cầu đường kính 42 nm (đó là hạt Dane)

Hình 1.6: Sự tổ chức bộ gen của virus HBV

* Trên phần capsid có cấu trúc HBcAg và HBeAg Trên vỏ bao ngoài có kháng nguyên bề mặt HBsAg Cấu trúc HBsAg có thể thay đổi để tạo thành nhiều thứ typ (subtyp) khác nhau Trong cấu trúc HBsAg của mọi HBV đều có thành phần

“a” là giống nhau còn các thành phần cấu trúc khác “y” “d” “w” “r” của các thứ typ

là khác nhau Các thành phần cấu trúc khác nhau của HBsAg trong các thứ typ HBV không có ý nghĩa gì về lâm sàng Chúng chỉ cho thấy sự khác biệt về gen và

có ý nghĩa khi nghiên cứu dịch tễ học HBV còn có cấu trúc DNA polymerase và nó

có thể mang chức năng của phosphokinase Sự nhân lên các thành phần cấu trúc của HBV có thể thực hiện trên tế bào người, động vật là khỉ, vượn và một số động vật mới sinh Sự nhân lên của HBV có qua giai đoạn tạo RNA trung gian (DNA → RNA → DNA) Nhờ DNA polymerase, HBV tổng hợp được đầy đủ DNA 2 sợi không khép kín (vòng) ở nhân tế bào, DNA tích hợp vào nhiễm sắc thể của tế bào gan một phần, còn một phần tự do làm khuôn mẫu tổng hợp mRNA Dựa vào mRNA này, các protein được tổng hợp và cả phần khiếm khuyết của DNA virus

cũng được tổng hợp Phần DNA khiếm khuyết này lại được dùng làm khuôn mẫu để tổng hợp nên sợi bổ sung DNA genom virus

* Cấu trúc kháng nguyên:

HBV có ba loại kháng nguyên chính:

- HBsAg: có sự thay đổi giữa các thứ typ, có trọng lượng phân tử

thay đổi từ 23000 đến 29000 Dalton, giúp cho sự bám của virus vào tế bào gan

- HBcAg: có trọng lượng phân tử từ 18000 tới 19000 Dalton HBcAg

chỉ tồn tại trong tế bào gan, không tìm được trong máu người nhiễm HBV

- HBeAg: có cấu trúc thay đổi ở các thứ typ Trọng lượng phân tử từ

16000 đến 19000 Dalton Kháng nguyên này cũng như HBsAg có thể tìm được trong máu, huyết tương bệnh nhân

1.2.1.2 Khả năng gây bệnh:

Hình 1.7: Chu trình tái bản của HBV

HBV gây bệnh cho người lây lan bởi đường máu qua nhiều phương thức: truyền máu, tiêm chích, tình dục, mẹ truyền sang con Sau khi nhiễm trùng, thời gian ủ bệnh trung bình là 50 tới 90 ngày, có thể 30 tới 120 ngày Bệnh cảnh lâm sàng thường cấp tính, nhưng không tạo dịch mà chỉ tản mạn với sốt, vàng da, vàng mắt, mệt mỏi Người ta thường tìm thấy virus trong máu từ hàng tháng đến hàng năm Bệnh có thể trở thành mạn tính từ 5 đến 10 % Cũng có người lành mang HBsAg Tỷ lệ tử vong trong giai đoạn cấp tính khoảng 1 % nhưng tai biến lâu dài là

xơ gan hay ung thư gan HBV không lây qua đường tiêu hóa Thai nhi thường bị lây truyền với tỷ lệ cao qua những bà mẹ có HBsAg và HBeAg dương tính [8,9]

Hình 1.8: Sự phản ứng của tế bào trước sự xâm nhiễm của virus HBV

Hình 1.9: Sự phân bố địa lý của bệnh biêm gan siêu vi B

1.2.2 Dịch tễ học về viêm gan B:

Số người mang HBsAg mạn trên toàn thế giới ước tính khoảng 360 triệu người Số người từng nhiễm HBV cao hơn rất nhiều, khoảng trên 2 tỷ Tỷ lệ người mang HBsAg thay đổi khác nhau trên thế giới từ 0,1 % – 0,2 % ở Anh, Mỹ và Scandinavia, đến hơn 3 % ở Hy Lạp và miền nam nước Ý và có thể lên đến

10 % – 11 % hoặc hơn nữa ở châu Phi và Viễn Đông trong đó có Đông Nam Á Người mang HBsAg có thể có tỷ lệ rất cao trong vài cộng đồng sống biệt lập như người Eskimo và thổ dân Australia Cũng từ thổ dân Australia mà Blumberg đã phát hiện ra HBsAg dưới tên là kháng nguyên Australia [6,8,9,50,51,54]

Tại Việt Nam, có hai nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm HBV trong cộng đồng đáng chú ý – một là của Lê Vũ Anh trên cộng đồng dân cư Hà Nội, một là của Châu Hữu Hầu trên cộng đồng dân cư huyện Tân Châu, An Giang với tần suất lần lượt là

11 ± 0,02 % và 11 ± 2 % Cả hai công trình thực hiện ở hai đầu đất nước nhưng lại

đưa ra kết quả gần giống nhau cho thấy nước ta thuộc vào nước có dịch HBV địa phương cao Bệnh viêm gan virus B trước đây thường gặp sau truyền máu Ngày nay, việc kiểm tra HBsAg của những người cho máu, nguyên nhân nhiễm HBV vẫn luôn là vấn đề thời sự Đường lây truyền hiện nay do tiêm chích, nghiện ma túy, qua đường tình dục, qua gia đình, qua đường cắt tóc, nhổ răng, châm cứu, … Việc lây lan HBV có nhiều con đường, do vậy trách nhiệm của người thầy thuốc rất lớn trong tuyên truyền cho mọi người hiểu rõ để tự điều chỉnh hành vi để phòng bệnh [6,8,9,50,51,54]

1.2.3 Sự khác biệt chính giữa virus viêm gan A, B và C: [6,8,9]

Đặc điểm phân biệt Viêm gan A Viêm gan B Viêm gan C

Thời kỳ ủ bệnh 15 – 45 ngày 20 – 240 ngày (25 – 30) 35 – 70 ngày (có thể

14 – 120)

Tuổi gặp 15 – 19 Mọi lứa tuổi Mọi lứa tuổi

Mùa gặp Quanh năm, mùa thu Quanh năm ?

Đường lây truyền Chủ yếu tiêu hóa Máu và ngoài tiêu hóa Chủ yếu ngoài tiêu hóa

(sau truyền máu)

Virus máu 2 tuần trước tới hơn 1 tuần

sau vàng da Hàng tháng tới hàng năm Hàng tháng tới hàng năm

Virus trong phân 2 tuần trước và 2 tuần sau

Nước bọt và tinh dịch ? Thường có ?

Lâm sàng Đột ngột – Tạo dịch Âm thầm – Tản mạn Âm thầm (95%)

1.2.4 Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBsAg – Hepatitis

B surface antigen):

Các kháng nguyên bề mặt lưu hành trong huyết thanh người nhiễm virus Đa

số là các hạt hình cầu đường kính 17 – 25 nm, thường có số lượng khoảng 1013hạt/ 1 ml Các hạt hình sợi (hoặc hình ống) ít hơn, đường kính độ 20 nm có chiều dài khá thay đổi, có nồng độ khoảng 1011 hạt/ 1 ml hoặc 1 μ/ml Huyết thanh của người mang có nồng độ virus huyết thấp chứa khoảng 1012/ml hạt cầu HBs và các sợi HBs rất ít hoặc không có [6,8,9]

Các hạt cầu và hạt hình sợi chỉ chứa lipid có nguồn gốc từ nội bào tương của

ký chủ và các protein bề mặt của virus nhưng không có nucleocapsid nên không gây nhiễm Các hạt này không chứa hoặc chứa ít protein bề mặt lớn, là protein mang điểm gắn thụ thể Bởi thế, các hạt virus phụ không gây nhiễm, cũng không có khả năng ngăn trở nhiễm virus [6,8,9]

Protein SHBs giống vùng S của MHBs và LHBs MHBs có một vùng tiền S2

ở phía ngoài LHBs chứa tiền S2 ở trong và tiền S1 ở ngoài Vỏ ngoài bao một capsid gồm 240 tiểu đơn vị protein HBc [6,8,9]

Các HBc bao bộ gen HBV DNA dài 3,2 kb; qua đó, men primerase của DNA polymerase gắn kết đồng hóa trị Protein kinase C và protein sốc nhiệt hsc90 cũng được bao Các dạng sợi HBs có các protein tương tự như vỏ ngoài virion Các hạt cầu chứa ít LHBs [6,8,9]

Các hạt HBs chứa các lượng nhỏ lipid có nguồn gốc từ lưới nội bào tương của

ký chủ nằm giữa các tiểu đơn vị protein Bên trong LHBs, các vùng tiền S kết hợp với protein sốc nhiệt hsc70 [6,8,9]

Các sợi HBs chứa 3 polypeptid HBs khác nhau: protein lớn nhất (LHBs), protein trung bình (MHBs), protein nhỏ (SHBs) SHBs là thành phần nhiều nhất trong tất cả 3 hạt protein vỏ của HBV và MHBs ít nhất [6,8,9]

LHBs thường thấy hơn MHBs trong virion và trong các sợi, nhưng ít gặp trong hạt hình cầu HBs Thành phần LHBs có thể xác định hình thái của hạt HBs, trong khi thành phần SHBs và MHBs không làm thay đổi hình thái đáng kể [6,8,9]

Nếu quá trình đọc mã bắt đầu từ vùng tiền S1 và tiếp tục đến hết vùng S sẽ tổng hợp protein LHBs Cũng thế, sự tổng hợp protein M và protein S lần lượt bắt đầu từ vùng tiền S2 và S Cả ba protein cấu tạo nên HBsAg [6,8,9]

Hình 1.10: Ba vùng của gen S (S, tiền S1, tiền S2)

và các protein được gen này mã hóa

1.2.4.3 Protein lớn (LHBs):

LHBs chứa cả 3 vùng S, tiền S1, tiền S2 Chuỗi mã tiền S1 ở người nhiễm HBV rất biến đổi, có lẽ đây là protein gắn vào gan Tiền S1 không có điểm glycosyl

hóa phụ, nhưng chứa một tín hiệu myristyl hóa ở đầu tận N, neo đầu tận N vào màng tế bào [6,8,9]

Hình 1.11: Các protein bề mặt

1.2.4.4 Các kiểu SHBs phụ:

SHBs có các kiểu phụ đã được xác định bằng các kháng thể Quyết định a chung ở tất cả các chủng phân lập HBs có tính sinh kháng nguyên mạnh nhất Các quyết định kiểu phụ khác là d hoặc y và w hoặc r Tại vị trí 122, quyết định d có một lyxin, y có một arginin Cũng thế, tại vị trí 160, quyết định w có một lyxin, r có một arginin Hơn nữa, w lại phân chia thành w1 đến w4 Một alen kiểu phụ khác đã được xác định có isoleuxin hoặc threoxin ở vị trí 126 của SHBs Gần đây, việc xác định chuỗi mã DNA của gen SHBs đã xác định được nhiều kiểu phụ Ít nhất 7 kiểu gen xếp từ A đến G, khác biệt hơn 8 % trong chuỗi mã protein Do quyết định a chung trong tất cả kiểu phụ SHBs có tính sinh miễn dịch mạnh, nên khi dùng SHBs làm thuốc chủng ngừa, có thể gây bảo vệ chéo Việc xác định kiểu phụ chỉ có ích lợi dịch tễ, tuy cũng có một vài kháng thể trung hòa chuyên biệt kiểu phụ, như đa số các virus khác [6,8,9]

1.3 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO:

Nuôi cấy mô tế bào là phương pháp dùng các điều kiện nhân tạo để duy trì sự sống của tế bào trong ống nghiệm (trong điều kiện in vitro) Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào là dùng các điều kiện như nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, phytohoocmon, … để điều khiển quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu cần đạt được [7,11,27,40,41]

Nuôi cấy mô – tế bào thực vật in vitro đã hình thành từ vài thập kỷ trước mà

cơ sở của nó là giả thuyết của nhà thực vật học người Đức là Haberland G (1902) Ông cho rằng tất cả các tế bào của cây đều có tính toàn năng, nghĩa là mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể Theo Harberland, mỗi tế bào

ấy có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi Tiếc rằng thí nghiệm của ông đã không thành công do ông nuôi cấy tế bào đã mất khả

năng tái sinh (cây một lá mầm như Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia là đối

tượng rất khó nuôi cấy in vitro) [15,16,40,41]

Năm 1924, Kotte và Robbins lặp lại thí nghiệm của Haberland và nuôi được đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ cây hòa thảo, tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ [42] Mười năm sau (1934) White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua

(Lycopersi cum esculentum) trên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng và

dịch chiết nấm men Các thí nghiệm tiếp theo White thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp ba vitamin nhóm B: thiamin (vitamin B1), piridoxin (vitamin B6), và axit nicotinic (vitamin B3) Sau đó ít lâu, Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA (indol axetic axit) [19,27,37,40,41]

Nghiên cứu về hướng khác, Gautheret và Nobecourt (1937) đã tạo ra và duy

trì được mô sẹo của cà rốt (Daucus carote) trong một thời gian dài Ở thời kỳ này,

các nhà khoa học nghiên cứu và tổng hợp thành công nhiều chất kích thích sinh trưởng như: NAA (α-naphthyl axetic axit), 2,4D (2,4 dilorophenoxy axetic axit) [7] Năm 1955, Skoog và Miller tìm ra kinetin trong dịch thủy phân của tinh dịch

cá bẹ (Lerringperm) Cùng với kinetin thì các xytokinin khác như BAP (6-benzyl

amino purin), 2ip, zeatin cũng lần lượt được phát hiện [7,38,40,41]

Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào thực vật trong sản xuất với việc tạo được cây hoàn chỉnh từ mô tách rời như đỉnh sinh trưởng, chồi, lá, Hai tác giả Morel và Martin đã phát triển kỹ thuật nuôi

cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống sạch bệnh ở khoai tây (Solanum

tuberosum) và hoa lan (Orchid) Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một

hướng mới của nuôi cấy mô – tế bào thực vật đó là vi nhân giống [7,11,19,40,41] Nuôi cấy tế bào tách rời (tế bào đơn và tế bào trần) được bắt đầu năm 1960 với các thí nghiệm tiên phong của Cooking và từ đó trở đi nuôi cấy tế bào tách rời đã có những bước phát triển đáng khích lệ Nhờ hoàn thiện các kỹ thuật nuôi cấy protoplast, người ta có thể tiến hành dung hợp tế bào tạo ra tế bào lai hoặc nghiên cứu chuyển gen có lợi vào cây trồng nhằm cải tạo giống [11,19,40]

Nói chung, những lợi ích của việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắt như sau:

- Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng nhờ phương pháp nuôi cấy

mô – tế bào thực vật để loại bỏ những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh [27,41]

- Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất [27,41]

- Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối Sự đồng loạt này giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch Do

đó năng suất lao động sẽ tăng lên Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ và chế biến [27,41]

1.3.1 Nguyên tắc của nuôi cấy mô tế bào thực vật:

ƒ Dựa vào tính toàn năng của tế bào:

- Năm 1902, Haberlandt G (nhà khoa học người Đức) đưa ra giả thiết

về tính toàn năng của tế bào thực vật Ông cho rằng tất cả các tế bào thực vật đều có tính toàn năng (totipotency), nghĩa là mỗi tế bào đều mang toàn bộ lượng thông tin

di truyền của cơ thể và có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi [7,11,41]

- Đến năm 1922, Kotte và Robbins đã nuôi được đỉnh sinh trưởng tách

từ đầu rễ một cây hòa thảo trong 12 ngày Như vậy, lần đầu tiên tính toàn năng của

tế bào được chứng minh bằng thực nghiệm Sau đó 43 năm (1965), Vasil và Hildebrant đã nuôi từng tế bào riêng biệt của cây thuốc lá và tạo được cây thuốc lá hoàn chỉnh trong ống nghiệm Kết quả này chứng minh toàn diện tính toàn năng của

tế bào [7,11,41]

ƒ Dựa vào khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào:

- Biệt hóa là sự biến đổi của tế bào từ trạng thái tế bào phôi cho đến khi

thể hiện một chức năng nào đó [27,40,41]

- Các tế bào dùng trong môi trường cấy đều đã biệt hóa về cấu trúc và

chức năng Trong những điều kiện thích hợp, có thể làm cho những tế bào này trở lại trạng thái của tế bào đầu tiên đã sinh ra chúng – tế bào phôi và quá trình đó gọi

là quá trình phản biệt hóa (dedifferentiation) [27,40,41]

- Trong cùng một cơ thể, mỗi loại tế bào đều có khả năng biệt hóa, phản

biệt hóa và vì thế triển vọng nuôi cấy thàng công cũng khác nhau Những tế bào càng chuyên hóa về một chức năng nào đó (đã biệt hóa sâu) thì càng khó xảy ra quá trình biệt hóa và ngược lại, như các tế bào mạch dẫn của hệ thống mạch dẫn ở thực vật, tế bào thần kinh động vật Người ta đã tổng kết rằng: những tế bào càng gần với trạng thái của tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấy nhiêu [41]

- Đối với các loài thực vật thì các tế bào phôi non, các tế bào mô phân sinh, các tế bào của cơ quan sinh sản (hạt phấn, noãn) rất dễ xảy ra quá trình biệt hóa Vì vậy, nói một cách hình tượng như Galson (1986) và Murasshige (1974) thì khả năng hình thành cơ quan hay cơ thể của các tế bào thực vật lại giảm dần theo chiều từ ngọn xuống gốc [27,40,41]

1.3.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng:

Các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật invitro Hiệu quả tác động của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: nồng độ dùng, hoạt tính vốn có của chất điều hòa sinh trưởng, mẫu nuôi cấy [11,19,38,40,41]

* Nhóm auxin: được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh

trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi

chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính …

(epstein và cộng sự, 1989) Các loại auxin thường dùng cho nuôi cấy: IAA (Indole

acetic acid); IBA (Indole butyric acid); NOA (Naphthoxy acetic acid); α-NAA

(α-Naphthalene acetic acid); Picloram (4-amino-3,5,6 trichloropicolinic acid); 2,4-D

(2,4-dichlorophenoxy acetic acid); pCPA (P-chlorophenoxy acetic acid); Dicamba

(3,6-Dichloro-O-anisic acid);… Các auxin khác có hàm lượng sử dụng từ 0,1 – 2,0 mg/l Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp Tùy theo loại auxin, hàm

lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy … mà tác động sinh lý của auxin là kích thích

sinh trưởng của mô, hoạt hóa sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ

của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus) [19,23,27,40,41]

* Nhóm cytokinin: kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh

trưởng của chồi invitro (Miller, 1961) Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ

và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có ảnh hưởng dương tính rõ rệt đến phát sinh

phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Các loại cytokinin thường được dùng trong nuôi cấy

bao gồm: Zeatin (6-[4-hydro-3-metyl-but-2-enylamino]purine); Kinetin (6-furfurylamino purine); BAP (Bezylamino purine); TDZ (Thidiazuron); 2-ip (Isopentenyl adenine);… Hàm lượng sử dụng của các cytokinin dao động từ

0,1 – 2,0 mg/l Ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt

đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy

Trong các loại cytokinin nói trên, kinetin và BAP là hai loại được dùng rộng rãi hơn

cả [11,19,23,27,37,40,41]

1.4 CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG:

1.4.1 Tạo dòng gen:

Tạo dòng gen là gắn một gen, một trình tự DNA cần thiết vào vector tách

dòng, tạo các vector tái tổ hợp và đưa vào tế bào nhận (tế bào chủ), nhằm thu một

số lượng lớn các bản sao của gen hoặc trình tự DNA cần thiết [2,14,26,28,32,36]

1.4.2 Enzyme giới hạn (restriction enzyme):

* Các enzyme giới hạn (restriction enzyme) gồm 2 loại: exonuclease và endonuclease Exonuclease cắt DNA từ hai đầu mút; còn endonuclease cắt DNA ở giữa phân tử Các restriction enzyme cắt phân tử DNA ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là restriction endonuclease Enzyme giới hạn là những enzyme endonuclease có khả năng nhận biết và cắt chính xác đoạn DNA kép tại một vị trí xác định theo những trình tự ngược xuôi 4 hoặc 6 cặp base Những trình tự ấy giống nhau trên cả hai sợi và luôn đọc theo hướng 5’ – 3’ trên cả hai sợi DNA Sự cắt

DNA này có thể tạo đầu bằng (như Hae III) hoặc đầu so le (như BamHI)

* Tên gọi các enzyme giới hạn:

Chữ số La Mã (chỉ enzyme được tách

ra lần đầu tiên hay lần thứ hai ở vi khuẩn đó)

EcoRI Escherichia (E) coli (co) Ry13 (R) I

* Một số đặc tính của enzyme giới hạn:

- Tác động trên những trình tự thuận nghịch giống nhau trên cả hai sợi và luôn đọc theo hướng 5’ – 3’ trên cả hai sợi [14,26,32,36]

- Các enzyme giới hạn có nguồn gốc khác nhau (từ các chủng vi khuẩn khác nhau) – có hằng số vật lý khác nhau, nhưng đôi khi có thể cắt DNA ở cùng một

vi trí giới hạn Ví dụ, Sac I và Sst I đều nhận biết trình tự GAGCT/C

[14,26,32,35,36]

- Một cặp enzyme giới hạn có nguồn gốc khác nhau có thể nhận biết một

vị trí tùy vị trí đó có bị methyl hóa hay không Ví dụ, Msp I có thể cắt ở vị trí C/CGG

và C/CmGG (methyl hóa ở vị trí cytosin); còn Hpa II chỉ cắt ở vị trí C/CGG

Mg2+, DNA-ase tác động trên sợi đơn riêng rẽ [2,3,4,5,12,13,14,20,21,26,32,35,36]

- Nuclease S1 – được chiết xuất từ Aspergillus oryzae – chỉ tác động

trên DNA sợi đơn, không tác động trên sợi kép hay các đoạn lai DNA/RNA; trừ trường hợp dùng ở nồng độ cao, và như vậy được dùng trong sự xác định vị trí khởi đầu của sự sao chép [2,3,4,5,12,13,14,20,21,26,32,35,36]

- RNase H là enzyme có tác dụng loại bỏ RNA trong các phân tử lai DNA – RNA, thường dùng để loại bỏ RNA sau các phản ứng phiên mã ngược, để hình thành mạch thứ hai của cDNA tạo nên phân tử DNA kép [2,3,4,5,12,13,14,20,21,26,31,32,35,36]

1.4.4 Enzyme nối DNA (ligase): [2,3,4,5,12,13,14,20,21,26,32,35,36]Dùng để nối hai đoạn DNA sợi kép với sự hiện diện của ATP Ligase kích thích sự thành lập một nối ester giữa đoạn 5’-PO4 và 3’-OH Nhận thấy có ligase nối hai đoạn đầu so le dễ dàng hơn nối hai đoạn đầu bằng, nên tùy trường hợp mà